CN117813397A - 蜡-微球基质组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种方法，该方法包括将包含蜡‑微球基质的组合物暴露于第一熔融条件，其中所述蜡‑微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂，由此将包含所述蜡‑微球基质的所述组合物暴露于所述第一熔融条件使该蜡组分熔融；将所述组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球；以及将所述至少一个再水合的冻干微球暴露于分离条件，以从所述至少一个再水合的冻干微球中分离所述蜡组分。还公开了制备蜡‑微球基质和从蜡‑微球基质释放一种或多种试剂的方法以及组合物。还公开了具有包含本文所述的组合物的试剂贮存器的料筒。还公开了用于控制一种或多种试剂的释放的系统，该试剂包括本文所述的组合物。

Description

蜡-微球基质组合物及其制备和使用方法

技术领域

本公开整体涉及蜡-微球基质组合物及其制备和使用方法。

背景技术

许多当前的测序平台使用“边合成边测序”(“SBS”)技术和基于荧光的检测方法。期望将允许更具成本效益、更快速和更方便的测序和核酸检测的替代测序方法和改善的样品及文库制备过程作为SBS的补充。

用于SBS技术的当前方案通常采用将DNA或RNA转化为适于测序的片段化模板文库的样品制备过程。样品制备方法通常涉及多个步骤、材料转移以及昂贵的仪器来实现片段化，并且因此往往是困难、繁琐、昂贵且低效的。

通常按任何合适的方式制备包含多核苷酸的文库，以将寡核苷酸衔接子附着到目标多核苷酸上。测序可导致确定目标多核苷酸的全部或部分序列。通过使用转座酶介导的片段化和加标签，可使在准备用于簇形成和测序的溶液中将核酸转化成衔接子修饰的模板所涉及的步骤数量减少或在一些情况下甚至最小化。该过程称为“标签片段化”(tagmentation)，其涉及通过转座体复合物修饰核酸，该转座体复合物包含与包括转座子末端序列的衔接子复合的转座酶，如例如WO 2016/130704中所述。用于在测序之前进行固定和扩增的方法描述于例如美国专利号8,053,192中。模板文库可用于通过固相扩增，并且特别是固相等温扩增来制备核酸集落的簇阵列，如美国专利公开号2005/0100900中所述。

可使用任何合适的测序技术进行测序，并且用于确定固定化且经扩增的衔接子-靶标-衔接子分子的序列(包括链再合成)的方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利号8,053,192中。SBS技术通常包括通过针对模板链反复加入核苷酸进行的新生核酸链的酶促延伸。在传统的SBS方法中，可在每次递送中在存在聚合酶的情况下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。示例性SBS系统和方法描述于美国专利公开号2007/0166705中。

存在阻碍样品制备组合物和测序过程的效率的各种问题。例如，在共同孔中交错溶解多种试剂存在困难。在溶解时间方面存在区分不同试剂的问题。还存在纯化大气捕获的水以用于样品和文库制备组合物及测序过程的问题。处理料筒中的微球存在问题，特别是由于微球倾向于静电粘附到包括孔的侧面和顶部的表面上。

因此，需要改善的样品制备组合物和过程。特别地，需要具有改善的稳定性的测序试剂、样品制备试剂、样品提取试剂、富集试剂、成簇试剂和文库制备试剂以及相关的组合物、方法、料筒和系统，其显示出工作流程和带标签文库制备的改善的效率，进而增加了所得文库的读段富集并简化了工作流程。

本公开涉及克服本领域中的这些和其他缺陷。

发明内容

第一方面涉及一种方法。该方法包括将包含蜡-微球基质的组合物暴露于第一熔融条件，其中所述蜡-微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂，由此将包含所述蜡-微球基质的所述组合物暴露于所述第一熔融条件使该蜡组分熔融；将所述组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球；以及将所述至少一个再水合的冻干微球暴露于分离条件，以从所述至少一个再水合的冻干微球中分离所述蜡组分。

在一个具体实施中，该第一熔融条件包括温度的改变。在一个具体实施中，该第一熔融条件包括高于约40℃的温度。

在一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于第二熔融条件以熔融该蜡组分，其中该第二熔融条件不同于该第一熔融条件。在另一个具体实施中，该第一释放条件包括添加水溶液。在一个具体实施中，该第一释放条件包括将该组合物与该水溶液混合。

在一个具体实施中，该多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中该内部隔室包含该一种或多种试剂。

在一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于第二释放条件。在一个具体实施中，该第二释放条件释放该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该第二释放条件不同于该第一释放条件。在另一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于第三释放条件以释放至少一种试剂，其中该第三释放条件不同于该第一释放条件和该第二释放条件。

在一个具体实施中，该分离条件包括温度的改变。在另一个具体实施中，该分离条件包括处于或低于约40℃的温度。在另一个具体实施中，该方法还包括在该分离条件之后去除该蜡组分。

在一个具体实施中，该一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物(organic osmolite)、磁珠、分子探针、拥挤剂(crowding agent)、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程中使用该至少一个再水合的冻干微球。在另一具体实施中，该方法还包括在文库制备过程中使用该至少一个再水合的冻干微球。在又另一个具体实施中，该方法还包括在样品制备过程中使用该至少一个再水合的冻干微球。

在一个具体实施中，该多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。在一个具体实施中，该第二释放条件释放一种或多种试剂。在一个具体实施中，该第三释放条件释放一种或多种试剂。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有至少两种不同的试剂。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。在一个具体实施中，该多个微球包含多于一种试剂。在一个具体实施中，该多个微球包含一种试剂。在一个具体实施中，将该组合物暴露于该第一熔融条件、该第一释放条件和该分离条件依序地或按顺序发生。

在一个具体实施中，该蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡(ceresin)、地蜡(ozocerite)、蜂蜡、小烛树蜡(candelilla)、褐煤蜡(montan)、巴恩斯达尔蜡(barnsdahl)、小冠椰子蜡(ouricury)、巴西棕榈蜡(carnauba)或它们的任何组合。

在一个具体实施中，该方法还包括使该至少一个再水合的冻干微球的该一种或多种试剂流过流通池。在另一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程期间使该至少一种再水合冻干微球的该一种或多种试剂流过流通池。

第二方面涉及一种制备蜡-微球基质的方法。该方法包括在有效形成蜡-微球基质的条件下将多个冻干微球与蜡组分混合，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含随机分布的该多个冻干微球。在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含均匀分布的该多个冻干微球。在一个具体实施中，该蜡-微球基质处于高于约40℃的温度。在一个具体实施中，该方法还包括在有效固化该蜡组分的条件下降低该蜡-微球基质的温度。在一个具体实施中，降低该蜡-微球基质的温度包括处于或低于约40℃的温度。

在一个具体实施中，该多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中该内部隔室包含该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在另一个具体实施中，该多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有至少两种不同的试剂。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

在一个具体实施中，该蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

在一个具体实施中，该制备蜡-微球基质的方法还包括在模具中形成蜡组分，该蜡组分包括空腔；以及在混合后用蜡密封该空腔。在另一个具体实施中，混合包括用该多个冻干微球填充该空腔。在又一个具体实施中，该蜡组分的体积为约40μL至约50μL。在又一具体实施中，该空腔的体积为约10μL至约80μL。

第三方面涉及一种组合物。该组合物包含蜡-微球基质，所述蜡-微球基质包含：蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

在一个具体实施中，该多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中该内部隔室包含该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。在一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，当该一种或多种试剂包含多种试剂时，该多种试剂含有至少两种不同的试剂。在一个具体实施中，当该一种或多种试剂包含多种试剂时，该多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

在一个具体实施中，该蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

第四方面涉及一种方法。该方法包括将孔中包含蜡-微球基质的组合物的温度从第一温度升高至第二温度；使液体在所述孔中流动；在所述孔中混合所述组合物和所述液体；以及在从所述蜡-微球基质有效释放一种或多种试剂的条件下，将所述液体的温度从该第二温度降低至第三温度。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中该多个冻干微球包含该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该第二温度高于约40℃。在一个具体实施中，该第三温度处于或低于约40℃。在一个具体实施中，该第二温度释放至少一种试剂。在一个具体实施中，该混合还包括在该孔中添加水溶液。在一个具体实施中，该混合包括将该组合物与该水溶液混合。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含多个冻干微球，并且该多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中该内部隔室包含该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该第二温度释放该内部隔室。在一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于一次或多次另外的温度改变。在一个具体实施中，该一次或多次温度改变释放至少一种试剂。在一个具体实施中，该一次或多次另外的温度修改为不同于该第二温度的温度。

在一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于一次或多次另外的温度改变以释放至少一种试剂，其中该一次或多次另外的温度改变达到不同于该第三温度的温度。在一个具体实施中，该方法还包括在从该蜡-微球基质释放一种或多种试剂后去除该蜡组分。

在一个具体实施中，该一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。在另一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，该多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。

在一个具体实施中，该第一温度不同于该第三温度。在一个具体实施中，该第一温度与该第三温度相同。

在一个具体实施中，该方法还包括使所述一种或多种试剂流过流通池。在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程期间使所述一种或多种试剂流过流通池。

第五方面涉及一种料筒。该料筒包括试剂贮存器，该试剂贮存器包含蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

在一个具体实施中，该多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中该内部隔室包含该一种或多种试剂。在一个具体实施中，该一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

在一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有至少两种不同的试剂。在一个具体实施中，其中该一种或多种试剂包含多种试剂，该多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

在一个具体实施中，该蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。在一个具体实施中，该料筒还包括在该试剂贮存器中的多种蜡-微球基质组合物。

第六方面涉及一种用于控制一种或多种试剂的释放的系统。该系统包括孔；蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂；以及液体。

在一个具体实施中，该液体在该孔中。在一个具体实施中，该组合物在该孔中。在一个具体实施中，该系统还包括该孔上的温度控制器。

处理料筒中的微球被证明是一个重大挑战。在再水合步骤期间，由于微球静电粘附到表面上的趋势，需要清洗孔的所有侧面和顶部。为了利用重力的益处，将本文所述的冻干微球作为块(在本文中可互换地称为“蜡-微球基质”、“块”和“蜡块”)整体包封在蜡基质中，该块可容易地处理并滴入孔中。由于其重量，微球的位置是可预测的，并且因此可以容易地完全再水合。

本文所述的微球被整体包封在蜡块中，该蜡块可容易地分配到孔中。为了释放微球并使它们再水合，将温度升高到高于蜡的熔点并将水添加到溶液中。然后，蜡从液相中分离出来，并且通过降低温度，可以从再水合液体试剂中分离出来。

根据本公开，本文所述的方法、组合物、料筒和系统具有许多优点。

使用本文所述的方法、组合物、料筒和系统可以解决在普通孔或料筒内处理微球的各种问题。

附图说明

图1A和图1B示出了用含有本文所述的微球的蜡块对现有微球使用情况的改善和缓解。图1A示出了通过静电粘附分散在整个孔中的当前状态的微球。因此，微球位于孔的侧面和顶部，并且孔需要清洗侧面和顶部。图1B示出了使用含有本文所述的微球的蜡块的改善。

图2A至图2C示出了含有微球的蜡块的制备。图2A和图2B示出了含有微球的蜡块和置于1000rpm的热混合器上以保持微球悬浮后和温度降至40℃以在混合的同时使蜡固化后的蜡块。图2C示出了含有本文所述的微球的所提取的蜡块。示出了含有根据本公开的微球的蜡块的制备。可以通过将干燥的微球分配到孔板中，分配液体状态(温热)或干燥状态(冷)的蜡，在温热的温度下摇动孔板，在温热的温度下离心板，在温热的温度下摇动板，以及在室温下放置板，随后将板落下或翻转以提取块来制备蜡块。

图3示出了制备含有根据本公开的微球的蜡块的方法。图3示出了微球与蜡在大容器中的混合，从而在水滴在冷却塔中下沉时产生固化的液滴。

图4示出了由两种类型的微球构成的本文所述的蜡-微球基质组合物(例如，蜡块)的示例。

图5A至图5E示出了再水合本文所述的蜡-微球基质组合物的方法的示例。图5A示出了在约20℃下的蜡-微球基质组合物。图5B示出了在约70℃下的蜡-微球基质。图5C示出了添加水后在约70℃下的蜡-微球基质组合物，其中在组合物的顶部发现蜡并且微球被再水合。图5D示出了在再水合后且在约20℃下的蜡-微球基质组合物，其中蜡位于组合物的顶部。图5E示出了在微球再水合时从蜡-微球基质组合物中释放的蜡和试剂的分离。

图6A至图6G示出了再水合本文所述的蜡微球-基质组合物的方法的示例。图6A示出了管内的本文所述的蜡-微球基质组合物(例如，“块”或“蜡块”)。图6B示出了蜡-微球基质组合物的蜡组分的熔融。图6C示出了向蜡-微球基质组合物的熔融蜡组分中添加再水合缓冲液。图6D示出了将蜡-微球基质组合物的熔融蜡组分混合以再水合微球。图6E示出了通过用空气向上推动溶液(或物理地翻转孔)来移动蜡组分的一个示例。图6F示出了蜡组分的固化。图6G示出了拉回空气以滴下试剂(这可以可另选地通过物理地翻转孔来实现)。

图7示出了可根据本文所述的方法、组合物、料筒和系统使用的应用和试剂的示例。

图8示出了可根据本文所述的方法、组合物、料筒和系统使用的应用和试剂的示例。

图9示出了描述本文中所述的方法的一个方面的流程图。

图10示出了描述本文所述的制备蜡-微球基质的方法的一个方面的流程图。

图11示出了描述本文中所述的方法的一个方面的流程图。

图12示出了通过使用模具制备具有空腔的蜡-微球基质的示例性方法。

图13示出了使用模具制成的具有空腔的蜡-微球基质的示例。

应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分并且可用于实现本文所述的益处和优点。

具体实施方式

第一方面涉及一种方法。该方法包括将包含蜡-微球基质的组合物暴露于第一熔融条件，其中所述蜡-微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂，由此将包含所述蜡-微球基质的所述组合物暴露于所述第一熔融条件使该蜡组分熔融；将所述组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球；以及将所述至少一个再水合的冻干微球暴露于分离条件，以从所述至少一个再水合的冻干微球中分离所述蜡组分。

应当理解，本公开的某些方面、模式、具体实施、变型和特征在下面以各种细节水平进行描述，以便提供对本技术的实质理解。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义通常与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式的使用不是限制性的。如本公开中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。

术语“基本上”、“大约”、“约”、“相对”或可在整个本公开(包括权利要求书)中使用的其他此类类似术语用于描述和说明例如由于处理中的变化而来自参考或参数的小波动。此类小波动也包括来自参考或参数的零波动。例如，波动可以指小于或等于±10％，诸如小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。

还应理解，本文所述的某些特征(为了清楚起见，其在单独具体实施的上下文中描述)也可在单个具体实施中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个具体实施的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或者以任何合适的子组合提供。

术语“连接”、“接触”和/或“耦接”包括各种布置和组件。这些布置和技术包括但不限于：(1)一个部件和另一个部件的直接接合，其间没有居间部件(即，部件直接物理接触)；以及(2)一个部件和另一个部件的接合，其间具有一个或多个部件，前提条件是该一个部件“连接到”或“接触”或“耦接到”该另一个部件在某种程度上是与该另一个部件是操作性连通(例如，电气、流体、物理、光学连通等)(任选地在其间存在一个或多个附加部件)。彼此直接物理接触的一些部件可彼此电接触和/或流体接触或者可不彼此电接触和/或流体接触。此外，电连接、电耦接、光学连接、光学耦接、流体连接或流体耦接的两个部件可直接物理接触或可不直接物理接触，并且一个或多个其他部件可定位在这两个连接部件之间。

如本文所述，术语“附着”可包括当两个物体彼此接合、扣紧、粘附、连接或结合时。反应组分如聚合酶可通过共价键或非共价键附着到固相组分如传导通道。如本文所述，短语“共价附着”或“共价结合的”是指形成特征在于原子之间共享电子对的一个或多个化学键。非共价键是不涉及共享电子对的非共价键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。

如本文所述，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。如本文所用，术语还涵盖cDNA，即由RNA模板例如通过逆转录酶的作用产生的互补DNA或拷贝DNA。在一个具体实施中，待例如通过使用所述系统的测序进行分析的核酸被固定在基底(例如，流通池内的基底或基底诸如流通池上的一个或多个小珠等)上。如本文所用，术语“固定”旨在包括直接或间接的共价或非共价附着，除非另外明确指出或通过上下文指出。在旨在使用载体的条件下，诸如在需要核酸测序的应用中，分析物(例如，核酸)可以保持固定或附着到载体。在一个具体实施中，模板多核苷酸是附着到基底的多个模板多核苷酸中的一个模板多核苷酸。在一个具体实施中，附着到基底的多个模板多核苷酸包括文库多核苷酸的拷贝的簇，如本文所述。

核酸包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似物结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种主链键，诸如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。

在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子可结合到嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。

核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可包括天然的或非天然的碱基。天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。

如本文所述，术语核苷酸可包括天然核苷酸及其类似物、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸以及被称为核苷酸的其他分子。如本文所述，“核苷酸”可包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸可以是核酸序列的单体单元，例如以识别DNA或RNA链中存在的亚基。核苷酸还可包括不一定存在于聚合物中的分子，例如能够通过聚合酶以依赖于模板的方式掺入到多核苷酸中的分子。核苷酸可包括例如在5'碳上具有0、1、2、3个或更多个磷酸基团的核苷单元。核苷四磷酸、核苷五磷酸和核苷六磷酸可以是有用的，在5'碳上具有超过6个磷酸基团(诸如7、8、9、10或更多个磷酸基团)的核苷酸也可以是有用的。天然存在的核苷酸的示例包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。

非天然核苷酸包括核苷酸类似物，诸如不存在于天然生物系统中或基本上不通过聚合酶在其天然环境下(例如在表达聚合酶的非重组细胞中)掺入到多核苷酸中的那些核苷酸。非天然核苷酸包括那些通过聚合酶以一种速率掺入到多核苷酸链中的那些非天然核苷酸，该速率显著快于或慢于另一种核苷酸(诸如具有与相同沃森-克里克互补碱基进行碱基配对的天然核苷酸)通过聚合酶掺入到链中的速率。例如，当与天然核苷酸的掺入速率相比时，非天然核苷酸可以至少2倍不同、5倍不同、10倍不同、25倍不同、50倍不同、100倍不同、1000倍不同、10000倍不同或更多倍不同的速率掺入。将非天然核苷酸掺入到多核苷酸中后能够被进一步延伸。示例包括具有3'羟基的核苷酸类似物或在3'位置具有可逆终止子部分的核苷酸类似物，该核苷酸类似物可被移除以允许掺入了该核苷酸类似物的多核苷酸进一步延伸。可逆终止子部分的示例例如描述于美国专利号7,427,673中，该专利据此全文以引用方式并入。应当理解，在一些具体实施中，具有3'终止子部分或缺乏3'羟基的核苷酸类似物(诸如双脱氧核苷酸类似物)可在已掺入核苷酸类似物的多核苷酸不被进一步延伸的条件下使用。在一些具体实施中，核苷酸可不包括可逆终止子部分，或该核苷酸将不包括不可逆终止子部分，或该核苷酸将根本不包括任何终止子部分。在一个具体实施中，3'-羟基封端基团是可逆的封端基团。

术语“簇”是指由多个相同的固定核酸链和多个相同的固定互补核酸链构成的固体载体上的离散位点。术语“簇阵列”是指由此类簇或群体形成的阵列。在该上下文中，术语“阵列”不应被理解为需要簇的有序布置。

如本文所用，当参考核酸使用时，术语“不同”意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两种或更多种核酸可具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。另选地，两种或更多种核酸可具有沿其长度的相当大部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种核酸可以具有彼此不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有彼此相同的通用序列区域。

如本文所用，“文库”是来自给定的来源或样品的多核苷酸群体。文库包括多个靶多核苷酸。

本文所述的经修饰的核苷酸包括具有嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分的经修饰的核苷酸。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸与可检测标记连接。在一个具体实施中，可检测标记包括荧光团。本公开涵盖包括荧光标记的核苷酸(或任何其他检测标签)，该荧光标记可用于本文公开的任何方法中，其本身掺入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合。可检测标记的另外的示例描述于美国专利号7,541,444中，该专利据此全文以引用方式并入。

荧光标记可包括选自任何已知荧光物质的化合物，例如罗丹明或花青。如本文所公开的荧光标记可附着到核苷酸碱基上的任何位置，并且可以任选地包括连接基。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸通过可裂解的连接基与可检测标记连接。连接基的功能通常是帮助荧光标记与核苷酸的化学附着。在特定具体实施中，仍然可以对所得的类似物进行沃森-克里克碱基配对。连接基基团可用于将染料共价附着到核苷或核苷酸。连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得该化合物不显著干扰核酸复制酶对核苷酸的总体结合与识别。因此，连接基还可包括间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。

连接基可以是可裂解的，并且裂解位点可以位于连接基上导致部分连接基在裂解后仍附着于核苷酸碱基或导致整个连接基从核苷酸碱基上去除的位置。示例性连接基包括含叠氮化物和烯丙基的可裂解部分、二硫键连接基、酸不稳定部分(包括二烷氧基苄基部分、Sieber连接基、吲哚部分、叔丁基Sieber部分)、亲电可裂解部分、亲核可裂解部分、光可裂解部分、还原条件下的裂解、氧化条件下的裂解、通过使用安全捕获部分的裂解和通过消除机制的裂解。此类部分的示例描述于WO03/048387中，其据此全文以引用方式并入。

该组合物可包含与不同可检测标记连接的不同的经修饰的核苷酸。在一些具体实施中，四种不同的经修饰的核苷酸可与四种不同的可检测标记连接。另选地，可以用两种不同的可检测标记(例如，对于双通道边合成边测序)或用单一可检测标记(例如，对于单通道边合成边测序)标记四种不同的经修饰的核苷酸。

如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子被碳取代和/或碳被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。

术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。

如本文所述，术语基底(或固体载体)可包括核酸可附着到其上的任何惰性基底或基质，例如玻璃表面、塑料表面、胶乳、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶片。例如，基底可以是玻璃表面(例如，流通池通道的平面表面)。在一个具体实施中，基底可以包括被“官能化”的惰性基底或基质，诸如通过施加中间材料的层或包衣，该中间材料包括允许共价附着到分子(诸如多核苷酸)的反应性基团。载体可包括负载在惰性基底诸如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶。分子(例如，多核苷酸)可直接共价附着至中间材料(例如，水凝胶)。载体可以包括多个颗粒或小珠，每个颗粒或小珠具有不同的附着分析物。

如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。这样的衍生物和类似物在例如Bücher,N.“NucleotideAnalogsSynthesis and Biological Function,”Angewandte Chemie 97:564(1980)中讨论，其据此全文以引用方式并入。核苷酸类似物还可包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文所述的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。

如本文所用，术语“固相”或“表面”用于表示平面阵列，其中引物附接到平坦表面，例如玻璃、二氧化硅或塑料显微镜载片或类似的流通池装置；表示小珠，其中一个或两个引物附接到这些小珠并且这些小珠被扩增；或者表示在小珠已扩增后表面上的小珠阵列。

如本文所用，“基本上不含”材料(包括例如拥挤剂或核酸)是指组合物具有小于10％的材料、小于5％的材料、小于4％的材料、小于3％的材料、小于2％的材料或小于1％的材料。

如本文所述的包含蜡-微球基质的组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中该多个冻干微球包括一种或多种试剂。

本文所述的蜡组分可包括任何合适量的蜡、蜡成分或蜡化合物，其适于在暴露于一种或多种熔融条件时熔融，从而将蜡-微球基质组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球。蜡组分可包括但不限于鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。表1中提供了可能有用的蜡类型的示例和它们各自的熔点。

表1.蜡类型和熔点。

蜡	熔点(℃)
		鲸蜡	41-49
日本蜡	53
		石蜡	53-55
纯地蜡	54-77
		地蜡	58-100
蜂蜡	61-63
		小烛树蜡	65-70
褐煤蜡	76-84
		巴恩斯达尔蜡	70-74
小冠椰子蜡	79-84
		巴西棕榈蜡	80-87

如本文所用，“微球”包括直径或横截面为0.1μm至25,000μm的球形颗粒或小珠。例如，微球可具有约0.1μm、0.5μm、1μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1,000μm、10,000μm、25,000μm的直径，或介于约0.1μm与约25,000μm之间的任何直径。在一个具体实施中，微球具有介于约100μm与约1,000μm之间的直径。在一个具体实施中，微球具有介于约0.1mm与约25mm的横截面。在一个具体实施中，微球具有介于约0.1mm与约1mm的横截面。在一个具体实施中，微球具有大于约1mm的横截面。在一个具体实施中，微球具有约0.1mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、50mm、100mm、200mm、300mm、400mm、500mm、600mm、700mm、800mm、900mm、1,000mm的直径，或介于约0.1mm与约1,000mm之间的任何直径。

本文所述的冻干微球包括包含冻干试剂的任何化合物。在一个具体实施中，微球是球形、椭圆形或环形。微球通常由外聚合物层构成，并且可包括一种或多种本文所述的成分。微球可包括例如生物可降解的聚合物。根据本公开的微球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。例如，微球可通过将液体冷冻成冷冻粒料，接着将冷冻微球放置在干燥器，例如通过加热或在盘式冷冻干燥器(诸如常规盘式干燥器)中或在旋转干燥器中干燥中来制备。在本公开中，术语“冻干(lyophilize)”或“冻干物(lyophilizate)”将用作“冻干的(lyophilised)”、“冻干物(lyophilisate)”或“冷冻干燥的”的等效术语，例如关于本文所述的组合物、方法、料筒和系统。本文所述的微囊包封包括在一种或多种粉末中包覆各个微球或颗粒。

根据本公开的大球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。本文所述的组合物、方法、料筒和系统可包括单个微球，或可包括多个微球并且因此可以形成大球。例如，本文所述的组合物可包括介于1个与超过1,000,000个之间的微球。在一个具体实施中，该组合物包含1个微球、或少于25个微球、或少于50个微球、或少于75个微球、或少于100个微球、或少于500个微球，或介于约1个和约1,000,000个之间的任何数目的微球。在一个具体实施中，例如在大球中，组成和/或试剂是不同的。如本文所述的大囊包封包括在一种或多种粉末中包覆多个微球或颗粒。

冻干微球可包括围绕内部隔室的壳，其中内部隔室包含一种或多种试剂。

如本文所述，“壳”包括包围内部隔室的组合物。如本文所述的内部隔室包括一种或多种试剂。如本文所述，该方法可包括将组合物暴露于第二释放条件。在一个具体实施中，第二释放条件可以释放一种或多种试剂。当壳暴露于第二释放条件时，组合物中的壳可释放内部隔室。当内部隔室暴露于第二释放条件时，本文所述的组合物的内部隔室可释放一种或多种试剂。内部隔室可例如具有围绕一种或多种试剂的其自身的内部隔室壳。第一释放条件可以不同于第二释放条件。

如本文所述，第一释放条件适于再水合至少一个冻干微球。如本文进一步所述，第二释放条件适于释放至少一种试剂。如本文所述的至少一个冻干微球的再水合不一定需要释放一种或多种试剂。如本文所述的一种或多种试剂的释放取决于如本文所述的至少一个冻干微球的再水合。

如本文所述，“包封(encapsulate)”、“包封的(encapsulated)”和“包封(encapsulation)”可包括封入如本文所述的一种或多种组合物。如本文所述的微囊包封是指将至少一种成分(例如活性剂)包埋到至少一种其他材料(例如壳材料)中。根据本公开的包封包括但不限于散装包封、基质包封、大囊包封、微囊包封、纳米包封、单分子和离子包封。

在一个具体实施中，内部隔室包括包含多种试剂的多个微球。在另一个具体实施中，内部隔室包括包含一种试剂的多个微球。如本文所述，多个微球中的每个微球可包括多种试剂。另选地，多个微球可共同包括多种试剂。

可冻干制剂可以重构成溶液、悬浮液、乳液或任何其他适于施用或使用的形式。可冻干制剂通常首先制备成液体，然后冷冻并冻干。冻干前的总液体体积可以小于、等于或大于冻干制剂的最终重构体积。冻干制剂的最终重构体积可小于冻干前的总液体体积，或可大于冻干前的总液体体积，或可为与冻干前相等的总液体体积。

冻干制剂可以在宽范围的温度下储存。冻干制剂可在25℃以下储存，例如在2℃-8℃冷藏，或在室温(例如，大约25℃)下储存。冻干制剂可以在约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或介于37℃与-80℃之间的任何温度下储存。例如，它们的组合物可以在介于约15℃与约37℃之间、低于约25℃、介于约4℃至20℃之间；低于约4℃；低于约-20℃；约-40℃；约-70℃或约-80℃下储存。冻干制剂的稳定性可以以本领域已知的多种方式测定，例如通过组合物的视觉外观和/或通过含水量来测定。本公开的蜡-微球基质组合物可经受在运输期间可能发生的温度剧增，例如高达70℃。在一个具体实施中，本文所述的组合物、方法、料筒和系统在储存一段时间(例如，10天、14天、20天、26天、30天、60天、100天、200天、300天、365天或更长时间，例如在37℃的温度下储存时)表现出稳定性。

冻干制剂通常通过添加水溶液以溶解冻干制剂而再水合(在本文中可互换地称为“重构”)。多种水溶液可用于重构冻干制剂，包括水、盐水或另一种电解质或非电解质稀释剂。在某些情况下，优选使用水重构本文所述的冻干组合物。冻干制剂可以用包含水(例如，USP WFI或注射用水)或抑菌水(例如，含0.9％苄醇的USP WFI)的溶液再水合。然而，也可以使用包含添加剂、缓冲剂、赋形剂和/或载体的溶液。

第一释放条件还可包括添加水溶液。水溶液可包括适于再水合冻干微球的任何水溶液。在一个具体实施中，第一释放条件可包括将组合物与水溶液混合。

冷冻干燥制剂或冻干制剂通常由液体制备，即由溶液、悬浮液、乳液等制备。因此，要经历冷冻干燥或冻干的液体可包括最终重构液体制剂中所期望的所有组分。另选地，待冻干的液体可包括单一试剂，然后，一旦冻干，就与一种或多种另外的冻干试剂一起干混，使得那些试剂在再水合时混合在一起以形成重构的液体制剂。因此，一种冻干材料可以再水合，或者两种或更多种冻干材料可以一起再水合。因此，当再水合或重构时，冷冻干燥制剂或冻干制剂将在重构时产生期望的液体制剂。

在一个具体实施中，当冻干时，本文所述的蜡-微球基质组合物包含低于约10重量％的含水量。例如，含水量可以小于约9.5重量％、小于约9重量％、小于约8.5重量％、小于约8重量％、小于约7.5重量％、小于约7重量％、小于约6.5重量％、小于约6重量％、小于约5.5重量％、小于约5重量％水、小于约4.5重量％、小于约4重量％、小于约3.5重量％、小于约3重量％、小于约2.5重量％、小于约2重量％、小于约1.5重量％、小于约1重量％、小于约0.5重量％、小于约0.1重量％水或其间的任何量。在一个具体实施中，蜡-微球基质组合物中不存在可测量含量的水。

本文所述的方法包括将包含蜡-微球基质的蜡-微球基质组合物暴露于第一熔融条件。第一熔融条件包括适于熔融蜡组分的任何条件。在一个具体实施中，第一熔融条件包括温度的改变。由第一熔融条件提供的温度的改变包括例如高于约40℃的温度。第一熔融条件中的温度可以是例如介于约40℃与约41℃之间、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、高于约100℃，或适于实现蜡组分熔融的任何温度。

在一个具体实施中，该方法还可包括将组合物暴露于第二熔融条件以熔融蜡组分，其中第二熔融条件不同于第一熔融条件。第二熔融条件同样可以高于约40℃。例如，第二熔融条件可以介于约40℃与约41℃之间、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、高于约100℃，或适于实现蜡组分熔融的任何温度。

本文所述的方法还包括将组合物暴露于第一释放条件。第一释放条件包括适于再水合至少一个冻干微球的任何条件。在一个具体实施中，本文所述的第一释放条件可释放至少一种试剂。在另一个具体实施中，第二释放条件释放一种或多种试剂。在又一个具体实施中，第三释放条件释放一种或多种试剂。因此，第一释放条件、第二释放条件和第三释放条件可以全部或单独地释放一种或多种试剂。第一释放条件、第二释放条件和第三释放条件可以彼此独立地操作。在一个具体实施中，当该一种或多种试剂包含多种试剂时，该多种试剂含有至少两种不同的试剂。在另一个具体实施中，当该一种或多种试剂包括多种试剂时，该多种试剂包含与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。在又一具体实施中，多个微球可包括多于一种试剂(例如，两种或更多种类型的试剂)。另选地，多个微球可包括一种试剂(例如，单一类型的试剂)。

如本文所用，术语“试剂”描述可用于与样品反应、与样品相互作用、稀释样品或添加到样品中的单一试剂或两种或更多种试剂的混合物，并且可包括本文所述的组合物以及用于核酸反应中的试剂，包括例如缓冲剂、化学品、酶、聚合酶、引物(包括大小小于50个碱基对的引物)、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。

在一个具体实施中，该一种或多种试剂是样品制备试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的组合。在一个具体实施中，该一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在一些具体实施中，试剂可以进一步或另选地包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。试剂可以进一步或另选地包括例如小珠连接的转座体(BLT)、Tris pH7、MgCl₂、乙酸镁、硫酸镁、索引引物、Q5聚合酶、Bst3.0、Tris pH9、dNTP、NaCl、甜菜碱或它们的任何组合。在某些具体实施中，如本文所述的试剂可包括酶，诸如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合伴侣，诸如抗体、表位、链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、凝集素或碳水化合物；或其他生物化学活性分子。其他示例试剂包括用于生物化学方案的试剂，诸如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶促测定方案、测序方案和/或用于分析生物流体的方案。根据本文公开的一些具体实施，根据特定工作流程和/或下游应用，试剂可以包括一个或多个小珠，尤其是磁珠。

在一个具体实施中，根据本公开的试剂是聚合酶。如本文所用，术语“聚合酶”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括例如使用核酸作为模板链产生核酸分子的互补复制的酶。通常，DNA聚合酶结合到模板链并且然后沿模板链向下移动，将核苷酸依序添加到生长核酸链的3’端处的游离羟基。DNA聚合酶通常自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶通常自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(称为引物)来开始链生长。一些聚合酶可以置换它们将碱基添加到链的位点上游的链。此类聚合酶称为链置换的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))聚合酶、exo-Klenow聚合酶或测序级T7 exo-聚合酶的大片段。一些聚合酶可使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有可使它们后面的链降解的活性(3’核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或者以其他方式修饰以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。

根据本公开的聚合酶可以包括能够耐受掺入磷酸标记的核苷酸的任何聚合酶。根据本公开可能有用的聚合酶的示例包括但不限于phi29聚合酶、klenow片段、DNA聚合酶I、DNA聚合酶III、GA-1、PZA、phi15、Nf、G1、PZE、PRD1、B103、GA-1、9oN聚合酶、Bst、Bsu、T4、T5、T7、Taq、Vent、RT、polβ、polγ和它们的组合。可以使用被设计成具有特定特性的聚合酶。在一个具体实施中，聚合酶可用于测序(“测序聚合酶”)。在一个具体实施中，试剂包括聚合酶，例如Pol 812、129DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶或它们的任何组合。

如本文所公开的引物包括可以与所关注靶序列杂交的核酸分子。在几个具体实施中，引物可用作底物，核苷酸可通过聚合酶聚合到该底物上。然而，在一些示例中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一个具体实施中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。

可以包括在上述组合物中的核酸分子的非限制性示例还包括DNA，诸如基因组或cDNA；RNA，诸如mRNA、sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂交体。组合物还可包含带标记的核苷酸。

术语“盐”可包括由毒性或无毒酸或碱(包括无机酸和无机碱以及有机酸和有机碱)制备的盐。盐可以由例如药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。

本领域技术人员已知的任何表面活性剂也可包括在组合物中，特别是当组合物被冻干时。表面活性剂可以是多离子型的、非离子型的或离子型的(特别是阳离子型的或阴离子型的)或者可以是两性离子型的。如本文所述的表面活性剂包括Tween-20、Tween 80、CHAPS或其他洗涤剂，诸如Brij-L23、Pluronic-F127或它们的组合。合适的表面活性剂的示例包括但不限于聚丙烯酸盐表面活性剂、有机硅表面活性剂和/或其他可商购的表面活性剂或洗涤剂。本文所述的组合物可包括阴离子表面活性剂，该阴离子表面活性剂在一端含有阴离子官能团，诸如硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根官能团。试剂可包含中性表面活性剂，例如聚乙二醇月桂基醚。

如本文所述的样品制备试剂可包括例如裂解缓冲液、蛋白酶K(PK1)、纯化小珠(PB)、重悬浮缓冲液(RSB)和乙醇(EtOH)。如本文所述的文库制备试剂可包括例如末端修复混合物、A-Tailing混合物、连接混合物、独特分子标识符(UMI)、终止连接缓冲液以及标签缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、连接酶、索引、小珠、SDS、转换寡聚物、dNTP和缓冲液。

组合物可以进一步或在替代方案中包括酶抑制剂、分子探针、拥挤剂、有机渗透物、环糊精、三磷酸腺苷(ATP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、肌氨酸激酶、肌氨酸磷酸酯、钯、硫辛酸、六乙二醇、三羟基丙烷膦、抗坏血酸钠或它们的任何组合。如本文所述的酶抑制剂包括与酶结合并降低其活性的任何分子。如本文所述的分子探针包括，例如，地高辛、8-苯胺基萘-1-磺酸(“ANS”)、卟啉、BODIPY、花青或它们的任何组合。如本文所述的拥挤剂包括本领域技术人员已知的任何拥挤剂。示例包括但不限于聚乙二醇、ficoll、葡聚糖和血清白蛋白。在一个具体实施中，组合物包含约5重量％、约4重量％5、约3重量％5、约2重量％、约1重量％、小于约1重量％的拥挤剂，例如小于约0.001重量％、约0.001重量％、约0.005重量％、约0.01重量％、约0.05重量％、约0.1重量％、约0.5重量％、约1重量％的另外的化合物，或其间的任何量或范围。在一个具体实施中，组合物中不存在可测量含量的拥挤剂。

测序技术领域的技术人员将理解存在本文未明确描述的可用于本公开的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统的另外的试剂。

本文所述的方法还包括将再水合的冻干微球暴露于分离条件。分离条件包括适于从再水合的冻干微球中分离蜡组分的任何条件。在一个具体实施中，该分离条件包括温度的改变。由分离条件提供的温度的改变包括蜡-微球基质具有例如处于或低于约40℃的温度。在分离条件下蜡-微球基质的温度可以是例如介于约0℃与约40℃之间、约39℃、约38℃、约37℃、约36℃、约35℃、约34℃、约33℃、约32℃、约31℃、约30℃、约25℃、约24℃、约23℃、约22℃、约21℃、约20℃、约19℃、约18℃、约17℃、约16℃、约15℃、约10℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃或低于约0℃。分离条件可导致蜡组分分离并移动至组合物的顶部和/或组合物位于其中的孔。例如，可以通过用空气向上推动溶液或物理地翻转孔来分离蜡组分。

在一个具体实施中，该方法还包括在分离条件之后去除蜡组分。当从蜡-微球基质释放的微球再水合时，蜡组分分离并释放试剂。一旦蜡组分固化，可将其从组合物和/或组合物所在的孔中去除。例如，固化的蜡组分可以通过拉回的空气或物理地翻转孔来去除。另选地，固化的蜡组分可从组合物中移出并可保留在组合物所在的孔中。

在一个具体实施中，将该组合物暴露于该第一熔融条件、该第一释放条件和该分离条件依序地或按顺序发生。例如，可将该组合物暴露于第一熔融条件，然后暴露于第一释放条件，然后暴露于分离条件。另选地，可将该组合物以适于进行本文所述方法的任何其他顺序暴露于第一熔融条件、第一释放条件和分离条件。在一个具体实施中，组合物可同时暴露于第一熔融条件、第一释放条件和分离条件，或可同时暴露于该等条件中的任何两个条件。

根据本公开，本文所述的组合物、方法、料筒和系统具有许多优点和益处，包括例如增加试剂的稳定性、使用大囊包封以实现多次运行的料筒以及使用蜡-微球基质以实现简化的工作流程、减少试剂孔的数量以及简化制造过程(通过例如静电缓解)。

“改变”如本文所述的任何条件(例如，通过提供第一熔融条件、第一释放条件、分离条件)包括组合物/或组合物周围环境(例如，再水合溶液或其他周围溶液)中的一个或多个条件的任何变化。在一个具体实施中修改条件允许蜡组分的熔融、一个或多个冻干微球的释放和/或组合物中的任何化合物的释放或内部隔室中的一种或多种试剂的释放。一种能够通过温度触发的释放来改变条件的方式。除了时间和(或在替代方案中)温度之外或代替时间和温度，可以改变其他反应特征。例如，可以改变pH和湿度以进一步控制一种或多种化合物、组分和包含在其中的试剂的释放。可将条件修改任何次数以产生任何数目的不同条件。

在一个具体实施中，例如如图5A至图5E中所示，再水合蜡-微球组合物的方法可以包括以下步骤：(1)在约20℃下提供蜡-微球基质组合物(图5A)；(2)将蜡-微球基质组合物的温度升高至约70℃(图5B)；(3)将水添加到蜡-微球基质组合物中，并且蜡组分可存在于组合物的顶部，并且微球可以再水合(图5C)；(4)将蜡-微球基质组合物的温度降低至约20℃，并且蜡组分可位于组合物的顶部(图5D)；以及(5)当蜡-微球基质组合物中的微球再水合时，蜡组分分离并释放试剂。

在一个具体实施中，例如如图6A至图6G中所示，再水合蜡微球-基质组合物的方法包括以下步骤：(1)在管或孔内提供蜡-微球基质组合物(图6A)；(2)将蜡-微球基质组合物暴露于熔融成蜡组分的条件(图6B)；(3)将再水合缓冲液添加到具有熔融的蜡组分的蜡-微球基质组合物(图6C)；(4)将具有熔融的蜡组分的蜡-微球基质组合物混合以再水合微球(图6D)；(5)例如通过用空气向上推动溶液或物理地翻转孔将蜡组分移至管或孔的顶部(图6E)；(6)蜡组分固化(图6F)；以及(7)将空气拉回或物理翻转孔以滴下试剂(图6G)。

在一个具体实施中，本文所述的方法还可包括将组合物暴露于第二释放条件以释放至少一种试剂，其中第二释放条件不同于第一释放条件。

在一个具体实施中，本文所述的方法还可包括将组合物暴露于第三释放条件以释放至少一种试剂，其中第三释放条件不同于第一释放条件和第二释放条件。

本文所述的组合物中的每一种试剂可响应于不同的释放条件。在某些具体实施中，第一试剂、第二试剂和/或第三试剂可以在微球基质中并且可以响应于不同的释放条件。在某些具体实施中，第一试剂和第三试剂响应于不同的释放条件。在某些具体实施中，第一试剂和第二试剂响应于不同的释放条件。在其他具体实施中，第二试剂和第三试剂响应于不同的释放条件。另选地，第一试剂、第二试剂和/或第三试剂可响应于相同或基本相似的释放条件。在某些具体实施中，第一试剂和第三试剂响应于相同或基本相似的释放条件。在某些具体实施中，第一试剂和第二试剂响应于相同或基本相似的释放条件。在某些具体实施中，第二试剂和第三试剂响应于相同或基本相似的释放条件。

本文所述的组合物、方法、料筒和系统提供定时释放，使得各种组分和试剂可以在不同时间释放，例如以依序或以其他方式控制的方式。释放速率可以是可调节的，以允许释放组合物组分和试剂。释放速率可以持续任何合适的时间段。例如，冻干微球的壳或内部隔室可在短时间段内释放或溶解，诸如1分钟或更短(例如，小于1秒、1秒、10秒、20秒、30秒、45秒、60秒或其间的任何时间段)。另选地，冻干微球的壳或内部隔室可在中间时间段内释放或溶解，诸如介于1分钟与30分钟之间(例如，1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或其间的任何时间段)。另选地，冻干微球的壳或内部隔室可在长时间段内释放或溶解，诸如超过30分钟(例如，35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、超过120分钟或其间的任何时间段)。例如，如本文所述的冻干微球的壳或内部隔室可在低pH(例如，介于约2-6之间)下快速释放(例如，在一分钟内)，而相同的壳可在高pH(例如，介于约10-14之间)下缓慢释放(例如，在约30分钟或更长时间内)。类似地，如本文所述的冻干微球的壳或内部隔室可在低pH(例如，介于约2-6之间)下缓慢释放(例如，在约30分钟或更长时间内)，而相同的壳可在高pH(例如，介于约10-14之间)下快速释放(例如，在一分钟内)。类似地，如本文所述的冻干微球的壳或内部隔室可在升高的温度(例如，高于约25℃或高于约40℃)下快速释放(例如，在一分钟内)，而相同的壳或内部隔室可在较低的温度(例如，处于或低于约25℃或高于约40℃)下缓慢释放(例如，在约30分钟或更长时间内)。在另一个示例中，如本文所述的冻干微球的壳或内部隔室可在升高的温度(例如，高于约25℃或高于约40℃)下缓慢释放(例如，在约30分钟或更长时间内)，而相同的壳或内部隔室可在较低温度(例如，处于或低于约25℃或高于约40℃)下快速释放(例如，在一分钟内)。在一个具体实施中，第一条件和第二条件中的任一个或两者包括温度的变化。例如，温度可升高至高于约25℃或高于约40℃的温度。另选地，例如，可将温度降低至处于或低于约25℃或高于约40℃。

如本文所述，当壳暴露于特定条件时，防止一种或多种试剂的释放包括防止释放比在不同释放条件下长至少一个数量级。如本文所述，防止一种或多种试剂的释放包括完全防止试剂释放和显著延迟试剂释放(即，防止一种或多种试剂的释放包括实际上防止释放)。

本文所述的组合物、方法、料筒和系统可在内部隔室中包括一种或多种干试剂、一种或多种微球、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼、一种或多种凝胶、一种或多种液体或它们的任何组合。

本文所述的组合物和试剂可包括干燥试剂，并且可任选地冻干为例如冻干微球。在一个具体实施中，该组合物包含饼、小珠或粉末。在另一个具体实施中，该组合物可以是微球、饼或它们的组合。

本文所述的组合物可表现出机械刚性。如本文所用，本体组合物的“机械刚性”是指在本体组合物经受机械应力(诸如振动或冲击应力)之后表现出至多5％，更优选至多1％，甚至更优选至多0.5％，并且最优选至多0.1％的从本体组合物的质量损失的本体组合物。保持本体组合物的机械刚性有助于减少或防止运输期间冻干材料的损失。例如，如果包含冻干微球的组合物缺乏机械稳定性，则可能发生不完全的再水合，导致测序反应的效率损失。不完全的再水合可由冻干材料的不可预测的位置引起，其中冻干碎片或脱落的粉末可能位于再水合线之外。

该组合物可以是适于制备蜡-微球基质的任何合适的大小或体积，该蜡-微球基质适于样品制备、样品提取、文库制备、富集、成簇、测序或它们的任何组合。在一个具体实施中，该组合物在基质中具有介于约0.1μL与约100,000μL之间的试剂体积。例如，该组合物可具有约0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、125μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、325μL、350μL、375μL、400μL、425μL、450μL、475μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1,000μL、1,100μL、1,200μL、1,300μL、1,400μL、1,500μL、1,600μL、1,700μL、1,800μL、1,900μL、2,000μL、2,500μL、3,000μL、3,500μL、4,000μL、4,500μL、5,000μL、5,500μL、6,000μL、6,500μL、7,000μL、7,500μL、8,000μL、8,500μL、9,000μL、9,500μL、10,000μL、15,000μL、20,000μL、25,000μL、30,000μL、35,000μL、40,000μL、45,000μL、50,000μL、55,000μL、60,000μL、65,000μL、70,000μL、75,000μL、80,000μL、85,000μL、90,000μL、95,000μL、100,000μL的活性试剂体积，或介于约0.1μL与约100,000μL之间的任何体积。例如，活性试剂体积可以介于约1,000μL与约100,000μL之间、介于约10,000μL与约100,000μL之间、介于约50,000μL与约100,000μL之间、介于约0.1μL与约10,000μL之间、介于约0.1μL与约50,000μL之间，或任何其他合适的大小。

本文所述的组合物可以在壳中包含另外的试剂。在一个具体实施中，组合物在壳中包含试剂或添加剂。壳中的试剂可包括例如前述试剂或添加剂中的任一种。在一个具体实施中，壳不含核酸分子，例如，壳不含DNA。在一个具体实施中，壳含有多于一种试剂和，或在替代方案中，含有多于一种添加剂。

本文所述的组合物可用于多个依序共测定，包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签片段化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、SBS技术、使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或依序执行的它们的任何组合。在一个具体实施中，该组合物用于进行多个共测定反应。在一个具体实施中，本文所述的组合物、方法、料筒和系统可改善测序质量，使得能够进行一锅文库制备，并且简化制造和使用。如本文所用，术语“一锅反应”也可称为“无转移反应”。

可准备本文所述的组合物、方法、料筒和系统用于测序的各个阶段，包括但不限于样品提取、文库制备、富集、成簇和测序。组合物可包含许多与本文所述的那些不同的试剂或可用于促进测序系统(例如，SBS技术)效用的任何试剂。

在一个具体实施中，生物样品接触该组合物。生物样品可以包括例如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸腔积液、漏出液、渗出液、胆囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、含有单个或多个细胞的液体、含有细胞器的液体、流化组织、流化生物体、含有多细胞生物体的液体、生物拭子和生物洗液。生物样品可以包括核酸，诸如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物，诸如具有终止子部分的类似物，诸如在以下文献中描述的那些：Bentley等人，“Accurate Whole Human Genome SequencingUsing Reversible Terminator Chemistry,”Nature 456:53-59(2008)和WO/2013/131962，其据此全文以引用方式并入。

如本文所述，再水合时间将根据组合物含量和反应条件(例如，试剂、温度、pH)而变化。在一个具体实施中，再水合时间可以介于0.1秒与10小时之间。例如，再水合时间可以是约0.1秒、1秒、10秒、30秒、45秒、60秒、5分钟、10分钟、12分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、2小时、5小时、8小时、10小时或介于之间的任何时间量。

如本文所用的再水合(或重构)溶液可包括水、去离子水、盐水溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液，并且可与前述再水合溶液一致。在一个具体实施中，再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。在一个具体实施中，本文所述的具有不同浓度、不同类型的酶和不同量的辅因子、盐、pH等的试剂可单独用水或甚至经大气水捕获再水合。可在再水合溶液中提供如本文所述的另外的添加剂。

在一个具体实施中，该方法还包括使再水合的组合物(例如，至少一个再水合的冻干微球)或一种或多种试剂流过流通池。在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程期间使再水合的组合物(例如，至少一个再水合的冻干微球)或一种或多种试剂流动。在另一个具体实施中，该方法还包括将再水合的组合物暴露于测序引物，其中测序引物中一种或多种经修饰的核苷酸的掺入产生延伸的测序引物。在另一个具体实施中，该方法还包括将再水合的组合物施用于包含核苷酸簇的固体载体，其中该核苷酸簇包含靶多核苷酸。

第二方面涉及一种制备蜡-微球基质的方法。该方法包括在有效形成蜡-微球基质的条件下将多个冻干微球与蜡组分混合，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

这个方面可以与先前描述的方面一致。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含随机分布的该多个冻干微球。在另一个具体实施中，该蜡-微球基质包含均匀分布的该多个冻干微球。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质处于高于约40℃的温度。例如，混合可以在介于约40℃与约41℃之间、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、高于约100℃的温度或适于实现蜡组分熔融的任何温度下进行。

在一个具体实施中，降低蜡-微球基质的温度以使蜡-微球基质固化。在一个具体实施中，降低蜡-微球基质的温度包括将温度降低至处于或低于约40℃。修改中的温度可以是例如介于约0℃与约40℃之间、约39℃、约38℃、约37℃、约36℃、约35℃、约34℃、约33℃、约32℃、约31℃、约30℃、约25℃、约24℃、约23℃、约22℃、约21℃、约20℃、约19℃、约18℃、约17℃、约16℃、约15℃、约10℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、低于约0℃或适于实现蜡组分固化的任何温度。

蜡-微球基质组合物(即，含有微球的蜡块)可通过将微球与熔融蜡(例如，熔融石蜡)组合来制备。可将微球和熔融的蜡置于1000rpm的热混合器上以保持微球悬浮。如图2A和图2B中所示，可将温度降至40℃以在混合的同时使蜡固化，从而形成蜡块。使用这种制备方法提取的含有微球的蜡块示于图2C中。

如图2A至图2C中所示，可以通过将干燥的微球分配到孔板中，分配液体状态(温热)或干燥状态(冷)的蜡，在温热的温度下摇动孔板，在温热的温度下离心板，在温热的温度下摇动板，以及在室温下放置板，随后将板落下或翻转以提取块来制备蜡块。

制备蜡-微球基质的方法还可以包括在模具中形成蜡组分，该蜡组分包括空腔；以及在混合后用蜡密封空腔(图12)。在一个具体实施中，模具包括多个孔，并且每个孔用热蜡填充。例如，模具的每个孔可以用约40μL至约50μL的热蜡填充，包括其中的任何和所有子范围，例如约40.1μL、约40.2μL、约40.3μL、约40.4μL、约40.5μL、约41μL、约42μL、约43μL、约44μL、约45μL、约46μL、约47μL、约48μL、约49μL和约50μL。在另一个具体实施中，当模具的每个孔中的蜡是热的时，销可以被推入每个孔中并且在移除销以产生空腔之前将蜡冷却。空腔可具有约10μL至约80μL的范围内的体积，包括其中的任何和所有子范围，例如约11μL、约12μL、约13μL、约14μL、约15μL、约16μL、约17μL、约18μL、约19μL、约20μL、约25μL、约30μL、约40μL、约50μL、约60μL、约70μL和约80μL等。

在一个具体实施中，混合可以包括用多个冻干微球填充空腔。在另一具体实施中，可以用微球填充空腔。可装入空腔的微球的数量取决于微球的几何形状或空腔的大小。例如，可以用约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约40个、约50个或约60个微球等填充空腔。在又一具体实施中，在用微球填充空腔之后，可以用蜡密封空腔。例如，可以将热液态蜡在模具顶部压成平片。在另一个具体实施中，可以将蜡-微球基质冷却并与模具分离。蜡-微球基质的示例示于图13中，其中蜡组分包括约44μL的石蜡，并且用约29个微球填充空腔。

第三方面涉及一种组合物。该组合物包含蜡-微球基质，所述蜡-微球基质包含：蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

这个方面可与先前描述的方面一致。

第四方面涉及一种方法。该方法包括将孔中包含蜡-微球基质的组合物的温度从第一温度升高至第二温度；使液体在所述孔中流动；在所述孔中混合所述组合物和所述液体；以及在从所述蜡-微球基质有效释放一种或多种试剂的条件下，将所述液体的温度从该第二温度降低至第三温度。

这个方面可以根据先前描述的方面来执行。

在一个具体实施中，该蜡-微球基质包含本文所述的组合物。

在一个具体实施中，该第二温度高于约40℃，如本文所述。例如，该第二温度可以介于约40℃与约41℃之间、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃、约100℃、高于约100℃，或适于实现蜡组分熔融的任何温度。在一个具体实施中，该第二温度释放至少一种如本文所述的试剂。在一个具体实施中，该第二温度释放该内部隔室。

在一个具体实施中，该第三温度处于或低于约40℃。在一个具体实施中，该第三温度可以例如介于约0℃与约40℃之间、约39℃、约38℃、约37℃、约36℃、约35℃、约34℃、约33℃、约32℃、约31℃、约30℃、约25℃、约24℃、约23℃、约22℃、约21℃、约20℃、约19℃、约18℃、约17℃、约16℃、约15℃、约10℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、约1℃、约0℃、低于约0℃，或适于实现蜡组分固化的任何温度。在一个具体实施中，该第一温度不同于该第三温度。在一个具体实施中，该第一温度与该第三温度相同。

在一个具体实施中，该混合还包括在该孔中添加水溶液。在一个具体实施中，该混合包括将该组合物与该水溶液混合。

在一个具体实施中，该方法还包括将组合物暴露于一次或多次另外的温度改变以释放至少一种试剂，其中该一次或多次另外的温度改变达到不同于第二温度的温度。在一个具体实施中，该方法还包括将该组合物暴露于一次或多次另外的温度改变以释放至少一种试剂，其中该一次或多次另外的温度改变达到不同于该第三温度的温度。另外的温度改变可以升高或降低温度，并且可以高于或低于第一温度、第二温度和/或第三温度。

在一个具体实施中，该方法还包括在从该蜡-微球基质释放一种或多种试剂后去除该蜡组分。这个步骤可以根据先前描述的方面来执行。

在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程中使用至少一个再水合的冻干微球或一种或多种试剂。例如，该至少一个再水合的冻干微球或该一种或多种试剂可流过流通池。

第五方面涉及一种料筒。该料筒包括试剂贮存器，该试剂贮存器包含蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

这个方面可以根据先前描述的方面来执行。

示例性料筒和构造描述于例如美国专利号8,637,242中，该专利据此全文以引用方式并入。示例性流通池描述于例如美国专利号8,241,573中，该专利据此全文以引用方式并入。

此外或另选地，料筒可以包括用于执行扩增方法和执行检测方法的单独的贮存器和流体系统。能够产生扩增核酸并且还确定核酸序列的整合测序系统的示例包括但不限于MiSeq^TM平台(Illumina,Inc.,San Diego,CA)和在美国专利号8,951,781中所述的装置，该专利据此全文以引用方式并入。

在一个具体实施中，该料筒还包括在该试剂贮存器中的多种蜡-微球基质组合物。

第六方面涉及一种用于控制一种或多种试剂的释放的系统。该系统包括孔；蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂；以及液体。

这个方面可以根据先前描述的方面来执行。

如本文所述的液体可存在于孔中，或另选地，组合物可存在于孔中。在一个具体实施中，该液体在该孔中。在另一个具体实施中，该组合物在孔中。

该系统还可包括温度控制器或传感器。温度控制器可用于改变或调节系统的温度以进一步控制本文所述的条件。例如，温度控制器可用于加速或减慢熔融条件、一个或多个释放条件和/或分离条件。在一个具体实施中，系统包括孔上的温度控制器。例如，温度控制器可包括靠近孔壁的电阻加热器以向其提供热量。温度控制器还可以包括温度传感器。温度控制器还可以包括启动和停止加热器以将孔保持处于特定温度的电路。

应当理解，前述概念和本文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。

在本公开中，参考了形成本公开的一部分的附图，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实施的特定具体实施。详细描述这些实施式案以使本领域的技术人员能够实践本公开，并且应当理解，可利用其他具体实施，并且可在不脱离本公开的范围的情况下作出结构、逻辑和电改变。因此，下面对示例性具体实施的描述不应被理解为限制性的。

本公开可通过参考以下示例进一步说明。

实施例

以下实施例旨在说明，但决不旨在限制如在所附权利要求中阐述的本公开的范围。

实施例1-在蜡中通过微球的基质整体包封进行的改善。

图1A至图1B示出了用含有本文所述的微球的蜡块对现有微球使用情况的改善和缓解。图1A示出了通过静电粘附分散在整个孔中的当前状态的微球。因此，微球位于孔的侧面和顶部，并且孔需要清洗侧面和顶部。图1B示出了使用含有本文所述的微球的蜡块的改善。

实施例2-在蜡中制备微球的基质整体包封的方法。

可通过将微球与熔融蜡(例如，熔融石蜡)组合来产生含有微球的蜡块。将微球和熔融的蜡置于1000rpm的热混合器上以保持微球悬浮。将温度降至40℃以在混合的同时使蜡固化，从而形成蜡-微球基质组合物(例如，蜡块)，如图2A和图2B中所示。如图2C所示提取含微球的蜡块。

还可以通过将干燥的微球分配到孔板中，分配液体状态(温热)或干燥状态(冷)的蜡，在温热的温度下摇动孔板，在温热的温度下离心板，在温热的温度下摇动板，以及在室温下放置板，随后将板落下或翻转以提取块来制备蜡块。这个过程示于图2A至图2C中。

图3示出了用于制备本文所述的蜡块的方法，其示出了微球与蜡在大容器中的混合，从而在水滴在冷却塔中下沉时产生固化的液滴。

实施例3-蜡中微球的基质整体包封的组成。

蜡中微球的基质整体包封的示例(即，蜡-微球基质组合物)示于图4中。基质可以包括一种或多于一种类型的微球。如图4中所示，当在蜡块中存在多种微球类型时，可以基于类型分离这些微球。另选地，多种微球类型(当存在时)可分布在整个蜡块中。

实施例4-再水合蜡-微球基质的方法。

图5A至图5E示出了再水合本文所述的蜡-微球组合物的方法的示例。图5A示出了在约20℃下的蜡-微球基质组合物。图5B示出了在约70℃下的蜡-微球基质。图5C示出了在添加水后在约70℃下的蜡-微球基质组合物，其中在组合物的顶部发现蜡并且微球被再水合。图5D示出了在再水合后且在约20℃下的蜡-微球基质组合物，其中蜡位于组合物的顶部。图5E示出了在微球再水合时从蜡-微球基质组合物中释放的蜡和试剂的分离。

图6A至图6G示出了再水合本文所述的蜡微球-基质组合物的方法的示例。图6A示出了管内的本文所述的蜡-微球基质组合物(例如，“块”或“蜡块”)。图6B示出了蜡-微球基质组合物的蜡组分的熔融。图6C示出了向熔融的蜡-微球基质组合物中添加再水合缓冲液。图6D示出了混合蜡-微球基质组合物的熔融的蜡组分以混合再水合微球。图6E示出了通过用空气向上推动溶液(或物理地翻转孔)来移动蜡组分的一个示例。图6F示出了蜡的固化。图6G示出了拉回空气以滴下试剂(这可以可另选地通过物理地翻转孔来实现)。

图7示出了可根据本文所述的方法、组合物、料筒和系统使用的应用和试剂的示例。

图8示出了可根据本文所述的方法、组合物、料筒和系统使用的应用和试剂的示例。

图9示出了描述本文中所述的方法的一个方面的流程图。该方法包括将包含蜡-微球基质的组合物暴露于第一熔融条件，其中蜡-微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中多个冻干微球包含一种或多种试剂，由此将包含所述蜡-微球基质的组合物暴露于第一熔融条件使蜡组分熔融；将组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球；以及将再水合的冻干微球暴露于分离条件，以从再水合的冻干微球中分离蜡组分。

图10示出了描述本文所述的制备蜡-微球基质的方法的一个方面的流程图。该方法包括在有效形成蜡-微球基质的条件下将多个冻干微球与蜡组分混合，其中多个冻干微球包含一种或多种试剂。

图11示出了描述本文中所述的方法的一个方面的流程图。该方法包括将孔中包含蜡-微球基质的组合物的温度从第一温度升高至第二温度；使液体在孔中流动；在孔中混合组合物和液体；以及在从蜡-微球基质有效释放一种或多种试剂的条件下，将液体的温度从第二温度降低至第三温度。

虽然本文可能已经详细描绘和描述了优选的具体实施，但是对于相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的实质的情况下可以做出各种修改、添加、替换等，因此这些修改、添加、替换等被认为是在如以下权利要求书中所限定的本发明的范围内。

实施例5-制备具有空腔的蜡-微球基质的方法

在一个实施例中，通过用热蜡填充模具的孔，在蜡是热的同时将销推入每个孔中，冷却蜡，并且移除销以在每个孔中产生空腔来制备具有空腔的蜡-微球基质。用微球填充空腔，并且在每个空腔的顶部用压成平片的另外的热液态蜡密封填充的空腔。在冷却后，将组件分离以释放含有微球的每个蜡-微球基质(图12)。具有用冻干微球填充的空腔的蜡-微球基质的示例示于图13中。在图13的示例中，蜡组分包括约44μL的石蜡，并且空腔被大约二十九(29)个微球填充。

Claims (82)

1.一种方法，所述方法包括：

将包含蜡-微球基质的组合物暴露于第一熔融条件，其中所述蜡-微球基质包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂，由此将包含所述蜡-微球基质的所述组合物暴露于所述第一熔融条件使所述蜡组分熔融；

将所述组合物暴露于第一释放条件以再水合至少一个冻干微球；以及

将所述至少一个再水合的冻干微球暴露于分离条件，以从所述至少一个再水合的冻干微球中分离所述蜡组分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一熔融条件包括温度的改变。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一熔融条件包括高于约40℃的温度。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将所述组合物暴露于第二熔融条件以熔融所述蜡组分，其中所述第二熔融条件不同于所述第一熔融条件。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一释放条件包括添加水溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一释放条件包括将所述组合物与所述水溶液混合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中所述内部隔室包含所述一种或多种试剂。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将所述组合物暴露于第二释放条件。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二释放条件释放所述一种或多种试剂。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述第二释放条件不同于所述第一释放条件。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将所述组合物暴露于第三释放条件以释放至少一种试剂，其中所述第三释放条件不同于所述第一释放条件和所述第二释放条件。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述分离条件包括温度的改变。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述分离条件包括处于或低于约40℃的温度。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括：

在所述分离条件之后去除所述蜡组分。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二释放条件释放一种或多种试剂。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述第三释放条件释放一种或多种试剂。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有至少两种不同的试剂。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述多个微球包含多于一种试剂。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述多个微球包含一种试剂。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中将所述组合物暴露于所述第一熔融条件、所述第一释放条件和所述分离条件依序地或按顺序发生。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述至少一个再水合的冻干微球的所述一种或多种试剂流过流通池。

27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括在边合成边测序过程期间使所述至少一个再水合的冻干微球的所述一种或多种试剂流过流通池。

28.一种制备蜡-微球基质的方法，所述方法包括：

在有效形成蜡-微球基质的条件下，将多个冻干微球与蜡组分混合，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蜡-微球基质包含随机分布的所述多个冻干微球。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述蜡-微球基质包含均匀分布的所述多个冻干微球。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述蜡-微球基质处于高于约40℃的温度。

32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括：

降低所述蜡-微球基质的温度以固化所述蜡组分。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述降低所述蜡-微球基质的温度包括处于或低于约40℃的温度。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中所述内部隔室包含所述一种或多种试剂。

35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。

38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂包含至少两种不同的试剂。

39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中所述蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

41.根据权利要求28所述的方法，所述方法还包括：

在模具中形成蜡组分，所述蜡组分包含空腔；以及

在所述混合后用蜡密封所述空腔。

42.根据权利要求41所述的方法，其中混合包括：

用所述多个冻干微球填充所述空腔。

43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述蜡组分的体积在约40μL至约50μL的范围内。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述空腔的体积在约10μL至约80μL的范围内。

45.一种组合物，所述组合物包含：

蜡-微球基质，所述蜡-微球基质包含：蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中所述内部隔室包含所述一种或多种试剂。

47.根据权利要求45或权利要求46所述的组合物，其中所述一种或多种试剂包括样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

49.根据权利要求45至48中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂包含至少两种不同的试剂。

50.根据权利要求45至49中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

51.根据权利要求45至50中任一项所述的组合物，其中所述蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

52.一种方法，所述方法包括：

将孔中包含蜡-微球基质的组合物的温度从第一温度升高至第二温度；

使液体在所述孔中流动；

在所述孔中混合所述组合物和所述液体；以及

在从所述蜡-微球基质有效释放一种或多种试剂的条件下，将所述液体的温度从所述第二温度降低至第三温度。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述蜡-微球基质包含根据权利要求45至51中任一项所述的组合物。

54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述第二温度高于约40℃。

55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述第三温度处于或低于约40℃。

56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述混合还包括在所述孔中添加水溶液。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述混合包括混合所述组合物和所述水溶液。

58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述蜡-微球基质包含多个冻干微球，并且所述多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中所述内部隔室包含所述一种或多种试剂。

59.根据权利要求52至58中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将所述组合物暴露于一次或多次另外的温度改变。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述一次或多次另外的温度改变释放至少一种试剂。

61.根据权利要求59或权利要求60所述的方法，其中所述一次或多次另外的温度改变达到不同于所述第二温度的温度。

62.根据权利要求52至61中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将所述组合物暴露于一次或多次另外的温度改变以释放至少一种试剂，其中所述一次或多次另外的温度改变达到不同于所述第三温度的温度。

63.根据权利要求52至62中任一项所述的方法，所述方法还包括：

在从所述蜡-微球基质释放一种或多种试剂后去除所述蜡组分。

64.根据权利要求52至63中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

65.根据权利要求52至64中任一项所述的方法，其中所述一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

66.根据权利要求58至65中任一项所述的方法，其中所述多个冻干微球包含一种或多种干试剂、一种或多种小珠、一种或多种粉末、一种或多种饼或它们的任何组合。

67.根据权利要求52至66中任一项所述的方法，其中所述第一温度不同于所述第三温度。

68.根据权利要求52至66中任一项所述的方法，其中所述第一温度与所述第三温度相同。

69.根据权利要求52至68中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述一种或多种试剂流过流通池。

70.根据权利要求69所述的方法，所述方法还包括在边合成边测序过程期间使所述一种或多种试剂流过流通池。

71.一种料筒，所述料筒包括：

试剂贮存器，所述试剂贮存器包含蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂。

72.根据权利要求71所述的料筒，其中所述多个冻干微球中的至少一个冻干微球包含围绕内部隔室的壳，其中所述内部隔室包含所述一种或多种试剂。

73.根据权利要求71或权利要求72所述的料筒，其中所述一种或多种试剂包含样品制备试剂、样品提取试剂、文库制备试剂、富集试剂、成簇试剂、测序试剂或它们的任何组合。

74.根据权利要求71至73中任一项所述的料筒，其中所述一种或多种试剂选自一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。

75.根据权利要求71至74中任一项所述的料筒，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有至少两种不同的试剂。

76.根据权利要求71至75中任一项所述的料筒，其中所述一种或多种试剂包含多种试剂，其中所述多种试剂含有与至少一种其他试剂相同的至少一种试剂。

77.根据权利要求71至76中任一项所述的料筒，其中所述蜡组分包含选自以下的蜡：鲸蜡、日本蜡、石蜡、纯地蜡、地蜡、蜂蜡、小烛树蜡、褐煤蜡、巴恩斯达尔蜡、小冠椰子蜡、巴西棕榈蜡或它们的任何组合。

78.根据权利要求71至77中任一项所述的料筒，所述料筒还包括：

所述试剂贮存器中的多种蜡-微球基质组合物。

79.一种用于控制一种或多种试剂的释放的系统，所述系统包括：

孔；

蜡-微球基质组合物，所述蜡-微球基质组合物包含蜡组分和多个冻干微球，其中所述多个冻干微球包含一种或多种试剂；以及

液体。

80.根据权利要求79所述的系统，其中所述液体在所述孔中。

81.根据权利要求79或权利要求80所述的系统，其中所述组合物在所述孔中。

82.根据权利要求79至81中任一项所述的系统，所述系统还包括：

所述孔上的温度控制器。