CN117925591A - 一种提升辅酶nad/nadh生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/mL，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/mL，同时制备了包含上述组合物的电化学试条。本发明中的组合物能够有效提升NAD/NADH的生物稳定性和反应体系整体的稳定性，可以应用于检测3‑羟基丁酸脱氢酶、胆固醇或乳酸的电化学试条中，对于对于脱氢酶+NAD反应原理下的体系具有一定的普适性。

Description

一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物、电化学试条及 其应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用。

背景技术

进入新世纪以来，体外诊断生物传感器发展迅猛，各种指标的生物传感器(如血糖、尿酸、胆固醇、乳酸等)在临床应用研究中取得突破性进展，而其中电化学生物传感器因具有重复性好、准确度高、测定范围广泛等优点，而受到科研工作者越来越多的关注。

现有已经成熟市场化的电化学试条多采用氧化酶体系，如血糖、尿酸、胆固醇等，基本是利用与之相对应的氧化酶来催化生物反应，然后利用铁氰化钾或亚铁氰化钾，亦或是其他电子介体传递反应过程中释放的电子到电极上，从而产生微电流完成检测，此反应体系制备的电化学传感器具有反应直接、原理明了、工艺简单的优点。但同时也有明显的缺点，比如血液样本的氧气含量会直接干扰测试的准确度，空气中的氧气也会使影响试条的稳定性和保存时间；另外，氧化酶体系的电化学反应在原理上不具有普适性，即并不是所有的氧化酶催化的生化反应中释放的电子都能够被转移到铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌化合物、有机染料这些常用的电子介体中去，也就没法形成能够被检测到的电化学信号，比如抗坏血酸氧化酶催化抗坏血酸的反应、胆红素氧化酶催化胆红素的反应等，都无法通过加入常用电子介体检测到可识别的电化学信号，需要对电子介体进行工作量极大的系统性筛查，才能找到合适的原理和方法来完成这一体系的检测。

与氧化酶体系相比，脱氢酶催化的生化反应大多需要辅酶或辅基的参与，虽然脱氢酶种类繁多，但辅酶或辅基却有极强的通用性，例如乳酸脱氢酶、3-羟丁酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶等一系列的脱氢酶都需要辅酶NAD的参与，才能进行完整的生物催化反应；而如葡萄糖脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、酯酰辅酶A脱氢酶等一系列的脱氢酶都需要辅酶FAD的参与。

因此如果能够开发出一种测定辅酶浓度变化的电化学试条，就可以根据间接法计算出体系中相应脱氢酶活性及其底物浓度的变化。而又因为辅酶具有通用性，即使改变体系中的脱氢酶和底物种类，该原理和方法也同样适用。例如，在对NAD/NADH实现有效的电化学检测方法后，就可以利用间接法测定其他同样以NAD/NADH为辅酶的脱氢酶底物活性或底物浓度，如胆固醇脱氢酶活性和对应的胆固醇浓度、乳酸脱氢酶活性和对应的乳酸浓度等。

现阶段，已经有越来越多的科研工作者将目光聚焦在了脱氢酶体系的电化学生物传感器的市场化研究上，例如罗氏的血糖金电极试条，就采用FAD为辅酶的葡萄糖脱氢酶为催化酶介，在提升抗干扰能力的同时，也较为明显的提升了试条的稳定性。还有目前市面上在售的雅培血酮电化学测试条同样采用脱氢酶体系，在辅酶NAD的存在下，利用3-羟基丁酸脱氢酶催化底物，在底物完成反应的同时，令NAD转化为NADH，然后再利用NADH转化到NAD的过程中，将电子转移到电子介体中，从而实现可被检测到的电化学信号变化。可以预见的是，未来将会有越来越多的脱氢酶体系电化学测试条实现商业化。

但是，相较于氧化酶体系，脱氢酶作为生化反应的酶介也有很明显的缺点。因为大部分脱氢酶与辅酶的连接都很脆弱，在酶的提取和纯化过程中，辅酶极容易与酶发生分离。因此在实际使用过程中，只有极少数酶(如FAD-GDH等)不需要额外加入辅酶或辅基，其他大部分均需要反应体系中加入NAD、NADP、FMN或FAD等，而这些辅酶稳定性较差，都需要保存在-20℃冰箱中，利用该体系检测的电化学试条保存时间和保存条件都有一定的限制。与氧化酶催化体系的电化学测试条相比，有明显的劣势。综上所述，具有针对性的提升辅酶在反应体系中的稳定性，对于提升试条的稳定性和保存时间，无疑具有巨大的裨益。

发明内容

为了克服现有技术中的技术问题，本发明提供一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物、电化学试条及其应用，本发明中的组合物能够有效提升NAD/NADH的生物稳定性和反应体系整体的稳定性，且对于对于脱氢酶+NAD反应原理下的体系具有一定的普适性。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下：

本发明提供一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/mL，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/mL。

在本发明中的环糊精是一种具有环形结构的有机高分子物质，其内环分布有一定数量的疏水基团，能够和NAD/NADH上的疏水基团进行结合，而外环分布的基团则主要为亲水基团。这种特殊的空间结构可以让NAD/NADH等生物有机小分子“镶嵌”入环糊精的内环中，然后再溶解到水溶液中，起到提升有机小分子溶解度的作用，同时这种特殊的包合结构，也能更好的保护NAD/NADH等有机生物小分子的空间结构，让其具有更好的稳定性。本发明中的电子介体结合物能够更好的和电子介体(钌、铁氰化钾等金属离子)产生结合，从而提升电子传递效率，同时也能够与酶等生物大分子相结合，提供一定的保护作用。本发明中的聚乙烯吡咯烷酮是一种非离子型水溶性高分子化合物，具有胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，同时具有优异的溶解性能及生理相容性。在本发明中，聚乙烯吡咯烷酮能在试条的干燥过程中，于酶液表面形成一层具有保护作用的生物膜，保护内部具有活性的酶和环糊精-NAD结合物分子结构不受破坏，从而保持酶和NAD/NADH的生物活性。环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮三种组合使用，共同提高NAD/NADH的生物稳定性。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的组合物中，所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、2,6-二-O-甲基-β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种。

优选地，所述环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的组合物中，所述电子介体结合物选自羧甲基壳聚糖、羧化壳聚糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素中的一种或多种。

优选地，所述电子介体结合物为羧甲基壳聚糖。

本发明中的羧甲基壳聚糖做为壳聚糖的衍生物，在具备壳聚糖良好的生物相容性、生物活性和生物可降解性的性能基础上，由于羧甲基的引入，使其还具备良好的水溶性和吸附性，其中尤其是对金属离子有着很强的吸附能力，因为分子结构中含有—OH、—NH₂和—COOH等基团，而由于这些理化性质，使得羧甲基壳聚糖能够更好的和电子介体(钌、铁氰化钾等金属离子)产生结合，从而提升电子传递效率，同时壳聚糖也能够与酶等生物大分子相结合，提供一定的保护作用。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的组合物中，所述聚乙烯吡咯烷酮选自聚乙烯吡咯烷酮6000、聚乙烯吡咯烷酮8000、聚乙烯吡咯烷酮10000中的一种或多种。

优选地，聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮8000。

基于相同的技术构思，本发明还提供包含上述提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物的电化学试条。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的电化学试条中，电化学试条的酶液中还包括电子介体，所述电子介体选自铁氰化钾、三氯化钌六水合物、三氯化六氨合钌中的一种或多种，所述电子介体在酶液中的浓度为20～40mg/mL。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的电化学试条中，所述电化学试条的酶液中还包括NAD/NADH，所述NAD/NADH的浓度为2～15mg/mL。

在本发明中，在制备电化学试纸条的酶液体系中，还需要额外加入NAD/NADH，含量为2～15mg/mL，过低会导致测定电流值在高浓度区间偏低的问题，过高则会出现酶液浑浊的现象。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的电化学试条中，所述电化学试条中的脱氢酶选自3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶或乳酸脱氢酶中的一种。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的电化学试条中，所述电化学试条的酶液中还包括酶保护剂、表面活性剂和缓冲液，所述酶保护剂为海藻糖和BSA，所述表面活性剂为TritonX-100，所述缓冲液选自HEPES、邻苯二甲酸氢钾、MES、甘氨酸、Tris或CAPS中的一种。

优选地，缓冲液为MES，pH值为6.0～8.0。

基于相同的技术构思，本发明还提供上述组合物在提高辅酶NAD/NADH生物稳定性中的应用。

基于相同的技术构思，本发明还提供上述组合物或上述电化学试条在检测3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇或乳酸中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供一种单独针对辅酶NAD/NADH的保护剂，在不影响其他反应物质的前提下，能够有效提升NAD/NADH的生物稳定性和反应体系整体的稳定性。

(2)本发明通过改变脱氢酶种类进行不同测试指标和不同反应体系下的考察，确定该方法对于脱氢酶+NAD反应原理下的体系具有一定的普适性，为其他相似反应原理指标(如谷氨酸、丙酮酸、乙醇、甲酸盐等)的电化学检测试剂或试条的商业化提供了一定的依据和参考价值。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

组合物对NADH的保护作用的验证，包括以下步骤：

(一)实验组试条制作

量取10mL的纯化水，然后向其中依次加入107mg的吗啉乙磺酸一水合物(MES·H₂O)、组合物(40mg的2-羟丙基-β-环糊精、10mg的羧甲基壳聚糖、200mg的聚乙烯吡咯烷酮8000)、10μL的TritonX-100，充分搅拌溶解完全后，pH值调节为6.8，配制成带有保护剂的基质缓冲液。然后取此缓冲液1mL，向其中加入10mg的NADH，制备成点液量为0.8μL的实验组电化学试条，45度烘箱中烘烤20min待其完全干燥后装桶待测。

(二)对照组试条制作

量取10mL的纯化水，向其中加入107mg的吗啉乙磺酸一水合物(MES·H₂O)和10μL的TritonX-100，充分搅拌溶解完全后，pH值调节为6.8，配制成不带组合物的基质缓冲液。然后取此缓冲液1mL，同样向其中加入10mg的NADH，制备成点液量为0.8μL的对照组电化学试条，45度烘箱中烘烤20min待其完全干燥后装桶待测。

待测物不同浓度梯度的三氯化六氨合钌溶液配制：准确称取77mg的三氯化六合钌于5mL的离心管中，然后加入5mL纯化水，搅拌溶解后配制成50mmol/L的三氯化六氨合钌母液，然后再用纯化水将其稀释为0.5mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L和8.0mmol/L不同浓度梯度的三氯化六氨合钌溶液。

电化学工作站时间-电流法测定不同浓度梯度的三氯化六氨合钌溶液：经过优化，测定电压确定为0.15V，测定时间确定为8s，此时试条上的电化学反应原理为：

NADH+Ru³⁺→NAD+H++Ru²⁺

在确定上述不同浓度梯度的三氯化六氨合钌溶液的测定电流值与浓度成明显线性关系后，对上述所得的两种不同电化学测定试条进行加速稳定性考察研究，具体方案如下：

实验组电化学试条和对照组电化学试条同时于45度烘箱中加速，每隔一周就用来测定同一批不同浓度梯度的三氯化六氨合钌溶液进行比对(其中三氯化六氨合钌均为新配溶液)。结果如下表1和表2所示，从表1可知，经历一个月的加速实验后，不加组合保护剂的对照组电化学试条，在测定高浓度三氯化六氨合钌的溶液时，电流值会逐渐降低，最高值相较于初始电流下降30～40％，从表2可知，加入了保护剂的实验组电化学试条则仅下降5～10％，说明在此电化学反应体系中，三种保护剂能够有效提升NADH的生物稳定性。

表1：不加入组合物的对照组试条检测结果

表2：加入组合物的实验组试条检测结果

实施例2

验证组合物在3-羟基丁酸脱氢酶+NAD的电化学反应体系中对NAD的保护作用，具体操作步骤如下：

一、实验组试条制作

(1)量取10mL的纯化水，然后向其中依次加入107mg的吗啉乙磺酸一水合物(MES·H₂O)、组合保护剂(40mg的2-羟丙基-β-环糊精、10mg的羧甲基壳聚糖、200mg的聚乙烯吡咯烷酮8000)、10μL的TritonX-100，200mg的海藻糖和50mg的BSA，其中海藻糖和BSA能够起到保护3-羟基丁酸脱氢酶的作用，充分搅拌溶解完全后，pH值调节为7.0，配制成带有NAD保护剂的基质缓冲液。

(2)取此带有NAD保护剂组合的缓冲液1mL，向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和1.5KU的3-羟基丁酸脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成3-羟基丁酸反应酶液。

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤30min以上，待其完全干燥后装桶待测。

二、对照组试条制作

(1)量取10mL的纯化水，然后向其中依次加入107mg的吗啉乙磺酸一水合物(MES·H₂O)、10μL的TritonX-100，200mg的海藻糖和50mg的BSA，充分搅拌溶解完全后，PH值调节为7.0，配制成不带有NAD保护剂的基质缓冲液.

(2)取此缓冲液1mL，向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和1.5KU的3-羟基丁酸脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成3-羟基丁酸反应酶液.

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤30min以上，待其完全干燥后装桶待测。

待测物不同浓度梯度的3-羟基丁酸钠溶液配制：准确称取32mg的3-羟基丁酸钠于5mL的离心管中，然后加入5mL纯化水，搅拌溶解后配制成50mmol/L的3-羟基丁酸钠母液，然后再用纯化水将其稀释为0.5mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L和8.0mmol/L不同浓度梯度的3-羟基丁酸钠溶液。

电化学工作站时间-电流法测定不同浓度梯度的3-羟基丁酸钠溶液：经过优化，测定电压确定为0.25V，测定时间确定为20s，此时试条上的电化学反应原理为：

NADH+Ru³⁺→NAD+H⁺+Ru²⁺

在确定上述不同浓度梯度的3-羟基丁酸钠溶液的测定电流值与浓度成明显线性关系后，对上述所得的两种不同电化学测定试条进行加速稳定性考察研究，具体方案如下：

实验组电化学试条和对照组电化学试条同时于45度烘箱中加速，每隔一周就用来测定同一批不同浓度梯度的3-羟基丁酸钠溶液进行比对(其中3-羟基丁酸钠均为新配溶液)。结果如下表3和表4所示，从表3可知，经历一个月的加速实验后，不加组合保护剂的对照组电化学试条，在测定高浓度3-羟基丁酸钠的溶液时，电流值会有所降低，最高值相较于初始电流下降15～25％，从表4可知，加入了保护剂的实验组电化学试条在测定高浓度3-羟基丁酸钠的溶液时，电流值也会降低，但降低幅度能控制在5～10％范围以内，有明显的改善效果，说明在此电化学反应体系中，三种保护剂能够有效提升NAD的生物稳定性。

表3：3-羟基丁酸脱氢酶体系对照组试条稳定性测试结果

表4：3-羟基丁酸脱氢酶体系实验组试条稳定性测试结果

实施例3

验证组合物在胆固醇脱氢酶+NAD的电化学反应体系中对NAD的保护作用，具体操作步骤如下：

(一)实验组试条制作

(1)量取20mL的纯化水，然后向其中依次加入15mg的甘氨酸、组合保护剂(40mg的2-羟丙基-β-环糊精、10mg的羧甲基壳聚糖、200mg的聚乙烯吡咯烷酮8000)、10mg的氯化镁、10μL的Brij30、200mg的海藻糖和50mg的BSA，其中氯化镁做为脱氢酶的启动子，海藻糖和BSA能够起到保护胆固醇脱氢酶的作用，充分搅拌溶解完全后，PH值调节为6.5，配制成带有NAD保护剂的基质缓冲液。

(2)取此带有NAD保护剂组合的缓冲液1mL，向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和1.0KU的胆固醇脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成胆固醇反应酶液.

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤40min以上，待其完全干燥后装桶待测。

(二)对照组试条制作

(1)量取20mL的纯化水，然后向其中依次加入15mg的甘氨酸、10mg的氯化镁、10μL的Brij30、200mg的海藻糖和50mg的BSA，充分搅拌溶解完全后，PH值调节为6.5，配制成不带有NAD保护剂的基质缓冲液。

(2)取此缓冲液1mL，同样向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和1.0KU的胆固醇脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成反应酶液。

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤40min以上，待其完全干燥后装桶待测。

待测物不同浓度梯度的胆固醇溶液配制：准确称取96.7mg的胆固醇于5mL的离心管中，然后加入5mL无水乙醇，加热至50～60℃，搅拌溶解完全后配制成50mmol/L的胆固醇母液，冷却后再用纯化水将其稀释为0.5mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L和8.0mmol/L不同浓度梯度的胆固醇溶液。

电化学工作站时间-电流法测定不同浓度梯度的胆固醇溶液：经过优化，测定电压确定为0.15V，测定时间确定为50s，此时试条上的电化学反应原理为：

NADH+Ru³⁺→NAD+H⁺+Ru²⁺

在确定上述不同浓度梯度的胆固醇溶液的测定电流值与浓度成明显线性关系后，对上述所得的两种不同电化学测定试条进行加速稳定性考察研究，具体方案如下：

实验组电化学试条和对照组电化学试条同时于45度烘箱中加速，每隔一周就用来测定同一批不同浓度梯度的胆固醇溶液进行比对(其中胆固醇均为新配溶液)。结果如下表5和表6所示。同样，从表5可知，经历一个月的加速实验后，不加组合保护剂的对照组电化学试条，在测定高浓度胆固醇的溶液时，电流值会明显降低，最高值相较于初始电流下降25～35％，从表6可知，加入了保护剂的实验组电化学试条在测定高浓度胆固醇的溶液时，电流值也会降低，但降低幅度能控制在5～10％范围以内，有明显的改善效果，说明在此电化学反应体系中，三种保护剂同样能够有效提升NAD的生物稳定性。

表5：胆固醇脱氢酶体系对照组试条检测结果

表6：胆固醇脱氢酶体系实验组试条检测结果

实施例4

验证组合物在乳酸脱氢酶+NAD电化学试条反应体系中对NAD的保护作用，具体操作如下：

(一)实验组试条制作

(1)量取20mL的纯化水，然后向其中依次加入242mg的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、组合保护剂(40mg的2-羟丙基-β-环糊精、10mg的羧甲基壳聚糖、200mg的聚乙烯吡咯烷酮8000)、10μL的TritonX-100、200mg的海藻糖和50mg的BSA，其中海藻糖和BSA能够起到保护胆固醇脱氢酶的作用，充分搅拌溶解完全后，PH值调节为7.5，配制成带有NAD保护剂的基质缓冲液。

(2)取此带有NAD保护剂组合的缓冲液1mL，向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和2.0KU的乳酸脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成乳酸反应酶液。

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤20min以上，待其完全干燥后装桶待测。

(二)对照组试条制作

(1)量取20mL的纯化水，然后向其中依次加入242mg的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、10μL的TritonX-100、200mg的海藻糖和50mg的BSA，充分搅拌溶解完全后，PH值调节为7.5，配制成不带有NAD保护剂的基质缓冲液。

(2)取此缓冲液1mL，同样向其中加入10mg的NAD、30mg的三氯化六氨合钌和2.0KU的乳酸脱氢酶，混匀使其溶解完全，配制成反应酶液。

(3)点酶机设置点酶量为0.8μL进行点液操作，然后45度烘箱中烘烤20min以上，待其完全干燥后装桶待测。

待测物不同浓度梯度的乳酸锂溶液配制：准确称取80mg的乳酸锂(60％纯度)于5mL的离心管中，然后加入5mL纯化水，搅拌溶解完全后配制成100mmol/L的乳酸锂母液，再用纯化水将其稀释为3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L和15mmol/L不同浓度梯度的胆固醇溶液。

电化学工作站时间-电流法测定不同浓度梯度的乳酸锂溶液：经过优化，测定电压确定为0.3V，静置时间为20s，测定时间确定为10s，此时试条上的电化学反应原理为：

NADH+Ru³⁺→NAD+H⁺+Ru²⁺

在确定上述不同浓度梯度的胆固醇溶液的测定电流值与浓度成明显线性关系后，对上述所得的两种不同电化学测定试条进行加速稳定性考察研究，具体方案如下：

实验组电化学试条和对照组电化学试条同时于45度烘箱中加速，每隔一周就用来测定同一批不同浓度梯度的乳酸锂溶液进行比对(其中乳酸锂均为新配溶液)。结果如下表7和表8所示。同样，从表7可知，经历一个月的加速实验后，不加组合保护剂的对照组电化学试条，在测定高浓度胆固醇的溶液时，电流值会明显降低，最高值相较于初始电流下降25～35％，而从表8可知，加入了保护剂的实验组电化学试条在测定高浓度胆固醇的溶液时，电流值也会降低，但降低幅度能控制在5～10％范围以内，有明显的改善效果，说明在此电化学反应体系中，三种保护剂同样能够有效提升NAD的生物稳定性。

表7：乳酸脱氢酶体系对照组试条检测结果

表8：乳酸脱氢酶体系实验组试条检测结果

上述不同的实施例说明，本发明提出的针对电化学试条体系中NAD稳定性提升的保护剂组合，在其他脱氢酶+NAD反应体系中具有一定的普适性。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述组合物由环糊精、电子介体结合物和聚乙烯吡咯烷酮组成，在含有脱氢酶的酶液中，所述环糊精的浓度为2～20mg/mL，所述电子介体结合物的浓度为0.5～1.5mg/mL，所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度为10～40mg/mL。

2.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述环糊精选自β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、2,6-二-O-甲基-β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述电子介体结合物选自羧甲基壳聚糖、羧化壳聚糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的提升辅酶NAD/NADH生物稳定性的组合物，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮选自聚乙烯吡咯烷酮6000、聚乙烯吡咯烷酮8000、聚乙烯吡咯烷酮10000中的一种或多种。

5.一种包含权利要求1-4任一所述的组合物的电化学试条。

6.根据权利要求5所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条的酶液中还包括电子介体，所述电子介体选自铁氰化钾、三氯化钌六水合物、三氯化六氨合钌中的一种或多种，所述电子介体在酶液中的浓度为20～40mg/mL。

7.根据权利要求5所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条的酶液中还包括NAD/NADH，所述NAD/NADH的浓度为2～15mg/mL。

8.根据权利要求5所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条中的脱氢酶选自3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶或乳酸脱氢酶中的一种。

9.根据权利要求8所述的电化学试条，其特征在于，所述电化学试条的酶液中还包括酶保护剂、表面活性剂和缓冲液，所述酶保护剂为海藻糖和BSA，所述表面活性剂为TritonX-100，所述缓冲液选自HEPES、领苯二甲酸氢钾、MES、甘氨酸、Tris或CAPS中的一种。

10.如权利要求1-4任一所述的组合物在提高辅酶NAD/NADH生物稳定性中的应用。

11.如权利要求1-4任一所述的组合物或权利要求5-9任一所述的电化学试条在检测3-羟基丁酸脱氢酶、胆固醇或乳酸中的应用。