CN117867071A - 用于制备序列文库的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备序列文库的方法和组合物。本文中提供的实施方案涉及用于下一代测序的方法和组合物。一些实施方案包括从与表面接触的靶核酸制备模板文库，以及对该表面上的文库进行测序。
Description
相关申请
本申请是申请日为2015年6月12日的、发明名称“用于制备序列文库的方法和组合物”、PCT申请号：PCT/GB2015/051735、专利申请号：201580031682.5的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本文中提供的实施方案涉及用于下一代测序的方法和组合物。一些实施方案包括从与表面接触的靶核酸制备模板文库，以及对该表面上的文库进行测序。
发明背景
几种下一代测序技术可用于快速和经济地测定基因组的整个序列。通常，在测序之前从靶基因组DNA样品制备模板核酸文库。样品制备通常包括DNA片段化步骤，其将较大的DNA链断裂成更适合下一代测序技术的较小的DNA片段。通常，将衔接子(adaptor)附着于DNA片段的末端，这可以通过DNA末端修复，然后是衔接子连接实现，或最近通过使用转座体(transposome)系统实现。转座体(其是转座酶和转座子序列的复合物)的使用允许同时进行基因组片段化和片段的衔接子连接，从而简化文库制备。文库制备方法通常是劳动密集型的，并且需要在不同阶段的几个手动操作步骤。因此，需要更有效的流线化文库制备方法。
发明概述
本发明的一个实施方案是制备用于测序的靶核酸群体的方法，包括：(a)提供具有包含捕捉部分的表面的基底；(b)使所述表面与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，其中每个转座体包含转座子序列和转座酶，其中所述模板核酸通过使靶核酸与多个转座体接触来制备；和(c)将模板核酸与捕捉部分缔合。一些实施方案进一步包括，(d)测序缔合的模板核酸。一些实施方案进一步包括在(c)之后和(d)之前扩增缔合的模板核酸。在一些实施方案中，表面的捕捉部分是固定在表面上的捕捉探针。在一些实施方案中，表面的捕捉部分是第一亲和部分，并且模板核酸包含对第一亲和部分具有亲和力的第二亲和部分。在一些实施方案中，所述扩增包括桥式扩增。在一些实施方案中，(a)还包括提供包含靶核酸和转座体的样品。在一些实施方案中，样品包含聚合酶或连接酶。
在一些实施方案中，通过在表面的存在下使靶核酸与多个转座体接触来制备模板核酸。在一些实施方案中，通过在表面与包含多个模板核酸和转座酶的反应体积接触之前使靶核酸与多个转座体接触来制备模板核酸。在一些实施方案中，在使表面与反应体积接触之后，将聚合酶或连接酶添加到反应体积中。在一些实施方案中，在使表面与反应体积接触之前，将聚合酶或连接酶添加到反应体积中。在一些实施方案中，(c)包括用聚合酶或连接酶延伸模板核酸。在一些实施方案中，捕捉探针包括核酸。在一些实施方案中，(c)包括使模板核酸与捕捉探针杂交。在一些实施方案中，(c)包括制备单链模板核酸。在一些实施方案中，(c)包括使捕捉探针和模板核酸与重组酶接触。
在一些实施方案中，模板核酸，捕捉探针和/或表面各自包含亲和部分。在一些实施方案中，亲和部分选自生物素，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，(c)包括将模板核酸的亲和部分与捕捉探针的亲和部分结合。在一些实施方案中，(c)包括将模板核酸的亲和部分与表面的亲和部分结合。在一些实施方案中，转座子序列包含选自条形码，测序引物和片段化位点的序列。一些实施方案进一步包括切割片段化位点。在一些实施方案中，在(c)之后切割位点。在一些实施方案中，至少一个转座子包含两个转座子序列。在一些实施方案中，转座子序列是不同的。在一些实施方案中，在(b)之后除去转座酶。在一些实施方案中，在(c)之后除去转座酶。在一些实施方案中，通过使转座酶与蛋白酶接触来除去转座酶。在一些实施方案中，通过使转座酶与十二烷基硫酸钠(SDS)接触来除去转座酶。在一些实施方案中，转座酶选自Tn5，Tn5的变体，超活性(hyperactive)的Tn5，Tn10和Mu。
在一些实施方案中，至少一个转座体不同于至少一个其它转座体。在一些实施方案中，使用模板核酸在表面上的接近性(proximity)确定从模板核酸获得的序列在靶核酸序列的线性表示(linear representation)中的接近性。在一些实施方案中，表面上彼此更接近(in closer proximity to one another)的模板核酸确定为包含与较不接近(lessclose proximity)的模板核酸相比在靶核酸序列的表示中更接近的序列。在一些实施方案中，靶核酸序列的表达包括单倍型信息。
在一些实施方案中，靶核酸选自DNA和RNA。在一些实施方案中，靶核酸选自基因组DNA和cDNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因组DNA。
在一些实施方案中，基底选自至少一个珠，载玻片，流动池，通道，浸渍片和孔。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约10,000个缔合的模板核酸。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约100,000个缔合的模板核酸。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约1,000,000个缔合的模板核酸。
本发明的一个实施方案是用于对靶核酸进行测序的反应容器，其包括：基底，其包含具有与其附着的多个捕捉探针的表面；以及与所述表面流体连通的反应体积，其包含：多个转座子，每个转座子包含转座子序列和转座酶，通过使靶核酸与多个转座体接触而制备的多个模板核酸，聚合酶，dNTP和/或连接酶。在一些实施方案中，捕捉探针附着于表面上的形成重复模式的位点处。在一些实施方案中，捕捉探针被限制在表面上的位点，并且在位点之间的间隙区域处不存在。在一些实施方案中，反应体积同时包括用于反应步骤的反应物，所述反应步骤包括：将转座子序列转座到靶核酸中；用所述聚合酶和/或连接酶延伸所述模板核酸；以及将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。在一些实施方案中，反应步骤包括：将转座子序列转座到靶核酸中；用聚合酶将模板核酸延伸至少几个碱基，然后连接。
在一些实施方案中，反应体积被配置用于包括在蛋白酶存在下去除转座酶的反应步骤。在一些实施方案中，反应体积被配置用于在重组酶存在下将模板核酸与捕捉探针缔合。在一些实施方案中，反应体积被配置用于扩增与捕捉探针缔合的模板核酸。在一些实施方案中，扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，反应体积包括试剂，其用于将转座子序列序贯转座到靶核酸中；然后用聚合酶或连接酶延伸模板核酸；然后将模板核酸与捕捉探针缔合。在一些实施方案中，反应体积包括用于将转座子序列序贯转座到靶核酸中；然后用聚合酶延伸模板核酸至少几个碱基的试剂和连接酶。在一些实施方案中，反应体积包含在蛋白酶存在下除去转座酶的试剂。在一些实施方案中，反应体积包含用于除去转座酶的SDS。在一些实施方案中，反应体积包含用于在重组酶存在下将模板核酸与捕捉探针缔合的试剂。
在一些实施方案中，反应体积包含用于扩增与捕捉部分缔合的模板核酸的试剂。在一些实施方案中，表面的捕捉部分是固定在表面上的捕捉探针。在一些实施方案中，表面的捕捉部分是第一亲和部分，并且模板核酸包含对第一亲和部分具有亲和力的第二亲和部分。在一些实施方案中，模板核酸与捕捉探针缔合。在一些实施方案中，捕捉探针包括核酸。在一些实施方案中，模板核酸与捕捉探针杂交。在一些实施方案中，模板核酸中的至少一种和捕捉探针中的至少一种各自包含亲和部分。在一些实施方案中，亲和部分选自生物素，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，捕捉探针包含重组酶。在一些实施方案中，将模板核酸中的至少一种的亲和部分附着到捕捉探针中的至少一种的亲和部分。在一些实施方案中，将模板核酸中的至少一种的亲和部分附着到表面的亲和部分。在一些实施方案中，转座酶选自Tn5，Tn5的变体，超活性的Tn5，Tn10和Mu。在一些实施方案中，转座子序列包含选自条形码，测序引物和/或片段化位点的序列。在一些实施方案中，转座体包含两个转座子。在一些实施方案中，转座子序列彼此不同。
在一些实施方案中，靶核酸选自DNA和RNA。在一些实施方案中，靶核酸选自基因组DNA和cDNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因组DNA。
在一些实施方案中，基底选自至少一种珠，载玻片，流动池，通道，浸渍片和孔。在一些实施方案中，使模板核酸与捕捉探针缔合。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约10,000个模板核酸。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约100,000个模板核酸。在一些实施方案中，表面包含每mm2至少约1,000,000个模板核酸。
在一些实施方案中，从靶核酸序列的线性表示中从两个模板核酸获得的序列接近性信息指示模板核酸在表面上的接近性。在一些实施方案中，与较不接近的模板核酸相比，表面上彼此更接近的模板核酸包含在靶核酸序列的表示中更接近的序列。在一些实施方案中，靶核酸序列的表达包含单倍型表示。
本发明的一个实施方案是包含本文公开的任何反应容器的流动池。
本发明的一个实施方案是用于对靶核酸测序的系统，其包含：本文中公开的任何反应容器；用于调节反应容器的温度的热循环仪；和用于收集来自反应容器的信号的检测器。一些实施方案包括处理器，其包含调节反应容器的温度以实施步骤的的指令，所述步骤包括：将转座子序列转座到靶核酸中，用聚合酶或连接酶延伸模板核酸，并将模板核酸与捕捉探针缔合。在一些实施方案中，在连接之前用聚合酶将模板核酸延伸至少一个碱基。在一些实施方案中，调节反应容器的温度以实施步骤的指令包括扩增与捕捉探针缔合的模板核酸。在一些实施方案中，扩增是桥式扩增。
附图简述
图1显示了用于无PCR(PCR-free)自动化文库制备的简化工作流的示例性实施方案，其中(A)将基因组DNA与标签化(tagmentation)溶液混合，所述标签化溶液包含可插入基因组DNA中并且使基因组DNA片段化的转座体，DNA聚合酶和dNTP；(B)将标签化反应体积装载到筒(例如MySeq筒)上；(C)将筒装载到调节筒温度的系统中，执行测序反应并获得测序信息。可以通过系统在筒内装载包含基因组DNA的标签化反应。
图2A，2B，2C显示出了具有簇的缺口大小分布(gap size distribution)的图，其中图2A，图2B，图2C分别显示出了来自泳道1、2和3的结果。X轴是插入物的大小(以bp计)，并且y轴是插入物的百分比。
图3A，图3B，图3C，图3D分别显示来自大肠杆菌(E.coli)，人，红杆菌属(Rhodobacter)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组DNA的样品的插入物的缺口大小分布的图。
图4显示了用sybr绿染色的HiSeq Flow cell(Illumina Inc.,San Diego,CA)上的区块(tiles)。
发明详述
本文中提供的实施方案涉及用于下一代测序的方法和组合物。一些实施方案包括从与表面接触的靶核酸制备模板文库，以及对该表面上的文库进行测序。
通常，制备用于下一代测序的测序模板文库的方法包括多个步骤和容器之间的反应体积的转移。在一些方法中，将转座子序列插入靶核酸，如基因组DNA。在一些方法中，转座子序列的插入可以将靶核酸片段化为多个修饰的核酸。插入的转座子序列可以包括测序引物位点，扩增引物位点和/或可以与表面(如流动池)上的捕捉探针退火的位点。在一些方法中，用有尾引物扩增经修饰的核酸以添加测序引物位点，扩增引物位点和/或可与表面上的捕捉探针退火的位点。将经修饰的核酸捕获在表面上，通过桥式扩增来扩增以在表面上形成簇，并测序。通常，包括洗涤步骤和反应容器之间转移的多个步骤可以是低效的。
本文中提供的一些实施方案包括用于制备用于下一代测序的测序模板文库的方法和组合物，其中在单个反应体积中制备文库(例如“单罐(single pot)”反应或不包括在反应完成之前物理去除试剂或产物的反应)。在一些实施方案中，制备与表面，如流动池接触的文库，并在表面上测序。在一些实施方案中，在单个反应体积中制备文库，并使反应体积与表面接触并在表面上测序(例如，装载到其中发生文库制备和测序反应的流动池中)。有利地，一些此类实施方案提高了从靶核酸获得的测序模板的产率(yield)以及用于制备和测序模板文库的时间的效率。例如，在一些实施方案中，由于效率的提高，在模板文库制备期间扩增核酸的需要降低。
在一些实施方案中，模板核酸在表面上的物理接近性与那些模板的序列在它们来源的靶核酸的线性表示中的接近性有关。因此，在表面上从靶基因组核酸制备模板文库可以有利地维持单倍型或定相信息。换言之，可以保留邻接(contiguity)信息。不希望受任何一种理论的束缚，在一些实施方案中，转座子序列插入靶核酸并使其片段化，催化插入的转座酶保持在切割位点的每个末端，并且在除去转座酶前，经修饰的核酸在表面上固定化。在一些实施方案中，在彼此间具有给定距离的桥式扩增的簇将具有来自原始基因组DNA的相同区段的显著概率。
在一些实施方案中，在表面(如流动池)上捕获靶核酸，使其原位片段化，并允许扩散和作为种子，形成以初始捕获位点为中心的簇云。在测序后，在组装期间，可以使用距离度量(例如，流动池中的簇之间的标准化物理分离)来评估两个读取是否应该组装在一起，被考虑定相，或用于校正彼此中的错误(例如，来自相同初始分子的互补链)。
图1描绘了在本文中提供的一些方法和组合物的情况中有用的工作流的实施方案。在该实施方案中，(A)将某一个量的基因组DNA转移到标签化溶液中以产生标签化反应；(B)将标签化反应加载到MiSeq筒(Illumina Inc.,San Diego CA)中；和(C)将柱装载到MiSeq仪器(Illumina Inc.,San Diego CA)中。自动化脚本在流动池内实施标签化反应。在标签化期间产生的文库分子通过标签化反应中存在的DNA聚合酶延伸，并随后与固定在流动池表面上的寡核苷酸杂交。通过桥式扩增将每个捕获的分子扩增成簇。将簇的核酸线性化，将测序引物与线性分子杂交，并对分子进行测序。操作者将基因组DNA与标签化溶液混合并将标签化反应加载到测序仪，如MiSeq筒和MiSeq仪器上。此类示例工作流去除了上游样品制备步骤，因为此类步骤在流动池内进行。
如本文中所用，“核酸”包括连接在一起的至少两个核苷酸单体。实例包括但不限于DNA，如基因组或cDNA；RNA，如mRNA，sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂合体。从以下实例和本文其它地方显而易见，核酸可以具有天然存在的核酸结构或非天然存在的核酸类似物结构。核酸可以含有磷酸二酯键；然而，在一些实施方案中，核酸可以具有其它类型的主链，包括例如磷酰胺，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，O-甲基亚磷酰胺和肽核酸主链和连接。核酸可以具有正的骨架；非离子主链和非核糖基主链。核酸也可以包含一个或多个碳环糖。在本文中的方法或组合物中使用的核酸可以是单链或备选地如规定的双链。在一些实施方案中，核酸可以含有双链和单链序列的部分，例如，如通过叉式衔接子所证明的。核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，异胞嘧啶，异鸟嘌呤和碱基类似物，如硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)等。在一些实施方案中，核酸可以包括至少一个混杂碱基。混杂碱基可以与多于一种不同类型的碱基进行碱基配对，并且例如当包括在寡核苷酸引物或插入物中时可以是有用的，所述寡核苷酸引物或插入物用于在复杂核酸样品，如基因组DNA样品中随机杂交。混杂碱基的实例包括可与腺嘌呤，胸腺嘧啶或胞嘧啶配对的肌苷。其它实例包括次黄嘌呤，5-硝基吲哚，无环5-硝基吲哚，4-硝基吡唑，4-硝基咪唑和3-硝基吡咯。可以使用可与至少两种，三种，四种或更多类碱基进行碱基配对的混杂碱基。
如本文中所用，“核苷酸序列”包括核酸聚合物中核苷酸单体的顺序和类型。核苷酸序列是核酸分子的特征并且可以以多种形式中的任一种表示，包括例如描述，图像，电子介质，符号系列，数字系列，字母系列，系列颜色等。信息可以例如以单核苷酸分辨率，以较高分辨率(例如指示核苷酸亚基的分子结构)或以较低分辨率(例如指示染色体区域，如单倍型区块)表示。一系列“A”，“T”，“G”和“C”字母是公知的序列，其表示可以在单核苷酸分辨率下与DNA分子的实际序列相关联的DNA。除了在系列中用“U”代替“T”外，类似的表示法用于RNA。
如本文中使用，“单倍型”包括在多于一种基因座处的一组等位基因，所述基因座由仅来自其亲本之一的个体继承。单倍型可以包括来自染色体的全部或部分的两个或更多个基因座。等位基因包括例如单核苷酸多态性(SNP)，短串联重复(STR)，基因序列，染色体插入，染色体缺失等。术语“定相等位基因”是指来自特定染色体或其部分的特定等位基因的分布。因此，两个等位基因的“相位”可以指一个或多个染色体上的两个或多个等位基因的相对位置的表征或表示。
如本文中使用，“流动池”包括具有表面的室，一种或多种流体试剂可以流过所述表面。通常，流动池将具有入口开口和出口开口以促进流体的流动。可以容易地用于本公开内容的方法中的流动池和相关流体系统和检测平台的实例描述于例如Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 071123744；US7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281,及美国专利申请公开号2008/0108082，其各自通过引用整体并入本文。
靶核酸
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸包括基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，使用线粒体或叶绿体DNA。在一些实施方案中，靶核酸包括RNA或其衍生物，如mRNA或cDNA。本文中所述的一些实施方案可利用以一个拷贝(即单个分子)存在或者备选以多个拷贝(即具有相同序列的核酸分子的整体)存在的单个靶核酸种类。其它实施方案可以利用多种不同的靶核酸种类(例如，具有多种不同核苷酸序列的核酸分子)。因此，多个靶核酸可以包括彼此都相同的多个靶核酸，所述多种序列中一些靶核酸彼此相同且一些靶核酸彼此不同的多种不同的靶核酸，或所有靶核酸与所述多种序列中的所有其它靶核酸不同的多个靶核酸。靶核酸可以从获自单个生物体的核酸分子或从包括多于一种生物体的来源获得的核酸分子群制备。靶核酸可以来自单细胞；来自单个生物体的多个细胞，组织或体液；来自同一物种的几种生物体的细胞，组织或体液；或来自多个物种(如宏基因组(metagenomic)样品一样)，如来自环境样品。核酸分子的来源包括但不限于细胞器，细胞，组织，器官或生物体。
在一些实施方案中，使靶核酸与转座子接触，使得转座子催化转座子序列插入靶核酸中以提供经修饰的核酸。
转座体
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括转座体。在一些实施方案中，转座体包括与一个或多个转座子序列结合的转座酶。转座酶包括能够与包含转座子元件或转座酶元件的转座子序列形成功能性复合物，并催化所述转座子序列插入或转座到靶核酸中以提供经修饰的核酸的酶。例如，在体外转座反应中，将转座子序列插入靶DNA中以提供经修饰的DNA。通过转座酶可以将转座子序列插入到靶核酸中的随机或基本上随机的位点处。转座酶还包括来自反转录转座子的整合酶和逆转录病毒转座酶。示例性转座酶包括但不限于Mu，Tn10，Tn5和超活性(hyperactive)Tn5(Goryshin and Reznikoff,J.Biol.Chem.,273:7367(1998))。与本文中提供的一些方法和组合物一起使用的转座酶的实施方案包括公开于美国专利申请公开号2010/0120098中公开的那些转座酶，其通过引用整体并入本文。转座酶和转座子元件的更多实施方案包括超活性Tn5转座酶和Tn5型转座酶元件(Goryshin and Reznikoff,J.Biol.Chem.,273:7367(1998)，其通过引用整体并入本文)，MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座酶元件(Mizuuchi,Cell,35:785,(1983)andSavilahti,et al.,EMBO J.,14:4893,15(1995)，通过引用整体并入本文)。与超活性Tn5转座酶(例如，EZ-Tn5TM转座酶，Epicentre Biotechnologies，Madison，Wisconsin)形成复合物的实例转座酶元件阐述于WO 2012/061832；U.S.2012/0208724,U.S.2012/0208705和WO2014018423，其各自通过引用整体并入本文。用于本文提供的一些方法和组合物的转座酶和转座子序列的更多实施方案包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552(Colegio et al.,J.Bacteriol.,183:2384-8(2001)；Kirby et al.,Mol.Microbiol.,43:173-86(2002))，Ty1(Devine&Boeke,Nucleic Acids Res.,22:3765-72(1994)和WO 95/23875)，转座子Tn7(Craig,Science 271:1512(1996)；Craig,Curr Top MicrobiolImmunol.,204:27-48(1996))，Tn/O和IS10(Kleckner et al.,Curr Top MicrobiolImmunol.,204:49-82(1996))，Mariner转座酶(Lampe et al.,EMBO J.,15:5470-9,(1996))，Tel(Plasterk,Curro Topics Microbiol.Immunol.,204:125-43,(1996))，P元件(Gloor,Methods Mol.Biol.,260:97-114,(2004))，Tn3(Ichikawa&Ohtsubo,JBioI.Chem.265:18829-32,(1990))，细菌插入序列(Ohtsubo&Sekine,CurroTop.Microbiol.Immunol.204:1-26,(1996))，逆转录病毒(Brown,et al.,Proc Natl AcadSci USA,86:2525-9,(1989))和酵母的反转录转座子(Boeke&Corces,Annu RevMicrobiol.43:403-34,(1989))。更多实例包括IS5，Tn10，Tn903，IS911和转座酶家族酶的工程化改造形式(Zhang et al.,PLoS Genet.5:el000689.Epub 2009Oct 16；and Wilsonet al.Microbiol.Methods 71:332-5(2007))。更多实例包括MuA转座酶(参见例如RasilaTS,et al.,(2012)PLoS ONE 7(5):e37922.doi:10.1371/journal.pone.0037922)。Tn5转座酶的变体，如具有氨基酸取代，插入，缺失和/或与其它蛋白质或肽的融合，公开于美国专利：5,925,545；5,965,443；7,083,980；7,608,434；和美国专利申请14/686,961。专利和专利申请通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，相对于如美国专利申请14/686,961中所公开的野生型蛋白质，Tn5转座酶在位置54、56、372、212、214、251和338处包含一个或多个取代。在一些实施方案中，Tn5野生型蛋白或其变体可以进一步包含融合多肽。在一些实施方案中，融合至转座酶的多肽结构域可以包含例如延伸因子Ts。本段中引用的每个参考文献通过引用整体并入本文。
如本文所用，捕捉部分包括捕捉探针和亲和部分。在一些实施方案中，捕捉探针可以是核酸。捕捉探针可以与模板核酸缔合(例如杂交)。亲和部分可以是结合对的成员。在一些情况下，表面可包含结合对的第一成员，且捕捉探针可包含结合对的第二成员。在一些情况下，捕捉探针可以被固定到表面，并且靶核酸可以包含结合对的第一成员，并且捕捉探针可以包含结合对的第二成员。结合对的实例包括但不限于生物素/链霉抗生物素蛋白，配体-受体，激素-受体和抗原-抗体。
在一些实施方案中，转座子序列包含双链核酸。转座子元件包括核酸分子或它的包括与转座酶或整合酶形成转座体的核苷酸序列的部分。在一些实施方案中，转座子元件能够在转座反应中与转座酶形成功能性复合物。本文提供了转座子元件的实例，并且包括19-bp外端(“OE”)转座子末端，内端(“IE”)转座子末端或由例如野生型或突变体Tn5转座酶识别的“马赛克末端(mosaic end)”("ME")转座子末端，或R1和R2转座子末端(参见例如美国专利申请公开号2010/0120098，其通过引用整体并入本文)。转座子元件可以包括适于在体外转座反应中与转座酶或整合酶形成功能性复合物的任何核酸或核酸类似物。例如，转座子末端可以包含DNA，RNA，修饰的碱基，非天然碱基，修饰的主链，并且可以包含一条或两条链中的切口。
在一些实施方案中，转座子序列可以包括转座子元件和另外的序列。在一些实施方案中，另外的序列可以在转座反应中插入靶核酸中。另外的序列可以包括引物结合位点，如测序引物位点和扩增引物位点。另外的序列还可以包括切割位点，锚定位点，报告标签和条形码。
在一些实施方案中，引物结合位点可以包括用于测序引物以在测序反应中与核酸退火的序列。在一些实施方案中，引物结合位点可包括针对引物的在扩增反应或其它延伸反应中与核酸退火的序列。
在一些实施方案中，切割位点可以包括转座子序列中的位点，其中共价键的断裂产生两个片段。例如，包含切割位点的转座子序列可以插入靶核酸中，然后修饰的核酸可以通过在插入的切割位点处的键断裂而片段化。在一些实施方案中，切割位点包括限制性内切酶识别序列和/或限制酶切割位点。在一些实施方案中，切割位点可以包括核酸中的至少一种核糖核苷酸，其在其它情况下可以包含脱氧核糖核苷酸并且可以用RNA酶切割。可以使用能够选择性切割脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸之间的磷酸二酯键的化学切割剂，包括例如金属离子，如稀土金属离子(例如La3+，特别是Tm3+、Yb3+或Lu3+,Fe(3)或Cu(3))，或暴露于升高的pH。在一些实施方案中，切割位点可以包括切口酶(即断裂双链核酸的一条链的切口内切核酸酶)的一个或多个识别序列。因此，片段化位点可以包括第一切口酶识别序列和任选地第二切口酶识别序列。第一和第二切口酶识别序列可以彼此相同或彼此不同。在一些实施方案中，切割位点可以包括一个或多个核苷酸类似物，其包含无碱基位点并且允许在某些化学剂，如多胺，N,N'-二甲基乙二胺(DMED)存在下在片段化位点处切割(参见例如，美国专利申请公开号2010/0022403，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，无碱基位点可以通过修饰切割位点内的尿嘧啶核苷酸来创建，例如使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)酶。然后可以通过用内切核酸酶(例如Endo IV内切核酸酶，AP裂合酶，FPG糖基化酶/AP裂合酶，Endo VIII糖基化酶/AP裂合酶)，热或碱处理，在无碱基位点处切割包含无碱基位点的多核苷酸链。无碱基位点还可以在除脱氧尿苷之外的核苷酸类似物上产生，并通过用内切核酸酶，热或碱处理以类似的方式切割。例如，8-氧代-鸟嘌呤可以通过暴露于FPG糖基化酶而转化为无碱基位点。脱氧肌苷可以通过暴露于AlkA糖基化酶而转化为无碱基位点。然后，可以通常通过用合适的内切核酸酶，如Endo IV或AP裂合酶处理切割如此产生的无碱基位点(参见例如，U.S.2011/0014657，其通过引用整体并入本文)。在另一个实例中，切割位点可包括允许通过用高碘酸盐(例如高碘酸钠)处理切割的二醇连接。在另一个实例中，切割位点可以包括允许用化学还原剂，例如三(2-羧乙基)-磷酸盐酸盐(TCEP)切割的二硫化物基团。在一些实施方案中，切割位点可以包括可光切割的部分。光化学切割可以通过利用光能断裂共价键的多种方法中的任一种来进行。用于光化学切割的位点可以由核酸中的非核苷酸化学部分提供，如亚磷酰胺[4-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰乙基-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)(Glen Research,Sterling,Va.,USA，产品目录号10-4913-XX)。
在一些实施方案中，转座子序列可以包括锚定位点。在一些实施方案中，锚定位点可以包括可以特异性结合捕捉探针的序列。在一些实施方案中，锚定位点包含与包含核酸的捕捉探针互补和/或基本上互补的序列。在一些实施方案中，锚定位点可以包括配体或受体，其结合包含相应受体或配体的捕捉探针的。换言之，锚定位点和捕捉探针可以包含配体/受体对。在一些实施方案中，配体或受体可以通过修饰的核苷酸与转座子序列的锚定位点缔合。配体和受体的实例包括分别能结合链霉抗生物素蛋白或镍的生物素或多聚His。其它实例包括本领域已知的配体对及其受体，例如抗生物素蛋白-生物素，链霉抗生物素蛋白-生物素，以及生物素，链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的衍生物，包括但不限于2-亚氨基生物素(2-iminobiotin)，脱硫生物素，NeutrAvidin(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)，CaptAvidin(Molecular Probes)等；结合蛋白/肽，包括麦芽糖-麦芽糖结合蛋白(MBP)，钙-钙结合蛋白/肽(CBP)；抗原抗体，包括表位标签，包括c-MYC，HA，VSV-G，HSV，V5和FLAG TagTM，及其相应的抗表位抗体；半抗原，例如二硝基苯和地高辛配基(digoxigenin)及其相应的抗体；适体及其相应靶标；多聚His标签(例如戊-His和己-His)及其结合配偶体，包括相应的固定化金属离子亲和层析(IMAC)材料和抗聚His抗体；荧光团和抗荧光团抗体；核酸链及其互补链等。
在一些实施方案中，转座子序列可以包括报告标签。有用的报告标签包括本领域已知的多种可识别标签，标记物或基团中的任一种。在某些实施方案中，报告标签可以发射信号。信号的实例包括荧光，化学发光，生物发光，磷光，放射性，量热或电化学发光的那些。示例性的报告标签包括荧光团，放射性同位素，色原，酶，包括表位标签的抗原，半导体纳米晶体如量子点，重金属，染料，磷光基团，化学发光基团，电化学检测部分，结合蛋白，磷光体(phosphors)，稀土螯合物，过渡金属螯合物，近红外染料，电化学发光标记物和质谱仪相容的报告标签，如质量标签，电荷标签和同位素。可以与本文的方法和组合物一起使用的更多的报告标签包括光谱标记物，如荧光染料(例如异硫氰酸荧光素，德克萨斯红，罗丹明等)；放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C、32P、33P等)；酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)；光谱比色标记物，如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶等)；珠；磁性标签；电标签；热标签；和质量标签。
在一些实施方案中，转座子序列可以包括条形码。在一些实施方案中，转座子群体可以包括这样的转座子序列，其包含相同条形码，一个或多个不同条形码，或其中每个转座子序列可以包括不同的条形码。在一些实施方案中，插入到靶核酸中的条形码可以用于鉴定靶核酸。在一些实施方案中，条形码可用于鉴定靶核酸中的插入事件。在一些实施方案中，转座体群中的每个转座体包括具有不同条形码的转座子序列，所述条形码可用于鉴定靶核酸中的插入位点。在一些实施方案中，条形码可用于鉴定在切割位点处片段化后的插入位点，例如条形码跨越切割位点的地方。示例条形码及其制备和使用的方法阐述于国际公开号WO 2012/061832；美国专利申请公开号2012/0208724，美国专利申请公开号2012/0208705和PCT申请流水号PCT/US2013/031023，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，转座体包括两个转座子序列。在一些实施方案中，每个转座子序列包括转座子元件。在一些实施方案中，每个转座子序列可以包括引物结合位点，如测序引物位点和扩增引物位点，另外的序列还可以包括锚定位点，报告标签和条形码。转座子序列转座到靶核酸中可导致在插入位点处靶核酸的切割。在一些实施方案中，转座体的转座酶可以保持于靶核酸的切割位点的每个末端，保持靶核酸的切割片段的物理接近性。
在一些实施方案中，转座子序列可以包括彼此连接的两个转座子元件。接头可以包括在插入物中，使得第一转座子元件与第二转座子元件连续。特别有用的插入物是形成“环状”复合物的插入物，如国际公开号WO 2012/061832；美国专利申请公开号2012/0208724,美国专利申请公开号2012/0208705和PCT申请流水号PCT/US2013/031023中列出，其各自通过引用整体并入本文。在此类结构中，具有连续转座子元件的单个插入物与形成“环状”复合体的两个转座酶亚基结合。环状复合物可用于将插入物放置到靶核酸中，同时保持初始靶核酸的排序信息，并且不会使得到的修饰的核酸聚合物片段化。插入环状转座子元件提供将插入物添加到靶核酸中，而不必使靶核酸片段化。
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括使用具有表面的基底。在一些实施方案中，表面包含多个将修饰的核酸结合到表面的捕捉探针。基底可以是二维或三维的，并且可以是平面表面(例如，玻璃载玻片)或可以是成形的。有用的材料包括玻璃(例如可控孔径玻璃(CPG))，石英，塑料(如聚苯乙烯(低交联和高交联聚苯乙烯)，聚碳酸酯，聚丙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯))，丙烯酸共聚物，聚酰胺，硅，金属(例如烷基硫醇衍生化的金(alkanethiolate-derivatized gold))，纤维素，尼龙，胶乳，葡聚糖，凝胶基质(例如，硅胶)，聚丙烯醛(polyacrolein)或复合材料。合适的三维固体支持物包括例如球体，微粒，珠，膜，载玻片，板，微机械加工芯片(micro machined chip)，管(例如毛细管)，微孔，微流体装置，通道，过滤器或适合于锚定核酸或其它捕捉探针的任何其它结构。固体支持物可以包括平面微阵列或能够具有包括核酸群或引物或其它捕捉探针的区域的矩阵。实例包括核苷衍生化的CPG和聚苯乙烯载玻片；衍生化的磁性载玻片；用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯等。可以使用各种方法将捕捉探针(如核酸)附着，锚定或固定到固体支持物的表面。附着可以通过直接或间接键合到表面来实现。键合可以通过共价连接进行(参见例如Joos et al.(1997)Analytical Biochemistry,247:96-101；Oroskar etal.(1996)Clin.Chem.,42:1547-1555；and Khandjian(1986)Mol.Bio.Rep.,11:107-11，其各自通过引用整体并入本文)。优选的附着是核酸的末端核苷酸与整合在表面上的环氧化物的直接胺键合。键合也可以通过非共价键连接。例如，生物素-链霉抗生物素蛋白(Taylor et al.(1991)1.Phys.D:Appl.Phys.,24:1443，其通过引用整体并入本文)和地高辛配基与抗地高辛配基(Smith etal.,Science,253:1122(1992)，其通过引用整体并入本文)是用于将核酸锚定于表面的常用工具。核酸与表面的附着可以通过中间结构如珠，颗粒或凝胶。通过凝胶将核酸附着到阵列以可购自Illumina Inc.(San Diego,CA)或记载于美国专利申请公开号2010/10111768；美国专利申请公开号2012/0270305；和US 8,563,477(其各自通过引用整体并入本文)的流动池例示。
在一些实施方案中，捕捉探针可以包括与锚定序列互补或基本上互补的核酸，受体或配体，如本文中提供的。在一些实施方案中，捕捉探针包含重组酶，其结合包含非互补链的双链核酸区域，如双链核酸中的“气泡”。
在一些实施方案中，基底可具有连续或整体表面。因此，核酸片段可以附着在空间随机位置处，其中最近邻片段(或从片段衍生的最近邻簇)之间的距离将是可变的。所得到的阵列可以具有特征的可变或随机空间模式。在一些实施方案中，本文中列出的方法中使用的基底可包括以重复模式存在的捕捉探针阵列。在一些此类实施方案中，捕捉探针提供核酸可以附着的位置。在一些实施方案中，重复模式是六角形模式，直线模式，网格模式，具有反射对称性的模式，具有旋转对称性的模式等。修饰的核酸附着的捕捉探针各自可具有是，或小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2、或100nm2，或由前述值中的任何两个定义的范围的面积。或者/另外，每个特征可具有是，或大于约100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2、或500μm2，或由上述任何两个值定义的面积。由阵列上的片段(无论是模式化的还是空间随机的)的扩增产生的核酸的簇或集落可以类似地具有在上述范围中或者选自上面列举的上限和下限之间的面积。
几种商品化的测序平台依赖于具有孔的基底，所述孔在序列检测步骤期间提供了检测试剂(例如，可购自454LifeSciences(Roche的子公司，Basel Switzerland)的平台中的焦磷酸盐或可购自Ion Torrent(Life Technologies的子公司,Carlsbad California)的平台中的质子)扩散的屏障。
本文中提供的一些实施方案包括扩增靶核酸，经修饰的核酸或其片段的部分。可以使用本领域中已知的任何合适的扩增方法。在一些实施方案中，在固体支持物上扩增核酸片段。例如，在一些实施方案中，使用桥式扩增方法来扩增核酸片段，如通过美国专利号5,641,658；美国专利公开号2002/0055100；美国专利号7,115,400；美国专利公开号2004/0096853；10美国专利公开号No.2004/0002090；美国专利公开号2007/0128624；和美国专利公开号2008/0009420的公开内容例示，其各自以全文引用的方式并入本文中。
桥式扩增方法允许将扩增产物固定在固体支持物上，以形成由固定的核酸分子的簇(或“集落”)组成的阵列。这种阵列上的每个簇或集落由多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定的互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列在本文中可以称为“聚簇阵列”。当由固定的多核苷酸链和固定的互补链的退火对形成时，固相扩增反应的产物是所谓的“桥式”结构，其中两条链优选通过共价附着固定在5'端的固体支持物上。桥式扩增方法是其中使用固定的核酸模板产生固定的扩增子的方法的实例。其它合适的方法也可用于从根据本文提供的方法产生的固定化核酸片段产生固定的扩增子。例如，可以通过固相PCR，固相MDA，固相RCA等形成一个或多个簇或集落，无论每对扩增引物中的一个或两个引物是否被固定化。
应当理解，本文中所述或本领域通常已知的任何扩增方法可以与通用引物或靶物特异性引物一起使用以扩增固定的DNA片段。用于扩增的合适方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，例如描述于美国专利号8,003,354，其全部内容通过引用并入本文。上述扩增方法可用于扩增一种或多种目的核酸。例如，PCR，多重PCR，SDA，TMA，NASBA等可以用于扩增固定的核酸片段。在一些实施方案中，特异性针对目标核酸的引物包括在扩增反应中。
用于扩增核酸的其它合适方法可包括寡核苷酸延伸和连接，滚环扩增(RCA)(Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998)，其通过引用整体并入本文)和寡核苷酸连接测定(OLA)(参见例如美国专利号7,582,420,5,185,243,5,679,524和5,573,907；EP0320308；EP 0336731；EP 0439182；WO 90101069；WO 89/12696；和WO 89109835，其通过引用整体并入本文)。应当理解，可以设计这些扩增方法以扩增固定的核酸片段。例如，在一些实施方案中，扩增方法可以包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其包含特异性针对目标核酸的引物。在一些实施方案中，扩增方法可包括引物延伸-连接反应，其含有特异性针对目标核酸的引物。作为可以特异性设计以扩增目标核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可包括用于GoldenGate测定(Illumina,Inc.,San Diego,CA)的引物，如通过美国专利号7,582,420和7,611,869例示，其各自通过引用整体并入本文。
等温扩增技术可以用于本公开的方法中。示例性的等温扩增方法包括但不限于多重置换扩增(MDA)，例如由Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)例示，或等温链置换核酸扩增，如以美国专利号6,214,587例示，其各自通过引用整体并入本文。可用于本公开的其它非基于PCR的方法包括例如在例如Walker et al.,MolecularMethods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166和5,130,238,及Walker et al.,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中描述的链置换扩增(SDA)或超分支链置换扩增(hyperbranched strand displacement amplification)，其描述于例如Lage et al.,Genome Research 13:294-307(2003)中，其各自通过引用整体并入本文。
扩增反应，条件和组分的另外描述在美国专利号7,670,810中阐述，其通过引用整体并入本文。其它有用的等温扩增技术包括重组酶促进的扩增技术，如由TwistDx(Cambridge，UK)以TwistAmpTM试剂盒商业销售的那些。重组酶促进的扩增试剂和反应条件的有用组分阐述于US 5,223,414和US 7,399,590中，其各自通过引用整体并入本文。也可以使用依赖于解旋酶的扩增，例如，如Xu et al.EMBO Rep 5:795-800(2004)，其通过引用以其整体并入本文。实现动力学排阻扩增的条件可以是特别有用的并且描述于例如US2013/0338042中，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可能期望需要进行再接种(re-seeding)步骤。例如，修饰的核酸片段可以在表面区域内的位置捕获，在扩增过程的一个或多个循环上复制，其原始片段和/或其扩增子可以从该位置释放，释放的核酸可以在相同区域中的其它位置捕获，并且可以扩增新捕获的核酸。在一个实施方案中，修饰的核酸片段在再接种前通过第一次延伸进行复制，并在不同位置重新捕获，所述位置可以紧邻第一捕获点或甚至远离它。在一个具体的实例中，可以对接种在表面上的片段进行单一循环的桥式扩增，而不是在从表面释放时洗掉原始模板片段，模板片段可以在新位置在表面上再接种，所述新位置邻近于其最初接种的位置。后续轮次的桥式扩增将允许在原始种子位置和再接种位置两者的簇生长。使用此类方法，可以在表面的区域创建重复的集落以提供技术重复。在上述实例的一些实施方案中，转座子序列可以包含独特的分子标识符(UMI)。UMI将允许跟踪文库分子，并且能够确定共享相同UMI(和基因组序列)的簇源自相同的原始文库分子。对技术重复的序列的分析可以提供错误检查的益处。例如，仅在近端簇(被鉴定为技术重复)的子集中出现的观察到的序列变体可以被鉴定为扩增错误，而发生在被鉴定为特定片段的技术重复的所有簇中的序列变体更多可能是真正的变体。
本文中所述的方法的一些实施方案可以包括对源自靶核酸的片段进行测序的步骤。一个实例是合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿着核酸模板(例如，靶核酸或其扩增子的片段)延伸以确定模板中的核苷酸序列。引物可以与存在于如上所述的插入物中的引发位点杂交。基础化学过程可以是聚合(例如，通过聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，将荧光标记的核苷酸以模板依赖性方式添加至引物中(从而延伸引物)，使得添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板。使用本文阐述的步骤，附着在阵列的不同位置处的多个不同核酸片段可以在由于其在阵列中的位置而能够区分针对不同模板发生的事件的条件下经受SBS技术。
在一些实施方案中，流动池提供用于容纳通过本公开的方法产生并且经受SBS或其它检测技术的核酸片段阵列的方便的形式，所述检测技术牵涉循环中的试剂的重复递送。例如，为了启动第一SBS循环，可以使一种或多种标记的核苷酸，DNA聚合酶等流入/通过容纳核酸片段阵列的流动池。可以检测阵列的那些位点，其中引物延伸(例如通过引物与位于附着于核酸片段的插入物上的引发位点的杂交)引起经标记的核苷酸被掺入。任选地，核苷酸可以进一步包括一旦核苷酸已经添加到引物就终止进一步引物延伸的可逆终止性质。例如，具有可逆终止剂部分的核苷酸类似物可以添加到引物中，使得随后的延伸不能发生，直到递送去封闭剂以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将去封闭试剂递送到流动池(在检测发生之前或之后)。可以在各个递送步骤之间进行洗涤。然后可以重复该循环“n”次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度“n”的序列。可以容易地适用于与由本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序，流体系统和检测平台描述于例如Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 071123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281,及美国专利申请公开号2008/0108082，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用利用循环反应的其它测序程序，例如焦磷酸测序。由于特定核苷酸被掺入新生核酸链中，焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi,etal.,Analytical Biochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi et al.Science 281(5375),363(1998)；US 6,210,891；US 6,258,568和US.6,274,320，其各自通过引用整体并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过由ATP硫酸化酶转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且可以通过萤光素酶产生的光子检测产生的ATP水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可用于将焦磷酸测序应用于本公开的方法的有用的流体系统，检测器和程序描述于例如WO 2012058096,美国专利申请公开号2005/0191698,US 7,595,883,和US 7,244,559，其各自通过引用整体并入本文。连接测序反应也是有用的，包括例如Shendure et al.Science 309:1728-1732(2005)；US 5,599,675；和US5,750,341中描述，其各自通过引用整体并入本文。一些实施方案可以包括杂交测序程序，如例如描述于Bains et al.,Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)；Drmanac etal.,Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor et al.,Science 251(4995),767-773(1995)；及WO 1989110977，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，如连接测序和杂交测序程序，存在于阵列位点处的靶核酸片段(或其扩增子)经历寡核苷酸递送和检测的重复循环。用于本文或本文引用的参考文献中所述的SBS方法的流体系统可容易地适用于递送用于连接测序或杂交测序程序的试剂。通常，寡核苷酸是经荧光标记的，并且可以使用与关于本文中或本文引用的参考文献中的SBS程序所述的荧光检测器类似的荧光检测器来检测。
一些实施方案可以利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和y-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者用Zeromode波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如Levene et al.Science 299,682-686(2003)；Lundquist et al.Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；和Korlach et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，其公开内容通过引用整体并入本文。
一些SBS实施方案包括检测在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可以使用可购自Ion Torrent(Guilford，CT，Life Technologies子公司)的电检测器和相关技术或美国专利申公开号2009/10026082AI；美国专利申公开号2009/10127589AI；美国专利申公开号2010/10137143；或美国专利申公开号2010/10282617(其各自以全文引用的方式并入本文中)中描述的测序方法和系统。
在一些实施方案中，本方法的测序步骤可包括纳米孔测序技术，例如Deamer&Akeson Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer&Branton,Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；和Li et al.,Nat.Mater.2:611-615(2003)中描述的，其各自通过引用整体并入本文。在此类实施方案中，靶核酸片段通过纳米孔。纳米孔可以是合成孔或生物膜蛋白，例如α-溶血素。当靶核酸通过纳米孔时，可以通过测量孔的电导率的波动来鉴定每个碱基。(美国专利号7,001,792；Soni&Meller Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,Nanomed.2:459-481(2007)；及Cockroft et al.,1.Am.Chem.Soc.130:818-820(2008)，其各自通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，单个纳米孔的位置类似于本文示例的阵列上的位点或特征。纳米孔彼此的接近性可以与它们读取的片段序列的接近性相关，例如，以便于将那些片段装配成它们来源的较大序列。
在一些实施方案中，本文中所述的测序步骤可以有利地以多重形式进行，使得同时操作多种不同的靶核酸。在具体实施方案中，可以在共同的反应容器中或在特定基底的表面上处理不同的靶核酸。这允许以多重方式方便地递送测序试剂，除去未反应的试剂和检测掺入事件。在使用表面结合的靶核酸或其片段的实施方案中，靶核酸或片段可以是阵列形式。在阵列形式中，靶核酸的片段通常可以以空间可区分的方式偶联到表面，例如使用本文所述的附着技术。阵列可以包括在每个位点(也称为特征)处的靶核酸片段的单拷贝，或者具有相同序列的多个拷贝可以存在于每个位点或特征。可以通过扩增方法如桥式扩增或乳液PCR产生多个拷贝。
模板核酸的制备
本文提供的方法的一些实施方案包括制备用于与基底(例如流动池)接触来进行测序的模板核酸。在一些实施方案中，通过插入转座子序列修饰靶核酸；通过插入转座子序列或通过随后的切割步骤使修饰的核酸片段化；可以通过用有尾引物扩增或与引物连接将另外的序列添加到片段化的核酸片段的一个或多个末端；片段由表面上的捕捉探针捕获；可以通过桥式扩增来扩增捕获的片段；并且捕获的片段在表面上被测序。在一些实施方案中，用于测序的核酸在与表面接触的反应体积中被原位制备。
本文中提供的方法的一些实施方案包括(a)提供具有表面的基底，所述表面包含附着于其上的多个捕捉探针；(b)使所述表面与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，每个转座体包含转座子序列和转座酶；其中所述模板核酸通过使靶核酸与多个转座体接触来制备，和(c)将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。一些实施方案还包括(d)对缔合的模板核酸测序。
在一些实施方案中，基底是具有表面的流动池，所述表面包含附着于表面的捕捉探针，如P7和P5序列或与其互补的序列。P7和P5探针描述于例如美国专利号8,563,477和Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，反应体积包含靶核酸，包含转座子序列的多个转座体。本文描述了与本文中提供的方法一起使用的转座体。
在一些实施方案中，反应体积包含靶核酸的多个核酸片段(所述核酸片段包含转座子序列)和多个转座体。在一些实施方案中，反应体积还包括连接酶，聚合酶，dNTP和/或引物以扩增核酸片段或将另外的序列连接至核酸片段。在一些实施方案中，当反应体积与基底接触时，发生转座子序列向靶核酸中的插入。
在一些实施方案中，在反应体积与基底接触之前发生转座子序列至靶核酸中的插入。在一些实施方案中，可以制备多个反应体积，每个反应体积包含不同的靶核酸。每个靶核酸可以基于通过转座子附着到核酸的条形码来鉴定，所述转座子包含含有条形码的转座子序列。因此，可以用具有一组转座子的多个转座体处理多个核酸中的单个核酸，使得单个核酸可通过唯一条形码鉴定(所述唯一条形码通过转座体附着于所述单个核酸)，所述转座子具有不同条形码。
在一些实施方案中，转座体包括两个转座子序列，其中每个转座子序列包括转座子元件。在一些实施方案中，两个转座子序列中的一个或多个包括引物结合位点，锚定位点和/或条形码。在一些实施方案中，转座子序列包含P7和P5序列或与其互补的序列。
在一些实施方案中，将转座子序列插入双链靶核酸产生具有单链缺口的经修饰的双链核酸。在一些实施方案中，使用聚合酶和/或连接酶填充单链缺口。
在一些实施方案中，用有尾引物扩增核酸片段。用有尾引物扩增导致将序列添加到扩增的核酸片段的一个或多个末端。在一些实施方案中，另外的序列可以包括引物结合位点和/或锚定位点。
在一些实施方案中，将双链核酸片段解链成单链片段。单链核酸片段可用于本文中列出方法的一个或多个步骤中。
在一些实施方案中，通过捕捉探针经由锚定位点捕获核酸片段或扩增的核酸片段。在一些实施方案中，锚定位点是通过探针和片段上的互补序列的杂交捕获片段的核酸。例如，杂交可以由包含P7和P5序列或与其互补的序列的锚定位点或捕获探针介导。
在一些实施方案中，扩增所捕获的核酸。在一些实施方案中，扩增是桥式扩增。或者/另外，可使用本文中列出的其它扩增方法。
在一些实施方案中，在表面上测序经捕获的核酸，例如使用本文中列出的方法。
获得单倍型信息
靶核酸，如基因组DNA可以包括多于单个单倍型。例如，人基因组DNA含有两组DNA分子，每组有母本和父本序列的不同组合。本文中提供的一些实施方案可用于从单个核酸分子的片段或其拷贝获得序列信息。可以获得关于序列的单倍型结构或相位的其它信息。所述方法的优点是确定靶核酸中序列区域的单倍型或相位的能力，所述靶核酸大于物理测序的靶核酸的片段。
在一些实施方案中，维持基底上某些片段的物理接近性。在一些实施方案中，与在线性靶核酸的序列中彼此较不接近的片段的序列相比，在线性靶核酸的序列中彼此更接近的片段的序列在表面上彼此具有更接近的物理接近性。片段的物理接近性可用于确定片段序列在衍生片段的靶序列的表示中的接近性。可以通过多种方法保留某些片段的物理接近性。
在一些实施方案中，通过插入转座子序列片段化靶核酸。然而，在其它实施方案中，转座酶的存在可以将两个片段保持在一起，例如，美国专利申请流水号61/919,529中描述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以在表面上捕获片段之后除去转座酶。在一些实施方案中，反应体积可包括减少片段扩散使得靶核酸的邻近片段保持紧密接近的试剂。
在一些实施方案中，获得单倍型信息的方法包括比较针对表面上的近端位置确定的互补序列以鉴定序列错误。在一些实施方案中，表面上任何两个片段种类的相对接近性可以提供对从两个片段获得的序列信息的比对有用的信息。具体地，在表面上来源于任意两个给定片段的簇之间的距离可以与两个簇来自相同的靶多核苷酸分子的概率正相关，如WO 2012/025250,美国专利申请流水号61/919,529和美国专利申请流水号13/790,220中更加详细描述，其各自以全文引用的方式并入本文中。
作为实例，在一些实施方案中，衍生自在流动池表面捕获的长核酸分子的片段出现在穿过流动池表面的线中(例如，如果核酸在片段化或扩增之前被延伸出来)或在表面上的云(cloud)中。此外，然后可以产生固定的核酸的物理图谱。因此，物理图关联扩增固定的核酸后的簇的物理关系。具体地，物理图谱用于计算从任何两个簇获得的序列数据连接的概率，如在WO 2012/025250,美国专利申请流水号61/919,529和美国专利申请流水号13/790,220的并入材料中描述，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，通过使表面成像以建立固定的核酸分子在整个表面上的位置来产生物理图谱。在一些实施方案中，通过将成像剂添加固体支持物并检测来自成像剂的信号来成像固定的核酸。在一些实施方案中，成像剂是可检测标记物。合适的可检测标记物包括但不限于质子，半抗原，放射性核素，酶，荧光标记物，化学发光标记物和/或生色剂。例如，在一些实施方案中，成像剂是嵌入染料或非插入DNA结合剂。可以使用如本领域中已知的任何合适的嵌入染料或非插入DNA结合剂，包括但不限于在美国专利申请公开号2012/0282617中列出的，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，多个经修饰的核酸分子流到包含多个纳米通道的流动池上。如本文中所用，术语纳米通道是指可以递送核酸分子的窄通道。递送可牵涉在沿着通道的长度的方向上延伸核酸分子。在一些实施方案中，链的数目是，或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个单独的长核酸链，或由任何两个前述值限定的范围，其被延伸穿过每个纳米通道。在一些实施方案中，单独的纳米通道被物理屏障隔开，所述物理屏障防止靶核酸的单个长链与多个纳米通道相互作用。在一些实施方案中，固体支持物包含，或至少包含，10、50、100、200、500、1000、3000、5000、10000、30000、50000、80000或100000个纳米通道，或由任何两个的上述值限定的范围。
在一些实施方案中，已经修饰核酸以包括具有切割位点的插入物，并且一旦已经将核酸递送到通道(例如经由沿着通道延伸)后，切割位点会得到切割。可以任选地扩增所得片段以沿着通道的表面形成簇。然后，可以例如通过在这些通道之一的长度向下追踪簇，或者以其它方式解决簇在通道表面上的接近性实施邻近定位(contiguity mapping)。作为实例，具有1000个或更多个纳米通道的流动池可用于对具有短“定位”读出的生物体的基因组进行测序，所述纳米通道在纳米通道中具有定位的固定化片段化产物。在一些实施方案中，纳米通道中定位的固定化片段化产物可以用于解析单倍型。在一些实施方案中，纳米通道中定位的固定化片段化产物可用于解决定相问题。
反应容器
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括用于对靶核酸测序的反应容器。在一些实施方案中，反应容器可以包括包含具有附着于其上的多个捕获探针的表面的基底；以及与所述表面流体连通的反应体积，其包含：转座酶，通过使靶核酸与多个转座体接触而制备的多个模板核酸，每个转座体包含转座子序列和转座酶，以及聚合酶和dNTP或连接酶。在一些实施方案中，通过转座体片段化的靶核酸在连接之前用聚合酶延伸至少一个碱基。在一些实施方案中，流动池包括反应容器。在一些实施方案中，反应容器可以包括流动池的通道和/或孔。
在一些实施方案中，在表面上模式化捕获探针。在一些实施方案中，捕获探针被限制在表面上的位点。
在一些实施方案中，反应体积包括配置用于反应步骤的液体(例如具有pH缓冲液的水性液体)，所述反应步骤包括：将转座子序列转座到靶核酸中；用聚合酶延伸模板核酸，随后连接；以及将所述模板核酸与所述捕获探针缔合。在一些实施方案中，液体配置用于包括在蛋白酶或SDS的存在下去除转座酶的反应步骤。在一些实施方案中，液体配置用于在重组酶存在下将模板核酸与捕获探针缔合。在一些实施方案中，液体配置用于扩增与捕获探针缔合的模板核酸。在一些实施方案中，扩增是桥式扩增。在一些实施方案中，反应体积包括试剂，其用于将转座子序列转座到靶核酸中；用所述聚合酶和/或连接酶延伸所述模板核酸；以及将所述模板核酸与所述捕获探针缔合。在一些实施方案中，反应体积包含在蛋白酶或SDS的存在下除去转座酶的试剂。在一些实施方案中，反应体积包含用于在重组酶存在下将模板核酸与捕获探针缔合的试剂。在一些实施方案中，反应体积包含用于扩增与捕获探针缔合的模板核酸的试剂。
在一些实施方案中，将模板核酸与捕获探针缔合。在一些实施方案中，捕获探针包括核酸。在一些实施方案中，使模板核酸与捕获探针杂交。在一些实施方案中，模板核酸的至少一种，捕获探针的至少一种和/或表面各自包含亲和部分。在一些实施方案中，亲和部分选自生物素，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，捕获探针包含重组酶。在一些实施方案中，将模板核酸中至少一种的亲和部分附着于捕获探针中的至少一种的亲和部分或表面的亲和部分。
在一些实施方案中，转座酶选自Tn5，Tn5的变体，超活性Tn5，Tn10和Mu。在一些实施方案中，转座子序列包含选自条形码，测序引物和片段化位点的序列。在一些实施方案中，转座体包含两个转座子序列。在一些实施方案中，转座子序列是不同的。
在一些实施方案中，靶核酸选自DNA和RNA。在一些实施方案中，靶核酸选自基因组DNA和cDNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因组DNA。
在一些实施方案中，表面包含或包含每mm2至少约10,000个模板核酸，每mm2至少约100,000个模板核酸，每mm2至少约1,000,000个模板核酸。
在一些实施方案中，使用从靶核酸序列的线性表示中的两个模板核酸获得的序列信息的接近性来确定模板核酸在表面上的接近性。在一些实施方案中，表面上彼此更接近的模板核酸确定为包含与较不接近的模板核酸相比在靶核酸序列的表示中更接近的序列。在一些实施方案中，靶核酸序列的表示包括单倍型或定相信息。
本文中提供的方法和组合物的一些实施方案包括用于对靶核酸进行测序的系统，其包含本文中提供的反应容器，用于调节反应容器的温度的热循环仪；和用于收集来自反应容器的信号的检测器。
一些实施方案还包括处理器，其包括调节反应容器的温度以进行步骤的的指令，所述步骤包括：将转座子序列转座到靶核酸中，用聚合酶或聚合酶和连接酶的组合延伸模板核酸，以及将模板核酸与捕获探针或与表面的捕获部分缔合。在一些实施方案中，调节反应容器的温度以进行步骤的指令包括扩增与捕获探针缔合的模板核酸。在一些实施方案中，扩增是桥式扩增。
实施例
实施例1：在流动池上进行自动化文库制备
以下实施例证明了转座文库的自动化制备和流动池上进行文库测序的实施方案。
从大肠杆菌分离未剪切的基因组DNA。用各种量的DNA与31.25μl标签化溶液(25μl2xIllumina Tagment DNA缓冲液；5μl Tn5转座体；0.25μl Taq DNA聚合酶；和1μl 10mMdNTP)制备几个反应体积，总体积为50μl。各种量的DNA包括：2μg，1μg，0.5μg，0.3μg，0.1μg，0.05μg和0.02μg。通过使用cBOT仪器(Illumina,Inc.,San Diego,CA)将每个反应体积加载到流动池上。
流动池的初始温度设定为20℃，并且所描述的所有温度变化以1℃/s的变温速率(ramp rate)进行。首先，将160μl洗涤缓冲液以60μl/分钟流过流动池的每个泳道；并以60μl/分钟将20μl空气泵入每个入口管内。
将每个50μl反应体积泵入相应的流动池道中，接着用25μl空气将反应溶液推入流动池上的泳道内。将流动池的温度升高至55℃，然后温育5分钟；60℃1分钟；65℃；1分钟；70℃1分钟；和74℃1分钟。为了将双链DNA产物变性为单链DNA，将流动池加热至94℃持续5分钟。为了使单链DNA与固定在流动池表面上的表面捕获寡核苷酸杂交，将流动池的温度降低至40℃持续5分钟。为了通过延伸捕获寡核苷酸来复制杂交的DNA分子，将流动池的温度升高至74℃持续1.5分钟。为了从流动池泳道洗涤反应溶液，将流动池温度降低至60℃，并将160μl洗涤缓冲液以60μl/min流过流动池的每个泳道。
用28个等温桥式扩增循环扩增固定的DNA模板。将每个双链簇线性化，用0.1MNaOH除去线性化的P5链，通过特异性碱基切割除去反向链，留下正向链。使测序引物与簇中模板的3'末端上的衔接子上的互补序列杂交。在GAIIx基因组分析仪(Illumina，Inc.SanDiego，CA)上进行测序，通过合成测序读取进行所配对的末端测序，并持续36个序列循环。
表1显示了测序量度，其中包括高达约700k/mm2的簇密度和具有可接受水平的簇通过滤光器(PF)和良好质量分数(％>＝Q30)的簇。观察到簇密度与所用基因组DNA量之间的逆相关。表2总结了结果并且显示与大肠杆菌参考基因组成功比对的约93％的簇。用更大量的基因组DNA获得更长的插入物。图2A-C分别包括泳道1、2和3的插入物尺寸分布的图。
表1
表2
实施例2：从各种基因组DNA来源制备文库
在本实施例的实施方案中，从来自各种生物体的基因组DNA制备转位文库并测序。该实施例包括用于使用HiSeq流动池C3F68ACXX(Illumina Inc.，San Diego，CA)进行自动化样品制备实验的材料和方法。
从各种生物体(包括大肠杆菌，人，红杆菌属和蜡状芽孢杆菌)制备50ng/μl基因组DNA的储备溶液。红杆菌属具有相对富含GC的基因组，并且蜡状芽孢杆菌具有相对富含AT的基因组。通过混合以下组分制备标签化溶液：132μl H2O；88μl 5X Nextera反应缓冲液；8.8μl 10mM dNTP；2.2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)；和44μl转座体。用31.25μl标签化溶液和300ng或500ng基因组DNA制备50μl反应体积。将每个反应体积混合并使用cBOT仪器(Illumina Inc.，San Diego，CA)转移到HiSeq流动池(Illumina Inc.，San Diego，CA)上的泳道。在表3的条件下进行标签化和桥式扩增反应。
表3
获得测序数据。表4和表5各自显示出了来自流动池上的一些道的区块的测序量度。图3A，3B，3C和3D分别显示来自大肠杆菌，人，红杆菌属和蜡样芽孢杆菌的基因组DNA的样品的插入物的缺口大小分布。
在平行实验中，通过用sybr绿染色显现流动池上每个泳道的区块上的簇，并用荧光显微镜成像。图4显示用sybr绿染色的流动池上的每个泳道的区块，其中反应体积含有以下量的DNA：泳道1：300ng大肠杆菌基因组DNA；泳道2：500ng大肠杆菌基因组DNA；泳道3：300ng人基因组DNA；泳道4：500ng人基因组DNA；泳道5：300ng红杆菌属基因组DNA；泳道6：500ng红杆菌属基因组DNA；泳道7：300ng蜡状芽孢杆菌基因组DNA；和泳道8：500ng蜡状芽孢杆菌基因组DNA。
表4
表5
如本文中使用，术语“包括”与“包含”，“含有”或“特征在于”同义，它们是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未记载的要素或方法步骤。
如本文中使用，术语“每个”当用于指代项的集合时，旨在鉴定集合中的单个项，但不一定指的是集合中的每个项。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可能发生例外。
以上描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于对方法和材料的修改，以及制造方法和设备的改变。考虑到本公开或本文公开的本发明的实践，此类修改对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，不意图本发明限于本文公开的具体实施方案，但是它涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代。
本文中引用的所有参考文献，包括但不限于公开的和未公开的申请，专利和文献参考文献通过引用以其整体并入本文，并且由此成为本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的程度下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
本发明具体涉及：
1.制备用于测序的靶核酸群体的方法，所述方法包括：
(a)提供具有包含捕捉部分的表面的基底；
(b)使所述表面与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，其中每个转座体包含转座子序列和转座酶，其中通过使靶核酸与多个转座体接触来制备所述模板核酸；并且
(c)将所述模板核酸与所述捕捉部分缔合。
2.项1的方法，其还包括(d)测序缔合的模板核酸。
3.项2的方法，其还包括在(c)之后和(d)之前扩增缔合的模板核酸。
4.项3的方法，其中所述扩增包括桥式扩增。
5.项1-4中任一项的方法，其中(a)还包括提供包含所述靶核酸和所述转座体的样品。
6.项1-5中任一项的方法，其中所述样品包含聚合酶和/或连接酶。
7.项1-6中任一项的方法，其中通过在所述表面的存在下使所述靶核酸与所述多个转座体接触来制备所述模板核酸。
8.项1-6中任一项的方法，其中在使所述表面与包含多个模板核酸和转座酶的反应体积接触之前，通过使所述靶核酸与所述多个转座体接触来制备所述模板核酸。
9.项1-8中任一项的方法，其中在使所述表面与所述反应体积接触后，将聚合酶和/或连接酶添加到所述反应体积中。
10.项9的方法，其中步骤(c)包括用所述聚合酶或用聚合酶和连接酶延伸所述模板核酸。
11.项1-10中任一项的方法，其中所述捕捉部分是捕捉探针。
12.项11的方法，其中所述捕捉探针包括核酸。
13.项12的方法，其中步骤(c)包括使所述模板核酸与所述捕捉探针杂交。
14.项1-13中任一项的方法，其中步骤(c)包括制备单链模板核酸。
15.项11-14中任一项的方法，其中步骤(c)包括使所述捕捉探针和所述模板核酸与重组酶接触。
16.项1-15中任一项的方法，其中所述模板核酸和所述捕捉部分各自包含亲和部分。
17.项16的方法，其中所述亲和部分选自生物素，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。
18.项16-17中任一项的方法，其中步骤(c)包括将所述模板核酸的亲和部分与所述捕捉探针的亲和部分结合。
19.项1-18中任一项的方法，其中所述转座子序列包含选自条形码，UMI，测序引物和片段化位点的序列。
20.项19的方法，其还包括切割所述片段化位点。
21.项20的方法，其中在步骤(c)之后切割所述片段化位点。
22.项1-21中任一项的方法，其中至少一个转座体包含两个转座子序列。
23.项22的方法，其中所述转座子序列是不同的。
24.项1-23中任一项的方法，其中在步骤(b)之后除去所述转座酶。
25.项1-23中任一项的方法，其中在(c)之后除去所述转座酶。
26.项1-25中任一项的方法，其中通过使所述转座酶与蛋白酶或SDS接触来除去所述转座酶。
27.项1-26中任一项的方法，其中所述转座酶选自Tn5，Tn5的变体，超活性Tn5，Tn10和Mu。
28.项1-27中任一项的方法，其中至少一个转座体不同于至少一个其它转座体。
29.项1-28中任一项的方法，其中使用所述模板核酸在表面上的接近性确定从所述模板核酸获得的序列在所述靶核酸序列的线性表示中的接近性。
30.项29的方法，其中确定所述表面上彼此更接近的模板核酸包含与较不接近的模板核酸相比在所述靶核酸序列的表示中更接近的序列。
31.项29-30中任一项的方法，其中所述靶核酸序列的表示包括单倍型信息。
32.项1-31中任一项的方法，其中所述靶核酸选自DNA和RNA。
33.项1-31中任一项的方法，其中所述靶核酸选自基因组DNA和cDNA。
34.项33的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。
35.项1-34中任一项的方法，其中所述基底选自由至少一种珠，载玻片，流动池，通道，浸渍片和孔组成的组。
36.项1-35中任一项的方法，其中所述表面包含每mm2至少约10,000个缔合的模板核酸。
37.项1-35中任一项的方法，其中所述表面包含每mm2至少约100,000个缔合的模板核酸。
38.项1-35中任一项的方法，其中所述表面包含每mm2至少约1,000,000个缔合的模板核酸。
39.用于对项1-38中任一项所述的靶核酸测序的反应容器，其包含：
包含具有捕捉部分的表面的基底；和
与所述表面流体连通的反应体积，所述反应体积包含：
转座酶，
通过使靶核酸与多个转座体接触而制备的多个模板核酸，每个转座体包含转座子序列和所述转座酶，以及
聚合酶或连接酶。
40.项39的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，其中所述捕捉探针附着在所述表面上的形成重复模式的位点处。
41.项40的反应容器，其中所述捕捉探针被限制在所述表面上的所述位点，且在所述位点之间的间隙区域处不存在。
42.项39-41中任一项的反应容器，其中所述反应体积同时包含用于反应步骤的反应物，所述步骤包括：
将所述转座子序列转座到所述靶核酸中；
用所述聚合酶，或聚合酶和连接酶延伸所述模板核酸；和
将所述模板核酸与所述捕捉部分缔合。
43.项39-42中任一项的反应容器，其中所述反应体积配置用于包括在蛋白酶或SDS的存在下去除所述转座酶的反应步骤。
44.项39-43中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述反应体积配置用于在重组酶存在下将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。
45.项39-44中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述反应体积配置用于扩增与所述捕捉探针缔合的所述模板核酸。
46.项45的反应容器，其中所述扩增是桥式扩增。
47.项39-46中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述反应体积包含试剂，其用于将所述转座子序列序贯转座到所述靶核酸中；然后用所述聚合酶或用所述聚合酶和连接酶延伸所述模板核酸；然后将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。
48.项39-47中任一项的反应容器，其中所述反应体积包括在蛋白酶或SDS的存在下除去所述转座酶的试剂。
49.项39-48中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述反应体积包含用于在重组酶存在下将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合的试剂。
50.项39-49中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述反应体积包括用于扩增与所述捕捉探针缔合的模板核酸的试剂。
51.项39-50中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。
52.项39-51中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述捕捉探针包括核酸。
53.项39-52中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述模板核酸与所述捕捉探针杂交。
54.项39-53中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述模板核酸中的至少一种和所述捕捉探针中的至少一种各自包含亲和部分。
55.项54的反应容器，其中所述亲和部分选自生物素，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。
56.项39-55中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述捕捉探针包括重组酶。
57.项54-55中任一项的反应容器，其中所述模板核酸中的至少一种的亲和部分附着到所述捕捉探针中的至少一种的亲和部分。
58.项39-57中任一项的反应容器，其中所述转座酶选自Tn5，Tn5变体，超活性Tn5，Tn10和Mu。
59.项39-58中任一项的反应容器，其中所述转座子序列包含选自条形码，UMI，测序引物和片段化位点的序列。
60.项39-59中任一项所述的反应容器，其中所述转座体包含两个转座子。
61.项60的反应容器，其中所述转座子序列彼此不同。
62.项39-61中任一项的反应容器，其中所述靶核酸选自DNA和RNA。
63.项39-62中任一项的反应容器，其中所述靶核酸选自基因组DNA和cDNA。
64.项63的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。
65.项39-64中任一项的反应容器，其中所述基底选自由至少一种珠，载玻片，流动池，通道，浸渍片和孔组成的组。
66.项39-65中任一项的反应容器，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中所述模板核酸与所述捕捉探针缔合。
67.项39-66中任一项所述的反应容器，其中所述表面包含每mm2至少约10,000个模板核酸。
68.项39-66所述的反应容器，其中所述表面包含每mm2至少约100,000个模板核酸。
69.项39-66所述的反应容器，其中所述表面包含每mm2至少约1,000,000个模板核酸。
70.项39-69中任一项的反应容器，其中在所述靶核酸序列的线性表示中从两个模板核酸获得的序列接近性信息指示所述模板核酸在所述表面上的接近性。
71.项39-69中任一项的反应容器，其中在所述表面上彼此更接近的模板核酸包含与在较不接近的模板核酸相比在所述靶核酸序列的表示中更接近的序列。
72.项70-71中任一项的反应容器，其中所述靶核酸序列的表示包括单倍型表示。
73.流动池，其包括项39-72中任一项的反应容器。
74.用于对靶核酸测序的系统，其包括：
项39-72中任一项的反应容器；
用于调节所述反应容器的温度的热循环仪；和
用于收集来自所述反应容器的信号的检测器。
75.项74的系统，其包含处理器，所述处理器包含调节所述反应容器的温度以实施步骤的指令，所述步骤包括：
将所述转座子序列转座到所述靶核酸中，
用所述聚合酶或连接酶延伸所述模板核酸，并且
将所述模板核酸与所述捕捉部分缔合。
76.项75的系统，其中所述捕捉部分是多个捕捉探针，并且其中调节所述反应容器的温度以实施步骤的指令包括扩增与所述捕捉探针缔合的所述模板核酸。
77.项76的系统，其中所述扩增是桥式扩增。
Claims (41)
1.制备用于测序的靶核酸群体的方法，其包括：
(a)提供具有包含捕捉探针的表面的基底，其中所述捕捉探针包含核酸；
(b)使所述基底与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，其中通过使所述靶核酸与所述转座体接触来制备所述模板核酸；其中每个转座体包含(1)转座子序列，其包含锚定位点，所述锚定位点包含与所述捕捉探针互补或基本互补的序列，和(2)转座酶，并且其中：
i.当所述反应体积与所述基底接触时发生转座子序列插入所述靶核酸以制备模板核酸，或
ii.在所述反应体积与所述基底接触之前发生转座子序列插入所述靶核酸以制备模板核酸；
(c)通过所述捕捉探针捕捉所述锚定位点，从而将所述制备的模板核酸与所述基底缔合；和
(d)在所述表面上对所述缔合的模板核酸进行测序。
2.权利要求1的方法，其包括在(c)之后和(d)之前扩增所述缔合的模板核酸；任选地其中所述扩增包括在所述表面上的桥式扩增。
3.权利要求1的方法，其中(a)包括提供包含所述靶核酸和所述转座体的样品；任选地其中所述样品包含聚合酶和/或连接酶。
4.权利要求1的方法，其中在所述测序前不进行聚合酶链式反应的情况下进行所述测序。
5.权利要求1的方法，其中(c)包括在所述接触之前制备单链模板核酸。
6.权利要求1的方法，其中在溶液中进行所述转座子序列的插入。
7.权利要求1的方法，其中所述转座子序列包含片段化位点并且所述方法包括切割所述片段化位点，任选地其中在(c)之后切割所述片段化位点。
8.权利要求1的方法，其中在步骤(b)之后除去所述转座酶。
9.权利要求1的方法，其中在(c)之后除去所述转座酶。
10.权利要求1的方法，其中通过使所述转座酶与蛋白酶或SDS接触来除去所述转座酶。
11.权利要求1的方法，其中至少一个转座体不同于至少一个其它转座体。
12.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括使所述捕捉探针和所述制备的模板核酸与重组酶接触。
13.制备用于测序的靶核酸群体的方法，其包括：
(a)提供具有包含捕捉探针的表面的基底，其中所述捕捉探针包含核酸；
(b)使所述基底与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，其中通过使所述靶核酸与所述转座体接触来制备所述模板核酸；其中每个转座体包含(1)包含片段化位点的转座子序列，和(2)转座酶；
(c)通过所述捕捉探针捕捉所述锚定位点，从而将所述制备的模板核酸与所述基底缔合；
(d)切割所述片段化位点；和
(e)在所述表面上对所述缔合的模板核酸进行测序。
14.权利要求13的方法，其中在所述表面上测序包括通过确定所述捕捉的模板核酸在所述表面上的物理接近性，确定从所述模板核酸获得的序列在所述靶核酸序列的线性表示中的接近性。
15.权利要求14的方法，其中确定所述表面上彼此更接近的模板核酸包含与较不接近的模板核酸相比在所述靶核酸序列的表示中更接近的序列。
16.权利要求13的方法，其包括在(c)之后和(d)之前扩增所述缔合的模板核酸；任选地其中所述扩增包括在所述表面上的桥式扩增。
17.权利要求13的方法，其中(a)包括提供包含所述靶核酸和所述转座体的样品；任选地其中所述样品包含聚合酶和/或连接酶。
18.权利要求13的方法，其中在所述测序前不进行聚合酶链式反应的情况下进行所述测序。
19.权利要求13的方法，其中(c)包括在所述接触之前制备单链模板核酸。
20.权利要求13的方法，其中在溶液中进行所述转座子序列的插入。
21.权利要求13的方法，其中在步骤(b)之后除去所述转座酶。
22.权利要求13的方法，其中在(c)之后除去所述转座酶。
23.权利要求13的方法，其中通过使所述转座酶与蛋白酶或SDS接触来除去所述转座酶。
24.权利要求13的方法，其中至少一个转座体不同于至少一个其它转座体。
25.权利要求13的方法，其中步骤(c)包括使所述捕捉探针和所述制备的模板核酸与重组酶接触。
26.制备用于测序的靶核酸群体的方法，其包括：
(a)提供具有包含捕捉部分的表面的基底，其中所述捕捉部分各自包含亲和部分，其中所述亲和部分选自生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；
(b)使所述基底与包含多个模板核酸和转座体的反应体积接触，其中通过使所述靶核酸与所述转座体接触来制备所述模板核酸；其中每个模板核酸包含亲和部分，其中所述亲和部分选自生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且其中：
i.当所述反应体积与所述基底接触时发生转座子序列插入所述靶核酸以制备模板核酸，或
ii.在所述反应体积与所述基底接触之前发生转座子序列插入所述靶核酸以制备模板核酸；
(c)通过将所述模板核酸的所述亲和部分与所述捕捉部分的所述亲和部分结合来将所述制备的模板核酸与所述基底缔合；和
(d)在所述表面上对所述缔合的模板核酸进行测序。
27.权利要求26的方法，其包括在(c)之后和(d)之前扩增所述缔合的模板核酸；任选地其中所述扩增包括在所述表面上的桥式扩增。
28.权利要求26的方法，其中(a)包括提供包含所述靶核酸和所述转座体的样品；任选地其中所述样品包含聚合酶和/或连接酶。
29.权利要求26的方法，其中在所述测序前不进行聚合酶链式反应的情况下进行所述测序。
30.权利要求26的方法，其中(c)包括在所述接触之前制备单链模板核酸。
31.权利要求26的方法，其中在溶液中进行所述转座子序列的插入。
32.权利要求26的方法，其中所述转座子序列包含片段化位点并且所述方法包括切割所述片段化位点，任选地其中在(c)之后切割所述片段化位点。
33.权利要求26的方法，其中在步骤(b)之后除去所述转座酶。
34.权利要求26的方法，其中在(c)之后除去所述转座酶。
35.权利要求26的方法，其中通过使所述转座酶与蛋白酶或SDS接触来除去所述转座酶。
36.权利要求26的方法，其中至少一个转座体不同于至少一个其它转座体。
37.用于对靶核酸进行测序的反应容器，其包含：
包含表面的基底，所述表面包括包含核酸的捕捉探针，其中所述表面可以用于对缔合的模板核酸进行测序；和
与所述表面流体连通的反应体积，所述反应体积包含：
转座酶，
多个模板核酸，其通过使靶核酸与多个转座体接触并在所述反应体积与所述基底接触时将转座子序列插入所述靶核酸而制备，其中每个转座体包含转座酶和转座子序列，所述转座子序列包含锚定位点和选自条形码，UMI，测序引物结合位点和片段化位点的序列，所述锚定位点包含与所述捕捉探针互补或基本互补的序列，
以及聚合酶或连接酶。
38.权利要求37的反应容器，其中所述捕捉探针附着在所述表面上的形成重复模式的位点处，任选地其中所述捕捉探针被限制在所述表面上的所述位点，且在所述位点之间的间隙区域处不存在。
39.权利要求37的反应容器，其中所述反应体积包含用于除去所述转座酶的蛋白酶或SDS。
40.用于对靶核酸进行测序的系统，其包含：
包含基底的基底，所述基底包括包含核酸的捕捉探针，其中所述表面可以用于对缔合的模板核酸进行测序；
与所述表面流体连通的反应体积，所述反应体积包含：
转座酶，
多个模板核酸，其通过使靶核酸与多个转座体接触并在所述反应体积与所述基底接触时将转座子序列插入所述靶核酸而制备，其中每个转座体包含转座酶和转座子序列，所述转座子序列包含锚定位点和选自条形码，UMI，测序引物结合位点和片段化位点的序列，所述锚定位点包含与所述捕捉探针互补或基本互补的序列，
以及聚合酶或连接酶；
用于调节所述反应容器的温度的热循环仪；和
用于收集来自所述反应容器的信号的检测器。
41.权利要求40的系统，其包含处理器，所述处理器包含调节所述反应容器的温度以执行步骤的指令，所述步骤包括：
将所述转座子序列转座到所述靶核酸中，
用所述聚合酶或连接酶延伸所述模板核酸，
将所述模板核酸与所述捕捉探针缔合，和
在所述表面上对所述模板核酸进行测序。
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