CN117866069B - 一种碘-131标记的小分子多肽tfmp-y4及其制备方法和应用 - Google Patents
一种碘-131标记的小分子多肽tfmp-y4及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种碘‑131标记的小分子多肽TFMP‑Y4及其制备方法和应用。本发明在caerin1.1多肽的基础上重新设计得到一个新的小分子多肽TFMP‑Y4，其对肝癌细胞和人正常肝细胞均无增殖抑制作用，而131I进行标记后的131I‑TFMP‑Y4能显著抑制肝癌细胞增殖，由于单纯的TFMP‑Y4对人正常肝细胞无增殖抑制作用，故131I‑TFMP‑Y4溶液中游离的单纯肽不会引起对正常细胞的毒副反应，因此与131I‑caerin1.1相比，131I‑TFMP‑Y4在具有显著的抗肿瘤活性的同时可降低毒副反应，提高药物安全性和肿瘤靶向性，能作为肿瘤内照射治疗的潜在药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，近年来，肝癌发病率逐年上涨，而肝癌的5年生存率仍旧较低。原发性肝癌包括肝细胞肝癌(HCC)及胆管细胞癌(ICC)，而90％的原发性肝癌是肝细胞肝癌。因此，各项针对肝细胞肝癌(HCC)的治疗研究应运而生。目前，已有研究表明放射治疗和延缓肿瘤生长免疫刺激剂联合治疗肝癌(HCC)，可显著延长生存期。由此可见，利用射线所产生的生物辐射效应与肿瘤生长抑制剂产生的抗肿瘤活性作用联合治疗是肝癌治疗最有效的方法之一。而本方法涉及的利用放射性标记的抗肿瘤活性多肽进行内照射治疗的原理正是如此。
内照射治疗是指将放射性核素或其标记物引入体内，利用放射性核素发射出α和β射线对周围组织产生电离辐射的生物学效应来达到破坏肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。同时保护正常组织。将放射性标记小分子多肽应用于核医学和肿瘤学中，已成为非常重要的显像和/或治疗方法。已有学者用临床相关的放射性核素对多种小分子多肽进行了放射性标记，并用于肿瘤的显像与治疗。
caerin系列多肽是一种从澳大利亚树蛙皮肤腺体分泌物提取而来宿主防御多肽，发明人团队前期研究证实caerin系列多肽对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用，其抗肿瘤增殖作用可能是通过调节PI3K/AKT信号通路，诱导TNF-α通路激活的结果。研究结果显示125I标记的caerin1.1对乳腺癌细胞有抑杀作用，131I标记的caerin1.1对甲状腺未分化癌、小细胞肺癌、食管癌等多种恶性肿瘤具有明显的抑杀作用，其IC50均较低。然而当Caerin1.1多肽处于高浓度状态时也可对正常细胞产生增殖抑制作用，因此需要研发能减少毒副作用，提高药物安全性的小分子多肽。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小分子多肽TFMP-Y4。
本发明的第二个目的在于提供一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4。
本发明的第三个目的在于提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明在caerin1.1多肽的基础上，重新设计得到了一个新的小分子多肽TFMP-Y4，用131I进行标记，探讨其对肝癌的作用，并与caerin1.1、131I-caerin1.1进行比较。
具体为：(1)采用MTT实验及平板克隆形成实验明确caerin1.1、TFMP-Y4对肝癌Hepg2肿瘤细胞增殖抑制作用及通过MTT实验验证TFMP-Y4对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用。(2)采用氯胺-T法制备131I-Caerin1.1及131I-TFMP-Y4多肽，测定其标记率及在不同溶液中、不同温度下的稳定性，并测定其脂水分配系数。(3)采用细胞摄取实验及细胞洗脱实验明确131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4是否能被肝癌细胞摄取并滞留在细胞内；通过细胞增殖毒性实验验证caerin1.1、TFMP-Y4单纯多肽及其碘标化合物对Hepg2肿瘤细胞增殖的抑制作用。(4)建立荷瘤裸鼠模型，研究单纯多肽及131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4体内治疗作用效果。(5)将肿瘤组织进行HE染色，观察肿瘤组织的病理改变。
结果显示，(1)Caerin1.1能有效抑制Hepg2细胞增殖，并呈浓度依赖性，IC50为9.32μg/mL，而TFMP-Y4对Hepg2细胞增殖未表现抑制作用，caerin1.1和TFMP-Y4对肝癌细胞抗肿瘤活性作用有显著差异(P＜0.05)。克隆实验表明随caerin1.1浓度增加，Hepg2细胞增殖受抑制更加显著(与对照组相比，P＜0.05)，TFMP-Y4对肝癌Hepg2细胞及人正常肝细胞LO2的增殖均未表现抑制作用。(2)131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4标记率均大于95％，并在不同溶液及为温度条件下能维持稳定。(3)131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4均能被细胞摄取并滞留，与单纯肽比较，两者抑制细胞增殖作用更强(P＜0.05)。(4)与对照组相比，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4均对Hepg2细胞异种移植模型有治疗效果(P＜0.05)，两组结果有明显差异(P＜0.05)。(5)与对照组相比，caerin1.1、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4组可见细胞显著坏死及变性(P＜0.05)。
本发明研究表明Caerin1.1能抑制肝癌细胞肿瘤的活性，TFMP-Y4不能，但131I标记的caerin1.1、TFMP-Y4均能抑制肝癌细胞增殖，其抑制效果与两者的单纯肽相比具有显著差异(P＜0.05)；由于纯的TFMP-Y4对肝癌细胞和人正常肝细胞均无增殖抑制作用，故131I-TFMP-Y4溶液中游离的单纯肽不会引起对正常细胞的毒副作用，因此与131I-caerin1.1对比，131I-TFMP-Y4可降低药物毒副作用和不反应，提高药物安全性和肿瘤靶向性。
具体地，所述小分子多肽TFMP-Y4其氨基酸序列为YGLFGVLGSAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2，如SEQ ID No.1所示，在获知氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域常规的多肽合成技术制备得到。
进一步地，所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4，为SEQ ID No.1所示小分子多肽TFMP-Y4的氨基酸基团上结合有放射性标记碘-131。
本发明还提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4的制备方法，为采用氯胺-T法，将小分子多肽TFMP-Y4溶液、Na-131I溶液与氯胺-T溶液室温震荡混匀，再利用层析法分离出含131I的TFMP-Y4多肽，即得。
进一步地，所述TFMP-Y4与Na-131I的比例为100μg：1mCi，该比例下131I标记率最高。
进一步地，所述TFMP-Y4溶液质量浓度为1mg/mL，所述Na-131I溶液的电离辐射为1mCi(3.7×107Bq)；所述氯胺-T溶液需现配现用，质量浓度为1mg/mL。
本发明还提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4在制备治疗肿瘤的药物中的应用，具体为碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4在制备肿瘤内照射治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括但不限于肝癌。
本发明还提供一种肿瘤治疗药物，所述药物含有碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明的药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但应认识到，本发明的药物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在caerin1.1多肽的基础上重新设计得到一个新的小分子多肽TFMP-Y4，其对肝癌细胞和人正常肝细胞均无增殖抑制作用，而131I进行标记后的131I-TFMP-Y4能显著抑制肝癌细胞增殖，由于单纯的TFMP-Y4对肝癌细胞和人正常肝细胞均无增殖抑制作用，故131I-TFMP-Y4溶液中游离的单纯肽不会引起对正常细胞的毒副作用和不良反应，因此与131I-caerin1.1对比，131I-TFMP-Y4在具有显著的抗肿瘤活性的同时可降低药物毒副反应，提高药物安全性和肿瘤靶向性，能作为肿瘤内照射治疗的潜在药物。
附图说明
图1为P3(对照肽)、caerin1.1、TFMP-Y4多肽对肝癌细胞Hepg2和人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用。其中，a为不同浓度的P3、TFMP-Y4作用下肝癌Hepg2细胞的存活率；b为不同浓度的caerin1.1、TFMP-TY4作用下Hepg2细胞的存活率比较；c为不同浓度P3、Caerin1.1、TFMP-TY4作用下Hepg2细胞的IC50；d为P3、Caerin1.1、TFMP-TY4对人肝正常细胞LO2的IC50；e为P3、TFMP-Y4作用下LO2细胞的存活率；f为不同浓度的caerin1.1、TFMP-TY4作用下LO2细胞的存活率比较。(NS：P＞0.05，****：P＜0.0001)。
图2为不同浓度的多肽Caerin1.1、TFMP-TY4作用下Hepg2细胞集落的数量。
图3为与对照组(0mg/mL)对比，不同浓度的多肽Caerin1.1、TFMP-Y4作用下Hepg2细胞集落的数量。其中，A为Caerin1.1的结果；B为多肽TFMP-Y4的结果。(NS：P＞0.05，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
图4为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的γ计数曲线。其中，A为131I-caerin1.1的γ计数曲线；B为131I-TFMP-Y4的γ计数曲线；C为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4标记率之间的差异性分析结果。(NS：P＞0.05)。
图5为在25℃及37℃温度下，单纯的131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4、与FBS混合的131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4、与NS混合的131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4在0h、24h、72h的放射化学纯度。其中，A～B分别为单纯的131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4在25℃及37℃温度下0h、24h、72h的放射化学纯度；C～D分别为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4与FBS混合后在25℃及37℃温度下0h、24h、72h的放射化学纯度；E～F分别为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4与NS混合后在25℃及37℃温度下0h、24h、72h的放射化学纯度。
图6为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的细胞摄取洗、脱实验结果。其中，A为Hepg2细胞在2h、4h、6h、24h对131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的药物摄取率；B为在药物与细胞作用24h后进行洗脱，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4在洗脱后2h、4h、6h、24h在Hepg2细胞中的药物结合率。
图7为131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的细胞增殖毒性实验结果。其中，A～B分别为在逐渐增大的caerin1.1浓度(0、2.5、5、10、20μg/mL)、TFMP-Y4浓度(0、6、12、24、48μg/mL)背景下，随之增大的131I(2000、4000、8000、16000KBq)浓度作用下的细胞存活率；C～D分别为在不同浓度(2000、4000、8000、16000KBq)的Na-131I、131I-caerin、131I-TFMP-Y4作用下Hepg2细胞的存活率；E为在不同浓度的caerin1.1(0、2.5、5、10、20μg/mL)和TFMP-Y4(0、6、12、24、48μg/mL)作用下Hepg2细胞的存活率；F为在不同浓度(2000、4000、8000、16000KBq)的131I-caerin、131I-TFMP-Y4作用下Hepg2细胞的存活率。(NS：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
图8为6个治疗组组裸鼠重量、肿瘤体积、肿瘤重量。其中，A～B为4次药物治疗前(7天，9天，11天，13天)及裸鼠促死前(15天)测量的裸鼠肿瘤体积；C为4次药物治疗前(7天，9天，11天，13天)及裸鼠促死前(15天)裸鼠体重；D为不同药物治疗组肿瘤重量。(*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
图9为6个治疗组分离出的肿瘤的图片。
图10为6个治疗组肿瘤切片的H&E染色。其中，A为不同治疗组肿瘤切片的H&E染色；B为不同治疗组细胞变性坏死面积差异统计图。(NS：P＞0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
(1)细胞系及细胞培养
肝癌(HCC)细胞系Hepg2和人正常肝细胞LO2均来自广东药科大学附属第一医院毛刘峰课题组赠送。Hepg2细胞和LO2细胞培养基由89％DMEM(GIBCO、USA)、10％热灭活胎牛血清(FBS，Corning，USA)、1％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，USA)配置而成。细胞放置于37℃、5％CO2的培养箱(Thermo Scientific，USA)中培养。
(2)Caerin1.1多肽、TFMP-Y4多肽、P3对照多肽的氨基酸序列组成
Caerin1.1多肽：GLLSVLGSVAKHVLPHVLPVVPVIAEHL-NH2，其结构式如下所示：
TFMP-Y4：YGLFGVLGSAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2(SEQ ID No.1)，其结构式如下所示：
P3对照多肽：GTELPSPPSVWFEAEF-OH
P3、caerin1.1、TFMP-Y4多肽均由中国多肽集团有限公司(上海，China)合成，采用高性能液体色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定，P3纯度均＞95％，caerin1.1、TFMP-Y4的纯度均＞98％。将P3、caerin1.1、TFMP-Y4多肽固体粉末在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解，并配成不同浓度(0.1mg/mL、1mg/mL、5mg/mL)，放置于-20℃冰箱内保存。多肽P3对肿瘤细胞增殖无抑制作用，为阴性对照。
(3)裸鼠
从广东省医学实验动物中心购买4～6周龄(成年)的特异性无病原体(SPF)BALB/c雌性裸鼠，SPF级小动物饲料及垫料。将这些裸鼠饲养在广东药科大学附属第一医院动物实验中心SPF级动物房。在研究期间，没有一只动物生病或死亡。根据《中华人民共和国卫生部动物管理办法》(2001年第55号文件)，所有裸鼠均采用颈椎脱位法处死。所有实验均按照广东药科大学附属第一医院动物实验伦理委员会(伦理批准号：FAHGPU20160316)的指导方针进行批准。
本发明在caerin1.1多肽的基础上，重新设计得到一个新的小分子多肽TFMP-Y4(SEQ ID No.1)，同时探究小分子多肽caerin1.1、多肽TFMP-Y4及两者的碘标化合物131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4对肝癌的作用，并进行比较。具体试验如以下实施例。
数据分析：以下实施例所有实验至少重复三次。所有数据均用GraphPad Prism(San Diego CA，USA)来进行统计分析。131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4标记率采用该软件的t检验进行分析，其他实验采用该软件的方差分析进行分析。P＜0.05被认为有统计学意义。
实施例1MTT实验探究caerin1.1、TFMP-Y4对Hepg2细胞和LO2细胞增殖的作用
将500mg的3-(4，5-二甲基噻唑-2-)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)粉末(Sigma-Aldrich，USA)在100mL的PBS中充分溶解，浓度为5mg/mL(即0.50％MTT)，在外周包裹一层锡纸用以避光，并放置于-20℃冰箱中保存。使用96孔板(Corning，USA)，选取呈指数生长的Hepg2细胞或LO2细胞，向每孔中接种5×103个细胞，100μL/孔，并放置于37℃，5％ CO2培养箱中孵育24h，向96孔板中加入P3、caerin1.1、TFMP-Y4，使其最终浓度为1、5、10、15、20、25、30、40mg/mL，每组3个复孔。将96孔板放置于培养箱中孵育24h，显微镜下观察细胞生长状况，向每孔内加入10μL MTT溶液后，再次放置于培养箱中静置4小时。随后，将96孔板内上清液吸出，向每孔内加入150μL二甲基亚砜溶液(DMSO，Sigma-Aldrich，USA)，将96孔板放在摇床上，低速摇匀10分钟。用酶标仪(Thermo Scientific，USA)测量570nm处的吸光度。用GraphPad Prism计算每种多肽半抑制浓度(IC50)和细胞存活率(S％)。
MTT实验结果如图1所示，Caerin1.1能有效抑制Hepg2细胞增殖，并呈浓度依赖性(图1b)，IC50为9.32μg/mL(图1c)，而TFMP-Y4对Hepg2细胞增殖未表现抑制作用(图1a、b、c)，TFMP-Y4对人正常肝细胞LO2的增殖也未表现抑制作用(图1d、e)。caerin1.1和TFMP-Y4对肝癌细胞抗肿瘤活性作用有显著差异(P＜0.05)(图1b)，且caerin1.1和TFMP-Y4对人正常肝细胞LO2的增殖抑制作用在高浓度时(≥25μg/mL)作用有显著差异(P＜0.05)(图1f)。
实施例2平板克隆形成实验
使用六孔板(Corning，USA)，向每孔中接种800个Hepg2细胞，2mL/孔，并在培养箱中放置过夜。观察细胞贴壁后，向每孔内加入不同体积的caerin1.1、TFMP-Y4溶液，使每孔中最终药物浓度为0、2.5、5、6、7、8μg/mL，将其放置于培养箱中培养。每2天更换一次培养基。显微镜下观察细胞集落数量，至培养第6天，吸取每孔内上清液，向每孔内加入1mL 4％多聚甲醛(Sigma，USA)，放置于细胞培养箱内20min后取出，向每孔内加入结晶紫溶液(Beyotime，China)染色20min，用PBS润洗并风干。采用ImageJ计数细胞集落，并用GraphPadprism比较同组间细胞生长差异。
显微镜下观察到的细胞集落数量结果如图2所示，细胞集落的计数结果如图3所示，克隆实验表明随caerin1.1浓度增加，Hepg2细胞增殖受抑制更加显著(与对照组相比，P＜0.05)，TFMP-Y4对Hepg2细胞增殖未表现抑制作用。
实施例3 131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的配制
(1)称取5mg氯胺-T三水化合物(Macklin，China)固体粉末并使其充分溶解于5mLPBS溶液中，浓度为1mg/mL。
(2)向1.5mL的无菌EP管(Shanghai Hongsheng Biotech Co.,Ltd.,China)内分别加入40μL caerin1.1(1mg/mL)、100μL1mCi(3.7×107Bq)的Na-131I溶液(Guangdong JunqiMedicine Technology Co.,Ltd.,China)、100μL新鲜制备的氯胺-T溶液，总体积为240μL，将EP管放置于涡旋混合器(Thermo Scientific，USA)中在室温下震荡10min使其充分混合。
(3)向1.5mL的无菌EP管内分别加入100μLTFMP-Y4(1mg/mL)、1mCi(3.7×107Bq)100μL的Na-131I溶液、100μL新鲜制备的氯胺-T溶液，总体积为300μL，将EP管放置于涡旋混合器中在室温下震荡10min使其充分混合。
(4)使用生理盐水(NS，Yangzhou Zhongbao Pharmaceutical Co.,Ltd.,China)作为展开剂。使用γ计数器(Zhongjia Optoelectronics Co.,Ltd.,China)，通过薄层纸层析法测定两种试剂的放射性，评估131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4的标记率。使用GraphPadPrism绘制γ计数曲线，计算曲线下面积得到标记率。
标记率(％)＝131I-caerin1.1或131I-TFMP-Y4放射性峰面积/放射性峰曲线总面积×100％
结果如图4所示，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4标记率均大于95％(图4A、图4B)，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4标记率之间无明显差异(NS：P＞0.05)(图4C)。
实施例4 131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4稳定性检测
将现配的131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4溶液分别与FBS及NS混合，并储存在25℃和37℃两种不同温度下，在0h、24h、72h时用纸色谱分析法测定其放射化学纯度(RCP)，由此得到两种放射性标记产物在不同温度及不同溶液中的稳定性。使用GraphPad Prism计算RCP，评价131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4的稳定性。
结果如图5所示，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4在不同溶液及温度条件下均能保持稳定状态。
实施例5脂水分配系数测定
取两个1.5mL的无菌EP管，两管中均加入500μL正辛醇(Macklin，China)和500μL生理盐水，分别向其中加入现配的131I-caerin1.1溶液和131I-TFMP-Y4溶液50μL，密封并震荡2分钟后，4000转、5min离心，这时正辛醇及生理盐水间出现平衡状态。从上层脂相和下层水相中分别吸取50μL样品，并测定他们的放射性计数值。本实验重复了4次。脂水分配系数(LogP)计算如下：Log P＝Log[(脂相γ计数-本底γ计数)/(水相γ计数-本底γ计数)]。
131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4两者的脂水分配系数分别如表1、表2所示，可见两者LogP均＞0，表明两种药物均呈脂溶性，而131I-TFMP-Y4的LogP更大，表明其可能较caerin1.1多肽更容易通过细胞膜进入细胞。
表1 131I-Caerin1.1在脂相及水相中的CPM计数及脂水分配系数
表2 131I-TFMP-4在脂相及水相中的CPM计数及脂水分配系数
实施例6细胞摄取实验
使用24孔板(Corning，USA)，向每孔内加入5×104个Hepg2细胞，500μL/孔。将24孔板放置于培养箱中过夜。镜下观察细胞贴壁，吸去上清液，每孔内加入500μL无血清培养基。每板3个组，每组设置1个阳性对照孔及3个复孔。向3组孔内分别加入131I-caerin1.1溶液1.7μL，131I-TFMP-Y4溶液2.1μL，Na-131I7μCi。将24孔板放置于细胞培养箱中培养2h、4h、6h、24h。阳性对照孔内所有溶液均收集于相应玻璃试管中。吸去上清液，每孔用PBS润洗2次，并加入200μL胰蛋白酶(GIBCO，USA)消化，再用PBS润洗3次，实验孔收集消化步骤后的溶液于相应玻璃试管中。用γ计数器测量每根玻璃试管中的放射性计数。使用GraphPad Prism计算药物结合率。
结果如图6所示，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4这两种放射性药物均能被细胞摄取并稳定滞留于细胞内，将两种药物同时加入细胞，6h后131I-caerin1.1的摄取率趋于稳定，而131I-TFMP-Y4的摄取率持续升高直至24h，明显高于131I-caerin1.1的摄取率(图6A)。
实施例7细胞洗脱实验
使用24孔板(Corning，USA)，向每孔内加入5×104个Hepg2细胞，500μL/孔。将24孔板放置于培养箱中过夜。镜下观察细胞贴壁，吸去上清液，每孔内加入500μL无血清培养基。每板3个组，每组设置1个阳性对照孔及3个复孔。向3组孔内分别加入131I-caerin1.1溶液1.7μL，131I-TFMP-Y4溶液2.1μL，Na-131I7μCi。将24孔板放置于培养箱中培养24h后，吸去上清液，每孔用PBS润洗2次，并加入500μL无血清培养基。再将24孔板放置于培养箱中培养2h、4h、6h、24h。阳性对照孔内所有溶液均收集于相应玻璃试管中。吸去上清液，每孔用PBS润洗2次，并加入200μL胰蛋白酶消化，再用PBS润洗3次，实验孔收集消化步骤后的溶液于相应玻璃试管中。用γ计数器测量每根玻璃试管中的放射性计数。使用GraphPad Prism计算药物滞留率。
实验结果如图6B示，洗脱24小时后药物结合率：131l-caerin 1.1：63.07％±2.35％，131I-TFMP-Y4：72.65％+0.92％和Na131I:1.26％±0.35％，提示131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4能稳定滞留于肝癌Hepg2细胞，且131I-TFMP-Y4的药物结合率要明显高于131I-caerin1.1。
实施例8细胞增殖毒性实验
使用24孔板，向每孔内接种5×103个Hepg2细胞，100μL/孔，将24孔板放置于细胞培养箱内培养24h后，分别向其中加入caerin1.1、TFMP-Y4、Na-131I、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4，每组5个复孔。caerin1.1组浓度为2.5、5、10、20μg/mL，TFMP-Y4组浓度为6、12、24、48μg/mL，Na-131I组、131I-caerin1.1组、131I-TFMP-Y4组浓度均为2000、4000、8000、16000KBq/mL。将24孔板放置于细胞培养箱中孵育24h后，向每孔内加入10μL CCK-8溶液(DOJINDO，Japan)，再次放入细胞培养箱中避光孵育2h。使用酶标仪在450nm处测量吸光度，用GraphPad Prism计算细胞存活率。
实验结果如图7所示，(A，B)在逐渐增大的caerin1.1浓度(0、2.5、5、10、20μg/mL)、TFMP-Y4浓度(0、6、12、24、48μg/mL)背景下，随之增大的131I(2000、4000、8000、16000KBq)浓度作用下的细胞存活率。(C，D)在不同浓度(2000、4000、8000、16000KBq)的Na-131I、131I-caerin、131I-TFMP-Y4作用下Hepg2细胞的存活率。(E)在不同浓度的caerin1.1(0、2.5、5、10、20μg/mL)和TFMP-Y4(0、6、12、24、48μg/mL)作用下Hepg2细胞的存活率。(F)在不同浓度(2000、4000、8000、16000KBq)的131I-caerin、131I-TFMP-Y4作用下Hepg2细胞的存活率。实验结果可知：131I-caerin和131I-TFMP-Y4均可显著抑制肝癌细胞增殖活性，且131I-caerin抗肿瘤增殖活性作用更强，这可能是由于caerin1.1多肽本身就具有抑制细胞增殖的作用(caerin1.1多肽对肝癌细胞和在高浓度时对人正常肝细胞均有增殖抑制作用，而单纯TFMP-Y4多肽在低浓度和高浓度时对肝癌细胞和人正常肝细胞均无增殖抑制作用，体现出更好的药物安全性)，在抗肿瘤活性多肽及β射线电离辐射两种作用下，肿瘤细胞存活率降低更为显著。(NS：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)。
实施例9荷瘤裸鼠模型建立及体内治疗
向每只SPF级裸鼠右侧腋窝皮下接种含Hepg2细胞数量为2×106的100μL细胞悬液，建立皮下异种移植模型。当肿瘤长至3-4mm开始后续实验。为了避免甲状腺不必要的摄取，第一次治疗开始前3天用0.1％碘化钾(Macklin，China)溶液喂食，以达到封闭甲状腺的效果。每次治疗前用游标卡尺(CD-15APX，Mitutoyo，Japan)测量肿瘤大小，肿瘤体积按以下公式计算：肿瘤体积＝宽2×长/2，同时称量裸鼠体重。将Hepg2荷瘤裸鼠随机分为6组，每2天进行1次瘤内注射，注射药物体积均为100μL，分组及药物剂量分别为：PBS组(对照组，纯PBS溶液100μL)，caerin1.1组(8μg)，TFMP-Y4组(20μg)，Na-131I组(200μCi Na-131I，7.4×106Bq),131I-caerin1.1组(200μCi Na-131I,8μg caerin1.1)，131I-TFMP-Y4组(200μCi Na-131I,20μg TFMP-Y4)。共治疗4次，分别为荷瘤后第7、9、11、13天，最后一次治疗后2天(第15天)，再次测量肿瘤大小并进行裸鼠称重，随后处死裸鼠，分离肿瘤并称重。用GraphPadPrism分析裸鼠重量、肿瘤体积、肿瘤重量。
实验结果如图8所示，在实验过程中，各组裸鼠体重均趋于稳定状态，如图8(C)，在裸鼠处死前，PBS、caerin1.1、TFMP-Y4、Na-131I、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4各组裸鼠体重分别为(20.90±0.55)g、(19.26±0.53)g、(20.47±0.61)g、(18.78±0.55)g、(18.99±0.34)g、(18.92±0.47)g。如图8(A)，在第一次治疗前，各组裸鼠肿瘤大小无明显差异(P＞0.05)。第一次治疗前PBS、caerin1.1、TFMP-Y4、Na-131I、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4各组肿瘤体积为(22.86±2.65)mm3、(19.52±2.07)mm3、(22.80±0.62)mm3、(25.42±0.46)mm3、(19.76±2.40)mm3、(21.61±1.32)mm3，至裸鼠处死前，各组肿瘤体积为(94.94±1.68)mm3、(45.76±2.04)mm3、(97.80±1.03)mm3、(70.59±01.20)mm3、(16.5±0.54)mm3、(29.31±0.60)mm3，131I-caerin1.1组肿瘤较治疗前缩小，131I-TFMP-Y4组肿瘤增长缓慢，余各组肿瘤均较治疗前明显增大，与PBS对照组对比，caerin1.1组的肿瘤体积与重量有明显差异(P＜0.05)，与PBS组及两者的单纯多肽组相比，131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4两组均具有显著差异(P＜0.05)，两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，131I-caerin1.1组肿瘤抑制效果更佳。第15天分离肿瘤并称重，如图8(D)，PBS、caerin1.1、TFMP-Y4、Na-131I、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4各组肿瘤重量为(0.132±0.010)g、(0.052±0.001)g、(0.157±0.012)g、(0.092±0.003)g、(0.012±0.003)g、(0.043±0.004)g，根据这些数据可知，131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4可在体内抑制肿瘤的生长，在治疗结束时，PBS组与caerin1.1组有明显差异(P＜0.05)，131I-caerin1.1和131I-TFMP-Y4分别与PBS组及Na-131I组对比，肿瘤重量具有显著差异(P＜0.05)。131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4两组肿瘤重量差异具有统计学意义(P＜0.05)。这些数据与CCK-8实验结果一致。即与对照组相比，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4均对Hepg2细胞异种移植模型有治疗效果(P＜0.05)，两组结果有明显差异(P＜0.05)。分离的肿瘤样本图片如图9所示，显示也与上述结果一致。
实施例10肿瘤组织H&E染色
将实施例9中的各组肿瘤组织用4％多聚甲醛固定，使用石蜡包埋并切片，切片厚度为4-6μm，烘干后进行苏木素和尹红染色(H&E)，显微镜下观察、拍照。
实验结果如图10所示，与对照组相比，caerin1.1、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4组可见细胞显著坏死及变性(P＜0.05)。
通过以上实施例MTT实验及克隆实验结果可知，caerin1.1对Hepg2细胞具有抗肿瘤活性作用，且其作用呈浓度依赖性，caerin1.1多肽的IC50为9.34μg/mL。从克隆实验中观察这种浓度依赖尤其明显。通过对caerin1.1多肽的修饰，得到了新的小分子多肽TFMP-Y4，其对细胞增殖并无抑制作用。采用氯胺-T法用放射性药物Na-131I标记两种多肽，两种放射性标记产物的标记率均＞95％，因单纯的TFMP-Y4对细胞增殖无抑制作用，故131I-TFMP-Y4溶液中游离的单纯肽不会引起对正常细胞的不良反应。但两者使用的比例不同，多次实验表明，当Caerin1.1多肽为40ug时，与1mCi 131I的标记率最高，而当TFMP-Y4多肽为100μg时与1mCi 131I的标记率最高，TFMP-Y4并没有失去结合131I的能力，由此推测一个Caerin1.1多肽分子有多个氨基酸基团与游离131I结合。进一步证实131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4在室温(25℃)、人体温度(37℃)及FBS、NS等不同条件下均能保持稳定状态。测定131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4两者的脂水分配系数，两者LogP均＞0，表明两种药物均呈脂溶性，而131I-TFMP-Y4的LogP更大，表明其可能较caerin1.1多肽更容易通过细胞膜进入细胞。细胞摄取与洗脱实验结果刚好证实这一点，两种放射性药物均能被细胞摄取并稳定滞留于细胞内，将两种药物同时加入细胞，6h后131I-caerin1.1的摄取率趋于稳定，而131I-TFMP-Y4的摄取率持续升高直至24h，明显高于131I-caerin1.1的摄取率，这可能与131I-TFMP-Y4的脂溶性更强有关。基于以上实验基础，将131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4加入细胞贴壁的96孔板中，结果符合预期，两者均可降低细胞存活率。
接下来进行了体内实验。根据先前的研究，200μCi的Na-131I可达到相应治疗效果。因TFMP-Y4本身不具有抑制细胞增殖作用，为了更好的对比131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4体内治疗效果，于是选择统一131I的放射性活度为200μCi，因此对应的caerin1.1剂量为的8μg，TFMP-Y4的剂量为20μg。实验结果显示，与PBS组(对照组)相比，caerin1.1、131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4三组裸鼠的肿瘤体积及重量均具有显著差异，这与MTT实验、克隆实验、细胞增殖毒性实验结果相一致，而131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4两组治疗效果也具有差异，这也与细胞增殖毒性实验结果相一致。进一步说明131I的生物辐射效应与多肽的抗肿瘤效应的叠加，较单纯的131I的辐射效应更优。在实验过程中，每组裸鼠体重均较稳定，且均未出现生病及及死亡情况，说明两种多肽均具有良好的生物安全性。接下来，将肿瘤组织切片进行H&E染色，统计各组坏死面积进行对比，发现131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4两组肿瘤切片内可见大量细胞变性坏死，这与前期的实验结果相符合，但caerin1.1组与PBS组对比，其肿瘤细胞变性坏死面积却无明显差异，可见PBS组肿瘤细胞坏死面积偏高，这可能是由于PBS对照组肿瘤细胞生迅速，由于其血供不足，营养缺乏产生坏死。以上实验表明，131I-caerin1.1、131I-TFMP-Y4均能成为肝癌内照射治疗的潜在药物。
综上所述，caerin1.1多肽可抑制Hepg2肿瘤细胞的增殖，caerin1.1与TFMP-Y4多肽均能被细胞摄取并稳定滞留，故而，131I-caerin1.1及131I-TFMP-Y4在体外及体内对肝癌Hepg2肿瘤细胞均有显著抑制作用。而多肽TFMP-Y4对Hepg2肿瘤细胞及人正常肝细胞LO2均无明显增殖抑制作用，故与131I-caerin1.1对比，131I-TFMP-Y4在具有显著的抗肿瘤活性的同时可降低毒副反应，提高药物安全性和肿瘤靶向性。因此，131I-TFMP-Y4有望成为肿瘤(包括肝癌)内照射治疗的一种潜在药物和治疗手段。
Claims (6)
1.一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4，其特征在于，所述小分子多肽TFMP-Y4的氨基酸序列为YGLFGVLGSAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2，其氨基酸基团上结合有放射性标记碘-131。
2.权利要求1所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4的制备方法，其特征在于，为采用氯胺-T法，将小分子多肽TFMP-Y4溶液、Na-131I溶液与氯胺-T溶液室温震荡混匀，再利用层析法分离出131I标记的TFMP-Y4多肽，即得。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述TFMP-Y4与Na-131I的比例为100μg：1mCi。
4.权利要求1所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4在制备治疗肝癌的药物中的应用。
5.一种肝癌治疗药物，其特征在于，含有权利要求1所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y4。
6.根据权利要求5所述药物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。
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