CN117825481B - 一种用于组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像方法，包括：步骤(1)对待测组织学样品进行冷冻切片处理，得到多个组织学切片；步骤(2)将步骤(1)中所得的组织学切片立即通过超音速喷雾装置喷涂衍生试剂(2‑((2‑氰基苯并噻唑‑6‑)胺基)‑N,N,N‑三甲基‑2‑乙酰‑1‑氯化铵)；步骤(3)将步骤(2)的组织学切片放在甲醇的雾室中进行有效衍生反应；步骤(4)将步骤(3)的组织学切片使用三氯甲烷清洗；步骤(5)将步骤(4)的组织学切片进行解吸电喷雾质谱成像(DESI‑MSI)实验，并采集得到对应的MSI数据。本发明的方法原位衍生化，可以在生理条件下有效地在组织切片中原位衍生；通过衍生反应增强的检测性能显著提高Cys的质谱分析性能；实现Cys的准确检测；不干扰其他非衍生代谢产物的检测。

Description

一种用于组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像 方法

技术领域

本发明涉及物质检测领域，特别涉及一种用于组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像方法。

背景技术

生物体内的氧化还原平衡主导着生物体内的各种生理病理过程，是诱发一系列严重疾病的重要因素。Cys是生物体内维持氧化还原平衡的重要活性分子。近些年来，越来越多的研究表明Cys的水平变化发生在神经退行性疾病的早期阶段，例如阿尔茨海默症(AD)、帕金森病(PD)，和癫痫等疾病。当下，全球有约5000万阿尔茨海默症患者，有超过5000万人受到癫痫疾病的影响。然而，不同的大脑区域受到影响，它们表现出的生化和病理生理特征各不相同。代谢网络极其复杂，且动态多变，代谢途径中的多种代谢物具有连动效应，同时检测多种代谢物能够提供更多真实有效信息。因此，检测多种Cys和相关代谢物在不同的脑区中的分布状态和浓度变化水平，能够为相关疾病提供更加精确的诊断证明和治疗方案，具有重要的科学价值。

为了更好的理解并研究复杂的脑部疾病生理和病理过程，脑组织中Cys的原位检测和其他相关代谢物的原位检测，一直以来都是亟待解决的研究问题。但是，目前关于疾病中Cys的研究多集中在血清/血浆样本，检测的结果不能很好的反映脑组织中Cys的原位浓度水平。荧光探针也越来越多的被设计开发应用于Cys检测，由于靶向性的特性以及分子光谱谱带宽度的限制，难以进行多组分分子的同时分析，也不适用未标记分子和未知分子的检测。

质谱成像技术(Mass spectrometry imaging，MSI)由于其无需/少量的样品前处理、同时获得多种物质的定性定量的可视化结果、高的空间分辨率、高的质量分辨率、宽的检测范围等特性，目前已被广泛应用于获取脑组织中代谢物的空间分布信息。相对于基质辅助激光解吸电离，样品需要涂覆基质，对小分子代谢物具有较强的基质效应，二次离子质谱容易产生大量碎片，对物质鉴定产生影响，解吸电喷雾电离(DESI)具有较低的离子抑制效应和较少的碎片被开发用于直接质谱成像。但由于Cys含有高反应活性的巯基，巯基是不稳定的化学官能团，游离的巯基很容易转化成为二硫化物。此外，Cys的质谱响应较差，浓度较低，MSI分析组织中的Cys十分重要也极具挑战。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种对组织中Cys原位衍生质谱成像新方法，通过衍生反应捕获Cys中高活性巯基反应基团，DESI实现组织切片中Cys的可视化分析，该方法弥补了DESI分析组织切片中Cys的技术空白，在物质检测领域具有重要且广泛的应用价值。

本发明的技术方案为，一种用于组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像方法，包括以下步骤：

步骤(1)、对待测组织学样品进行冷冻切片处理，得到多个连续组织学切片；

步骤(2)、将步骤(1)中所得的组织学切片立即通过超音速喷雾装置喷涂衍生试剂(2-((2-氰基苯并噻唑-6-)胺基)-N，N，N-三甲基-2-乙酰-1-氯化铵，NCBT)；

步骤(3)、将步骤(2)的组织学切片放在甲醇的雾室中进行有效衍生反应；

步骤(4)、将步骤(3)的组织学切片使用三氯甲烷清洗；

步骤(5)、将步骤(4)的组织学切片进行解吸电喷雾质谱成像(DESI-MSI)实验，并采集得到对应的MSI数据。

进一步的，所述步骤(1)中组织学样品进行冷冻切片处理步骤包括：取出冷冻的脑组织在-20℃低温恒温箱放置30-60min后，使用OCT包埋试剂将脑组织固定后，在-20℃低温恒温器(莱卡生物系统公司)中切片。将脑组织切成15μm厚度的切片，粘附在粘性显微镜载玻片上解冻。

进一步的，所述步骤(2)中喷雾装置喷涂衍生试剂的步骤包括：用注射器以1～10μL min^-1(例如，1μL min^-1、2μL min^-1、3μL min^-1、4μL min^-1、5μL min^-1、6μL min^-1、7μL min^-1、8μL min^-1、9μL min^-1或10μL min^-1)，NCBT溶液浓度为0.1～10mM(例如，0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM)；N₂作为鞘气，气压为0.3～1.0Mpa(例如，0.3Mpa、0.4Mpa、0.5Mpa、0.6Mpa、0.7Mpa、0.8Mpa、0.9Mpa或1.0Mpa)；在注射器针头上施加直流高压(2.5～4kV)，以保持电接触；喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持0.5～5cm(例如，0.5cm、1cm、1.5cm、2cm、2.5cm、3cm、4cm或5cm)；组织切片使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是1～4cm/min，每两行的间隔是1～4mm；最终使得衍生试剂均匀喷涂整张组织切片。

进一步的，所述步骤(2)中喷雾装置喷涂衍生试剂的步骤包括：用500μL注射器(Hamilton，Nevada)以8μL min^-1，1mM NCBT(甲醇溶剂)的流速泵过约长50em的熔融石英毛细管(100m i.d.(内径)，365m o.d.(外径))进行喷雾。N₂作为鞘气，气压为0.5Mpa。在注射器针头上施加直流高压3kV，以保持电接触。喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约2em。组织切片使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是20mm/min，每两行的间隔是2mm。最终使得衍生试剂均匀喷涂整张组织切片。

进一步的，所述步骤(3)中对组织学切片放在甲醇的雾室中进行有效衍生反应：在容器中倒入甲醇液体，维持容器中的甲醇液体温度为10～50℃(例如，10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，容器中维持甲醇的饱和蒸汽环境；将步骤(2)获得的组织学切片放在充满甲醇饱和蒸汽的雾室中放置5～35min(例如，5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min)，使得衍生试剂与组织切片中的Cys进行有效衍生反应。

进一步的，所述步骤(3)中对组织学切片放在甲醇的雾室中进行有效衍生反应：在半径12cm、高2.4cm的玻璃器皿中倒入甲醇液体，使用温度控制器维持玻璃器皿中的甲醇液体温度在25℃，玻璃器皿中维持甲醇的饱和蒸汽环境。将步骤(2)获得的组织学切片放在充满甲醇饱和蒸汽的雾室中放置5min，使得衍生试剂与组织切片中的Cys进行有效衍生反应。

进一步的，所述步骤(4)中对组织学切片进行DESI-MSI实验，并采集得到对应的MSI数据，具体步骤包括：

(a)DESI-MS和DESI-MSI的质谱实验在轨道阱质谱仪(Exactive plus，ThermoFisher Scientific，San Jose，California)上进行。DESI实验均采用DESI离子源，喷雾溶剂的使用熔融石英毛细管(50μm i.d.，150μm o.d.)，鞘气传送使用金属毛细管(250μmi.d.，365μm o.d.)。通过以下参数固定DESI离子源：喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约1.5mm，喷雾毛细管尖端与质谱入口的距离固定在6mm，喷雾毛细管尖端的冲击角度是55°，收集角度小于10°。喷雾溶剂为10mM TFA的甲醇溶液，喷雾流速为2μL min^-1，N₂的鞘气气压为0.8MPa。在整个实验中，质谱仪的采样参数条件如下：扫描模式为正离子模式，m/z范围60-900，离子透镜电压为50％(正离子模式)，质谱入口毛细管的温度为275℃，质谱分辨率为70000，最大离子注入时间为270ms，每个扫描包括1个微扫描。大鼠组织切片的DESI-MSI实验使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是250μm/s，每两行的间隔是0.25mm。

(b)使用Proteo Wizard的MS Convert软件(http：//proteowizard.sourceforgr.net)将质谱原始Xcalibur Raw数据转换为.mzXML格式，然后通过MATLAB运行的程序将所有.mzXML格式文件合并成一个mat文件，即可导入开源成像软件包MSIReader，选择对感兴趣的m/z进行空间分布分析。

有益效果：

由于组织中特别是脑组织中的游离半胱氨酸(Cys)浓度低、质谱响应差、高反应活性，目前难以通过DESI手段实现脑组织中Cys的可视化分布。本发明提供的一种用于组织切片中Cys的衍生质谱成像方法，该方法具有以下特点：

(1)原位衍生化，该反应具有反应快、效率高、生物兼容性的特点，可以在生理条件下有效地在组织切片中原位衍生，而无需其他准备工作；

(2)灵敏度，通过衍生反应增强检测性能，原因是永久带电离子将主导电离过程中的电荷竞争，从而显著提高Cys的质谱分析性能；

(3)捕获高活性官能团，通过衍生反应捕获Cys中的高反应活性的巯基，实现Cys的准确检测；

(4)不干扰其他非衍生代谢产物的检测，在存在过量NCBT的情况下，其他非衍生代谢产物的信号强度不受干扰。

附图说明

图1为本发明组织切片中游离半胱氨酸(Cys)的衍生质谱成像方法流程图；

图2为影响高效衍生体系的因素探究：(a)衍生试剂浓度；(b)衍生试剂流速；(c)衍生反应时间；

图3为在空气中放置不同时间的脑组织切片经过NCBT衍生后，对NCBT-Cys的MSI图像。6张脑片是连续切片。(a)没有经过NCBT衍生，对Cys的质子加合峰的MSI成像图及分别对应在空气放置0min，5min，10min，30min，60min后，经过NCBT衍生处理后，对NCBT-Cys的MSI成像图。(b)分别统计对应全脑区的NCBT-Cys的质谱强度，所有质谱强度值根据0min后衍生NCBT-Cys的强度值进行归一化处理。

图4为连续三张大鼠脑组织切片DESI-MSI的NCBT-Cys的成像图。

图5为(a)在未经过和经过NCBT衍生处理的大鼠脑组织切片上获得的平均质谱信号。(b)质子化Cys(m/z 122.0278)和NCBT-Cys(m/z 379.0881)的质谱谱图放大图。

图6为大鼠脑组织中Cys的可视化分析。(a)和(b)分别对应正常鼠和癫痫大鼠的大脑组织矢状面切片的NCBT-Cys的分布情况。大鼠癫痫通过腹腔注射PTZ药物点燃，癫痫大鼠的情况照片(c)，(d)癫痫疾病组大鼠和正常大鼠的全脑区域统计的Cys水平分析。所有数据都是归一化PBS组别数据。

图7为DESI-MSI同时研究癫痫大鼠脑切片中Cys和其他代谢物的水平变化。(a)在正常大鼠矢状面脑切片中定义感兴趣区域。正常大鼠和癫痫大鼠的整个脑组织以及15个感兴趣的区域中NCBT-Cys(b)的信号强度柱状图。所有数据都是归一化其对应的PBS组数据。

图8为NCBT衍生化对Cys检测的增强性能的质谱信号强度，10μM Cys在无(a)/有(b)NCBT(200μM)的水溶液中的质谱信号强度。

具体实施方式

为了使本发明的具体流程和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。但所述实施例只是为了对本发明作进一步的解释，本发明不限于以下实施例。

根据本发明的一个实施例1，建立一种用于组织切片中游离Cys的衍生质谱成像方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤(1)、对待测组织学样品进行冷冻切片处理，得到多个连续组织学切片；

步骤(2)、将步骤(1)中所得的组织学切片立即通过超音速喷雾装置喷涂衍生试剂2-((2-氰基苯并噻唑-6-)胺基)-N，N，N-三甲基-2-乙酰-1-氯化铵，NCBT)；

步骤(3)、将步骤(2)的组织学切片放在甲醇的雾室中进行有效衍生反应；

步骤(4)、将步骤(3)的组织学切片使用三氯甲烷清洗；

步骤(5)、将步骤(4)的组织学切片进行解吸电喷雾质谱成像(DESI-MSI)实验，并采集得到对应的MSI数据。

实施例1，一种用于组织切片中游离Cys的衍生质谱成像方法，具体如下：

动物实验：

1、SD大鼠(平均体重180g-200g，雌性)购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有大鼠都是12：12小时光-暗循环环境中正常饲养，且随时可以获得食物和饮水。大鼠麻醉后，取出脑组织，速冻并保存在-80℃备用。

2、大鼠脑匀浆制备：

将获取的冷冻大鼠脑组织称重，按照脑组织和去离子水按照重量比1：10配置，用超声波细胞破碎器后获得大鼠脑组织匀浆。将制备完成的脑匀浆均分成1mL的等份用于后续的单词测量实验。脑匀浆保存在-80℃冰箱，DESI-MSI(解吸电喷雾质谱成像)分析实验时，取出室温解冻后上样分析。

3、大鼠脑组织切片实验：

取出冷冻的脑组织在-20℃低温恒温箱放置60min后，使用OCT包埋试剂将脑组织固定后，在-20℃低温恒温器(莱卡生物系统公司)中切片。将脑组织切成15μm厚度的切片，粘附在粘性显微镜载玻片上解冻。所有脑组织切片迅速衍生处理后用于后续MSI实验。

4、组织切片衍生处理：

使用电喷雾离子源(ESI)喷涂衍生试剂。用500μL注射器(Hamilton，Nevada)以8μLmin^-1，1 mM NCBT溶液(此溶液的溶剂为甲醇)的流速泵过约长50cm的熔融石英毛细管(100μm i.d.，365μm o.d.)进行喷雾。N₂作为鞘气，气压为0.5Mpa。在注射器针头上施加直流(dc)高压(HV)(3kV)，以保持电接触。喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约2em。大鼠组织切片使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是2cm/min，每两行的间隔是2mm。喷涂过NCBT试剂的脑组织切片放在充满甲醇饱和蒸气压的雾室中，室温反应5min。

5、DESI-MSI分析：

DESI-MSI的质谱实验在轨道阱质谱仪(Exactive plus，Thermo FisherScientific，San Jose，California)上进行。DESI实验均采用DESI离子源，喷雾溶剂的使用熔融石英毛细管(50μm i.d.，150μm o.d.)，鞘气传送使用金属毛细管(250μm i.d.，365μmo.d.)。通过以下参数固定DESI离子源：喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约1.5mm，喷雾毛细管尖端与质谱入口的距离固定在6mm，喷雾毛细管尖端的冲击角度是55°，收集角度小于10°。喷雾溶剂为10mM TFA的甲醇溶液，喷雾流速为2μL min^-1，N₂的鞘气气压为0.8MPa。在整个实验中，质谱仪的采样参数条件如下：扫描模式为正离子模式，m/z范围60-900，离子透镜电压为50％(正离子模式)，质谱入口毛细管的温度为275℃，质谱分辨率为70000，最大离子注入时间为270ms，每个扫描包括1个微扫描。大鼠组织切片的DESI-MSI实验使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是250μm/s，每两行的间隔是250μm。

6、数据处理：

使用Proteo Wizard的MS Convert软件(http：//proteowizard.sourceforgr.net)将质谱原始Xcalibur Raw数据转换为.mzXML格式，然后通过MATLAB运行的程序将所有.mzXML格式文件合并成一个mat文件，即可导入开源成像软件包MSIReader，选择对感兴趣的m/z进行空间分布分析。

为了使得NCBT于脑组织切片中的Cys的衍生反应效率最高，对衍生试剂NCBT的浓度，NCBT的喷涂流速和在甲醇雾室中的反应时间等影响NCBT衍生效率的因素进行了考察。首先，在对不同浓度范围的NCBT(0.1-2.5mM，甲醇溶剂)使用超音速喷雾装置喷涂到新鲜脑匀浆样品，DESI-MSI分析后发现NCBT-Cys质谱信号最高时NCBT浓度是1mM(图2(a))。其次，对衍生试剂喷涂的流速进行了考察，发现在1-10μL min^-1的流速范围内，流速为8μL min^-1时NCBT-Cys质谱信号最高(图2(b))。最后对喷涂基质后的脑组织切片在甲醇雾室中的衍生时间进行考察，发现基于NCBT-Cys的点击反应速率较快，5min的反应时间就能达到最优的反应效率(图2(c))。因此，在后续实验部分中，对DESI-MSI探索大鼠脑组织中Cys的实验时，NCBT的衍生浓度为1mM，喷雾流速为8μL min^-1，在甲醇雾室的衍生时间为5min。

进一步的，为了说明对组织切片中Cys的MSI进行衍生是必要的步骤，我们考察了组织切片有无衍生的影响，已经现切的脑片在空气中放置不同时间在经过NCBT衍生处理后MSI图像的差异。如图3，分别对应现切的脑片未经过NCBT衍生处理和经过NCBT衍生处理后对Cys质子加合峰(m/z 122.0278)和NCBT-Cys(m/z 379.0881)的MS成像图片结果。当脑片未经过NCBT处理，直接DSEI-MSI分析，未能观察到预期的Cys质子加合峰信号，而相邻的脑片经过NCBT处理后，DESI-MSI分析检测到Cys的衍生产物NCBT-Cys在脑片上的质谱信号。该结果表明由于通过NCBT衍生试剂引入了永久带电荷基团季铵盐官能团，增强了离子化效率，使得脑组织切片中的Cys被成功检测。由于Cys含有高活性官能团巯基，在空气中容易被氧化生成双硫键，从而影响检测结果。因此，我们设计了连续5张脑组织切片(图3(a))，在空气中分别放置0min，5min，10min，30min，60min后，在经过NCBT衍生化处理，发现检测到NCBT-Cys的质谱信号随着放置时间的延长逐渐降低。将全脑信号平均统计后发现，相较于放置0min衍生的NCBT-Cys信号强度，在空气放置10min后NCBT-Cys信号损失约40％，在空气中放置60min后NCBT-Cys损失近80％(图3(b))。对于正常的切片DESI-MSI分析来说，整个过程需要几十分钟，随着组织切片面积的增加或是分辨率的提高，所需要的分析时间将继续增加。以上实验结果说明对于高活性物质在组织切片中的检测，衍生化处理，将高活性物质转化成较稳定的物质检测的必要性。而通过我们之前设计开发的NCBT质谱探针，不仅可以特异性的和Cys反应保证其正确检测，同时引入了电荷标签，又提高了质谱分析性能。

进一步的，当DESI-MSI的重现性较高时才能保证大鼠脑组织切片中Cys水平以及变化的结果的可靠性。因为相较于常规的DESI-MSI实验，多了衍生处理的步骤，成像的重现性可能受到影响。图4展示了连续三张(a)(b)(c)大鼠大脑组织切片的DESI-MSI的NCBT-Cys的成像结果。通过对全脑区域的NCBT-Cys信号平均强度的统计分析，三次结果的相对标准偏差是4.7％。同时进一步从空间分布上评估重现性，NCBT-Cys的分布均集中于小脑、胼胝体、下丘脑等部分。

进一步的，我们继续探索衍生前后对大鼠脑组织切片上Cys和其他代谢物的影响。图5(a)展示了m/z 60-400范围内不经过NCBT和经过NCBT处理对应的脑组织上的质谱图，Cys和主要的小分子代谢物主要分布在这个区间。在图5(下方(b))中展示了对应的Cys氢离子加合峰(m/z 122.0278)和NCBT-Cys(m/z 379.0881)质谱图。研究发现，仅对于NCBT衍生化处理脑片，可以检测到NCBT-Cys的质谱响应信号。在未经过和经过NCBT处理的脑片均检测不到Cys自身的信号。

实施例2

根据本发明的实施例2－－癫痫疾病大鼠和正常大鼠脑组织中Cys的分布实验，具体操作如下：

由于使用的参考组织学切片是大鼠立体定位图中进行了组织学染色后的脑切片，在进行MSI试验后，将DESI-MSI分析后的组织学切片进行染色处理，采用染色切片定义感兴趣的脑区与DESI-MSI的质谱成像图比对。具体的实验步骤如下：

1、组织学切片样品的制备及染色；

SD大鼠(平均体重180g-200g，雌性)购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有大鼠都是12：12小时光-暗循环环境中正常饲养，且随时可以获得食物和饮水。对于PTZ(戊四唑，CAS：54-95-5，阿拉丁试剂)点燃性的癫痫模型，每天腹腔注射亚惊厥计量70mg/kg的PTZ试剂(戊四唑，CAS：54-95-5，阿拉丁试剂)。当大鼠达到完全点燃状态时，停止注射PTZ试剂。每次注射PTZ后，每只动物分别关入笼内，观察癫痫发作情况及强度，癫痫持续时间25～30min以上。癫痫发作的强度根据Racine分级标准计算。0级没有任何反应；I级面部痉挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；II级：I级加节律性点头；III级：II级加前肢肌阵挛，但无后肢直立位；IV级：III级加后肢直立位；V级全面性强直-阵挛发作，并失去体位控制。对照组大鼠腹腔注射相同计量PBS溶液(PBS溶液的组分是：NaCl 136.89mM；KCl2.67mM；Na₂HPO₄8.1mM；KH₂PO₄1.76mM；PH＝7.4)。大鼠麻醉后，取出脑组织，速冻并保存在-80℃备用。

在MSI实验完成之后，将与MSI实验后脑切片进行组织学染色，具体的操作步骤为：先用4％甲醛固定1h，再进行PBS洗涤，超纯水灭菌。然后在0.25％甲苯胺蓝溶液中染色15分钟后，分别用70％、80％、90％和100％(体积比V：V，乙醇：水)乙醇有序脱水。再用中性香脂固定切片。最终配准所用的组织学染色切片的图像是使用直立光学显微镜进行采集的。

2、组织切片衍生处理：

使用ESI喷涂衍生试剂(1mM NCBT(甲醇作为溶剂))。用500μL注射器(Hamilton，Nevada)以8μL min^-1，1mM NCBT溶液(所述溶液以甲醇作为溶剂)的流速泵过约长50cm的熔融石英毛细管(100μm i.d.，365μm o.d.)进行喷雾。N₂作为鞘气，气压为0.5Mpa。在注射器针头上施加直流(dc)高压(3kV)(HV)，以保持电接触。喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约2em。大鼠组织切片使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是2cm/min，每两行的间隔是2mm。在半径12cm、高2.4cm的玻璃器皿中倒入甲醇液体，使用温度控制器维持玻璃器皿中的甲醇液体温度在25℃，玻璃器皿中维持甲醇的饱和蒸汽环境。喷涂过NCBT试剂的脑组织切片放在充满甲醇饱和蒸气压的雾室中，室温反应5min。

3、对步骤2中的脑组织学切片进行DESI-MSI实验：

DESI-MSI的质谱实验在轨道阱质谱仪(Exactive plus，Thermo FisherScientific，San Jose，California)上进行。DESI实验，喷雾溶剂传送使用熔融石英毛细管(50μm i.d.，150μm o.d.)，鞘气传送使用金属毛细管(250μm i.d.，365μm o.d.)。通过以下参数固定DESI离子源：喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持约1.5mm，喷雾毛细管尖端与质谱入口的距离固定在6mm，喷雾毛细管尖端的冲击角度是55°，收集角度小于10°。喷雾溶剂为10mM三氟乙酸(TFA)的甲醇溶液，喷雾流速为2μLmin^-1，N₂的鞘气气压为0.8MPa。在整个实验中，质谱仪的采样参数条件如下：扫描模式为正离子模式，m/z范围60-900，离子透镜电压为50％(正离子模式)，质谱入口毛细管的温度为275℃，质谱分辨率为70000，最大离子注入时间为270ms，每个扫描包括1个微扫描。大鼠组织切片的DESI-MSI实验使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是250μm/s，每两行的间隔是250μm。

3、数据处理：

使用Proteo Wizard的MS Convert软件(http：//proteowizard.sourceforgr.net)将质谱原始Xcalibur Raw数据转换为.mzXML格式，然后通过MATLAB运行的程序将所有.mzXML格式文件合并成一个mat文件，即可导入开源成像软件包MSIReader，选择对感兴趣的m/z进行空间分布分析。

首先，利用NCBT衍生化处理的方式通过DESI-MSI实现大鼠脑组织片切中Cys的可视化分析。通过腹腔注射戊四唑(PTZ)的点燃癫痫大鼠模型，如图6(c)所示，对照组大鼠腹腔注射PBS。正常大鼠和癫痫大鼠脑组织中NCBT-Cys的DESI-MSI成像图分别对应图6(a)和(b)。两者的Cys分布具有一致性，能够发现Cys的分布主要集中分布在小脑、胼胝体和大脑脚部分，通过全脑区域的Cys水平统计分析，癫痫大鼠中的Cys水平(癫痫大鼠中的Cys从1.00±0.08下调到0.81±0.20，*p＜0.05，所有数据都是归一化到对应PBS组别数据)较正常大鼠发生了显著性下调，如图6(d)所示。

此后，我们进一步研究癫痫大鼠(PTZ点燃模型)上Cys的水平变化(图7)。首先实验大鼠的脑切片被分成15个感兴趣的区域，如图7(上方(a))所示。随后分别对全脑区域内和对应的15个感兴趣的脑区中NCBT-Cys和其他代谢物的平均信号分别进行提取，并比对分析正常组和癫痫组大鼠的NCBT-Cys和其他代谢物的水平变化。与正常组相比，癫痫大鼠组脑切片中Cys的整体水平显著下调，图6(d)。之前的报道是全脑区域的统计分析，而使用成像方法可以在一次实验中同时获得不同脑区Cys的水平变化。在该研究中，癫痫大鼠组的Cys主要在小脑(CB)(从1.00±0.09下调到0.77±0.17，**p＜0.01)、纹状体(CPU)(从1.00±0.13下调到0.83±0.18，*p＜0.05)、海马(Hipp)(从1.00±0.10下调到0.83±0.19，*p＜0.05)、下丘脑(HTM)(从1.00±0.14下调到0.69±0.15，***p＜0.001)、上丘(SUC)(从1.00±0.15下调到0.87±0.29，***p＜0.001)、梨状皮层(PC)(从1.00±0.15下调到0.71±0.20，**p＜0.01)、视觉皮层(VC)(从1.00±0.14下调到0.54±0.25，***p＜0.001，)中表现了显著性下调，所有数据都是归一化到对应PBS组别数据(图7，下方(b))。目前研究显示，小脑和纹状体维持身体平衡，以及控制肌肉的张力以及协调；上丘，参与大脑皮质眼球外肌运动中枢对眼球快速垂直和水平运动的控制，并参与协调眼球、头部对声、光刺激的定向运动；海马，学习记忆功能。通过不同脑区的代谢物分析，有望加深对疾病的理解。

NCBT的合成具体步骤参见下述文章：

NCBT合成

将氯甲酸异丁酯(IBCF，20μL，0.15mmol)加入盐酸甜菜碱(23mg，0.15mmol)和4-甲基吗啉(MMP，33μL，0.3mmol)的四氢呋喃(THF，2mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。将2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CBT，8.8mg，0.05mmol)的溶液加入到反应混合物中，并在0℃下进一步搅拌1小时。然后将混合物在室温搅拌过夜。经高效液相色谱纯化后，获得纯产物NCBT。高效液相色谱分析是在配备有G1322A泵和在线二极管阵列UV检测器的Agilent 1200HPLC系统上进行的，该系统使用Agilent Zorbax 300SB-C18 RP色谱柱，以乙腈和水(0.1％TFA)作为洗脱液。详见Chem.Sci.，2020，11，7308-7312。

如图8所示，为了评估NCBT衍生化对Cys检测的增强性能，比较了10μM Cys在无(a)/有(b)NCBT(200μM)的水溶液中的质谱信号强度。对于10μM Cys，获得的离子强度比较低(如[Cys+H]⁺，m/z 122.0278，理论m/z 122.0276，强度值约为1.0E5)，而经过NCBT衍生处理的信号强度相较于未衍生的Cys的信号强度提高了约77倍(如[NCBT-Cys]⁺，m/z379.0881，理论m/z 379.0893；强度值约为7.7E6)。

尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，且应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (5)

1.一种用于组织切片中游离半胱氨酸的衍生质谱成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、对待测组织学样品进行冷冻切片处理，得到多个连续组织学切片；

步骤(2)、将步骤(1)中所得的组织学切片立即通过超音速喷雾装置喷涂衍生试剂2-((2-氰基苯并噻唑-6-)胺基)-N,N,N-三甲基-2-乙酰-1-氯化铵；

步骤(3)、在容器中倒入甲醇液体，维持容器中的甲醇液体温度为10~ 50℃，容器中维持甲醇的饱和蒸汽环境；将步骤(2)获得的组织学切片放在充满甲醇饱和蒸汽的雾室中放置5~30 min，使得衍生试剂与组织切片中的游离半胱氨酸进行有效衍生反应；

步骤(4)、将步骤(3)的组织学切片使用三氯甲烷清洗；

步骤(5)、将步骤(4)的组织学切片进行解吸电喷雾质谱成像实验，并采集得到对应的质谱成像数据。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中组织学样品进行冷冻切片处理步骤包括：取出冷冻的脑组织在-16~ -24℃低温恒温箱放置30-60 min后，使用OCT包埋试剂将脑组织固定后，在-16~ -24℃低温恒温器中切片，将脑组织切成10~ 20 μm厚度的切片，粘附在粘性显微镜载玻片上解冻。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中喷雾装置喷涂衍生试剂的步骤包括：用注射器以1~ 10 μL min^-1，2-((2-氰基苯并噻唑-6-)胺基)-N,N,N-三甲基-2-乙酰-1-氯化铵溶液浓度为 0.1~ 10 mM；N₂作为鞘气，气压为0.3~ 1.0 Mpa；在注射器针头上施加直流高压2.5~ 4 kV，以保持电接触；喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持0.5~ 5cm；组织切片使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是1~4 cm/min，每两行的间隔是1~ 4 mm；最终使得衍生试剂均匀喷涂整张组织切片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤(3)中，在半径12 cm、高2.4 cm的玻璃器皿中倒入甲醇液体，使用温度控制器维持玻璃器皿中的甲醇液体温度在25℃，玻璃器皿中维持甲醇的饱和蒸汽环境；将步骤(2)获得的组织学切片放在充满甲醇饱和蒸汽的雾室中放置5 min，使得衍生试剂与组织切片中的游离半胱氨酸进行有效衍生反应。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中对组织学切片进行解吸电喷雾质谱成像实验，并采集得到对应的质谱成像数据 ，具体步骤包括：

(a)通过以下参数固定解吸电喷雾离子源：喷雾毛细管尖端到组织切片的距离保持1~6 mm，喷雾毛细管尖端与质谱入口的距离固定在3~ 10 mm，喷雾毛细管尖端的冲击角度是40~ 70°，收集角度小于15°；喷雾溶剂为0.1~ 100 mM三氟乙酸的甲醇溶液，喷雾流速为1~6 μL min^-1，N₂的鞘气气压为0.4~ 1.2 MPa；使用二维电移动平台控制样品的运动速度和扫描方向，每行的扫描速度是50~ 500 μm/s，每两行的间隔是100~ 400 mm；

(b)将质谱数据转换格式，并对质荷比进行空间分布分析。