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CN117866844B - 一株乳酸片球菌lh01及其应用 - Google Patents

一株乳酸片球菌lh01及其应用 Download PDF

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CN117866844B CN202410075747.7A CN202410075747A CN117866844B CN 117866844 B CN117866844 B CN 117866844B CN 202410075747 A CN202410075747 A CN 202410075747A CN 117866844 B CN117866844 B CN 117866844B
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Abstract

本发明公开了一株乳酸片球菌LH01，所述乳酸片球菌LH01（Pediococcus acidilactici LH01）已于2023年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63840。本发明的优点在于：乳酸片球菌LH01具有较强的降胆固醇能力，同时具有较强的抑制细菌和真菌的能力；耐酸耐胆盐实验、溶血性实验、抗生素敏感实验表明，该菌株具有极高安全性，具有广泛的应用前景。

Description

一株乳酸片球菌LH01及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株具有降胆固醇能力的乳酸片球菌及其应用。
背景技术
心脑血管疾病是一类危害人类健康且很难被攻克的慢性疾病。其致病因素众多，诸如遗传因素、不规律生活习惯、高热量食物的暴食等均会引起该类疾病的发生。至今，还未找到确实可行的治愈该疾病的有效方法。由此防重于治是控制该类疾病的有效方法。有证据表明，血液以及肝脏中胆固醇含量过高是诱发心脑血管类疾病的重要原因之一。如果可以控制血液中胆固醇水平维持在合理的范围之内，则可降低心脑血管疾病的发病趋势。
目前降低胆固醇主要依靠长期服用化学药物进行预防治疗，存在的问题是长期服药产生多种副作用，例如血管紧张素相关的拮抗药可能会产生肌肉无力、高血钾、心跳过慢等副作用；他汀类药物可能会产生肝功能指数上升、头痛、恶心、疲倦等副作用。采用益生菌制成的各种药品、食品、保健品等，在降低胆固醇方面具有一定的作用，且相比于传统的化学药物，副作用小。因此，研发一种副作用小，且能有效降低胆固醇含量，预防心血管疾病的微生物产品具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有较强的降胆固醇能力的乳酸片球菌。
本发明提供一株乳酸片球菌LH01，所述乳酸片球菌LH01(Pediococcusacidilactici LH01)已于2023年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63840。
本发明提供一种包括乳酸片球菌LH01的菌剂。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂发酵获得的发酵产物。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂或发酵产物在制备降胆固醇、降血脂、减肥或者抑菌药品中的应用。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂或发酵产物在制备食品或保健品中的应用。
本发明有益效果：
本发明从云南传统发酵豆豉中分离的乳酸菌库中筛选出来的一株乳酸片球菌LH01，具有较强的降胆固醇能力，同时具有较强的抑制细菌和真菌的能力；耐酸耐胆盐实验、溶血性实验、抗生素敏感实验表明，该菌株具有极高安全性，将该菌株用于生产，在达到治疗疾病的同时，可有效降低药物带来的一系列副作用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为乳酸片球菌LH01的菌落形态图；
图2为乳酸片球菌LH01的系统进化树；
图3为乳酸片球菌LH01对大肠杆菌的抑菌结果图；
图4为乳酸片球菌LH01对金黄色葡萄球菌的抑菌结果图；
图5为乳酸片球菌LH01对白色念珠菌的抑菌结果图；
图6为乳酸片球菌LH01对红色毛癣菌的抑菌结果图；
图7为金黄色葡萄球菌的溶血试验结果图；
图8为乳酸片球菌LH01的溶血试验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供一株乳酸片球菌LH01，分离自云南传统发酵豆豉中，乳酸片球菌LH01(Pediococcus acidilactici LH01)已于2023年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63840。
本发明提供一种包括乳酸片球菌LH01的菌剂。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂发酵获得的发酵产物。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂或发酵产物在制备降胆固醇、降血脂、减肥或者抑菌药品中的应用。
本发明提供一种乳酸片球菌LH01或菌剂或发酵产物在制备食品或保健品中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一株乳酸片球菌LH01及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
乳酸片球菌LH01的分离纯化、鉴定及保藏
1.菌株的分离和纯化
乳酸片球菌LH01分离自云南传统发酵豆豉中，方法为：装有5mL MRS液体培养基的试管经115℃高压蒸汽灭菌20min。取发酵豆豉样品3-5粒快速放于试管中，立即塞上胶塞，充分混匀。将试管置于培养箱中37℃静置培养24h。在无菌操作台中吸取100μL已经培养24h且已经混匀的菌液加入到已经分装好的900uL的无菌生理盐水中进行梯度稀释，然后取100μL的105，106，107的稀释液均匀涂布在MRS固体培养基上，每个梯度做三次平行，将涂布好的的固体培养基置于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h，待长出单菌落后，用灭过菌的牙签挑取其中的单菌落在MRS固体培养基上划线，放于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h，重复用牙签挑取单菌落划线2-3次，直到长出的纯化好的单一菌落。最后将单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃静置培养24h后，用30％甘油保存至-80℃冰箱备用。
所述MRS液体培养基(g/L)组成：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，加水1000mL混匀，115℃灭菌20min。
所述MRS固体培养基(g/L)组成：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，加水1000mL混匀，115℃灭菌20min。
2.菌株形态学鉴定
革兰氏染色与镜检鉴定表明，该菌株为革兰氏阳性菌，球状，大圆形菌落，边缘规则，表面光泽，不透明，凸起，乳白色。乳酸片球菌LH01的菌株形态图如图1所示。
3.菌株分子生物学鉴定
将菌株接种于MRS的液体培养基中，放置到37℃恒温培养箱进行活化培养，然后提取菌株的基因组DNA(DNA提取采用试剂盒QIAamp genomic DNAand RNAkits进行)，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)对所分离菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、DNA模板1μL、ddH2O 8μL；反应程序：95℃5min；94℃1min，55-58℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min。样品中分离培养出的菌株的16S rRNA的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列的测定，然后将所测的16S rRNA基因序列在NCBI数据库的GenBank中进行Blast比对，选取与分离菌株相似度最高的细菌标准株，然后将所测的16S rRNA基因序列在NCBI数据库的GenBank中进行Blast比对，选取与分离菌株相似度最高的细菌标准株，确定菌株种类，并应用MEGA7.0软件构建系统进化树，构建系统进化树。乳酸片球菌LH01的系统进化树如图2所示。
实验结果：经形态学鉴定、分子生物学鉴定，16S rRNA基因序列比对，构建系统进化树，LHO1为乳酸片球菌鉴定为乳酸片球菌。
4.菌株保藏
该菌株已于2023年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63840；保藏地址为：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼；联系电话：020-87137633。
实施例2
降胆固醇试验
实验步骤如下：
(1)绘制标准曲线
将胆固醇标准品用甲醇溶解配成1mg/mL溶液，将固醇标准品溶液稀释成不同浓度梯度，制备得到不同浓度的胆固醇标准液。
针对不同浓度的胆固醇标准液，进行如下操作：取500μL胆固醇标准液与2500μLKOH-甲醇溶液充分混匀，80℃水浴中皂化10min，每隔1min震荡混匀一次。其中KOH-甲醇溶液的制备方法为：称取200gKOH，加入甲醇溶解，最后用甲醇定容至1L。皂化结束后，将冷却至20℃的皂化物与3mL正己烷充分混匀1min，然后静置分层，并取上层溶液，2000r/min，4℃离心10min。将离心上清1mL加入离心管中60℃干燥，待溶剂全部挥发后，用400μL冰乙酸进行充分洗脱，最后在洗脱液中加入1mL显色剂，60℃金属浴反应15min，于490nm波长下测定被测样品的吸光度值。以胆固醇标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
本实施例中绘制出的胆固醇标准曲线为：y＝1.356x-0.0003。
(2)试验样品处理
将乳酸片球菌LH01用MRS液体培养基复壮两次后，按4‰的接种量将菌株接种至5mL复筛培养基中，37℃厌氧培养72h后，2000r/min，4℃离心10min，取500μL上清，按照上述胆固醇标准液同样的操作方法进行作业，最终于490nm波长下测定被测样品的吸光度值。根据吸光度值计算样品中胆固醇浓度，并按照如下公式计算菌株对胆固醇的去除率：
胆固醇去除率(R)＝(a-b)/a×100％
其中a表示乳酸片球菌LH01样品初始培养时培养液中的胆固醇浓度；
b表示乳酸片球菌LH01样品培养结束后培养液中胆固醇浓度；
(3)空白对照样品处理
取500μL复筛培养基，按照上述胆固醇标准液同样的操作方法进行作业，最终于490nm波长下测定被测样品的吸光度值。
所述复筛培养基(g/L)组成：胆固醇0.192g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，加水1000mL混匀，115℃灭菌20min。
本试验采用改良的皂化-比色法测定LH01的胆固醇去除率，具有快捷简便，分离筛选效率高，成本较低，适用于大规模筛选等优点。结果表明，LH01的胆固醇去除率高达86％。
实施例3
抑制细菌、真菌试验
抑制细菌试验：在平板底部均匀倾倒10mLMRS固体培养基，晾干后在平板中间放置牛津杯，牛津杯内部加入108CFU/mL的乳酸片球菌LH01，待病原菌对应的培养基冷却至40℃时，往培养基中加入适量病原菌，使病原菌终浓度为106CFU/mL，病原菌分别为金黄色葡萄球菌(培养基为BHI固体培养基)、大肠杆菌(培养基为LB固体培养基)，至完全冷却凝固后置于37℃恒温培养24h，测量抑菌圈的直径，所有实验重复3个平行。抑菌培养结果如图3所示。
抑制真菌试验：在平板底部均匀倾倒约10mLMRS固体培养基，晾干后在平板中间放置牛津杯，牛津杯内部加入108CFU/mL的乳酸片球菌LH01，待病原菌对应的培养基冷却至40℃时，往培养基中加入适量病原菌，使病原菌终浓度为106CFU/mL，病原菌分别为白色念珠菌(培养基为沙氏固体培养基)、红色毛癣菌(培养基为YEPD固体培养基)，至完全冷却凝固后置于37℃恒温培养24h，测量抑菌圈的直径，所有实验重复3个平行。
病原菌所用培养基均为合成培养基，购买自广东环凯微生物科技有限公司。
抑菌培养结果如图3-6所示。抑菌结果表明，LH01对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和红色毛癣菌四种病原菌都有抑菌作用，其中对大肠杆菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径为40mm，其次是金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径为31mm，LH01对真菌的抑菌效果也较为显著，其抑菌圈直径均超过20mm。
实施例4
耐酸、耐胆盐试验
(1)耐酸试验：当乳酸片球菌LH01的活菌数达到108CFU/mL时，按照4‰的接种量分别接入pH2.5、pH3.0和pH6.5的MRS液体培养基，37℃培养12h，每2h取样测定其活菌数，每组3次平行。
菌株存活率计算公式如下：
其中N1为培养12h后各pH培养基培养后的活菌数；N0为菌株初始活菌数108CFU/mL。
结果显示，经过12h的培养，乳酸片球菌LH01呈现了较强的耐酸性，在pH3.0的条件下LH01存活率为112.34％，当pH下降到2.5时，LH01的存活率为98.21％，正常人体进食后胃部pH维持在3.0-5.0之间，因此LH01能进入人体的肠道，对其降胆固醇活性没有影响。
(2)耐胆盐试验:当乳酸片球菌LH01的活菌数为108CFU/mL时，按照4‰的接种量接入含0.3％胆盐的MRS液体培养基中，置于37℃培养，并于培养3h时取样，稀释后涂布于MRS琼脂平板。待培养结束后统计MRS琼脂平板上的活菌数，并按如下公式计算菌株存活率：
其中N1为含0.3％胆盐培养基培养3h后的活菌数；N0为菌株初始活菌数108CFU/mL。
结果显示，将乳酸片球菌LH01用0.3％耐胆盐处理3h后，LH01的存活率为97.19％，人体肠道内胆盐的含量一般在0.03％-0.3％之间，LH01在高胆盐情况下的存活率较高，具有较强的耐胆盐能力。
实施例5
溶血试验
将乳酸片球菌LH01用MRS液体培养基复壮两次后，当活菌数达到108CFU/mL时，提取1mL菌液，2000r/min，4℃离心10min后，用0.9％灭菌生理盐水洗涤菌体2次后，重新悬浮菌液。将菌液稀释后涂布于含5％的无脱纤维蛋白羊血的BHI固体培养基中，37℃培养48h，随后观察菌株的溶血情况。采用金黄色葡萄球菌按照上述培养方法作为阳性对照。以上实验重复3次。金黄色葡萄球菌和乳酸片球菌LH01溶血试验结果如图7-8所示。
结果显示，与阳性对照金黄色葡萄球菌相比，乳酸片球菌LH01无溶血性，表明乳酸片球菌LH01在使用上不存在致病性，可放心用于商业化使用。
实施例6
药敏试验
用药敏纸片琼脂扩散法检测菌株对药物的敏感性，具体步骤如下：将滤纸片裁剪成5mm直径圆形小纸片，121℃灭菌后置于烘箱中干燥。将滤纸片分别浸入氨苄青霉素、四环素、氯霉素、利福平、红霉素、链霉素、庆大霉素、替考拉宁8种不同的药品溶液中，制备成药物含量标准的药敏纸片，干燥备用。乳酸片球菌LH01菌株用MRS液体培养基活化两次，当活菌数达到1x108CFU/mL时，取1mL菌液离心去上清，用0.9％灭菌生理盐水洗涤两次菌液后，重新悬浮菌液，取100μL菌液均匀涂布在MRS固体培养基上。待培养基凝固后，贴放自制的药敏纸片，纸片间距不少于24mm，距平板内缘大于15mm，贴好后迅速放入恒温培养箱中，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。试验测得的乳酸片球菌LH01的抗生素敏感试验结果如下表所示：
抗生素 敏感性结果
氨苄青霉素(10μg) S
四环素(30μg) S
氯霉素(30μg) I
利福平(5μg) I
红霉素(5μg) I
链霉素(10μg) S
庆大霉素(10μg) S
替考拉宁(30μg) I
其中：S代表敏感性，I代表中间抗性。
结果显示，LH01对氨苄青霉素、四环素、链霉素和庆大霉素具有敏感性，对氯霉素、利福平、红霉素和替考拉宁具有中间抗性。表明LH01安全性很高，可被后续食品开发利用。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一株乳酸片球菌LH01，其特征在于：所述乳酸片球菌LH01（Pediococcus acidilactici LH01）已于2023年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63840。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的乳酸片球菌LH01。
3.权利要求1所述的乳酸片球菌LH01或权利要求2所述的菌剂发酵获得的发酵产物。
4.权利要求1所述的乳酸片球菌LH01或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在制备降胆固醇、降血脂、减肥或者抑菌药品中的应用。
5.权利要求1所述的乳酸片球菌LH01或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在制食品或保健品中的应用。
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