CN117897395A - 己糖激酶衍生肽及其治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明人先前的研究表明，在坐骨神经损伤和糖尿病神经病变以及CMT1A后，线粒体VDAC1通过蛋白激酶途径(MAPK)和c‑jun活化直接诱导施万细胞脱髓鞘。他们发现，在糖尿病、格林‑巴利综合征和腓骨肌萎缩病症模型中，通过VDAC1阻断减少线粒体钙释放，可以显著减少体内脱髓鞘施万细胞的数量，并改善神经传导和神经肌肉活性。在此，发明人通过缺失研究完成的ala扫描精确定位N‑端HK‑1螺旋的结合区域。此外，他们还通过使用α‑氨基异丁酸(Aib)作为螺旋诱导剂取代非必需氨基酸来稳定螺旋，从而优化了HK衍生肽。此外，他们描述了一种内部细胞筛选试验，该方法基于MJ从VDAC中分离HK的能力，以确定肽的效力。总的来说，他们的数据证实了作用于VDAC的N‑末端HK衍生肽是研究脱髓鞘过程的有前景的工具。因此，本发明涉及一种优化的HK衍生肽及其用于治疗周围脱髓鞘疾病、心肌疾病^10,11、癌症^12,13‑15、糖尿病^14,14‑16、狼疮样疾病(lupus‑like diseases)¹⁷、非酒精性脂肪肝疾病^24,25、化疗诱导的神经性疾病⁹、阿尔茨海默病^18,19、帕金森病²⁰、亨廷顿病²¹、ALS^22,23以及更一般地所有与蛋白聚集相关的神经退行性疾病²⁸的用途。

Description

己糖激酶衍生肽及其治疗用途

技术领域

本发明涉及己糖激酶(HK-)衍生肽及其治疗用途，特别是用于治疗周围脱髓鞘疾病或神经退行性疾病或癌症。

背景技术

线粒体外膜(OMM)上存在的电压依赖性阴离子通道(VDAC)对于线粒体和胞内细胞区室之间的离子¹和代谢物的交换至关重要²。VDAC是一种具有β-桶状结构的跨膜蛋白，其N-端螺旋垂直于孔壁，影响通道渗透性，表明具有分子门控功能^3,4,5。VDAC N-端螺旋的移动允许在开闭状态之间切换，从而影响细胞稳态。它还调节VDAC多聚化，通过释放到胞浆中的细胞色素C和钙触发细胞凋亡，并激活半胱氨酸蛋白酶^6,7。此外，VDAC是多达200个蛋白质的优先对接位点^8,9，其中一些蛋白质参与了多种病理过程⁹，包括心肌疾病^10,11，癌症^12,13-15，糖尿病^14,14-16，狼疮样疾病¹⁷，阿尔茨海默病^18,19，帕金森病²⁰，亨廷顿病²¹，ALS^22,23，非酒精性脂肪性肝病^24,25和化疗诱导的神经性疾病⁹。因此，VDAC构成了一个治疗靶点，能够调节其渗透性或破坏/增强其与协同蛋白结合的药物正在研究中。在已知与VDAC相互作用的蛋白质中，己糖激酶(HK)I和II是主要的配体。由于这种蛋白/蛋白相互作用在几种疾病中的关键作用，已经确定了负责HK两种异构体与VDAC结合的氨基酸。结合位点位于HK的N端序列的前20个氨基酸中，更确切地说，前10个氨基酸是必不可少的^23,26。HK1和HK2的N端区域具有很强的序列同源性，已知有大量的两种HK异构体都位于细胞的线粒体外膜(OMM)。在神经退行性疾病中发现HKs和HK-VDAC1复合物的线粒体部分显著减少，并且与神经退行性疾病有关的几种错误折叠蛋白似乎与VDAC结合^27,19,28。在此背景下，VDAC1也被确定为施万细胞(SC)脱髓鞘的关键参与者^29,30。

施万细胞(SC)负责周围神经系统中髓鞘的产生。这些细胞包裹轴突并保持连接，以保护轴突并允许正确和有效的动作电位传递⁴⁶。不幸的是，周围神经系统(PNS)的遗传性和获得性脱髓鞘疾病很多，并且影响着越来越多的人⁴⁷。由于获得性脱髓鞘疾病包括糖尿病周围神经病变⁴⁸、药物相关的周围脱髓鞘疾病、麻风病和炎症病因的周围脱髓鞘疾病⁴⁹，因此更为常见。脱髓鞘周围神经病变是糖尿病的主要并发症，也是导致相当高发病率的原因⁵⁰。这种神经病的慢性形式的特征在于施万细胞脱髓鞘和轴突损失和/或变性，导致神经传导速度减慢^51,52。此外，据报道，至少有50％的糖尿病患者在诊断后25年内出现一种或多种形式的糖尿病神经病变⁵³。

茉莉酸甲酯(MJ)是一种植物激素，能够将HK从VDAC1³¹中分离出来，并诱导自发性脱髓鞘²⁹。另一方面，使用施万细胞中的沉默VDAC或与VDAC结合的神经保护药物奥利索西(olesoxime)^32,33对施万细胞进行处理，可阻止线粒体钙释放，阻断脱髓鞘²⁹。因此，恢复HK/VDAC紧密连接是治疗涉及VDAC渗透性的几种疾病的一个有吸引力的机会。据报道，在这种肌萎缩性侧索硬化症的特殊背景下，N-端HK-1衍生肽与VDAC在体外和在细胞中相互作用，以阻止VDAC/SOD1 G93A相互作用²³。此外，在遗传性脱髓鞘周围神经病变CMT4G中，HK1的5’非编码序列中的突变促进了缺乏HK1规则N-端的剪接的同工型的表达³⁴。在CMT4G患者的外周血单个核细胞和HEK293细胞中模拟疾病，这导致HK与VDAC之间缺乏相互作用(图1A-C)。在模拟疾病的HEK293细胞中，突变的HK1并不通过VDAC阻断线粒体钙释放(图2)。最后，虽然源自野生型HK1 N-端的肽能够阻止MJ处理后线粒体钙的释放(图3)，但源自突变型HK1的肽没有作用(图3)。因此，在一些周围神经疾病(如CMT4G)中，包括野生型HK1的N端区域的肽可用于阻断钙的外流，从而阻止脱髓鞘过程。这种肽也可能是所有涉及VDAC渗透性的疾病的治疗方案。

在此，发明人开发了优化的HK衍生肽，其对VDAC，特别是对VDAC1具有更高的稳定性和亲和力。

发明内容

本发明涉及一种HK-衍生肽，具有氨基酸序列：AQX₁X₂X₃YYX₄(SEQ ID NO:1)；

其中，X₁为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₂为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₃为丙氨酸(A)、D-异构丙氨酸(A_D)或α-氨基异丁酸(U)；

X₄为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)。

具体地，本发明由权利要求限定。

具体实施方式

发明人通过缺失研究完成的ala扫描精确定位N-端HK-1螺旋的结合区域。此外，他们还通过使用α-氨基异丁酸(Aib)作为螺旋诱导剂取代非必需氨基酸来稳定螺旋，从而优化了HK-衍生肽。此外，他们描述了一种内部细胞筛选测定法，该方法基于MJ从VDAC中分离HK的能力，以确定肽的效力。总的来说，他们的数据证实了作用于VDAC的N-末端HK-衍生肽是研究脱髓鞘过程的有前景的工具。

本发明的肽

本发明涉及一种HK-衍生肽，具有氨基酸序列：丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-X₁-X₂-X₃-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-X₄(SEQ ID NO:1)；

其中，X₁为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₂为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₃为丙氨酸(A)、D-异构丙氨酸(A_D)或α-氨基异丁酸(U)；

X₄为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)。

如本文所用，术语“己糖激酶”(HK)具有其在本领域的一般含义，指一种磷酸化己糖(六碳糖)形成磷酸己糖的酶。己糖激酶I和II是己糖激酶的两种亚型，是VDAC的主要配体。

如本文所用，术语“VDAC”具有其在本领域的一般含义，指电压依赖性阴离子选择性通道血管炎蛋白1。VDAC是线粒体外膜的主要成分，它促进代谢物和离子跨线粒体外膜的交换，并可以调节线粒体功能、细胞生理及分化。这种蛋白质还在质膜中形成多聚体通道，并参与细胞凋亡和跨膜电子传递。交替剪接导致多个转录本变体。该蛋白还在质膜上形成多聚体通道，可能参与细胞凋亡和跨膜电子传递。交替剪接导致多个转录物变体。VDAC有许多控制其渗透的结合伙伴，特别是己糖激酶(HK)。HK与VDAC的结合显著降低了孔道对钙的渗透性。VDAC包括3种VDAC亚型：VDAC1、VDAC2和VDAC3。

如本文所用，术语“肽”对应属于蛋白质家族的化学试剂。肽由几种氨基酸的混合物组成。根据涉及的氨基酸的数量，肽分为由2个氨基酸组成的二肽，由3个氨基酸组成的三肽，依此类推，由10个以上氨基酸组成的肽称为多肽。因此，本发明的肽可以被认为是多肽。

本发明的肽可以通过常规的自动化肽合成方法或通过重组表达来制备。设计和制造蛋白质的一般原理为本领域技术人员所熟知。

本发明的肽可以按照常规技术在溶液或固体载体上合成。各种全自动合成仪均为市售的，可以按照Stewart和Young所描述的已知协议使用(Tam etal.,1983；Merrifield,1986and Barany and Merrifield,Gross and Meienhofer,1979.)。本发明的肽也可通过采用示例性肽合成仪固相技术合成。通过全自动多肽合成或重组方法合成的任一给定蛋白的纯度均可以通过反相高效液相色谱进行测定。每种肽的化学真实性可以通过本领域技术人员所熟知的任何方法确定。作为全自动多肽合成的一种替代方法，重组DNA技术可用于将编码选择蛋白的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染到适当的宿主细胞中，并在适合表达的条件下培养，如下文所述。重组方法尤其适用于生产较长的多肽。多种表达载体/宿主系统可用于包含和表达肽或蛋白质编码序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒(cosmid DNA)表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化酵母(Giga-Hama等人,1999)；用病毒表达载体感染昆虫细胞系统(例如杆状病毒，参见Ghosh等人,2002)；用病毒表达载体转染(例如花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病病毒和TMV)或用细菌表达载体转化(例如Ti或pBR322质粒；参见例如Babe等人,2000)的植物细胞系统；或动物细胞系统。本领域技术人员熟知各种优化哺乳动物蛋白质表达的技术，参见例如Kaufman,2000；Colosimo等人，2000。用于生产重组蛋白的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于在细菌、酵母和其它无脊椎动物中重组表达肽底物或融合多肽的示例性方案是本领域技术人员熟知的，并在下文中简要描述，如美国专利第6,569,645号、美国专利第6,043,344号、美国专利第6,074,849号和美国专利第6,579,520号提供了重组生产多肽的具体实例，这些专利通过引用明确并入本文，以供参考。用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员所熟知的。可以选择宿主细胞株处理表达蛋白质或产生某些翻译后修饰，这将有助于提供蛋白质活性。多肽的这种修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白质的“前体”形式的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或功能也是重要的。不同的宿主细胞如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等对这种翻译后活性具有特定的细胞机制和特征机制，可以选择以确保引入的外源蛋白质的正确修饰和加工。

本文所用的术语“氨基酸”是指手性氨基酸的D和L立体异构体中的天然或非天然氨基酸。应理解为是指氨基酸和相应的氨基酸残基，例如存在于肽基结构中。天然和非天然氨基酸是本领域熟知的。常见的天然氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬酰胺(Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酰胺(Gln,Q)、谷氨酸(Glu,E)、甘氨酸(Gly,G)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、蛋氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)和缬氨酸(Val,V)。不常见和非天然氨基酸包括但不限于α-氨基异丁酸(Aib，U)、烯丙基甘氨酸(AllylGly)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸、联苯丙氨酸(biphenylalanine(Bip))、瓜氨酸(Cit)、4-胍基苯丙氨酸(4-guanidinophenylalanine(Phe(Gu)))、高精氨酸(hArg)、高赖氨酸(hLys)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、鸟氨酸(Orn)、环己基丙氨酸(Cha，Fx)和五氟苯丙氨酸(pentafluorophenylalanine)。

在一些实施方案中，本发明的HK-衍生肽包括7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸。

在一些实施方案中，本发明的HK-衍生肽不包含以下氨基序列：丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-亮氨酸(L)-亮氨酸(L)-丙氨酸(A)-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-苯丙氨酸(F)(SEQ IDNO:95)。

在一些实施方案中，本发明的HK-衍生肽不包含丙氨酸(A)-丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-亮氨酸(L)-亮氨酸(L)-丙氨酸(A)-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-苯丙氨酸(F)-苏氨酸(T)-谷氨酸(E)-亮氨酸(L)-赖氨酸(K)(SEQ ID NO:96)的氨基序列。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含氨基酸序列：丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-X₁-X₂-X₃-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-X₄-苏氨酸(T)-谷氨酸(E)-X₅-赖氨酸(K)(SEQ ID NO:2)；

其中，X₁为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₂为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₃为丙氨酸(A)、D-异构丙氨酸(A_D)或α-氨基异丁酸(U)；

X₄为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)；

X₅为亮氨酸(L)或色氨酸(W)。

在一些实施方案中，X₃为α-氨基异丁酸(U)。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由表1中的氨基序列组成。

表1：优化的HK-1衍生肽。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包括或由氨基酸序列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29组成。

此外，发明人证明了将AUAU补丁或在N-端融合的3-CF₃-Ph[Tz]Aib对于增强HK-衍生肽的稳定性的重要性(见图7)。发明人还证明了用α-氨基异丁酸取代第二个丙氨酸对增强HK-衍生肽的稳定性的重要性。

研究人员在先前的研究中发现，3-CF₃Ph[Tz]U二肽作为N-端封端能够增强肽在膜内的插入(见图4A和Das等人,Chemistry.2017Dec ²⁴)。

如本文所用，3-CF₃Ph[TZ]U二肽具有其在本领域的一般含义，指2-甲基-2-{4-[(3-三氟甲基)苯基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}丙酸(2-methyl-2-{4-[(3-trifluoromethyl)phenyl]-1H-1,2,3-triazol-1yl}propanoic acid)，又称为1,4-二取代-1,2,3-三唑(1,4-disubstituted-1,2,3-triazole)，与具有如下分子式C₁₆H₁₆F₃N₃O的α-氨基异丁酸的耦合物：

在一些实施方案中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或AU(SEQ ID NO:55)与HK-衍生肽偶联。

在一些实施方案中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或AU(SEQ ID NO:55)与HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或AU(SEQ ID NO:55)与HK-衍生肽的C-端偶联。

在一些实施方案中，二肽3-CF₃Ph[Tz]U与HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，使细胞穿透序列与HK-衍生肽偶联。

如本文所用，术语“细胞穿透序列”具有其在本领域的一般含义，指促进细胞摄入和摄取本发明的肽的短序列。根据肽段的来源，CPPs分为嵌合型、蛋白衍生型和合成型。细胞穿透序列包括但不限于细胞穿膜肽(Penetratin)、八精氨酸(octaarginine)(R8)、tat、转运素(Transportan)和Xentry。Penetratin是第一代细胞穿透肽，来源于果蝇触角足突变同源结构域(Drosophila Antennapedia Homeodomain)。Penetratin通过巨噬细胞途径克服哺乳动物细胞的质膜屏障，并以生物活性的形式有效地运送分子物质。tat肽来源于人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子(tat)。TAT是一种富含精氨酸的肽，可以直接穿过质膜并稳定DNA。细胞穿膜肽(Transportan)是一种嵌合型CPP，由甘丙肽和乳突蛋白酶衍生而来。Xentry是一种源自乙型肝炎病毒x-蛋白的N端区域的短肽。Xentry以黏结蛋白聚糖-4作为入口渗透进黏附细胞。霍顿肽(Horton peptide)是一种合成的细胞渗透性肽，能够进入线粒体。MPPs的序列被设计用于显示两个已知的对穿过血浆膜和线粒体膜都很重要的性质：正电荷和亲脂性，如Horton等人,Chem Biol.2008中所解释的那样⁵⁸。

在一些实施方案中，细胞穿透序列在HK-衍生肽的N-端或C-端偶联。

在一些实施方案中，细胞穿透序列由表2中的序列组成：

细胞穿透序列	SEQ ID NO:	序列
			Penetratin	56	RQIKIWFQNRRMKWKK
R8	57	RRRRRRRR
			tat	58	GRKKRRQRRRPQ
Transportan	59	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
			Xentry	60	LCLRPVG
Horton Peptide	61	FXRFXRFXRFXR

表2：细胞穿透序列

在一些实施方案中，细胞穿透序列为tat(SEQ ID NO:58)。

在一些实施方案中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或AU(SEQ ID NO:55)在HK-衍生肽的N-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的C-端偶联。

在一些实施方案中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或AU(SEQ ID NO:55)在HK-衍生肽的C-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，二肽3-CF₃Ph[Tz]U在HK-衍生肽的N-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的C-端偶联。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29，其中，二肽3-CF₃Ph[Tz]U在HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29，其中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或序列AU(SEQ ID NO:55)在HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29组成，其中，二肽3-CF₃Ph[Tz]U在HK-衍生肽的N-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的C-端偶联。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29，其中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或序列AU(SEQ ID NO:55)在HK-衍生肽的N-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的C-端偶联。

在一些实施方案中，HK-衍生肽包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29，其中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或序列AU(SEQ ID NO:55)在HK-衍生肽的C-端偶联，细胞穿透序列在HK-衍生肽的N-端偶联。

在一些实施方案中，细胞穿透序列为tat(SEQ ID NO:58)。

本发明第二方面涉及一种包含本发明HK-衍生肽的载体。

通常情况下，肽可以与载体结合进行递送。本发明的HK-衍生肽包含在合适的载体中，例如质粒、黏粒、游离基因、人工染色体、噬菌体或病毒载体。因此，本发明的另一目的涉及包含本发明肽的载体。通常，所述载体为病毒载体，包括腺病毒相关病毒(AAV)、反转录病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒、多瘤病毒或传染性病毒。在一些实施方案中，所述载体为AAV载体。如本文所用，术语“AAV载体”是指源自腺相关病毒型载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10及其突变形式。AAV载体可以有一个或多个AAV野生型基因全部或部分缺失，优选是rep和/或cap基因，但保留功能性ITR侧翼序列。由于逆转录病毒能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外来遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型并包装在特定细胞系中的能力，因此可以选择逆转录病毒作为基因递送载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码目标基因的核酸代替某些病毒序列插入病毒基因组中，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和/或env基因但不包含LTR和/或包装组分的包装细胞系。当含有cDNA的重组质粒以及逆转录病毒LTR和包装序列引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，该包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，然后将其分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，如在潜在感染的过程中。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV1、HIV2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过多重减毒HIV毒力基因而产生的，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，从而使该载体在生物学上是安全的。慢病毒载体是本领域已知的，参见例如美国专利第6,013,516号和第5,994,136号，两者均通过引用并入本文。通常，载体是基于质粒或基于病毒的，并且配置为携带用于掺入外来核酸、用于选择以及用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。目标载体的gag、pol和env基因在本领域中也是已知的。因此，将相关基因克隆到选择的载体中，然后用于转化目标靶细胞。其中合适的宿主细胞用两种或更多种携带包装功能的载体(即gag、pol和env以及rev和tat)转染的能够感染非分裂细胞的重组慢病毒描述于通过引用并入本文的美国专利第5,994,136号中。其描述了可以提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体和可以提供编码用于生产包装细胞的病毒env的核酸的另一种载体。将提供异源基因的载体引入该包装细胞产生了生产细胞，该生产细胞释放出携带目标外源基因的感染性病毒颗粒。该env优选为双嗜性包膜蛋白，其允许转导人和其他物种的细胞。典型地，本发明的核酸分子或载体包括“控制序列”，其统称为启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，它们共同在受体细胞中提供编码序列的复制、转录和翻译。并非所有控制序列都需要始终存在，只要所选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。另一核酸序列是“启动子”序列，其在本文中以其一般含义使用，指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调控序列衍生自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中，可操作地连接到启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)，“抑制型启动子”(其中，可操作地连接到启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。

在一些实施方案中，载体为腺相关病毒(AAV)。

在一些实施方案中，载体为AAV9或AAVrh10。

治疗方法

施万细胞在周围神经轴突周围形成髓鞘对动作电位的快速传播至关重要。一些周围神经病变具有脱髓鞘的病理生理学过程。发明人此前证明，线粒体VDAC1在坐骨神经损伤、糖尿病神经病变以及CMT1A后通过MAPK通路和c-jun活化直接诱导施万细胞脱髓鞘。他们发现，在糖尿病、格林-巴利综合征和腓骨肌萎缩病症模型中，通过VDAC1阻断减少线粒体钙释放，可以显著减少体内脱髓鞘施万细胞的数量，并改善神经传导和神经肌肉活性。

因此，恢复HK/VDAC紧密连接是对抗不同周围脱髓鞘疾病和所有涉及VDAC渗透性的其他疾病的一个有吸引力的机会。

因此，本发明涉及将本发明的HK-衍生肽或载体用作药物。

换句话说，本发明涉及用于治疗的本发明的HK-衍生肽或载体。

更具体地，本发明涉及用于治疗周围脱髓鞘疾病的本发明的HK-衍生肽或载体。

换句话说，本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者的周围脱髓鞘疾病的方法，包括向受试者施用有效治疗剂量的本发明的HK-衍生肽或本发明的载体。

本文所用的术语“受试者”是指人类或其它哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在一些实施方式中，受试者是人。通常，受试者受到或可能受到周围神经系统的疾病的影响。通常，受试者受到或可能受到周围脱髓鞘疾病的影响。

如本文所用，术语“疗法”和“治疗”是指预防性或预防性治疗，也指治愈性或疾病缓解性治疗，包括治疗有感染疾病风险或疑似感染该疾病的患者以及生病或被诊断患有疾病或医疗状况的患者，并包括抑制临床复发。可以对患有医学疾病或最终可能患有该疾病的患者进行治疗，以预防、治愈、延缓疾病或复发性疾病的发作、降低疾病或复发性疾病的严重程度，或改善疾病和复发性疾病的一种或多种症状，或为了延长患者的存活时间，使其超过在没有此类治疗的情况下的预期存活时间。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如，治疗期间使用的给药模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“负荷方案”，其中可以包括给予比医生在维持方案期间使用的药物剂量更大的给药剂量，比医生在维持方案期间给药频率更频繁地给物，或两者兼有。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在疾病治疗期间维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长时间(数月或数年)处于缓解状态。维持治疗方案可以采用连续治疗(例如，定期给药，例如每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如，中断治疗、间歇治疗、复发治疗或达到特定预定标准后的治疗[例如，疼痛、疾病表现等])。

如本文所用，“治疗有效量”是指向患者施用治疗获益所必需的最小量的活性剂(即本发明的肽)。例如，对患者而言，“治疗有效量的活性剂”是指诱导、改善或引起与影响患者的疾病相关的病理症状、疾病进展或身体状况改善的活性剂的量。据了解，本发明的化合物和组合物的每日使用总量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所用特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定多肽联合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。

如本文所用，术语“周围脱髓鞘疾病”具有其在本领域中的一般含义，指涉及轴突和神经胶质细胞，尤其是周围神经系统(PNS)中的施万细胞(SC)的实质性损伤的一系列疾病。周围脱髓鞘疾病所表现出的多种的形态，可以各自独特地归因于同样广泛的各种原因。例如，周围脱髓鞘疾病可以是遗传性获得性的(“遗传性周围脱髓鞘疾病”)，或者可以是由系统性疾病引起，或者也可以是由毒性物质或传染性物质诱发(“获得性周围脱髓鞘疾病”)。

本发明的方法广泛适用于治疗或预防影响周围神经调节的周围脱髓鞘疾病，包括外周神经节神经元、交感神经、感觉神经元以及有髓鞘的运动神经元和感觉神经元。

具体地，本发明的方法适用于眼神经、内耳和听神经、有髓鞘的运动神经元和感觉神经元的治疗。具体地，本发明的方法特别适用于预防周围神经脱髓鞘。

本发明的肽适用于遗传性周围脱髓鞘疾病的治疗。

遗传性周围脱髓鞘疾病是由代代相传的遗传异常引起的。对于其中的一些，遗传缺陷是已知的，并且可以通过检测进行诊断和产前咨询。具体地，遗传性周围脱髓鞘疾病的诊断通常与神经病理性症状的早期发病有关，特别是在有阳性家族史的情况下。在最近的遗传学进展之前，肌电图和神经活检的神经传导研究明显减慢的典型发现支持了这一诊断。神经活检的典型发现包括出现洋葱球外观，表明神经纤维的反复脱髓鞘和再髓鞘化。有几种遗传性神经病变与周围神经脱髓鞘直接或间接相关。示例包括但不限于雷富孙氏病(Refsum's disease)、无β-脂蛋白血症(Abetalipoproteinemia)、谈基氏病(Tangierdisease)、半乳糖脑苷脂积累症(Krabbe's disease)、异染色性脑白质障碍症(Metachromatic leukodystrophy)、腓骨肌萎缩征(CMT)、费勃莱氏病(Fabry's disease)、遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)、家族性淀粉样周围神经病(Familial AmyloidoticNeuropathy)、遗传性感觉和自主神经病II型(HSN II)、遗传性卟啉症(hereditaryporphyria)、肌营养不良症(muscular dystrophies)如先天性肌营养不良1A和肥大性间质性多发性神经病(Dejerine-Sottas syndrome)。

在一些实施方案中，遗传性脱髓鞘疾病为腓骨肌萎缩病(CMT)。

腓骨肌萎缩症(CMT)是最常见的遗传性神经系统疾病。其特征是由于周围神经节段性脱髓鞘以及相关的轴突和前角细胞变性导致肌肉无力和萎缩。在过去的15年中，对腓骨肌萎缩症(CMT)遗传基础的了解大幅增加，目前已知有60多个基因。定期更新的列表可在http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Home/IPN.cfm.上找到。常染色体显性遗传很常见，相关的退行性中枢神经系统疾病(如弗立特里希氏共济失调(Friedreich'sataxia))也很常见。在一些实施方案中，本发明的肽可用于治疗4G型和1A型腓骨肌萎缩症。

本发明的肽也适用于治疗获得性周围脱髓鞘疾病。

获得性外周脱髓鞘疾病具有其在本领域的一般含义，包括但不限于糖尿病性神经病变、免疫型的神经病变；急性和慢性运动神经病变；急性和慢性感觉神经病变；急性和慢性自主神经系统病变；米勒费雪综合征(miller-fisher syndrome)，表现为眼睛凝视麻痹、不协调和步态不稳。

在一些实施方案中，本发明的肽用于治疗糖尿病性神经病。糖尿病是神经病变的最常见原因。大约50％的糖尿病患者会出现症状。在大多数情况下，神经病变主要是感觉性的，伴有手脚疼痛和感觉丧失。但部分糖尿病患者存在慢性脱髓鞘性神经病变，单神经炎或多发性单神经炎，导致一条或多条神经无力，或腰荐椎神经丛病变或肌萎缩，导致下肢无力、炎症、坏死和脓肿。

在一些实施方式中，本发明的肽用于治疗免疫型神经病变。免疫系统的主要功能是保护机体免受来自外界传染性生物体的侵害。然而，在某些情况下，免疫系统会反作用于机体，引起自身免疫性疾病。免疫系统由几种类型的白细胞组成，包括T淋巴细胞，它们也调节免疫反应；和分泌被称为“抗体”的特殊蛋白质的B-淋巴细胞或浆细胞。有时，由于不明原因，免疫系统会错误地攻击身体的某些部位，如周围神经。这就是“自身免疫性”周围神经病变。根据周围神经受到攻击的部位和免疫反应的类型，分为几种不同的类型。例如，本发明的方法适用于治疗吉兰-巴雷综合症(GBS)。急性神经病变因其突然或迅速发病。吉兰-巴雷综合症(GBS)可在发病后数天或数周内进展为瘫痪和呼吸衰竭。神经病变是由于免疫系统破坏运动神经和感觉神经的髓鞘而引起的。它通常先于感染、疫苗接种或创伤，这被认为是引发自身免疫反应的原因。该病具有自限性，可在6～8周内自行恢复。但恢复往往是不完全的。

另一种可能被本发明的多肽治疗的获得性周围脱髓鞘疾病是慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。CIDP被认为是吉兰-巴雷综合症的一种慢性和更惰性的形态。疾病的进展或反复发作，称为复发，或以阶梯式或稳定的方式进行。与在GBS中一样，髓鞘似乎被抗体和T淋巴细胞破坏。但由于没有针对CIDP的特异性检查，因此其诊断主要基于临床和实验室特征。

本发明的肽可用于治疗的另一种获得性周围脱髓鞘疾病是具有周围神经抗体的慢性多发性神经病。在一些类型的慢性神经病变中，已经鉴定出了针对特定神经成分的抗体。包括与髓鞘相关糖蛋白(MAG)抗体相关的周围脱髓鞘疾病，与神经节苷脂GM1或GDla抗体相关的运动神经病变，与抗-硫苷脂或GDlb神经节苷脂抗体相关的感觉神经病变。这些情况下，抗体与寡糖或糖类分子结合，这些寡糖或糖类分子与神经中的蛋白质(糖蛋白)或脂质(糖脂或神经节苷脂)连接。

本发明的肽还可用于治疗与血管炎或周围神经血管炎症相关的周围脱髓鞘疾病。周围脱髓鞘疾病也可由血管炎引起，血管炎是周围神经血管的炎症。它沿周围神经的病程产生小的“中风”，可局限于神经，也可泛发，包括皮疹或累及其他器官。一些风湿性疾病，如类风湿性关节炎、狼疮、结节性动脉周围炎或干燥综合征，均与全身性血管炎有关，也可累及周围神经。根据病变的分布和严重程度，血管炎可导致多神经炎、单神经炎或多发性单神经炎。

在一些实施方式中，本发明的方法适用于治疗与单克隆球蛋白病相关的周围脱髓鞘疾病。在单克隆丙种球蛋白血症中，骨髓或淋巴器官中单个克隆的B-细胞或浆细胞扩增形成良性或恶性肿瘤并分泌抗体。“单克隆”是因为抗体是单克隆的。“丙种球蛋白病”代表丙种球蛋白，是抗体的另一个名称。在某些情况下，抗体与神经元组件发生反应；在另一些情况下，抗体的片段形成淀粉样沉积。

在一些实施方式中，本发明的方法适用于治疗与肿瘤或肿瘤相关的周围脱髓鞘疾病。神经病变可以是由于肿瘤细胞向神经浸润或肿瘤的间接作用导致。后者称为副肿瘤性神经病。下面分几种类型进行说明。例如，本发明的方法可用于治疗与肺癌相关的感觉神经病变。同样，本发明的方法也可用于治疗多发性骨髓瘤相关的周围脱髓鞘疾病。在一些实施方式中，本发明的方法适用于治疗与华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulemia)、慢性淋巴细胞白血病或B-细胞淋巴瘤相关的周围脱髓鞘疾病。在一些实施方式中，本发明的方法被用作治疗方案的一部分，用于治疗周围脱髓鞘疾病是由于局部照射或由化疗药物引起的癌症患者。已知引起感觉和/或运动神经病变的化疗药物包括长春新碱(vincristine)(一种用于治疗血液系统恶性肿瘤和肉瘤的抗肿瘤药物)，以及顺氯氨铂(cisplatin)、紫杉酚(taxol)以及其他。神经毒性与剂量相关，表现为肠道动力减弱和周围神经病变，尤其是手足远端肌肉，体位性低血压和膀胱无力。紫杉酚和顺氯氨铂也存在类似的问题(MoUman,J.E.,1990,New Eng Jour Med.322:126-127)，虽然与顺氯氨铂相关的神经毒性可以通过神经生长因子(NGF)来缓解(Apfel,S.C.等人,1992,Annals ofNeurology 31:76-80)。虽然在去除神经毒性物质后，神经毒性有时是可逆的，但恢复可能是一个非常缓慢的过程(Legha,S.,1986,Medical Toxicology 1:421-427；Olesen,et al,1991,Drug Safety 6:302-314)。

在一些实施方式中，本发明的方法适用于治疗氯奎(Chloroquine)、FK506(他克莫司)、派克昔林(Perhexiline)、盐酸普鲁卡因酰胺(Procainamide)和齐美定(Zimeldine)药物引起的周围脱髓鞘疾病。

在一些实施方式中，本发明的方法适用于治疗由感染引起的周围脱髓鞘疾病。周围脱髓鞘疾病可由周围神经的感染引起。引起周围脱髓鞘疾病的病毒包括引起缓慢进展的感觉神经病变的艾滋病病毒和HIV-I、引起快速进行性麻痹性神经病变的巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、引起带状疱疹的带状疱疹病毒(Herpes Zoster)和引起运动神经病变的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)。乙型肝炎或丙型肝炎感染有时与血管炎性神经病有关。引起神经病变的细菌感染包括引起斑片状感觉神经病变的麻风病和引起快速进展的麻痹性神经病变的白喉。引起神经病变的其他传染性疾病包括由螺旋体引起的莱姆病和由寄生虫引起的锥虫病。两者均常表现为多灶性神经病变。

在一些实施方式中，本发明的肽适用于治疗营养失衡引起的周围脱髓鞘疾病。例如，维生素B12、Bl(硫胺素)、B6(吡哆醇)或E的缺乏会引起多发性神经病变，且伴有周围神经轴突变性。这可能是由于饮食不良，或无法从胃或肠道吸收营养。此外，大剂量的维生素B6也会引起周围脱髓鞘疾病，本发明的肽可作为此类情况下解毒方案的一部分。

在一些实施方式中，本发明的肽适用于治疗肾脏疾病引起的周围脱髓鞘疾病。慢性肾衰竭可引起以感觉性为主的周围神经病，并伴随有周围神经轴突变性。

在一些实施方式中，本发明的肽适用于治疗甲状腺功能减退性神经病。甲状腺功能减退性神经病有时与伴有轴突变性的疼痛性感觉多发性神经病变有关。单神经病或多发性单神经病也可由于肿胀组织压迫周围神经而发生。

在一些实施方式中，本发明的肽适用于治疗酒精和毒素引起的周围脱髓鞘疾病。某些毒素可引起周围神经病。铅中毒与运动神经病变有关；砷或汞可引起感觉神经病变，铊可引起感觉和自主神经病变，几种有机溶剂和杀虫剂也可引起多发性神经病变。酒精对神经有直接毒性，酗酒是导致神经病变的主要原因。在一些实施方式中，本发明的肽可以用作更广泛的解毒程序的一部分使用。在另一个实施方案中，本发明的肽可用于治疗由药物引起的周围脱髓鞘疾病。已知有几种药物可引起神经病变。它们包括用于治疗肾盂肾炎的呋喃妥因，用于治疗心律失常的胺碘酮，用于治疗酒精中毒的双硫醒，用于治疗艾滋病的ddC和ddl，以及用于治疗麻风病的氨苯砜。如上所述，在一些实施方案中，本发明的肽可以用作更广泛的解毒程序的一部分。

在一些实施方式中，本发明的肽适用于治疗外伤或压迫引起的周围脱髓鞘疾病。局限性神经病变可由外部压力或被覆肌腱和其他组织压迫神经所致。其中最著名的是腕管综合症(Carpal Tunnel Syndrome)，它是由于腕部受到压迫引起的，而颈椎或腰椎神经根病变(坐骨神经痛)是由于神经根在离开脊柱时受到压迫引起的。其他常见的神经受压部位包括肘部、腋窝和膝背后部。

本发明的肽还可用于治疗多种突发性周围脱髓鞘疾病。当无法找到周围脱髓鞘疾病的病因时，就会使用术语“突发性”一词。在这些病例中，周围脱髓鞘疾病根据其表现进行分类，即感觉性、运动性或突发性感觉运动神经病变。

VDAC孔道是参与许多疾病的蛋白质的优势对接位点，使其成为能够破坏或加强其与协同蛋白结合的药物的治疗靶点。阻断该通道从信号传导途径上游被激活在对抗心肌疾病^10,11，癌症^12,13-15，糖尿病^14,14-16，狼疮样疾病¹⁷，非酒精性脂肪性肝病^24,25，化疗诱导的神经性疾病⁹，阿尔茨海默病^18,19，帕金森病²⁰，亨廷顿病²¹，ALS^22,23以及更普遍的所有与蛋白聚集相关的神经退行性疾病方面具有重要意义²⁸。

因此，本发明还涉及用于治疗心肌疾病、癌症、糖尿病、狼疮样疾病、非酒精性脂肪肝病、神经退行性疾病如化疗诱导的神经病变、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病¹或ALS的本发明的HK-衍生肽或本发明的载体。

如本文所用，术语“狼疮样疾病”具有其在本领域中的一般含义，是指具有与突发性系统性红斑狼疮相似的临床、组织学和免疫学特征的疾病。

如本文所用，术语“非酒精性脂肪性肝病”具有其在本领域中的一般含义，是指由肝脏中脂肪堆积引起的情况。NAFLD的主要阶段是单纯性脂肪肝(脂肪变性)；肝脏发炎的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；一种纤维变性，持续性炎症导致肝脏和附近血管周围的疤痕组织和肝硬化-最严重的阶段，发生在多年炎症之后，肝脏萎缩并开始结疤和结块。

如本文所用，术语“神经退行性疾病”具有其在本领域中的一般含义，指神经退行性疾病，即神经元结构或功能的逐渐丧失，包括神经元死亡。许多神经退行性疾病，包括肌萎缩侧索硬化、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和亨廷顿症，都是神经退行性疾病的结果。这些疾病是无法治愈的，导致神经元细胞逐渐变性和/或死亡。随着研究的进展，在亚细胞水平上出现了许多将这些疾病联系在一起的相似之处。发现这些相似之处为可以同时改善许多疾病的治疗进展提供了希望。不同的神经退行性疾病之间存在许多相似之处，包括非典型蛋白质聚集以及诱导的细胞死亡(Rubinsztein DC(2006).Nature.443(7113):780–6andBredesen DE,et al(2006)..Nature.443(7113):796–802)。在一些实施方案中，神经退行性疾病是与蛋白质聚集相关的疾病²⁸。

神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病，特别是化疗诱导阿尔茨海默神经病变^18,19、路易体痴呆(DLB)、伴有额颞痴呆的肌萎缩侧索硬化(ALS)、包涵体肌病伴佩吉特骨病和/或额颞叶痴呆(IBMPFD)、额颞叶退化症(frontotemporal lobar degeneration)，突触核病(synucleopathies)，亨廷顿病和帕金森病，淀粉样变性病包括淀粉样血管病，Tau蛋白病包括17号染色体连锁额颞叶痴呆合并相关的帕金森综合征，蛋白包涵体神经肌肉疾病，以及发育性疾病包括唐氏综合征。

在一些实施方式中，本发明的肽可用于治疗，或至少可减轻化疗诱导的神经病变、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或ALS的严重程度。

如本文所用，术语“糖尿病”具有其在本领域中的一般含义，是指以慢性高血糖为特征的常见的代谢紊乱。它使患有心脏病、中风、周围神经病变、肾脏疾病、失明和截肢的风险更大。糖尿病主要有三种类型：1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。先前的研究表明，抑制VDAC1可恢复糖尿病小鼠的β细胞功能并预防高血糖。

如本文所用，术语“癌症”具有其在本领域中的一般含义，是指具有侵袭或扩散到身体其他部位的可能性的异常细胞生长。癌细胞具有一些区别于正常细胞的特征，包括避免细胞凋亡。细胞凋亡调控的缺陷甚至逃避是癌症的标志。VDAC1作为能量代谢和细胞凋亡的关键调节因子，为抗癌治疗提供了独特的靶点⁸。与正常细胞中的水平相比，电压依赖性阴离子通道1在许多癌症类型中高度表达。⁸本发明的多肽适合于通过干扰己糖激酶等抗凋亡蛋白与VDAC的结合，从而诱导细胞凋亡来治疗癌症。

根据本发明，所述癌症可选自肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑与中枢神经系统癌、乳腺癌、卡尔斯曼(Castleman)病、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、胃肠道类癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、脑垂体癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌和子宫颈癌。

药物组合物

本发明的肽可以在药物组合物中使用或制备。

在另一个方面，本发明涉及一种包含本发明的肽的药物组合物。

本发明涉及包含本发明的肽或本发明的载体的药物组合物，用于治疗周围髓鞘形成病、心肌疾病、癌症、糖尿病、狼疮样疾病、非酒精性脂肪性肝病或神经发生疾病，如化疗诱导的神经病⁹、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和ALS。

通常，本发明的肽可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质如可生物降解的聚合物相结合，以形成治疗组合物。

如本文所用，术语“药学上的”或“药学上可接受的”是指当适当地向哺乳动物(特别是人)施用时，不会产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或制剂助剂。

在本发明用于口服、舌下含服、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、经皮给药、局部或直肠给药的药物组合物中，活性原料药单独或与另一活性原料药联合使用，可以以单位给药形式，作为与常规药物载体的混合物，给药于动物和人类。活性成分单独或与另一种活性成分组合，可与常规药物载体混合，以单位给药形式用于动物和人。合适的单位给药形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒和口服混悬液或溶液等口服给药形式、舌下和口腔给药形式、气溶胶、植入管、皮下注射、经皮给药、局部给药、腹腔注射、肌肉注射、静脉注射、皮下注射、经皮给药、鞘内和鼻腔给药形式以及直肠给药形式。优选地，药物组合物含有能够注射的制剂在药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物含有能够被注射的制剂在药物上可接受的载体。特别是，这些可以为等渗的无菌生理盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冷冻干燥的组合物，根据情况，加入无菌水或生理盐水后，可制成注射溶液。适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；配方包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。制剂包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该剂型必须是无菌的，并且必须是易于注射的流体。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染作用。可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备包含本发明抑制剂作为游离碱或药学上可接受的盐的溶液。分散体也可以在甘油、聚乙二醇液体及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。本发明的抑制剂可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，其由无机酸形成(例如盐酸或磷酸)或由有机酸形成(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇液体等)及其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以通过使用涂层(如卵磷脂)，在分散的情况下保持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来保持。各种抗菌剂和抗真菌剂(例如防腐剂、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等)可以防止微生物的生长。在许多情况下，优选为包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。无菌注射溶液的制备是将活性化合物按所需量与上述几种其它成分(如果需要)混合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体是通过将各种灭菌的活性成分加入到含有基本分散介质和上述所需其他成分的无菌载体中进行制备。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中获得活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。配制后，溶液将以与剂量配方兼容的方式和以治疗有效量进行给药。该制剂易于以各种剂型给药，例如上述注射溶液的形式，但也可以使用药物释放胶囊等形式。例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如有必要，应适当缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特殊的水溶液特别适用于静脉注射、肌肉注射、皮下注射和腹腔注射的给药形式。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。根据接受治疗的患者的情况，剂量必然会有一些变化。在任何情况下，负责给药的人员都将为个体受试者确定适当的剂量。

下面将通过附图和实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。

附图说明

图1：在患者血液的外周血单个核细胞(PBMC)和表达wt HK或CMT4G-突变HK的HEK293细胞(或无对照组)中与HK免疫共沉淀的VDAC1的量。A.通过离心从CMT4G患者或对照组的外周血中收集PBMC，在洗涤液中洗涤并裂解以提取蛋白质。使用与G蛋白偶联的琼脂糖凝胶珠用特异性单克隆抗体沉淀HK。洗涤后，使用针对VDAC1的多克隆抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析免疫共沉淀蛋白。免疫共沉淀的VDAC1的量与细胞裂解物中蛋白质的量相一致。B.人类HK1的主要亚型和可变剪接的AlT2亚型的序列显示了外显子1和2以及替代外显子T3和T4对每种亚型的N-端序列的贡献。参见Hantke,J.等人.2009C.用表达野生型Flag标记的人类HK1或CMT4G突变的Flag标记的人类HK1的质粒转染HEK293细胞。48小时后，将细胞洗涤并在洗涤溶液中裂解以提取蛋白质。使用与G蛋白偶联的琼脂糖凝胶珠用单克隆抗-Flag抗体沉淀HK。洗涤后，使用针对VDAC1的多克隆抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析免疫共沉淀蛋白。免疫共沉淀的VDAC1的量与细胞裂解物中蛋白质的量相一致。

图2：过表达wt HK或CMT4G突变HK(或无对照组)的HEK293细胞中线粒体钙离子荧光探针的荧光强度。用表达mito-GCaMP2的质粒单独(对照组)或与表达wt Flag标记的人类HK1或CMT4G突变的Flag标记的人类HK1的质粒一起转染HEK 293细胞。48小时后，洗涤细胞，用多聚甲醛固定并用DAPI处理以检测细胞核。使用LSM700 Zeiss共焦显微镜记录GFP荧光，并对每张图片中的背景值进行归一化。

图3：用茉莉酸甲酯(MJ，6毫摩尔)和wt HK1的N-端肽(HK1-Nt肽)或突变HK1的N-端肽(HKmut-Nt肽)处理的HEK293细胞中线粒体钙离子荧光探针荧光强度的延时记录。用表达mito-GCaMP2的质粒转染HEK293细胞。48小时后，使用为实时成像设计的Zeiss Axio-observer对细胞进行成像，并用MJ(6mM)和/或5微摩尔的肽处理。肽序列：wt HK1肽Ac-MIAAQLLAYYFTELKGRKKRRQRRRPPQ-NH2(SEQ ID NO:90)、CMT4G-突变HK1肽Ac-MGQICQRESATAAEKGRKKRRQRRRPPQ-NH2(SEQ ID NO:91)和对照肽Ac-GRKKRRQRRRPPQ-NH2(SEQ ID NO:92)。

图4：肽库1-6设计用于优化VDAC结合。1a和2a代表提交给ala扫描、缺失、优化和稳定分析的肽的初始序列。nL代表正亮氨酸是蛋氨酸的不可氧化替代物。Tat序列以蓝色突出显示，而NHK1识别序列以红色突出显示，序列编号在顶部。

图5：分别对线粒体和胞质溶胶内的mitoGCaMP2(A)和GCaMP2(B)荧光水平进行延时定量。用mitoGCaMP2(A)和GCaMP2(B)探针转染的HEK-293细胞荧光水平的定量。对照组(圆圈)表示当使用用于MJ和化合物增溶的稀释剂(0.1DMSO和5％EtOH)处理细胞时线粒体内的荧光水平。在6mM处测试MJ，在33μM处测试化合物1a。使用双向方差分析(two-wayANOVA)进行统计学分析，随后进行Tukeys多重比较检验(N＝3个独立实验)。结果以平均值±SEM表示。**p<0.01、****p<0.0001，ns为差异不显著，A.U.为任意单位。

图6：ala扫描(A.B)和缺失(C.D)研究对化合物1a和2a的影响。所有化合物均在10μM处进行了筛选试验(N＝5个独立实验)。ala扫描以粗体显示。统计分析显示了化合物1a(A和C中的深灰色曲线)或2a(B和D中的深灰色曲线)与其他化合物之间的单向方差分析(one-way ANOVA)，随后进行Dunnett多重比较检验。蓝色图表示ala扫描研究揭示了与VDAC相互作用的重要氨基酸的化合物，或缺失研究导致活性显著丧失的化合物。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。如果未指定，则统计检验不显著(白色图)。结果以平均值±SEM表示。A.U.为任意单位。

图7：等比取代组合对化合物3c(A)和4d(B)中参与VDAC相互作用的氨基酸的影响。取代物以粗体显示。除化合物3c和4d在10μM(深灰色区)和3μM(浅灰色区)处测试外，所有化合物均在3μM处测试(N＝3个独立实验)。统计分析显示3μM处的化合物3c或4d以及其他化合物之间的单向方差分析(one-way ANOVA)，随后进行Dunnett多重比较检验。红色区表示等比取代组合导致活性最显着增加的化合物。*p<0.05,**p<0.01。如果未指定，则统计检验不显著。结果以标准差值±SD表示。A.U.为任意单位。

图8：A)7f中引入的N-端修饰的结构。在3c或5x序列中引入螺旋Aib(U)的影响。修饰氨基酸为粗体。所有化合物均在10μM(A)和3μM(B)下进行测试。对照条件(虚线)表示当使用用于MJ和化合物增溶的稀释剂(0.1DMSO和5％EtOH)处理细胞时线粒体内的荧光水平。MJ(线)表示当单独用6mM的MJ处理细胞时线粒体中的荧光水平。使用单向方差分析进行统计分析，随后对3c或5x(10μM处为深灰色，3μM处为浅灰色)和其他化合物(N＝3个独立实验)进行Dunnett多重比较检验。红色区对应于表现出显着增加活性的肽。结果以标准差值±SD表示。*p<0.05,***p<0.001。ns为差异不显著，A.U.为任意单位。

图9：SAR研究通过VDAC优化对线粒体Ca²⁺外排的影响，以说明活性的增加。该图显示了化合物1a、5x和7g在筛选试验中的代表性剂量反应曲线。对于每种化合物指示IC₅₀(N＝3个独立实验)。结果以标准差值±SD表示。A.U.为任意单位。

图10：NHKI衍生序列(3c’、7a’、7d’、7f’-g’)对大鼠血清稳定性研究(N＝3个独立实验)。在37℃下培养24小时后，在25％(v/v)大鼠血清和水的存在下，以66.6mol/L的浓度测试所有肽。误差条显示标准偏差。

图11：NHKI衍生肽3c、5x、7d和7g对在补充血清的培养基中培养的坐骨神经外植体的影响。(A)代表性的CARS图像显示收集完整坐骨神经的髓磷脂(绿色)并立即固定在4％的PFA中，将在补充有FBS的培养基中培养的坐骨神经外植体作为阴性对照。(B)代表性的CARS图像显示将坐骨神经外植体的髓磷脂(绿色)在补充有含有3μM NHKI衍生肽的FBS的培养基中培养24小时。所有神经都以纵切片表示。图示了健康髓鞘(白色箭头)、Ranvier结节(白色星形)和髓鞘卵圆形物(橙色箭头)。比例尺：20μm。(C)图示了完整神经(白色图)、阴性对照(浅灰色图)、3c及其类似物7d(蓝色图)和5x及其类似物7g(红色图)中受损纤维百分比。(N＝3个独立实验)。结果以标准差±SD表示。使用单向方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析，随后进行Dunnett多重比较检验。*p<0.05,**p<0.01。ns为差异不显著。

图12：AAV9表示维持靶细胞中抗-脱髓鞘肽表达的有效方法。用对照AAV9或AAV9-HK肽感染或不感染HEK293细胞。两天后，细胞与荧光染料Rhod-2一起孵育，该荧光染料与线粒体中的钙一起发出荧光。15分钟后，将感染的细胞与茉莉酸甲酯(6mM)一起孵育，将未感染的细胞与茉莉酸甲酯(6mM)+5z肽(5μM)一起孵育40分钟。每5分钟拍摄一次照片，对Rhod-2染料进行成像。

实施例1

材料&方法

SAR研究(截断和Ala-扫描)中使用的肽1a-6r购自Proteomic Solutions(Saint-Marcel，法国)。肽7a-g、3c’、5x’、7a’-g’在CEM Liberty One自动微波肽合成仪(CEM公司)上合成。氨基酸和Rink Amide MBHA树脂购自Iris Biotech(德国)，而Rink Amide MBHA LL树脂购自Sigma-Aldrich/Novabiochem(St.Louis,MO，美国)。Oxyma pure和DIC收购自IrisBiotech(Marktredwitz，德国)。HOBt、DIEA和TIS购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,美国)，二氯甲烷和乙腈购自VWR Chemicals(Radnor,Pennsylvania，美国)。DMF购自Carlo ErbaReagents(Val de Reuil，法国)，哌啶(piperidine)购自Acros Organics(Illkirch，法国)，酸酐购自Prolabo(Paris,法国)。大鼠血清和二甲基亚砜购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,美国)。弹性蛋白酶(来自猪胰腺，EC 3.4.21.36)购自Promega(Madison,WI,美国)。

固相肽合成

所有肽均在CEM Liberty One微波辅助肽合成仪上使用Fmoc方案通过标准固相肽合成制备。使用的树脂是Rink Amide MBHA(100-200目，负载0.67mmol/g)，用于以0.1mmol规模合成12-16个肽残基(化合物3c’、5x’、7a’-f’)，Rink Amide MBHALL(100-200目，负载0.36mmol/g)，用于以0.033mmol或0.055mmol规模合成25-29个肽残基(化合物5x、7a-f)。DIC/Oxyma(0.5M/2M的DMF溶液)用作偶联试剂，每种受保护氨基酸的含量是偶联试剂的5倍。在Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联的情况下，进行双偶联。使用20％哌啶的DMF溶液用于对Fmoc基团进行脱保护。将树脂在反应容器中的DMF溶液中溶胀过夜，然后在微波照射下(1mL DIC+0.5mL Oxyma pure，70℃(25W)下10min)进行伸长过程。使用20％哌啶的DMF溶液(75℃下、7mL中持续30秒，然后70℃下、7mL中持续3min)进行脱保护循环。当N-端部分(化合物7a、7b、7d、7e、7f)需要进一步修饰/添加氨基酸时，将树脂分成2或3份。合成完成后，用2×15mL的DMF和2×15mL的DCM洗涤肽结合的树脂。最后，肽的侧链脱保护和从树脂上切割，通过TFA/水/三异丙基硅烷(95/2.5/2.5)处理2-3小时，将肽从树脂中裂解出来。减压蒸发三氟乙酸溶液，随后进行二乙醚沉淀和二乙醚洗涤，得到白色粉末的粗肽。类似物经C18柱反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，产物经LC-MS鉴定。发现所有肽的肽纯度均为≥95％。

分析高效液相色谱

使用赛默飞世尔科技LC-MS设备、Accela HPLC与装有电喷雾电离源和3D离子阱分析仪(锥孔电压为30V)的LCQ Fleet联用对肽进行分析。所用的色谱柱是PhenomenexBioZen^TM2.6μm肽XB-C18(LC色谱柱50x2.1mm)，用0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸乙腈溶液(溶剂B)洗脱，洗脱梯度如下：0-2分钟，20％B；2-5分钟，20-90％B；5-6分钟，90％B；7-10分钟，20％B，流速为0.5mL/min，进样量为10μL。

高效液相色谱纯化

使用装有Waters 2487可调吸光度检测器的Waters 1525色谱系统，通过半制备级HPLC对肽进行纯化，该检测器设置在214nm和254nm，由Breeze软件控制。使用GRACE VydacC-18色谱柱(250x10mm,5μm)，流速为3mL/min。根据肽的极性进行两次纯化梯度。

方法A：将粗肽在0.1％甲酸水溶液(缓冲液A)和0.1％甲酸乙腈(缓冲液B)中从A/B(90:10)到A/B(50:50)洗脱30分钟，然后在A/B(90:10)洗脱5分钟，随后在A/B(90:10)进行2分钟等比梯度洗脱。

方法B：将粗肽在0.1％甲酸水溶液(缓冲液A)和0.1％甲酸乙腈(缓冲液B)中从A/B(80:20)到A/B(30:70)洗脱30分钟，然后在A/B(90:10)洗脱5分钟，随后在A/B(90:10)进行2分钟等比梯度洗脱。

CD光谱学

在Jasco J815分光偏振仪上记录圆二色性(CD)实验。在20℃下，190-260nm的波长范围内，使用1mm光程的CD比色皿，在pH为7的MeOH或DPBS中获得光谱。使用连续扫描模式，响应时间为1.0s，步长为0.2nm，带宽为2nm。通过平均三次扫描获取每个谱频来提高信噪比。通过从样品光谱中减去背景来校正基线。α螺旋含量使用以下公式确定：％螺旋度＝([θ]obs x 100)/(-39500x(1-2.57)/N)，其中([θ])obs是220nm处的平均残基椭圆率，N是肽键的数量。

核磁共振构象分析

通过将NHKI类似物(3c’、7c’、7d’和7g’)溶解在pH为6.8的PBS(10％D2O)中至最终浓度为2mM来制备NMR样品。如果需要，使用微量的0.1M的NaOH或HCl溶液来调节pH。如果出现溶解度问题，则添加高达10％的DMSO。化合物3c’、7d’和7f’在40％TFE(PBS，10％D2O，pH为6.8)存在下进行研究。在40％TFE(PBS，10％D2O，pH为6.8)存在下研究化合物3c’，7d’和7f’。化学位移以三甲基硅基丙酸(TSP)为参考。

所有光谱均记录在蒙彼利埃大学(UM)“测量物理实验室(LMP)”的配备有5mm三重共振冷冻探针(1H、13C、15N)的Bruker Avance 600AVANCE III光谱仪上。通常使用States-TPPI方法在相敏模式下记录同核2D光谱DQF-COSY、TOCSY(DIPSI2)、ROESY和NOESY，作为256-400个实数(t1)×2048(t2)复数数据点的数据矩阵；在两个维度上，每t1增量使用8-48次扫描，恢复延迟为1.0-1.5s，频谱宽度均为6009Hz。TOCSY的混合时间为80ms，ROESY/NOESY实验的混合时间为150ms。使用Topspin(Bruker Biospin)处理谱图，并在Linux工作站上使用Topspin或NMRview 64进行可视化。在F1域中通过移位正弦平方乘法和线性预测进行切趾后，矩阵被零填充至1024(t1)×2048(t2)个点。

蛋白水解稳定性分析

在Tris.HCl缓冲液(50mM，pH 8，含有0.5mM CaCl₂)中制备1mg/mL的弹性蛋白酶储备溶液。在42μL Tris.HCl缓冲液中加入658μL的储备溶液将其稀释至0.94mg/mL。将所有肽溶解在DMSO中以制备6.66mmol/L储备溶液。在pH为8的630μL Tris.HCl缓冲液中加入70μL储备溶液，制备得到稀释后的肽溶液(0.666mmol/L)。在1.5mL Eppendorf中，加入890μL pH为8的Tris.HCl溶液，然后加入100μL肽溶液(0.666mmol/L)，并在降解前在37℃下孵育15分钟。然后，加入10μL弹性蛋白酶溶液(0.94mg/mL)。将反应混合物在37℃下以1000转/分钟的速度振荡培养4小时。在不同时间点取等分试样(50μL)，用450μL甲醇淬灭，并在4℃下离心20分钟(14000rpm)。将上清液转移到注射瓶中，通过LC-MS分析，洗脱程序为0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸乙腈溶液(参见分析数据部分)。通过对HPLC色谱/MS迹线中的相应峰进行积分来计算剩余肽和裂解产物的相对浓度。制备不含该酶的对照肽溶液。除化合物5x’外，对照肽溶液在Tris缓冲液中在37℃下水解4小时后是稳定的。所有蛋白水解降解实验均一式三份进行。

结构计算

¹H化学位移是根据经典程序确定的。NOE交叉峰在NMRView软件中进行整合和分配。亚甲基对质子之间的NOE峰体积用作的参考。对于强、中和弱相关性，所有约束条件的下限固定为/>上限分别为/> 和/>如前所述，对未解析的芳香族、亚甲基和甲基质子信号应用上限的伪原子校正。使用AMBER 16分两个阶段进行结构计算：蒸煮、使用广义Born隐式溶剂模型模拟退火。在1000K下进行蒸煮阶段，以产生100个初始随机结构。在20ps(20000步长，1fs长)内进行模拟退火计算。首先，温度快速升高，并在最初5000步中保持在1000K，然后从第5001步到第18000步，系统逐渐从1000K冷却至100K，最后，在剩余的2000步中温度降至0K。对于前3000步，距离约束的力常数从2.0逐渐增加到20对于模拟的其余部分(3001-20000步)，力常数保持在20/>没有超过/>的20个最低能量结构被认为是肽结构的代表。使用MOLMOL和PyMOL进行表征和定量分析。

大鼠血清的体外代谢稳定性

在降解之前，通过Bradford测定法测定大鼠血清的蛋白质含量，发现其蛋白质含量为108mg/mL。对于每种肽，以6.66mmol/L的浓度制备DMSO储备溶液。取出70μL溶液，并加入到630μL的MilliQ水中，制成水性肽溶液(0.666mmol/L)。反应包括325μL MilliQ水和125μL未稀释的大鼠血清，在37℃下预孵育约10-15分钟，然后加入50μL 0.666mmol/L的肽溶液。将混合物在37℃下孵育，以1000rpm振荡。取不同时间点(0min、5min、15min、30min、1h、2h、3h、5h、7h、24h、48h)等分试样(25μL)，用225μL MeOH终止酶促反应，析出所有血清蛋白。将Eppendorf管在4℃下直接离心(14000rpm)20分钟，以通过造粒除去沉淀的蛋白质。将上清液转移到注射瓶中，并通过LC-MS分析，洗脱程序为0.1％甲酸的水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液(参见分析数据部分)。通过对HPLC色谱/MS迹线中的相应峰进行积分来计算剩余肽和裂解产物的相对浓度。

制备不含大鼠血清的对照肽溶液。发现所有肽对照溶液在37℃的水中均稳定48h以上。所有血清稳定性实验一式三份进行。

细胞培养和转染

HEK-293细胞购自ATCC(美国模式菌种保藏中心，美国)。将它们在37℃的湿润培养箱中培养，其中含有5％CO₂的DMEM(Gibco，Thermo Fisher Scientific，法国)，补充有10％热灭活的FBS(Gibco，Thermo Fisher Scientific，法国)和1％PS(Gibco，Thermo FisherScientific，法国)。

对于肽筛选试验和活体成像实验，根据制造商的建议，使用jet-PRIME试剂(polyplus-transference S.A，法国)用mitoGCaMP2和GCaMP2质粒转染细胞。这两种质粒分别表达线粒体靶向和细胞溶质靶向GCaMP2蛋白。

实时成像

在用mitoGCaMP2或GCaMP2质粒转染的HEK-293细胞上进行活体成像实验。以每孔500,000个细胞接种在6孔微孔板中(NUNC，参考号153066，Thermo Fisher Scientific，法国)，加入1mL补充有10％FBS和1％PS的DMEM中。接种后48小时，根据制造商的方案，使用jet-PRIME试剂用2μgmitoGCaMP2或GCaMP2质粒转染细胞。转染后48小时，将微孔板置于配备有37℃湿化室和5％CO₂的摄像显微镜下。接下来，在1mL不含红苯酚、补充有10％FBS和1％PS并含有0.1％DMSO和5％EtOH的DEME培养基中，向含有或不含有肽1a(33μM)的孔中加入6mM预热的MJ(37℃)。仅含1mL红苯酚的DMEM和补充有10％FBS、1％PS、0.1％DMSO和5％EtOH的孔作为平行对照组。当添加含有或不含有肽1a的MJ时，会触发实时成像采集。对照条件为加入1mL不含红苯酚、含有10％FBS和1％PS，含有0.1％DMSO和5％EtOH的DMEM培养基后触发图像采集。在30分钟内，使用倒置Zeiss Axio Observer Z1(法国蔡司)和20x/0.4物镜(法国蔡司)每2分钟采集一次成像。对于每种情况，进行了三个独立的实验。总的来说，使用Zen软件(Zen 2.3lite，Zeiss，法国)和ImageJ软件(version 1.52o，NIH，美国)分析每个条件下的5个ROI。使用GraphPad Prism软件(版本8.0.1)将结果以平均数±SEM表示。

筛选试验

在用mitoGCaMP2转染的HEK-293细胞上评估所设计化合物的活性。以每孔40,000个细胞接种在涂有多聚-D-赖氨酸(参考655946,Greiner Bio-One,法国)的96孔板中，加入200μL补充有10％FBS和1％PS的DMEM中。接种后24小时，根据制造商的建议，使用jet-PRIME试剂(poly plus-transference S.A，法国)用每孔50ng的mitoGCaMP2质粒转染细胞。转染后48小时，使用酶标仪(BMG Labtech,法国)进行第一次荧光测量。该测量值代表转染后进入线粒体的Ca2+的基础水平。用100μL的PBS洗涤后，细胞与终浓度为6mM的预热(37℃)MJ和指定终浓度的化合物的混合物在含有0.1％DMSO和5％EtOH的PBS中孵育。在细胞培养箱中放置35分钟后，使用酶标仪/>进行第二次荧光测量。该测量值代表了根据肽活性的线粒体Ca²⁺水平。化合物在每个微孔板中测试三次，对每种肽进行三到五次独立的实验。对于剂量效应曲线，化合物在每个微孔板中测试三次，并在三个独立的实验中进行测试。结果表示为第二次测量和第一次测量之间的比值，并归一化为不含有仅含PBS和0.1％DMSO和5％EtOH的化合物的条件。使用GraphPad Prism软件(版本8.0.1)针对平均值±SEM绘制直方图和剂量反应曲线来表示结果。

将小鼠纳入研究

所有小鼠实验均获得Languedoc-Roussillon《区域动物实验伦理委员会》和“高等研究与教育部”的批准(授权2017032115087316和2016091313354892)。所有程序均按照法国动物程序条例(法国法令2013-118和2020-274)和欧盟保护动物福利的具体准则(指令2010/63/EU)进行。将小鼠置于12小时黑暗和12小时光照的循环中，湿度介于40％和60％之间，环境温度为21-22℃。小鼠实验在购自Janvier实验室的12周龄C57BL6/J的小鼠上进行。

坐骨神经外植体培养及CARS成像

使用戊巴比妥(54.7mg/mL,100mg/kg,Centravet,法国)对12周龄的C57BL6/J小鼠实施安乐死。首先，收集坐骨神经，在PBS中洗涤并切除其神经外膜。接下来，将5mm长的神经放入24孔微孔板(NUNC，Thermo Fisher Scientific，法国)中，放入500μL的补充有1％PS和含有或不含有10％FBS(含有3μM的含有0.1％DMSO的化合物)的DMEM中，并进一步在37℃和5％CO₂的湿润室中孵育。阴性对照包括不含有化合物的坐骨神经外植体培养物中(仅补充有1％PS的DMEM，有或没有10％FBS和0.1％DMSO)。收集完整的坐骨神经并立即固定在4％PFA中，作为健康髓鞘的对照，用于CARS成像。培养24小时后，用PBS洗涤坐骨神经外植体三次，并在室温下在4％PFA水溶液(Electron Microscopy Sciences,Thermo FisherScientific,法国)中固定1小时。所有的CARS图像均使用双光子显微镜LSM 7MP耦合到由延迟线补充的OPO(Zeiss,法国)获得的。使用×20水浸物镜(W Plan Apochromat DIC VIS-IR,Zeiss,法国)进行图像采集。每次采集都在三个独立的实验中进行。对于每个实验，使用Zen软件(Zen 2.3lite，Zeiss，法国)在每个条件下使用三个ROI来量化每个区域的受损纤维百分比。结果以标准差±SD表示。

统计分析

使用excel(Microsoft Office Standard 2016)和GraphPad Prism软件(版本8.0.1)分析数据，如图中图例所示，表示为平均值±SD或±SEM。平均值之间的统计差异使用单向方差分析，随后进行Dunnett多重比较检验，或使用双向方差分析，随后进行Tukey多重比较检验，如图例所示。数值之间的差异被认为是显著的：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001。ns为差异不显著。

结论

肽1-7的合成

允许ala扫描的肽库1、2，用于缺失研究的肽库3、4和用于第一轮优化的肽库5均购买于Proteomic Solutions。使用Rink酰胺树脂通过固相Fmoc/tBu策略合成肽库6和7。延伸完成后，使用TFA将肽从树脂上切割下来，得到目标化合物，根据HPLC/MS分析，每种合成肽的产率范围为x％至x％，纯度至少为95％。除了库7’中的肽以外，所有肽1-7都含有Tat细胞穿透肽，用于在纤维结合分析过程中确保肽内化。将Tat放置在HK片段的C-端或N-端，以评估其对VDAC识别的影响(图4)。

结合分析

肽的生物筛选基于茉莉酸甲酯(MJ)以时间和剂量依赖的方式结合和分离线粒体VDAC中HK-1的能力^16,20。为此，我们开发了一种细胞内筛选试验，其中表达VDAC和HK,25的HEK-293细胞用胞质Ca²⁺感应探针GCaMP2或与线粒体基质相同探针mitoGCaMP2转染。如前所述，使用这些探针可以实时监测细胞质和线粒体Ca²⁺水平。从VDAC中去除HK的MJ用于诱导线粒体外的Ca²⁺释放，这通过细胞中mitoGCaMP2荧光的下降和GCaMP2荧光的增加来测量。然后，模拟NHKI序列的化合物可以在MJ存在下阻断这种释放，并通过与VDAC结合来维持线粒体和细胞质中的荧光水平。另一方面，VDAC的低活性化合物会导致线粒体中的荧光减少，并在加入MJ后观察到细胞质中的荧光增加。

为了验证该试验，我们对用mitoGCaMP2或其细胞质形式GCaMP2转染的HEK-293细胞进行了延时成像。线粒体或胞质溶胶中Ca²⁺的基础水平在治疗前至少保持30分钟稳定。用MJ(T＝0)处理后，mitoGCaMP2的荧光至少在30min内显著降低(图5A)，这表明线粒体Ca²⁺的释放。

相反，在相同的时间范围内，GCaMP2的荧光显著增加(图5B)，表明胞质Ca²⁺的增加伴随着线粒体Ca²⁺的释放。MJ处理诱导的任何荧光变化都被模拟NHK-I序列的肽1a(图5A中的MJ+肽1a条件)或胞质溶胶(图5B中的MJ+肽1a条件)阻断，表明该肽能够随着时间的推移通过VDAC阻断线粒体钙的释放。

因此，这在纤维素系统中构成了一种相关的测定法，测量化合物通过VDAC对线粒体Ca²⁺释放的活性。采用该方法测得化合物1a和2a的IC₅₀分别为15.6±2μM和13.9±3.1μM(数据未显示)。根据这些数据，我们使用这些条件在10μM下筛选新肽活性。Tat肽在N-端或C-端的位置不影响NHKI肽的活性。

肽1a和2a的Ala扫描

为了鉴定参与VDAC识别的肽1a和2a的氨基酸，我们对这两种肽进行了ala扫描。我们为每个肽合成了十二个衍生物，其中所有氨基酸都被丙氨酸递送序列1b-m和2b-m取代(图6A，6B)。分别使用上述结合测定法，在10μM浓度下对序列1和2中因N端或C端而不同的两个系列进行测试。这两个序列表现相似。事实上，化合物1e-f、1i、2e-f和2i中，NHK1中的亮氨酸6、7和苯丙氨酸11被丙氨酸取代导致对VDAC的亲和力下降。化合物11中亮氨酸14被丙氨酸取代诱导了类似的亲和力下降，尽管在相应的化合物21中没有观察到这种情况。

肽1a、2a的缺失研究

通过对NHK1序列的缺失研究(图6C，6D)完成了这一ala扫描，以确定可用于适当结合VDAC的最小序列。通过以1a为基础合成的7种肽3a-g来研究N-末端缺失，并通过以2a为基础合成的同类肽4a-g来研究C-端缺失。两个序列在10μM浓度下进行了测试。从残基1延伸至3的NHK1的N-端部分似乎不是必需的，如化合物3a-c所示。证实了ala扫描的结果，化合物3f-g中亮氨酸6和7的缺失对于与VDAC的相互作用是有害的。如化合物4a-c所证明，化合物2a的最后3个C-端氨基酸(ELK)的缺失诱导了荧光的下降。令人惊讶的是，化合物4d保留了对VDAC的显著亲和力，再次突出了苯丙氨酸11在与VDAC的相互作用中的关键作用。因此，正如Ala扫描和缺失研究结合所证明的那样，NHK1肽的疏水序列AQLLAYYF(SEQ ID NO:89)构成了与VDAC相互作用的核心。

结合优化

因此，我们保留了肽3c和4d，其序列被缩短以进行第二次优化，旨在用等位配对物取代疑似参与VDAC相互作用的氨基酸。因此，化合物3c提供了一系列新的化合物5a-h，其中NHK1序列第12位的独特苏氨酸被酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和缬氨酸取代，以研究苏氨酸携带的羟基部分的重要性。在同一系列研究中，亮氨酸14被缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸取代，以评估β-支链或芳香族氨基酸的影响。对化合物4d的亮氨酸6和亮氨酸7应用相同的取代，其中亮氨酸，色氨酸和酪氨酸用作苯丙氨酸11的取代物(数据未显示)。

当引入带负电荷的天冬氨酸时，5a-d中的苏氨酸12取代效率不高，甚至有害(5b)。相反，亮氨酸被色氨酸取代略微增强了与VDAC的相互作用，如化合物5h和6d所示，但在6h中亮氨酸7被取代的水平更显著。最后，化合物5h中色氨酸取代亮氨酸14也显著导致活性增加。因此，NHK1与VDAC的相互作用主要由疏水残基介导，根据氨基酸疏水性等级，色氨酸被认为是最疏水的残基，这加强了这种相互作用^35,36。

为了利用这些结果，将具有积极作用的修饰结合在一起，在3μM下进行测试化合物5i-z和6l-r，并分别与3c和4d进行比较。对于系列化合物5i-z和6l-r，化合物3c和4d作为基准。将参考物浓度从10μM降低到3μM，可以使VDAC保持在部分封闭状态，从而更好地区分阻断钙外流的化合物。如化合物5x、5z和6q所示，虽然疏水性亮氨酸6或7被色氨酸单独取代伴随着适度的亲和力增加，但将这两种取代结合在单个肽中更为显著。然而，苯丙氨酸11的取代不太容易分析，但是5l、6q中的亮氨酸或5t、5m、6m、6o中的酪氨酸同样位于该位置。最后，用色氨酸取代亮氨酸14对化合物5l、5t、5x和5z也有有益的作用。

通过加强螺旋折叠的结合优化

我们引入的最后一个修饰，旨在考虑NHK1序列采用的螺旋折叠³⁷。为此，在HK-1序列的N-端引入了改变丙氨酸和α-氨基异丁酸(Aib,U)的序列，这两种物质都是都是α-螺旋诱导物，从而产生了肽系列7。此外，这种修饰有望降低化合物对蛋白水解裂解的敏感性。此外，由于疏水相互作用限制了适当的VDAC相互作用，我们引入了3-CF₃Ph[Tz]U二肽作为N-端封端，这在先前的研究中显示出增强肽在膜内的插入(图8A)³⁸。

对系列7a-g在10μM和3μM下进行了筛选试验(图8A-B)。在这一系列中，尽管7b、7d、7f和7g明显比化合物3c和5x更有活性(图8A)，但当在10μM下测试时，只有7f和7g在3μM处仍表现出明显更高的活性(图8B)。因此，为了精确确定它们的活性，在筛选试验中以剂量反应方式测试了7f和7g(数据未显示)。它们的IC₅₀分别为2.6±0.6μM和1.7±0.2μM。总结这项SAR研究，HK的AQLLAYYF序列(SEQ ID:36)包含与HK相互作用的关键残基。更具体地说，由亮氨酸6，7和苯丙氨酸11构成的疏水片段控制相互作用，它们被色氨酸取代增强了相互作用。如在筛选试验中对化合物1a、5x和7g进行的剂量反应实验所示(图9)，不同的优化步骤导致通过VDAC外排线粒体Ca²⁺的活性提高了10倍。此外，不同系列化合物的螺旋轮突将参与VDAC相互作用的残基置于螺旋的同一面上(数据未显示)。

圆二色性

通过圆二色性分析PBS缓冲液中的化合物3c、5x、7a-f。虽然化合物3c、5x、7a未被结构化，但化合物7b-f在210和220nm附近呈现负最大值，与部分结构化为α-螺旋的肽相容(数据未显示)。为了评估在N端引入的Aib在NHK1肽结构中的作用，合成了没有Tat序列的化合物3c’、7a’、7b’和7c’(数据未显示)。如对化合物7b’和7c’所观察到的那样，在PBS溶液中，在NHK序列的N-端引入的AU重复序列允许化合物逐渐折叠成螺旋(数据未显示)。由于在PBS溶液中，CD光谱不能扩展到整个波长范围，因此我们在甲醇中进行了分析。虽然化合物3c在PBS中呈现无规卷曲结构，由于甲醇的渗透作用，化合物3c开始折叠成螺旋。然而，在PBS中观察到的折叠趋势取决于序列中引入的Aib的量，这被证实为含有三个Aib的化合物7d’是该系列中结构最强的(数据未显示)。

蛋白水解稳定性分析

虽然Tat被证明是可用于递送生物活性物质(如NHK1衍生肽)的合适CPP，但其使用因血清稳定性差而受到影响^39,40。事实上，血清中的Tat序列半衰期小于6分钟^41,42。此外，血清由不允许识别不同切割位点的酶的混合物构成。在初步实验中，肽3c在25％大鼠血清中的溶液证实了这种不稳定性，因为5min后只有10％的3c残留(数据未显示)。此外，多个切割位点会产生过多的片段，其浓度低于LC-MS仪器的检测限，无法进行鉴定。因此，使用确定的蛋白水解酶来鉴定优选的切割位点通常更方便。

在本实验室现有的酶中，选择了胰腺和血清中发现的丝氨酸内肽酶弹性蛋白酶中(EC 3.4.21.36)，由于在P1位置的丙氨酸和亮氨酸具有显著的初级特异性而被选择，这两种氨基酸存在于AQLLAYYF序列(SEQ ID NO:89)中，它们需要保持完整才能进行VDAC识别，但在TAT中不存在^43,44。因此，由于NHK1序列对于与VDAC的正确结合至关重要，我们致力于研究没有Tat的NHK1序列，并在pH值为8的Tris-HCl缓冲液中将化合物3c’、5x’、7a’和7d’-f’暴露于弹性蛋白酶两个小时(数据未显示)。

从这组化合物中，含有NHKI序列的肽3c’和5x’在第一个优化步骤后诱导了最高的活性，在不到30分钟的时间内被完全降解。在7c’和7e’中这些肽的N-端添加AUAU补丁对提高它们的代谢稳定性无效(数据未显示)。然而，用Aib取代7a’和7d’的8位丙氨酸提高了它们对弹性蛋白酶的稳定性。此外，尽管8位丙氨酸是保守的，但N-端用三唑衍生物封端的化合物7f’是最稳定的化合物(数据未显示)。值得注意的是，弹性蛋白酶的主要切割位点位于丙氨酸8的C-端，因为半衰期缩短(3c’、5x’、7c’和7e’)的化合物含有这种丙氨酸。因此，酶促片段符合弹性蛋白酶的特异性，并用Aib取代了8位丙氨酸，从而提高了稳定性。

为了验证在更复杂的介质中稳定性是否能够保持这种，我们在含有数百种肽酶的大鼠血清中测试了对弹性蛋白酶具有最高稳定性的化合物7a’、7d’和7f’，以及在8位带有Aib而不是丙氨酸的7f’类似物，即化合物7g’。43化合物3c’和5x’用作参照(图10)。

根据弹性蛋白酶获得的数据，化合物3c’很容易被大鼠血清中存在的蛋白水解酶处理，1小时后仅剩下8％(图10)。化合物7f’以相当的速度消失，这表明在血清中，简单地用三唑基团对肽进行封端是不够的。然而，用7g’中的Aib替换8位的丙氨酸在24小时后仍保留了54％的化合物。化合物7a’随着时间的推移表现出较慢的降解，孵育24小时后，剩余约为65％的化合物，而7d’(7a’的类似物)在N-端含有AUAU补丁，其表现出最佳的血清肽酶耐药性，能够剩余75％的化合物(图10)。通过高分辨率串联质谱鉴定酶促片段。

总之，这些稳定性研究表明，8位的丙氨酸似乎是酶促裂解NHKI衍生肽的优先位点。事实上，在第8位添加Aib增强了NHKI对血清蛋白酶的稳定性。通过用3-CF₃-Ph[Tz]U衍生物或AUAU补丁对N-端封端，进一步增强了这种稳定性。

坐骨神经外植体培养物的离体活性

接下来，我们测试了NHKI衍生化合物在坐骨神经外植体培养物上的活性，在这种培养物中，施万细胞通过涉及线粒体Ca²⁺通过VDAC1释放的机制发生脱髓鞘。44,45,9使用相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)非线性显微镜对坐骨神经外植体中的完整髓鞘进行成像和定量。这种成像方法不需要任何特异性标记，适用于髓鞘分析^47,48。在使用CARS成像的完整坐骨神经中，SC产生的髓鞘在轴突周围形成一条连续的线(图11)，但Ranvier节点除外(图11)。在细胞培养基中孵育神经24小时后，出现以形成卵形体为特征的自发性脱髓鞘(图11)。脱髓鞘通过测量受损纤维(即显示卵圆形形成)占成像纤维总数的百分比来量化。

在第一组实验中，筛选试验中活性最高的化合物，即7d和7g，以及作为对照的相关化合物3c和5x，在培养基中不添加血清的情况下，以3μM的浓度进行测试(数据未显示)。在无血清培养基中培养24小时后，化合物3c的损伤纤维百分比与阴性对照相同，而其他化合物受损纤维的水平均显著降低(数据未显示)。与我们之前的实验一致，优化后的化合物7d和7g的活性明显高于对照化合物3c和5x。此外，这些优化的化合物显示出与完整神经(数据未显示)相同的髓鞘模式。在无血清培养基条件下获得的结果与筛选试验的结果相关，优化后的化合物对阻断线粒体Ca²⁺释放具有增强的活性。

在下一组实验中，在补充有血清的培养基中以3μM的浓度测试相同的化合物(图11A-C)。在所有测试的化合物中，只有化合物7d和7g能够显著降低神经纤维损伤，这表明这些肽能有效阻断脱髓鞘，又能在血清中稳定足够长的时间且有效。值得注意的是，这两种化合物能够显著地将髓鞘保持在与完整神经相似的水平(图11A-C)。

总而言之，结果证实了化合物7d和7g具有更高的蛋白水解稳定性，因此，8位A8U取代与AUAU补丁或N-端三唑部分联合使用具有积极作用。

讨论

本文提出了基于VDAC1与HK1和HK2结合结构的两种分子模型^46,47。两种模型的形状相似，HK位于孔道顶部，从而封闭了通道。构成HK N-端螺旋的25个残基楔入N-端VDAC螺旋和桶壁之间。HK2中丝氨酸突变为非极性亮氨酸增加了突变体的稳定性及其与VDAC的结合。Ala扫描与缺失研究相结合，使我们能够确定AQLLAYYF序列(SEQ ID NO:89)及其亮氨酸和苯丙氨酸是VDAC相互作用的关键。这三种氨基酸被更疏水的氨基酸如色氨酸取代，增强了与VDAC的相互作用，从而证实了疏水性和结合能力之间关系的假设⁴⁸。采用螺旋折叠³⁷的HK的N-端序列，我们考虑了亮氨酸6、7和苯丙氨酸11构成位于螺旋同一面的疏水区的可能性。因此，我们试图通过在HK序列中添加螺旋诱导剂(如Aib)来加强螺旋折叠。正如预期的那样，这种取代会引起螺旋折叠，这种折叠在有机溶剂(如甲醇)中比在缓冲溶液中更明显，并且伴随着对孔隙的结合亲和力增加。然而，这一结果与将N-端螺旋塞入滤水孔的分子模型相悖。事实上，虽然孔蛋白通道大多是带正电荷的，但是位于VDAC胞质暴露环上的带负电荷的残基E66，E73，K74，D78，E189，E203在HK⁴⁹的结合中是必不可少的，而对HK的N-端区域参与结合的残基却知之甚少⁵⁰。事实上，HK与VDAC相互作用所必需的N-端螺旋主要由疏水残基构成，因此无法直接与带电的VDAC残基结合。然而，不同的研究强调E73是HK结合⁵¹的关键残基，这也得到了消除HK1结合的E73Q突变的支持。E73在b-管的外侧有一个特别的位置，指向薄膜^52,3,4。E73也被光亲和方法鉴定为胆固醇和神经类固醇的优势结合位点⁵³。在这种情况下，类固醇与VDAC的结合并不影响其电导能力，但更有可能表明类固醇结合位点与通道二聚化或己糖激酶介导的信号传导有关。有证据表明，胆固醇负载会影响HK与VDAC的结合，因此开发出了胆固醇肟(胆固醇异羟肟酸衍生物)。最近的研究表明，高度疏水性的胆固醇肟并没有进入充满水的VDAC孔，而是在蛋白质脂质界面上发生了相互作用⁵⁴。因此，具有疏水性3-CF₃-Ar[Tz]标记的化合物7f可能以类似的方式与VDAC的b管的疏水外部相互作用，因为这也适用于将HK螺旋插入脂质双分子层中⁵⁰。此外，与化合物7f具有相似分子模式的不同小分子也能与VDAC-1相互作用，它们的结合是通过微尺度热电泳分析确定的^55,56。我们在这项工作中开发的疏水稳定螺旋的性质促使我们倾向于螺旋在膜和VDAC之间的膜界面处直接相互作用。因此，正如最近在电生理测量维持的模型中提出的，HK螺旋可以定义为启动HK/VDAC相互作用的膜锚着点⁵⁷。在这种情况下，这种螺旋可以作为开发交联探针的工具，能够将NHK1序列正确地放置在VDAC界面上。

实施例2

我们生产了一种表达HK肽5z(AAV9-HK肽)的AAV9病毒。用对照AAV9或AAV9-HK肽感染或不感染HEK293细胞。两天后，用荧光染料Rhod-2对细胞进行孵育，Rhod-2能与线粒体中的钙一起发出荧光。15分钟后，感染细胞与茉莉酸甲酯(6mM)一起孵育，未感染细胞与茉莉酸甲酯(6mM)+5z肽(5μM)一起孵育40分钟。每隔5分钟拍摄一次Rhod-2染料成像图。

茉莉酸甲酯诱导感染对照病毒的细胞线粒体中的Rhod-2荧光下降，这与之前实验中未感染细胞中的下降相似。在感染了表达5z肽的病毒的细胞或用5z肽处理过的细胞中，Rhod-2的荧光没有减少(图12)。

这表明，表达5z肽的AAV9病毒在茉莉酸甲酯存在下可防止线粒体钙释放，如5z肽所做的那样。AAV9表达是在靶细胞中持续表达抗-脱髓鞘肽的有效方法。

参考文献

在整个申请过程中，各种参考文献描述了与本发明相关的现有技术。这些参考文献的披露特此通过引用并入本公开。

1.Sander,P.,Gudermann,T.&Schredelseker,J.A Calcium Guard in the OuterMembrane:Is VDAC a Regulated Gatekeeper of Mitochondrial Calcium Uptake？Int.J.Mol.Sci.22,(2021).

2.Shoshan-Barmatz,V.et al.VDAC,a multi-functional mitochondrialprotein regulating cell life and death.Mol.Aspects Med.31,227–285(2010).

3.Hiller,S.et al.Solution Structure of the Integral Human MembraneProtein VDAC-1in Detergent Micelles.Science 321,1206–1210(2008).

4.Ujwal,R.et al.The crystal structure of mouse VDAC1 at resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,17742–17747(2008).

5.Choudhary,O.P.et al.Structure guided simulations illuminate themechanism of ATP transport through VDAC1.Nat.Struct.Mol.Biol.21,626–632(2014).

6.De Pinto,V.et al.Determination of the Conformation of the HumanVDAC1 N-Terminal Peptide,a Protein Moiety Essential for the FunctionalProperties of the Pore.ChemBioChem 8,744–756(2007).

7.Manzo,G.et al.Folded Structure and Membrane Affinity of the N-Terminal Domain of the Three Human Isoforms of the Mitochondrial Voltage-Dependent Anion-Selective Channel.ACS Omega 3,11415–11425(2018).

8.Shoshan-Barmatz,V.,Pittala,S.&Mizrachi,D.VDAC1 and the TSPO:Expression,Interactions,and Associated Functions in Health and DiseaseStates.Int.J.Mol.Sci.20,3348(2019).

9.Winquist,R.J.&Gribkoff,V.K.Targeting putative components of themitochondrial permeability transition pore for novel therapeutics.Biochem.Pharmacol.177,113995(2020).

10.Klapper-Goldstein,H.et al.VDAC1 in the diseased myocardium andtheeffect of VDAC1-interacting compound on atrial fibrosis inducedbyhyperaldosteronism.Sci.Rep.10,(2020).

11.Wilting,F.et al.The antiarrhythmic compound efsevindirectlymodulates voltage-dependent anion channel 2 by binding to its innerwall andenhancing mitochondrial Ca2+uptake.Br.J.Pharmacol.177,2947–2958(2020).

12.van Delft,M.F.et al.A small molecule interacts with VDAC2 toblockmouse BAK-driven apoptosis.Nat.Chem.Biol.15,1057–1066(2019).

13.Shoshan-Barmatz,V.,Krelin,Y.,Shteinfer-Kuzmine,A.&Arif,T.Voltage-Dependent Anion Channel 1 As an Emerging Drug Target for NovelAnti-CancerTherapeutics.Front.Oncol.7,(2017).

14.Zhang,E.et al.Preserving Insulin Secretion in Diabetes byInhibitingVDAC1 Overexpression and Surface Translocation inβCells.Cell Metab.(2018)doi:10.1016/j.cmet.2018.09.008.

15.Pittala,S.et al.The VDAC1-based R-Tf-D-LP4 Peptide as aPotentialTreatment for Diabetes Mellitus.Cells 9,(2020).

16.Sohlang,M.N.&Majaw,S.Altered VDAC-HK association andapoptosis inmouse peripheral blood lymphocytes exposed to diabetic condition:an in vitroand in vivo study.Arch.Physiol.Biochem.1–11(2021)doi:10.1080/13813455.2020.1867187.

17.Kim,J.et al.VDAC oligomers form mitochondrial pores toreleasemtDNA fragments and promote lupus-like disease.Science 366,1531–1536(2019).

18.Smilansky,A.et al.The Voltage-dependent Anion Channel 1MediatesAmyloidβToxicity and Represents a Potential Target for AlzheimerDiseaseTherapy.J.Biol.Chem.290,30670–30683(2015).

19.Shoshan-Barmatz,V.,Nahon-Crystal,E.,Shteinfer-Kuzmine,A.&Gupta,R.VDAC1,mitochondrial dysfunction,and Alzheimer’s disease.Pharmacol.Res.131,87–101(2018).

20.Rostovtseva,T.K.et al.α-Synuclein Shows High Affinity Interactionwith Voltage-dependent Anion Channel,Suggesting Mechanisms of MitochondrialRegulation and Toxicity in Parkinson Disease*.J.Biol.Chem.290,18467–18477(2015).

21.Karachitos,A.,Grobys,D.,Kulczyńska,K.,Sobusiak,A.&Kmita,H.TheAssociation of VDAC with Cell Viability of PC12 Model of Huntington’sDisease.Front.Oncol.6,(2016).

22.Israelson,A.et al.Misfolded Mutant SOD1 Directly Inhibits VDAC1Conductance in a Mouse Model of Inherited ALS.Neuron 67,575–587(2010).

23.Magrì,A.et al.Hexokinase I N-terminal based peptide prevents theVDAC1-SOD1 G93A interaction and re-establishes ALS cell viability.Sci.Rep.6,34802(2016).

24.Pittala,S.,Krelin,Y.,Kuperman,Y.&Shoshan-Barmatz,V.A MitochondrialVDAC1-Based Peptide Greatly Suppresses Steatosis and NASH-AssociatedPathologies in a Mouse Model.Mol.Ther.27,1848–1862(2019).

25.Pittala,S.,Krelin,Y.&Shoshan-Barmatz,V.Targeting Liver Cancer andAssociated Pathologies in Mice with a Mitochondrial VDAC1-BasedPeptide.Neoplasia N.Y.N 20,594–609(2018).

26.Bryan,N.&Raisch,K.P.Identification of a mitochondrial-binding siteon the N-terminal end of hexokinase II.Biosci.Rep.35,(2015).

27.Abramov,A.Y.,Berezhnov,A.V.,Fedotova,E.I.,Zinchenko,V.P.&Dolgacheva,L.P.Interaction of misfolded proteins and mitochondria inneurodegenerative disorders.Biochem.Soc.Trans.45,1025–1033(2017).

28.Magri,A.&Messina,A.Interactions of vdac with proteins involved inneurodegenerative aggregation:an opportunity for advancement on therapeuti cmolecules.Curr.Med.Chem.24,4470–4487(2017).

29.Tricaud,N.et al.Schwann cell demyelination is triggered by atransient mitochondrial calcium release through Voltage DependentAnionChannel 1.bioRxiv 581157(2019)doi:10.1101/581157.

30.Tricaud,N.&Park,H.T.Wallerian demyelination:chronicle of acellularcataclysm.Cell.Mol.Life Sci.74,4049–4057(2017).

31.Goldin,N.et al.Methyl jasmonate binds to and detachesmitochondria-bound hexokinase.Oncogene 27,4636–4643(2008).

32.Magalon,K.et al.Olesoxime accelerates myelination andpromotesrepair in models of demyelination.Ann.Neurol.71,213–226(2012).

33.Weber,J.J.,Clemensson,L.E.,H.B.&Nguyen,H.P.Olesoxime inneurodegenerative diseases:Scrutinising a promising drugcandidate.Biochem.Pharmacol.168,305–318(2019).

34.Hantke,J.et al.A mutation in an alternative untranslated exonofhexokinase 1 associated with hereditary motor and sensory neuropathy--Russe(HMSNR).Eur.J.Hum.Genet.EJHG 17,1606–1614(2009).

35.Wilce,M.C.J.,Aguilar,M.-Isabel.&Hearn,M.T.W.Physicochemical Basisof Amino Acid Hydrophobicity Scales:Evaluation ofFour New Scales of AminoAcid Hydrophobicity Coefficients Derived fromRP-HPLC ofPeptides.Anal.Chem.67,1210–1219(1995).

36.Wimley,W.C.&White,S.H.Experimentally determinedhydrophobicityscale for proteins at membrane interfaces.Nat.Struct.Biol.3,842–848(1996).

37.Mulichak,A.M.,Wilson,J.E.,Padmanabhan,K.&Garavito,R.M.Thestructure of mammalian hexokinase-1.Nat.Struct.Biol.5,555–560(1998).

38.Das,S.et al.Enhancing the Antimicrobial Activity ofAlamethicinF50/5 by Incorporating N-terminal Hydrophobic TriazoleSubstituents.Chem.–Eur.J.23,17964–17972(2017).

39.Koren,E.,Apte,A.,Sawant,R.R.,Grunwald,J.&Torchilin,V.P.Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems:Proteolyticstabilityrequirements.Drug Deliv.18,377–384(2011).

40.Young Kim,H.,Young Yum,S.,Jang,G.&Ahn,D.-R.Discovery of anon-cationic cell penetrating peptide derived from membrane-interactinghumanproteins and its potential as a protein delivery carrier.Sci.Rep.5,11719(2015).

41.Stalmans,S.et al.Cell-Penetrating Peptides Selectively CrosstheBlood-Brain Barrier In Vivo.PLOS ONE 10,e0139652(2015).

42.Rizzuti,M.,Nizzardo,M.,Zanetta,C.,Ramirez,A.&Corti,S.Therapeuticapplications of the cell-penetrating HIV-1 Tat peptide.Drug Discov.Today 20,76–85(2015).

43.Lee,V.H.L.&Yamamoto,A.Penetration and enzymatic barriers topeptideand protein absorption.Adv.Drug Deliv.Rev.4,171–207(1989).

44.Hooper,N.M.Proteolytic enzymes:A practical approach Edited by RJBeynon and J S Bond.pp 259.IRL Press at Oxford University Press,Oxford.1989.￡29(spiral bound)/￡19(paper)ISBN 0-19-963058-5/963059-3.Biochem.Educ.18,55–55(1990).

45.Maffioli,E.et al.High-Resolution Mass Spectrometry-BasedApproachesfor the Detection and Quantification of Peptidase Activity inPlasma.Molecules 25,4071(2020).

46.Rosano,C.Molecular model of hexokinase binding to theoutermitochondrial membrane porin(VDAC1):Implication for the design ofnewcancer therapies.Mitochondrion 11,513–519(2011).

47.Zhang,D.,Yip,Y.M.&Li,L.In silico construction of HK2-VDAC1complexand investigating the HK2 binding-induced molecular gatingmechanism ofVDAC1.Mitochondrion 30,222–228(2016).

48.Gelb,B.D.et al.Targeting of hexokinase 1 to liver and hepatomamitochondria.Proc.Natl.Acad.Sci.89,202–206(1992).

49.Abu-Hamad,S.,Zaid,H.,Israelson,A.,Nahon,E.&Shoshan-Barmatz,V.Hexokinase-I Protection against Apoptotic Cell Death IsMediated viaInteraction with the Voltage-dependent Anion Channel-1:MAPPING THE SITE OFBINDING.J.Biol.Chem.283,13482–13490(2008).

50.Xie,G.&Wilson,J.E.Rat brain hexokinase:The hydrophobie N-terminusof the mitochondrially bound enzyme is inserted in the lipid bilayer.Arch.Biochem.Biophys.267,803–810(1988).

51.Zaid,H.,Abu-Hamad,S.,Israelson,A.,Nathan,I.&Shoshan-Barmatz,V.Thevoltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death.Cell DeathDiffer.12,751(2005).

52.Bayrhuber,M.et al.Structure of the human voltage-dependent anionchannel.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,15370–15375(2008).

53.Cheng,W.W.L.et al.Multiple neurosteroid and cholesterol bindingsites in voltage-dependent anion channel-1 determined by photo-affinitylabeling.Biochim.Biophys.Acta BBA-Mol.Cell Biol.Lipids 1864,1269–1279(2019).

54.Rovini,A.et al.Molecular mechanism of olesoxime-mediatedneuroprotection through targetingα-synuclein interaction with mitochondrialVDAC.Cell.Mol.Life Sci.(2019)doi:10.1007/s00018-019-03386-w.

55.Ben-Hail,D.&Shoshan-Barmatz,V.VDAC1-interacting anion transportinhibitors inhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis.Biochim.Biophys.ActaBBA-Mol.Cell Res.1863,1612–1623(2016).

56.Ben-Hail,D.et al.Novel Compounds Targeting the MitochondrialProtein VDAC1 Inhibit Apoptosis and Protect against MitochondrialDysfunction.J.Biol.Chem.291,24986–25003(2016).

57.Haloi,N.et al.Structural Basis of Complex Formation BetweenMitochondrial Anion Channel VDAC1 and Hexokinase-II.bioRxiv 2020.11.18.365965(2020)doi:10.1101/2020.11.18.365965.

58.Horton K.L.,Stewart K.M.,Fonseca S.B.,Guo Q.,KelleyS.O.Mitochondria-penetrating peptides.Chem Biol.2008 Apr；15(4):375-82.

Claims (16)

1.一种HK-衍生肽，所述HK-衍生肽具有氨基酸序列：丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-X₁-X₂-X₃-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-X₄(SEQ ID NO:1)；

其中，X₁为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₂为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₃为丙氨酸(A)、D-异构丙氨酸(A_D)或α-氨基异丁酸(U)；

X₄为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)；

其中，所述HK-衍生肽不包含如SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，并且所述HK-衍生肽不包含如SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的HK-衍生肽，所述HK-衍生肽包含氨基酸序列：丙氨酸(A)-谷氨酰胺(Q)-X₁-X₂-X₃-酪氨酸(Y)-酪氨酸(Y)-X₄-苏氨酸(T)-谷氨酸(E)-X₅-赖氨酸(K)(SEQ IDNO:2)；

其中，X₁为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₂为亮氨酸(L)或色氨酸(W)；

X₃为丙氨酸(A)、D-异构丙氨酸(A_D)或α-氨基异丁酸(U)；

X₄为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)；

X₅为亮氨酸(L)或色氨酸(W)。

3.根据权利要求1或2所述的HK-衍生肽，其中，X₃为α-氨基异丁酸(U)。

4.根据权利要求1或3所述的HK-衍生肽，其中，所述HK-衍生肽包含8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸。

5.根据权利要求1所述的HK-衍生肽，其中，所述HK-衍生肽包含或由选自下组中的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53。

6.根据权利要求5所述的HK-衍生肽，其中，所述HK-衍生肽包含或由以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:29。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的HK-衍生肽，其中，序列AUAU(SEQ ID NO:54)或序列AU(SEQ ID NO:55)与所述HK-衍生肽偶联。

8.根据权利要求1-6中任意一项所述的HK-衍生肽，其中，二肽3-CF₃Ph[Tz]U与所述HK-衍生肽的N-端偶联；

其中，所述二肽3-CF₃Ph[Tz]U具有如下分子式：

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的HK-衍生肽，其中，细胞穿透序列与所述HK-衍生肽偶联。

10.根据权利要求9所述的HK-衍生肽，其中，所述细胞穿透序列为tat(SEQ ID NO:58)。

11.一种载体，包含权利要求1-10中任意一项所述HK-衍生肽。

12.权利要求1-10中任意一项所述的HK-衍生肽或权利要求11所述的载体在治疗中的用途。

13.权利要求1-10中任意一项所述的HK-衍生肽或权利要求11所述的载体在治疗外周脱髓鞘疾病、心肌疾病、癌症、糖尿病、狼疮样疾病、非酒精性脂肪性肝病、神经源性疾病如化疗诱导的神经性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、ALS中的用途。

14.根据权利要求13所述的HK-衍生肽的用途，其中，所述周围脱髓鞘疾病选自以下的组：雷富孙氏病(Refsum's disease)、无β-脂蛋白血症(Abetalipoproteinemia)、丹吉尔病(Tangier disease)、半乳糖脑苷脂积累症(Krabbe's disease)、异染色性脑白质障碍症(Metachromatic leukodystrophy)、费勃莱氏病(Fabry's disease)、肥大性间质性多发性神经病(Dejerine-Sottas syndrome)、腓骨肌萎缩征(Charcot-Marie-Tooth Disease)、遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)、家族性淀粉样周围神经病(Familial AmyloidoticNeuropathy)、遗传性感觉和自主神经病II型(HSN II)、遗传性卟啉症(hereditaryporphyria)、肌营养不良症(muscular dystrophies)、肥大性间质性多发性神经病(Dejerine-Sottas syndrome)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathies)、免疫型的神经病变(immune-mediated neuropathies)、急性运动性神经病(Acute MotorNeuropathy)、急性感觉神经病变(Acute Sensory Neuropathy)、急性自主神经病(Acute AutonomicNeuropathy)、米勒费雪综合征(miller-fisher syndrome)、慢性多发性神经病(ChronicPolyneuropathies)、与血管炎或周围神经血管炎症相关的周围脱髓鞘疾病、与单克隆丙种球蛋白相关的周围脱髓鞘疾病、与肿瘤或肿瘤相关的周围脱髓鞘疾病、药物引起的周围脱髓鞘疾病、由感染引起的周围脱髓鞘疾病、营养失衡引起的周围脱髓鞘疾病、肾脏疾病引起的周围脱髓鞘疾病、甲状腺功能减退性神经病、酒精和毒素引起的周围脱髓鞘疾病、外伤或压迫引起的周围脱髓鞘疾病以及突发性周围脱髓鞘疾病。

15.一种包含权利要求1-10中任意一项所述肽或权利要求11所述载体的药物组合物。

16.一种用于治疗有需要的受试者的周围脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效治疗剂量的权利要求1-10中任意一项所述的HK-衍生肽或权利要求11所述的载体。