CN117915960A

CN117915960A - 可用于布鲁顿酪氨酸激酶的pet成像的化合物

Info

Publication number: CN117915960A
Application number: CN202280058537.6A
Authority: CN
Inventors: D·J·唐纳利; A·J·阿连托夫; M·A·华莱士; S·J·博纳克斯; S·H·沃特森; J·A·帝诺
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2024-04-19
Also published as: JP2024534191A; EP4395841A1; KR20240054325A; US20240383871A1; WO2023034732A1

Abstract

公开了一种式(Ib)的化合物：所述式(Ib)的化合物可用于哺乳动物中布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的正电子发射断层显像(PET)成像。还公开了使用所述化合物作为布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的标记和诊断显像剂的方法，以及制备化合物(Ib)的方法。

Description

可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的化合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月30日提交的美国临时申请序列号63/238,255的权益，将所述临时申请以其整体并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及一种放射性标记的布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)化合物及其在哺乳动物的BTK的标记和诊断成像中的用途。

背景技术

正电子发射断层显像(PET)是一种非侵入性成像技术，其可以提供关于活体受试者中的生物过程的功能信息。成像和监测体内分子事件的能力可用于深入了解活体生物体中的生物化学和生理过程。这进而对于用于疾病的治疗、疾病的早期检测和新药物的设计的新型方法的开发是至关重要的。PET依赖于用正电子发射放射性同位素标记的分子的设计和合成。这些分子被称为放射性示踪剂或放射性配体。对于PET成像，最常用的正电子发射(PET)放射性核素是¹⁸F、¹¹C、¹⁵O和¹³N，它们都是回旋加速器产生的，并且分别具有110、20、2和10分钟的半衰期。在用正电子发射放射性核素放射性标记后，典型地通过静脉内(i.v.)注射将这些PET放射性配体施用于哺乳动物。一旦在体内，放射性配体就会衰变并且发射正电子，所述正电子行进一小段距离，直到它与电子结合。然后发生被称为湮灭事件的事件，所述事件产生两个共线光子，其中每个光子的能量为511keV。使用能够检测由放射性配体发射的γ辐射的PET成像扫描仪，平面图像和断层图像揭示出放射性示踪剂的分布随时间的变化。PET放射性配体提供了与人受体的靶标接合和剂量依赖性受体占据率有关的有用体内信息。

多发性硬化是一种中枢神经系统的慢性炎性脱髓鞘和神经退行性疾病。其特征是几种神经系统症状的复发或积累，并且在病理学上是区域单核细胞浸润、脱髓鞘伴有不完全髓鞘再生以及整个脑和脊髓中的轴突丧失。B细胞、T细胞和髓样细胞的活性和相互作用参与了多发性硬化的免疫病理学特征。激活的B细胞可以通过抗原呈递和细胞因子产生发挥效应子功能。巨噬细胞和小胶质细胞在多发性硬化中是丰富的，并且有助于组织损伤和损害组织修复。布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是酪氨酸蛋白激酶家族的成员，其通过多种B细胞受体和髓样细胞传递信号。最近，已经研究了BTK抑制剂作为多发性硬化的潜在治疗方法(Nature Biotechnology Vol.39(1),3-5(2021))。

美国专利号9,802,915B2披露了可用作BTK抑制剂的化合物，用于治疗BTK依赖性或BTK介导的病症或疾病(诸如多发性硬化)。

与支持成像技术结合使用对BTK具有高亲和力的特定PET放射性配体提供了用于围绕BTK抑制剂的靶标接合和剂量/占据率关系两者在人脑或表达此靶标的其他器官(诸如脾脏、肾脏、肝脏或心脏)的临床演变的方法。

含有短寿命的放射性核素的PET化合物的制备需要合成PET化合物，将其纯化，配制成药物剂量并且在短时间段内施用于患者，以便使通过放射性核素标记的放射性衰变的损失最小化。希望的是所用放射性核素的制备时间大体上是2-3个物理半衰期。PET化合物的较长制备时间导致在施用于患者之前放射性核素标记的损失增加，并且可能导致需要使用较高剂量的PET化合物。

PET分子的选择部分地取决于在合成过程的最后阶段将短寿命的PET放射性核素掺入PET分子中的位置的能力。在回旋加速器中产生PET放射性核素之后，分离出含有PET放射性核素的放射性分子，并且然后以需要最少量时间的最小数目的合成步骤将其快速掺入PET分子前体中。在合成的最后阶段中掺入PET放射性核素还允许合成化学家在合成的早期阶段使用非放射性材料来工作，并且限制放射性材料的处理直到最后的合成阶段。直到最后的合成阶段之前，不需要使用特殊设备和保护程序来处理放射性材料。

碳-11的半衰期是20分钟。用碳-11标记需要快速且高效的方法来最大化放射性示踪剂的产率(等人,Journal of Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals 2007,50:794-810；Dahl等人,Clin Transl Imaging(2017)5:275-289)。

仍然需要可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的放射性标记的化合物。

此外，需要可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的放射性标记的化合物，其可以在所用放射性核素的三个或少于三个物理半衰期的时间范围内合成、纯化、配制和施用于患者。

此外，需要对BTK具有高亲和力的可用于PET成像的放射性标记的化合物。

而且此外，仍然需要对BTK具有高亲和力的放射性标记的化合物，其具有跨过脑血屏障的能力以用于脑中布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像。

发明内容

本发明通过提供¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物来满足上述需要，所述化合物将可用于体外和体内两者的探索性和诊断性成像应用以及用于使用放射性标记的和未标记的BTK抑制剂的竞争研究。

申请人已发现可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物。

申请人已发现可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物，其可以在所用放射性核素的三个或少于三个物理半衰期的时间范围内被合成、纯化、配制和施用于患者。

申请人已发现可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物，其对BTK具有高亲和力。

申请人已发现可用于布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像的¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物，其具有跨过脑血屏障的能力以用于脑中布鲁顿酪氨酸激酶的PET成像。

本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物以及药学上可接受的载体。

本发明还提供了使用¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物对哺乳动物组织中的BTK表达进行成像的方法。

本发明还提供了用于制备¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物的方法。

随着本公开文本的继续，本发明的这些和其他特征将以扩展的形式阐述。

附图说明

图1：使用方法A纯化[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的代表性半制备型HPLC色谱图。在注射到HPLC上后的8.5-9.5分钟之间分离[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。

图2：[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺和(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺(非放射性参考标准品)的共注射，使用分析型反相HPLC。使用此HPLC分析方法，峰在0.1分钟内共洗脱。

图3：使用方法A纯化[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的代表性半制备型HPLC色谱图。在注射到HPLC上后的9-10.5分钟之间分离[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。

图4：[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺PET信号的标准摄取值(SUV)，显示出在2只EAE诱导的小鼠中，配体保留在小鼠脑的EAE病变区域内。左柱指示在施用配体后50分钟，小鼠脑病变区域内的SUV值。右柱指示在相同动物中施用配体后50分钟，小鼠脑病变区域内的后续SUV值。在第二次施用PET配体后24小时后获取这些后续图像。每组柱表示来自单独小鼠的数据。

图5：示出了[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的脑积累(从PET配体施用后20-50min的SUV)的代表性PET图像，(A)WT小鼠中的基线，(B)EAE诱导的小鼠中的基线。圆圈指示每只动物的脑区域，并且由在病变区域中测量的SUV与在脑的病变区域之外的区域中的SUV相比计算对比度，该对比度为4.7:1。

图6：来自EAE诱导的小鼠的脑中PET图像定量的代表性柱状图。在这项研究中定义了两个感兴趣区域，病变区域和病变外部的脑区域，示出了[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的脑积累(来自PET配体施用后50分钟的SUV)。左柱表示脑内的病变区域。下一个柱表示给药组(5或0.5mg/kg BTK抑制剂)过程中的病变区域。右柱表示在基线处小鼠脑内在病变区域之外的代表性ROI。柱表示在BTK抑制剂给药过程中小鼠脑内在病变区域之外的代表性ROI。

图7：代表性恒河猴图像和[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺在健康NHP中在基线处的TAC。圆圈区域指示在PET扫描图像内NHP的脑区域。

本公开文本部分地基于这样的认识，即放射性标记的布鲁顿酪氨酸激酶(在下文为“BTK”)抑制剂可用于在哺乳动物物种的组织中BTK和/或BTK表达和/或化合物占据BTK受体的亲和力的检测和/或定量和/或成像。已经发现，当施用于哺乳动物物种时，放射性标记的BTK抑制剂积聚在BTK处或占据BTK并且可以通过成像技术检测，从而为组织中BTK的存在、化合物占据BTK的亲和力、和BTK抑制剂的临床评价和剂量选择提供有价值的诊断标记物。另外，本文公开的放射性标记的BTK抑制剂可以用作研究工具，以在体内通过未标记的药物与放射性标记的药物之间结合至受体的竞争来研究未标记的BTK抑制剂与BTK的相互作用。这些类型的研究可用于确定BTK受体占据率与未标记的BTK抑制剂的剂量之间的关系，以及用于研究各种剂量的未标记的BTK抑制剂阻断结合位点的持续时间。

作为临床工具，放射性标记的BTK抑制剂可以用于帮助限定BTK抑制剂的临床有效剂量。在动物实验中，放射性标记的BTK抑制剂可以用于提供信息，所述信息可用于在选择用于临床开发的潜在药物候选者之间进行选择。放射性标记的BTK抑制剂还可以用于研究在人和动物的活体肺组织和其他组织(诸如肾脏、心脏、肝脏和皮肤)中和在组织样品中BTK的区域分布和浓度。它们可以用于研究疾病或BTK浓度的药理学相关变化。

具体实施方式

WO 2016/065226披露了在实施例95中的作为外消旋混合物的非PET标记的化合物4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺；和在实施例153和154中的两种单独对映异构体。实施例154是非PET标记的(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺，并且在本文中称为“化合物(Ia)”。化合物(Ia)的结构为：

WO 2016/065226披露了用于实施例154的BTKIC₅₀抑制值为0.10nM。

本发明的第一方面提供了具有以下结构的式(Ib)的化合物：

式(Ib)的化合物是¹¹C放射性标记的BTK抑制剂化合物，并且在本文中也称为“化合物(Ib)”。化合物(Ib)的化学名称是[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。

本发明的第二方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供了使用式(Ib)的化合物进行成像、筛选和/或监测的方法。

本发明的第四方面提供了制备式(Ib)的化合物的方法。

如本文所用，术语“化合物(I)”是指化合物(Ia)和化合物(Ib)的混合物。化合物(I)包括具有从零摩尔％化合物(Ia)和100摩尔％化合物(Ib)的混合物至具有100摩尔％化合物(Ia)和零摩尔％化合物(Ib)的混合物。例如，化合物(I)包括以下的混合物：1摩尔％化合物(Ia)和99摩尔％化合物(Ib)；5摩尔％化合物(Ia)和95摩尔％化合物(Ib)；10摩尔％化合物(Ia)和90摩尔％化合物(Ib)；20摩尔％化合物(Ia)和80摩尔％化合物(Ib)；30摩尔％化合物(Ia)和70摩尔％化合物(Ib)；40摩尔％化合物(Ia)和60摩尔％化合物(Ib)；50摩尔％化合物(Ia)和50摩尔％化合物(Ib)；70摩尔％化合物(Ia)和30摩尔％化合物(Ib)；80摩尔％化合物(Ia)和20摩尔％化合物(Ib)；90摩尔％化合物(Ia)和10摩尔％化合物(Ib)；95摩尔％化合物(Ia)和5摩尔％化合物(Ib)；和100摩尔％化合物(Ia)和0摩尔％化合物(Ib)。

如本文所用，术语“化合物(I)的摩尔活度”是指测量放射性活度/摩尔化合物(I)。摩尔活度的合适单位包括千兆贝可/摩尔(GBq/mol)。

如本文所用，术语“化合物(I)的比活度”是指测量放射性活度/克化合物(I)。摩尔活度的合适单位包括千兆贝可/毫克(GBq/mg)。

药物组合物

本发明的第二方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体的例子包括无菌盐水溶液、乙醇和抗坏血酸钠。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含式(Ib)的化合物和药学上可接受的载体，其中所述式(Ib)的化合物的剂量在0.2μg至100μg的范围内。该实施方案中包括包含式(Ib)的化合物的药物组合物，其中所述剂量在0.5μg至90μg的范围内。该实施方案中还包括包含式(Ib)的化合物的药物组合物，其中所述剂量在1μg至75μg的范围内。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含5至25毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含5至22毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含5至20毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含7至20毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含10至20毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含7至15毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含10至15毫居里的式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含0.2μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含0.2μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含0.5μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含0.5μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含1μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含1μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含2μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含2μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含5μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含5μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含10μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含10μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含15μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含15μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含20μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含20μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含30μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含30μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含40μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含40μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含50μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。该实施方案包括药物组合物，所述药物组合物包含50μg至100μg化合物(Ib)以及药学上可接受的载体。

根据本发明的一个实施方案，提供了药物和诊断组合物。此类药物或诊断组合物包含式(Ib)的化合物；以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，式(Ib)的化合物分别以治疗有效量和诊断有效量存在于药物和诊断组合物中。

使用方法

本公开文本部分地基于这样的认识，即放射性标记的布鲁顿酪氨酸激酶(在下文为“BTK”)抑制剂可用于在哺乳动物物种的组织中BTK和/或BTK表达和/或化合物占据BTK受体的亲和力的检测和/或定量和/或成像。已经发现，当施用于哺乳动物物种时，放射性标记的BTK抑制剂积聚在BTK处或占据BTK并且可以通过成像技术检测，从而为组织中BTK的存在、化合物占据BTK的亲和力、和BTK抑制剂的临床评价和剂量选择提供有价值的诊断标记物。另外，本文公开的放射性标记的BTK抑制剂可以用作研究工具，以在体内通过未标记的药物与放射性标记的药物之间结合至受体的竞争来研究未标记的BTK抑制剂与BTK的相互作用。这些类型的研究可用于确定BTK受体占据率与未标记的BTK抑制剂的剂量之间的关系，以及用于研究各种剂量的未标记的BTK抑制剂占据结合位点的持续时间。

作为临床工具，放射性标记的BTK抑制剂(式(Ib)的化合物)可以用于帮助限定BTK抑制剂的临床有效剂量。在动物实验中，放射性标记的BTK抑制剂可以用于提供信息，所述信息可用于在选择用于临床开发的潜在药物候选者之间进行选择。放射性标记的BTK抑制剂还可以用于研究在人和动物的活体脑组织、肺组织和其他组织(诸如肾脏、心脏、肝脏和皮肤)中和在组织样品中BTK的区域分布和浓度。它们可以用于研究疾病或BTK浓度的药理学相关变化。

一个实施方案提供了一种对具有已知BTK表达的哺乳动物组织进行体内成像的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向哺乳动物物种施用式(Ib)的放射性标记的化合物；以及

(b)通过正电子发射断层显像(PET)扫描对所述放射性标记的化合物的分布进行体内成像。

该实施方案包括具有已知BTK表达的哺乳动物活体脑组织的体内成像方法。另外，该实施方案中包括具有已知BTK表达的人活体脑组织的体内成像方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中BTK的结合位点的亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向哺乳动物物种施用式(Ib)的放射性标记的化合物；

(b)通过正电子发射断层显像(PET)对具有已知BTK表达的组织进行体内成像以确定所述放射性标记的化合物的基线摄取；

(c)向所述哺乳动物物种施用所述非放射性标记的化合物；

(d)向所述哺乳动物物种施用第二剂量的式(Ib)的放射性标记的化合物；

(e)对所述式(Ib)的放射性标记的化合物在所述表达BTK的组织中的分布进行体内成像；

(f)将在所述表达BTK的组织中在所述基线处来自PET扫描数据的信号与在所述表达BTK受体的组织中在施用所述非放射性标记的化合物后检索的PET扫描数据进行比较。

该实施方案包括用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中BTK结合位点的亲和力的方法，其中所述哺乳动物组织是人组织。该实施方案包括用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中BTK结合位点的亲和力的方法，其中所述哺乳动物组织是人脑组织。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于监测正在用BTK抑制剂治疗的哺乳动物患者的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述患者施用式(Ib)的放射性标记的化合物；

(b)通过正电子发射断层显像(PET)获得所述患者的表达BTK的组织的图像；以及

(c)检测所述放射性标记的化合物占据所述BTK的结合位点到什么程度。

(a)向所述患者施用式(Ib)的放射性标记的化合物；

(b)通过正电子发射断层显像(PET)获得所述患者的表达BTK的脑组织的图像；以及

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于组织成像的方法，所述方法包括以下步骤：使含有BTK的组织与式(Ib)的放射性标记的化合物接触，以及使用正电子发射断层显像(PET)成像检测所述放射性标记的化合物。在这种方法中，可以体外或体内检测放射性标记的化合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于诊断哺乳动物物种的多发性硬化的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向有需要的哺乳动物物种施用式(Ib)的放射性标记的化合物，所述式(Ib)的放射性标记的化合物结合至与所述多发性硬化疾病的存在相关的BTK；以及

(b)获得所述哺乳动物物种的至少一部分的放射图像以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述疾病的存在或不存在。

(b)获得所述哺乳动物物种脑组织的PET扫描或放射自显影图以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述疾病的存在或不存在。

(a)向有需要的哺乳动物物种施用式(Ib)的放射性标记的化合物，所述式(Ib)的放射性标记的化合物结合至与多发性硬化的存在相关的BTK；

(b)检测针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射；

(c)将来自针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射与标准值进行比较；以及

(d)找到针对所述哺乳动物物种检测到的放射性发射相比于标准值之间的任何显著偏差，并且将所述偏差归因于所述多发性硬化。

该实施方案包括用于诊断多发性硬化的存在的方法，其中在哺乳动物物种的脑组织中检测步骤(b)中哺乳动物物种的放射性标记的化合物的放射性发射。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于定量哺乳动物物种的患病细胞或组织的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向具有患病细胞或组织的哺乳动物物种施用式(Ib)的放射性标记的化合物，所述放射性标记的化合物结合至位于所述患病细胞或组织内的BTK；以及

(b)检测所述患病细胞或组织中所述放射性标记的化合物的放射性发射，其中所述放射性发射在所述患病细胞或组织中的水平和分布是所述患病细胞或组织的定量测量。

该实施方案包括用于定量哺乳动物物种中患病细胞或组织的方法，其中所述患病细胞或组织是患病脑细胞或脑组织。

式(Ib)的化合物是放射性标记的BTK抑制剂，其可用作具有BTK亲和力的正电子发射分子。如本文所用的术语“放射性标记的BTK抑制剂”是指式(Ib)的化合物。

在另一个实施方案中，本公开文本提供了一种用于成像BTK的诊断组合物，所述诊断组合物包含放射性标记的BTK抑制剂(即，式(Ib)的化合物)和药学上可接受的载体。在仍另一个实施方案中，本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含放射性标记的BTK抑制剂(即，式(Ib)的化合物)和药学上可接受的载体。在又另一个实施方案中，本公开文本提供了一种具有已知BTK表达的哺乳动物组织的放射自显影的方法，所述方法包括以下步骤：向哺乳动物物种施用放射性标记的BTK抑制剂，通过正电子发射断层显像获得所述组织的图像，以及检测所述组织中的放射性标记的化合物以确定所述组织的BTK抑制剂靶标接合和BTK抑制剂受体占据率。

当被适当的放射性核素标记时，放射性标记的BTK抑制剂潜在地可用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究、和放射疗法应用。可能的诊断成像和放射疗法应用的具体例子包括确定BTK的位置、相对活性和/或定量；BTK抑制剂的放射免疫测定；以及用于确定在哺乳动物或其器官或组织样品中BTK的分布的放射自显影。

特别地，本发明的放射性标记的BTK抑制剂可用于在活体人和实验动物的脑、脾脏以及其他器官中BTK的正电子发射断层显像(PET)成像。此放射性标记的BTK抑制剂可以用作研究工具，以在体内通过未标记的药物与放射性标记的化合物之间结合至激酶结合位点的竞争来研究未标记的BTK抑制剂与BTK的相互作用。这些类型的研究可用于确定BTK占据率与未标记的BTK抑制剂的剂量之间的关系，以及用于研究各种剂量的未标记的BTK抑制剂对受体的阻断持续时间。作为临床工具，放射性标记的BTK抑制剂可以用于帮助限定BTK抑制剂的临床有效剂量。在动物实验中，放射性标记的BTK抑制剂可以用于提供信息，所述信息可用于在选择用于临床开发的潜在药物候选者之间进行选择。放射性标记的BTK抑制剂还可以用于研究在人脑、脾脏和活体实验动物的其他器官中以及在组织样品(包括健康和患病组织，诸如肿瘤)中BTK的区域分布和浓度。放射性标记的BTK抑制剂还可以用于研究疾病或BTK浓度的药理学相关变化。

例如，正电子发射断层显像(PET)示踪剂(诸如本发明的放射性标记的BTK抑制剂)可以与目前可用的PET技术一起使用，以获得以下信息：候选BTK抑制剂的受体占据率水平与患者的临床功效之间的关系；在开始长期临床研究之前，BTK抑制剂临床试验的剂量选择；结构上BTK抑制剂的比较效力；研究在用BTK抑制剂治疗临床靶标期间，BTK抑制剂对体内转运蛋白亲和力和密度的影响；在多发性硬化和癌症的有效和无效治疗期间BTK的密度和分布的变化。

本发明的放射性标记的BTK抑制剂可用于成像BTK以关于与BTK相关的多种障碍进行诊断成像。

对于本发明化合物作为探索性或诊断性成像剂的用途，可以根据标准药物实践将放射性标记的化合物在药物组合物中单独地或优选在药物组合物中与药学上可接受的载体或稀释剂、任选地与已知佐剂(诸如明矾)组合地施用于哺乳动物、优选人。此类组合物可以口服或非肠道地施用，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠和局部施用途径。优选地，施用是静脉内的。BTK PET放射性配体是用短寿命的正电子发射放射性核素标记的放射性示踪剂，并且因此经由在其合成的少于一小时内经由静脉内注射来施用。这是必要的，因为所涉及的放射性核素的半衰期短。当将本发明的放射性标记的BTK PET放射性配体施用于人受试者时，成像所需的量通常将由处方医师确定，其中剂量通常根据从放射性核素的发射的量而变化。然而，在大多数情况下，有效量将是足以产生在约1-20mCi范围内的发射的化合物量。在一个示例性应用中，施用以在注射到哺乳动物中的0.5-20mCi的总放射性活度之间的量进行，取决于受试者的体重。上限由在啮齿动物或非人类灵长类动物中放射性标记的分子的剂量测定来设置。

当在临床上对患者进行PET成像研究时，可以使用以下说明性程序。将患者在实验日之前的某个时间用未标记的BTK抑制剂预先用药，并且禁食至少12小时，允许随意摄入水。将20G两英寸静脉导管插入对侧尺骨静脉中，用于放射性示踪剂施用。PET示踪剂的施用时间通常与在血液中BTK抑制剂浓度的最大值(T_max)或最小值(T_min)的时间相符。

将患者定位在PET照相机中，并且经由静脉内导管施用示踪剂剂量的放射性标记的BTK抑制剂，诸如化合物(Ib)(<20mCi)。在整个PET扫描过程中以适当的时间间隔取得动脉或静脉血液样品，以便分析和定量血浆中[¹¹C]化合物(Ib)的未代谢PET示踪剂的分数。获取图像长达120min。在注射放射性示踪剂的十分钟内和在成像时段的结束时，获得1mL血液样品以确定可能已经在PET示踪剂之前施用的任何BTK抑制剂的血浆浓度。

通过图像重构来获得断层图像。为了确定放射性示踪剂的分布，在重构图像上绘制感兴趣区域(ROI)，包括但不限于脑、脾脏、肿瘤、肺、肝脏、心脏、肾脏、皮肤或其他器官和组织。使用在这些区域中随时间的放射性示踪剂摄取来生成在不存在任何干预的情况下或在未标记的BTK抑制剂的存在下在所检查的各种给药模式下获得的时间活度曲线(TAC)。数据表示为放射性活度/单位时间/单位体积(μCi/cc/mCi注射剂量)。用本领域众所周知的各种方法处理TAC数据以产生与感兴趣区域内未被占据的BTK的密度成比例的定量参数，诸如结合潜力(BP)或分布体积(V_T)。然后基于与未用药状态下的BP或V_T相比在BTK或BTK抑制剂的存在下在各种给药模式下通过平衡分析BP或V_T的变化来计算BTK抑制剂的抑制。通过绘制以上数据与BTK抑制剂的剂量(浓度)的关系，生成抑制曲线。然后基于与在未用药状态下的BP或V_T相比可以通过在E_max、T_max或T_min时阻断药物达到的PET放射性配体的V_T或BP的最大降低和在BTK抑制剂的存在下在各种给药模式下其非特定分布体积(V_ND)和BP的变化来计算BTK抑制剂的抑制。ID₅₀值通过曲线拟合剂量-速率/抑制曲线获得。

本公开文本进一步涉及一种用于对有需要的哺乳动物中的BTK进行诊断成像的方法，所述方法包括以下步骤：将放射性标记的BTK抑制剂与药物载体或赋形剂组合。

用于制备式(Ib)的化合物的方法

一个实施方案提供了一种制备[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使[¹¹C]CO₂和乙烯基溴化镁反应以提供具有式(II)的结构的[¹¹C]-丙烯酸：

以及

(b)使所述[¹¹C]-丙烯酸和(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺反应以提供[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。

方案1-方法A

方法A：一般条件：a)5℃，在THF中持续5min，[¹¹C]CO₂流速5-6mL/min，然后加热至25℃持续2min。25℃，在DMF中的2％TFA持续1min。b)25℃，2,6二甲基吡啶、HBTU、DMF中持续8min。

一个实施方案提供了一种制备[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：使[¹¹C]CO和碘化乙烯与乙烯基溴化镁在(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺的存在下反应以提供[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。

方案2-方法B

方法B：一般条件：a)N XantPhos、碘化乙烯、Pd(dba)₂、THF，25℃，在不锈钢回路中5min。

本发明可以在不脱离其精神或本质属性的情况下以其他特定形式实施。本发明涵盖本文所述的本发明的方面和/或实施方案的所有组合。应当理解，本发明的任何和所有实施方案可以与任何其他一个或多个实施方案结合来描述另外的实施方案。还应当理解，实施方案的每个单独的要素都意在与来自任何实施方案的任何和所有其他要素组合来描述另外的实施方案。

在阅读以下详细描述后，本领域普通技术人员可以更容易地理解本发明的特征和优点。应当理解，出于清楚原因而在前后不同实施方案中描述的本发明某些特征也可以组合成单个实施方案。相反，出于简洁的原因，在单个实施方案的上下文中所描述的本发明的各种特征也可以组合以形成其子组合。在本文中标识为示例性或优选的实施方案旨在是说明性的而非限制性的。

除非另有说明，否则本申请(包括说明书和权利要求)中使用的以下术语具有下面给出的定义。必须指出，如在说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。

除非另有指示，否则使用质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。本文使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。

如本文所用的关于配制品、组合物或成分的术语“可接受的”意指对所治疗的受试者的总体健康没有持久的有害作用。

如本文所用的术语“调节”意指与靶标直接或间接相互作用，以便改变靶标的活性，仅以举例的方式包括增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性、或扩展靶标的活性。

除非另外指示，否则具有不饱和化合价的任何原子均被假定为具有足以满足化合价的氢原子。

本文阐述的定义优先于通过引用并入本文的任何专利、专利申请和/或专利申请公开案中阐述的定义。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断的范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

式(Ib)的化合物可以作为无定形固体或结晶固体来提供。可以采用冻干来提供呈固体的式(Ib)的化合物。

还应当理解，式(Ib)的化合物的溶剂化物(例如，水合物)也在本发明的范围内。术语“溶剂化物”意指式(Ib)的化合物与一个或多个溶剂分子(无论是有机的还是无机的)的物理缔合。此物理缔合包括氢键。在某些情况下，溶剂化物将是能够分离的，例如当一个或多个溶剂分子被掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离溶剂化物两者。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇化物、甲醇化物、异丙醇化物、乙腈溶剂化物和乙酸乙酯溶剂化物。溶剂化方法在本领域中是已知的。

各种形式的前药是本领域众所周知的，并且描述于Rautio,J.等人,NatureReview Drug Discovery,17,559-587(2018)中。

另外，可以分离并且纯化式(Ib)的化合物(在其制备之后)，以获得含有按重量计等于或大于99％的量的式(Ib)的化合物(“基本上纯的”)的组合物，然后将所述组合物如本文所述使用或配制。此类“基本上纯的”式(Ib)的化合物在本文中也被考虑作为本发明的一部分。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防症状、并发症、病症或与疾病相关的生化指标的进展、发展、严重程度或复发。相比之下，“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指向未患疾病的受试者施用以预防疾病的发生。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”不涵盖“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”。

“治疗有效量”旨在包括单独的本发明化合物的量，或所要求保护的化合物的组合的量，或与有效于在细胞中降低Helios蛋白水平、降低Helios活性水平和/或抑制Helios表达水平或有效于治疗或预防病毒感染和增殖性障碍(诸如癌症)的其他活性成分相组合的本发明化合物的量。

如本文所用，术语“细胞”意在指代体外、离体或体内的细胞。在一些实施方案中，离体细胞可以是从生物体(诸如哺乳动物)切离的组织样品的一部分。在一些实施方案中，体外细胞可以是在细胞培养物中的细胞。在一些实施方案中，体内细胞是生活在生物体(诸如哺乳动物)中的细胞。

术语“患者”包括接受治疗性治疗或预防性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文公开的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，受试者是人受试者。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料，其参与将主题化合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一个器官或身体部分。每种载体都必须是在以下意义上“可接受的”：与配制品的其他成分相容，所述其他成分包括：即，佐剂、赋形剂或媒介物，诸如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调节剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、加香剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分配剂，取决于施用方式和剂型的性质；并且对患者无害。

术语“药物组合物”意指包含本发明的化合物与至少一种另外的药学上可接受的载体的组合的组合物。

效用

式(I)的化合物可用于治疗克罗恩病、溃疡性结肠炎、哮喘、特应性皮炎、格雷夫斯病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病、多发性硬化、舍格伦综合征、阿尔茨海默病和帕金森病。

在一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物和一种或多种另外的治疗剂的组合制剂，其用于在与布鲁顿酪氨酸激酶相关的多种疾病或障碍的治疗和/或预防中同时、分开或顺序使用。所述组合制剂可以用于抑制布鲁顿酪氨酸激酶。

药物组合物

本发明还提供了药学上的组合物，所述组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的式(Ib)的化合物，以及任选地如上所述的一种或多种另外治疗剂。

式(Ib)的化合物可以经由任何药学上可接受且合适的可注射形式静脉内、皮下和/或肌内施用。示例性的可注射形式包括但不限于例如无菌水溶液，所述无菌水溶液包含可接受的媒介物和溶剂，例如像水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液；无菌水包油微乳剂；以及水性或油性混悬剂。

用于肠胃外施用的配制品可以呈水性或非水性等渗无菌注射溶液或混悬剂形式。这些溶液和混悬剂可以使用提及用于在供口服施用的配制品中使用的一种或多种载体或稀释剂或者通过使用其他合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。可以将化合物溶解于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠、黄芪胶和/或各种缓冲液中。其他佐剂和施用方式在制药领域中是众所周知的。活性成分也可以作为与合适的载体(包括盐水、右旋糖或水)或与环糊精(即，Captisol)、共溶剂增溶物(即，丙二醇)或胶束增溶物(即，Tween 80)的组合物通过注射施用。

无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规地将无菌的非挥发性油用作溶剂或助悬介质。为此目的，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸诸如油酸可用于制备可注射剂。

药学上可接受的载体是根据本领域普通技术人员认知范围内的许多因素来配制。这些因素包括而不限于所配制的活性剂的类型和性质；待被施用含有药剂的组合物的受试者；组合物的预期施用途径；以及所靶向的治疗适应证。药学上可接受的载体包括水性和非水性液体介质两者、以及多种固体和半固体剂型。此类载体还可以包括除活性剂之外的许多不同的成分和添加剂，此类另外的成分出于本领域普通技术人员众所周知的多种原因(例如，活性剂、粘合剂等的稳定化)被包括在配制品中。合适的药学上可接受的载体的描述及其选择涉及的因素发现于各种可容易获得的来源，例如像Allen,L.V.Jr.等人Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2卷),第22版(2012),Pharmaceutical Press。

本发明的药物组合物包含至少一种式(Ib)的化合物和任选的选自任何药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的另外药剂。本发明的替代组合物包含本文所述的式(Ib)的化合物或其前药和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。

所选剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的式(Ib)的特定化合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄或代谢速率、吸收速率和程度、治疗的持续时间、与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和先前病史以及医学领域中众所周知的类似因素。

当与式(Ib)的化合物组合使用时，以上其他治疗剂可以例如以在Physicians'Desk Reference(PDR)中指示的那些量来使用，或者如由本领域普通技术人员以其他方式确定的那些量来使用。在本发明的方法中，所述一种或多种其他治疗剂可以在施用本发明化合物之前、同时或之后施用。

缩写列表

Bp 结合潜力

BTK 布鲁顿酪氨酸激酶

[¹¹C]CO₂ 碳-11标记的二氧化碳

[¹¹C]CO 碳-11标记的一氧化碳

CFA 完全弗氏佐剂

CT 计算机断层显像

DMF 二甲基甲酰胺

EAE 实验性自身免疫性脑脊髓炎

FBP 滤波反投影

FOV 视野

GBq 千兆贝可

h 小时

HPLC 高压液相色谱法

HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

IC₅₀ 半数最大抑制浓度

ID 注射剂量

IV 静脉内

MAP 最大后验

MBq 兆贝可

MOA 作用机制

MRI 磁共振成像

mCi 毫居里

mL 毫升

mm 毫米

min 分钟

NHP 非人灵长类动物

nM 纳摩尔

Nm 纳米

Pd(dba)₂ 钯(0)双(二亚苄基丙酮)

PET 正电子发射断层显像

PLP 蛋白脂质蛋白

ROI 感兴趣区域

S.C. 皮下

SJL Swiss Jim Lambert

SPE 固相萃取

SUV 标准摄取值

SD 标准差

t 1/2 半衰期的时间

TAC 时间-活度曲线

THF 四氢呋喃

TFA 三氟乙酸

Vnd 非特定分布体积

Vt 分布容积

WT 野生型

μCi 微居里

μL 微升

μm 微米

实施例

HPLC条件：

方法A：GE FXCPro HPLC和GE FXCProγram放射-HPLC检测器，使用以下方法：柱：Luna C18(2)，9.6x250mm，5-μm颗粒；流动相：等度：在0.1％三氟乙酸水溶液中的51％乙腈；流量：4.2mL/min；检测：在240nm处的UV。

方法B：Agilent 1100系列HPLC和Lab logicγram放射-HPLC检测器，使用以下方法，柱：Luna C18(2)-250x4.6mm-3-μm颗粒分析型HPLC柱；流动相A：0.1％TFA水溶液，B：在乙腈中的0.1％TFA。梯度法由以下组成：起始于5％B并且经15分钟线性梯度增加至85％B的溶液；流量：1.00mL/min；检测：在254nm处的UV。

方法C：Agilent 1100系列HPLC和Lab logicγram放射-HPLC检测器，使用以下方法：柱：Luna C18(2)-250x4.6mm，3-μm颗粒；流动相等度：在0.1％三氟乙酸水溶液中的51％乙腈；流量：1.0mL/min；检测：在254nm处的UV。

化合物(Ib)的合成

(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺可以根据WO 2016/065226中披露的用于中间体106的方法制备。

实施例1

通过方法A制备[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺

使用高性能[¹¹C]CO₂靶和GE PET微量回旋加速器，使用氮气(N60纯度级)和1％氧气的混合物，通过核反应¹⁴N(P,α)¹¹C产生[¹¹C]CO₂。在环境温度下，使用稳定的氦气流将[¹¹C]CO₂气体转移到分子筛柱中。在完成靶递送后，通过在350℃下和流速为7mL/分钟的氦气下加热分子筛柱，从所述柱中释放[¹¹C]CO₂气体。在5℃下将[¹¹C]CO₂捕集到含有乙烯基溴化镁(80μL，0.056mmol)和四氢呋喃(THF)(320μL)的小瓶中。在[¹¹C]CO₂转移完成后，将反应混合物温热至25℃并且搅拌2分钟。将反应混合物转移到含有在250μL二甲基甲酰胺(DMF)中的2％三氟乙酸(TFA)的中间小瓶中。将此溶液在环境温度下搅拌1分钟。将另外200μLDMF和50mL 2,6-二甲基吡啶转移到该小瓶中。将反应混合物搅拌。接下来，将全部体积的该溶液转移到含有100μL的2,6-二甲基吡啶的新中间小瓶中。在转移完成后，添加在200μLDMF中的2-(1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(V)(5mg，0.013mmol)(HBTU)。允许将反应混合物在环境温度下搅拌1分钟。接下来，将(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺(4mg，0.012mmol)溶解于200μLDMF和50μL 2,6-二甲基吡啶中的溶液添加到反应混合物中。将反应混合物在环境温度下再搅拌9.5分钟。接下来，将500μL DMF添加到反应混合物中，并且将全部样品转移到含有8mL去离子水样品的新中间小瓶中。将该样品装载到C18(360mg)固相萃取(SPE)柱筒上。在合成之前，将此柱筒用5mL乙腈，随后用10mL无菌注射用水预活化。在装载全部样品后，用1.4mL乙腈将SPE洗脱到含有0.6mL在去离子水中的0.1％TFA的样品中。将反应混合物装载到LunaC18(2)，5微米，9.6x250mm高压液相色谱(HPLC)柱上，并且使用HPLC方法A纯化方法纯化。在色谱图的9.5与10.5标记之间分离[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺，并且将样品收集到含有55mL的2mg/mL抗坏血酸钠水溶液的稀释烧瓶中，如图1所示。将溶液转移至HLB轻(30mg)SPE柱筒。在合成之前，将柱筒用5mL乙醇，然后用10mL无菌水预活化。转移后，将柱筒用0.7mL乙醇洗脱到含有4mL无菌注射用盐水的无菌产品小瓶中。分离出28mCi(1.04GBq)[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺，并且经由反相HPLC分析如图2所示：通过共注射非放射性标准品化学鉴定放射化学纯度和化学纯度、摩尔活度。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是99.9％放射性化学纯的，97％化学纯的，并且摩尔活度为1mCi/nmol(38MBq/nmol)。使用分析型反相HPLC来确定结构身份(structuralidentity)、放射性化学纯度和化学纯度，使用HPLC方法B。使用该方法，[¹¹C]-(R)-4-(2-(丙烯酰基-1)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的保留时间是12.03分钟。使用6点标准曲线(分析型HPLC峰面积(Y)对标准品浓度(X：nmol))确定摩尔活度。使用反相HPLC方法C确定拟合线方程。

该过程的总合成时间是40分钟，并且以3.7％衰减校正的产率分离产物。

实施例2

通过方法B制备[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺

使用高性能[¹¹C]CO₂靶和GE PET微量回旋加速器，使用氮气(N60纯度级)和1％氧气的混合物，通过核反应¹⁴N(P,α)¹¹C产生[¹¹C]CO₂。在环境温度下，使用稳定的氦气流将[¹¹C]CO₂气体转移到分子筛柱中。在完成靶递送后，通过在350℃下和流速为55mL/分钟的氦气下加热分子筛柱，从所述柱中释放[¹¹C]CO₂气体，并且将其递送到含有钼的石英管中。一旦[¹¹C]CO₂被捕集到钼粉末(350微米粒度99.9％纯)上，并且使用850℃炉将其还原为[¹¹C]CO。在液氮温度(-160℃)下，将[¹¹C]CO以55mL/min的流速从处理单元递送通过含有100mg硅胶(230-400目，60A)的不锈钢捕集器。在将[¹¹C]CO捕集在硅胶捕集器内之后，通过移除液氮捕集器2分钟将捕集器缓慢温热至环境温度。使用5mL/min的氦气将[¹¹C]CO转移到含有以下溶液的5mL HPLC不锈钢回路中。首先，将双(二亚苄基丙酮)钯(0)(2.7mg，4.70μmol)溶解在200μL THF中，并且将该溶液添加到n-Xantphos 97％样品(2.7mg，4.90μmol)中，并且在环境温度下将样品涡旋以溶解固体1分钟。向该溶液中添加5g 95％碘化乙烯(3μL，0.041mmol)，并且将所得溶液涡旋另外一分钟以确保前体材料的适当混合。向该溶液中添加(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺(1.7mg，5.04μmol)，并且将粗混合物涡旋30秒。在[¹¹C]CO递送到热室(hot cell)中前，将该溶液添加到不锈钢HPLC回路中。使用氦气以5mL/min从二氧化硅捕集器转移[¹¹C]CO，并且转移时间大致是20秒。反应在环境温度下在密封的2mL不锈钢HPLC回路中进行5分钟。将粗反应混合物加载到Luna C18(2)，5微米，9.6x250mm半制备型HPLC柱上，并且使用以下HPLC纯化方法A纯化。[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺在色谱图的9.5与10.5标记之间分离，并且将该样品收集到含有55mL 2mg/mL抗坏血酸钠水溶液的稀释烧瓶中，如图3所示。将该溶液转移至HLB轻(30mg)SPE柱筒。在合成之前，将该柱筒用5mL乙醇，然后用10mL无菌水预活化。转移后，将柱筒用0.7mL乙醇洗脱到含有4mL无菌注射用盐水的无菌产品小瓶中。分离130mCi(1.04GBq)[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺并且使用以下方法通过反相HPLC分析。用共注射的非放射性标准品化学鉴定放射化学纯度和化学纯度、摩尔活度。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是99.9％放射性化学纯的，97％化学纯的，并且摩尔活度为13mCi/nmol(481MBq/nmol)。使用分析型反相HPLC方法B来确定结构身份、放射化学纯度和化学纯度。使用该方法，[¹¹C]-(R)-4-(2-(丙烯酰基-1)-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的保留时间是12.03分钟。使用6点标准曲线(分析型HPLC峰面积(Y)对标准品浓度(X：nmol))确定摩尔活度。使用反相HPLC方法C确定拟合线方程。

从回旋加速器轰击结束，合成和纯化时间是大约33分钟，并且以42.3％衰减校正的产率分离产物。

[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺可以用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究和放射治疗应用。可能的诊断成像和放射疗法应用的具体例子包括确定位置、相对活性和/或定量BTK阳性组织、BTK阳性组织的放射免疫测定、以及用于确定在哺乳动物或其器官或组织样品中BTK阳性组织的分布的放射自显影。特别地，[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺可用于人和实验动物的脾脏、脑、心脏、肾脏、肝脏和皮肤等器官内BTK阳性组织的正电子发射断层显像(PET)成像。使用[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的PET成像可以用于获得以下信息：药剂中BTK抑制剂候选物的组织占据率水平与患者临床功效之间的关系；在开始长期临床研究之前，BTK抑制剂治疗药剂的临床试验的剂量选择；结构新颖的BTK抑制剂治疗药剂的比较效力；在用BTK抑制剂治疗药剂治疗临床靶标期间，研究BTK抑制剂治疗药剂对体内转运体亲和力和密度的影响；有效和无效治疗期间BTK阳性组织的密度和分布的变化。

测试[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺以确认其作为BTK PET放射性配体的特性。测试[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺以了解其对在野生型小鼠和PLP诱导的复发/缓解型EAE小鼠模型中的小鼠的脑组织内的BTK的特异性和靶向性。使用用蛋白脂质蛋白(PLP)免疫的一系列Swiss Jim Lambert(SJL)小鼠，诱导EAE诱导的复发/缓解模型。为了诱导复发/缓解型EAE小鼠模型，向SJL/J雌性小鼠(Harlan，9-11周/约20克)在背部(肩胛骨之间和右臀部上方)的2个部位(0.1ml/部位)注射在含有2mg/mL结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(Difco，密歇根州底特律)的完全弗氏佐剂(CFA)中的50μg小鼠PLP 139-151。两小时后，向小鼠腹膜内注射含有300ng百日咳毒素的100μL。两天后，另外向小鼠腹膜内注射100uL的300ng百日咳毒素。然后将小鼠放回其笼中，并且在实验持续时间内每天监测。在EAE诱导后第40-45天之间获得PET成像。将小鼠(EAE和WT)保持固定在PET成像系统(P4，Siemens Preclinical Solutions，田纳西州诺克斯维尔)机架内侧的动物支架中。扫描区域是大约从动物的鼻子向后朝向尾巴，以适合7.6cm MicroPET系统轴向视野(FOV)。出于发射PET图像的衰减校正的目的使用⁵⁷Co源对上述FOV执行进行10分钟的透射扫描，随后在PET研究中进行90分钟的动态发射扫描。每只动物通过尾静脉导管注射大约232μCi的[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。通过在基线成像研究后立即给予EAE小鼠5mg/kg或0.5mg/kg口服剂量，在EAE动物中完成阻断研究。在基线研究后24小时给予同一EAE小鼠另外5mg/kg或0.5mg/kg口服剂量。在第二次施用[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺后，遵循相同的图像获取程序在原始扫描后28小时获取药物上PET图像。使用具有衰减校正和放射性同位素衰减校正的最大后验(MAP)算法重构PET图像。用野生型和EAE小鼠脑两者的每个脑切片内手动绘制的感兴趣区域(ROI)对每只小鼠进行分析。在WT小鼠的脑中绘制单个ROI，并且在每只EAE小鼠的脑中绘制2个ROI(疑似EAE病变区域和背景脑区域)。基于这些ROI计算标准摄取值，并且生成时间-活度曲线(TAC)以确定在成像时间点过程中的示踪剂摄取。使用该方法，在EAE诱导后40-45天，对EAE小鼠进行测试/再测试PET研究。2只EAE动物接受基线PET图像和后续基线成像研究(仅PET配体注射)。[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的获取数据总结在表1中：

表1：在啮齿类动物中的[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺PET成像的获取数据

这些研究的结果示出于图(4-6)中。如图4所示，这些结果表明在两次获得的PET成像扫描中在EAE病变区域内的PET配体摄取类似。在第一次基线扫描时在EAE病变内测量到0.073SUV，并且在后续基线扫描时相同病变区域测量到0.064SUV。在另一只EAE动物中观察到类似的结果，基线时在EAE病变内测量到0.126SUV，后续基线扫描时测量到0.11SUV。这些结果显示该PET配体的扫描之间13％的变异性，所述变异性是在PET配体成像扫描中看到的典型变化内。

图4：[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺PET信号的标准摄取值(SUV)，显示出在2只EAE诱导的小鼠中，配体保留在小鼠脑的EAE病变区域内。蓝色柱指示在施用配体后50分钟，小鼠脑病变区域内的SUV值。红色柱指示在相同动物中施用配体后50分钟，小鼠脑病变区域内的后续SUV值。在第二次施用PET配体后24小时后获取这些后续图像。每组柱表示来自单独小鼠的数据。

图5示出了WT和EAE小鼠中PET配体的脑积累的代表性PET图像。在WT小鼠中，在非患病状态下BTK的脑表达非常低。[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺TAC展示出快速的脑渗透，随后随着药物被清除而快速洗出。图5也强调了这一点，在放射性配体施用后20-50分钟之间，只有[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的背景水平保留在脑中。与非患病小鼠相反，EAE小鼠中的PET成像研究表明，在药物从脑中洗出后，在对应于延髓侧面的区域中配体的病灶保留是明显的，其中在该EAE动物模型中典型地观察到炎性病变。图5还展示了[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺在EAE小鼠脑内病变区域内的病灶保留被测量为具有0.141的SUV，相比之下脑外区域具有0.03的SUV，导致对比度为4.7:1。该结果表明，可以使用PET成像将EAE小鼠脑内的这些病变区域可视化。为了评估BTK抑制剂药物靶标接合和小鼠脑EAE病变中BTK PET信号的剂量依赖性位移，EAE诱导的动物接受了基线(仅PET配体)扫描，使用[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺。接下来，在同一动物中在口服给药两剂BTK抑制剂(5mg/kg或0.5mg/kg，每个剂量组n＝3)后，获得第二次施用[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺和连续PET扫描。在第二次示踪剂注射前28小时进行口服给药并且再次在4小时进行口服给药。图6示出了用于靶标接合的这2个单独剂量组的结果。在第一给药组中，在基线处扫描动物，并且在这些小鼠的病变区域内显示平均SUV为0.14并且在该区域外显示SUV为0.039。在2次口服剂量的5mg/kg的BTK抑制剂后，病变区域内的平均SUV降低至0.05，而疑似区域外的强度在很大程度上保持不变。该剂量组的平均位移百分比在疑似病变中为89％。在0.5mg/kg剂量组下完成类似的研究，其导致EAE小鼠的病变区域内的SUV为0.09。在0.5mg/kg剂量水平下阻断后，疑似病变中平均位移百分比为39％。这些结果表明，在EAE诱导的小鼠的脑病变内，可以用这种¹¹C标记的BTK PET配体测量BTK抑制剂的剂量依赖性靶标接合。

图6：来自EAE诱导的小鼠的脑中PET图像定量的代表性柱状图。在这项研究中定义了2个ROI，病变区域和病变外部的脑区域，示出了[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺的脑积累(来自PET配体施用后50分钟的SUV)。红色柱表示脑内的病变区域。蓝色柱表示给药组(5或0.5mg/kg BTK抑制剂)过程中的病变区域。绿色柱表示在基线处小鼠脑内在病变区域之外的代表性ROI。黄色柱表示在BTK抑制剂给药过程中小鼠脑内在病变区域之外的代表性ROI。

实施例5：用[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺在恒河猴的体内PET成像以确定BTK抑制剂的脑渗透性。

将非人灵长类动物保持固定在PET成像系统(P4，SiemensPreclinical Solutions，田纳西州诺克斯维尔)机架内侧的扩展成像床中。扫描区域是大约从头骨顶部开始并且延伸穿过下颈部区域的单床位置，以适合7.6cm MicroPET系统轴向FOV。为了对随后的发射图像进行衰减校正的目的，使用⁵⁷Co点源获取10分钟的透射扫描。静脉内注射大约0.96mCi的[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺并且获得60分钟动态PET图像。使用滤波反投影(FBP)或具有衰减校正的MAP算法重构PET图像。使用AMIDE软件包，在PET图像中手动绘制涵盖整个脑的ROI。计算用体重(kg)和注射剂量(mCi)归一化的平均标准化摄取值(SUV)，并且绘制随时间的变化以获得TAC。在健康恒河猴中的该基线成像研究(仅PET配体)证实了在非人灵长类动物脑中的脑外显率。如图7所示，在该猴的整个脑中观察到弥散性摄取。PET配体注射后0-60分钟的汇总图像在NHP内证明了这一点。在健康恒河猴中，如在WT小鼠中那样，在非患病状态下BTK的脑表达非常低。[¹¹C]-(R)-4-(2-丙烯酰基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-5-氟-2,3-二甲基-1H-吲哚-7-甲酰胺TAC显示出快速的脑渗透，随后随着配体被清除而洗出。

Claims

1.一种式(Ib)的放射性标记的化合物：

2.一种组合物，所述组合物包含式(Ia)的化合物和/或式(Ib)的化合物：

基于式(Ia)的化合物和式(Ib)的化合物的摩尔数，具有10至100摩尔％的式(Ib)的化合物。

3.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物；以及药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，所述药物组合物包含5至25毫居里的所述式(Ib)的化合物以及药学上可接受的载体。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是盐水溶液。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含乙醇。

7.一种对具有已知BTK表达的哺乳动物组织进行体内成像的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向哺乳动物物种施用根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物；以及

8.一种用于诊断哺乳动物物种的多发性硬化的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向有需要的哺乳动物物种施用根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物，所述式(Ib)的放射性标记的化合物结合至与所述多发性硬化疾病的存在相关的BTK；以及

(b)获得所述哺乳动物物种的至少一部分的放射图像以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；

其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述疾病的存在或不存在。

9.一种用于诊断哺乳动物物种脑中多发性硬化病变的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向有需要的哺乳动物物种施用根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物，所述式(Ib)的放射性标记的化合物结合至与所述多发性硬化病变相关的BTK；以及

(b)获得所述哺乳动物物种脑的至少一部分的放射图像以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；

其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述多发性硬化病变的存在或不存在。

10.一种用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中BTK的结合位点的亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向哺乳动物物种施用根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物；

(c)向所述哺乳动物物种施用所述非放射性标记的化合物；

(d)向所述哺乳动物物种施用第二剂量的所述放射性标记的化合物；

(e)对所述放射性标记的化合物在表达BTK的组织中的分布进行体内成像；

11.一种用于监测正在用BTK抑制剂治疗的哺乳动物患者的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述患者施用根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物；

12.一种用于组织成像的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使含有BTK的组织与根据权利要求1所述的式(Ib)的放射性标记的化合物接触；以及

(b)使用正电子发射断层显像(PET)成像检测所述放射性标记的化合物。

13.一种用于诊断哺乳动物物种的多发性硬化的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

14.一种制备式(Ib)的化合物的方法：

所述方法包括以下步骤：

以及

(b)使所述[¹¹C]-丙烯酸和(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺反应以提供所述式(Ib)的化合物。

15.一种制备式(Ib)的化合物的方法：

所述方法包括以下步骤：使[¹¹C]CO与碘化乙烯在(R)-5-氟-2,3-二甲基-4-(1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)-1H-吲哚-7-甲酰胺的存在下反应以提供所述式(Ib)的化合物。