CN117804876B

CN117804876B - 一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法

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Publication number: CN117804876B
Application number: CN202410233835.5A
Authority: CN
Inventors: 宋鑫; 宋玉莹; 李硕
Original assignee: Dezhou Guoke Medical Technology Co ltd
Current assignee: Dezhou Guoke Medical Technology Co ltd
Priority date: 2024-03-01
Filing date: 2024-03-01
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2044-03-01
Also published as: CN117804876A

Abstract

本发明涉及一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法，属于细胞染色技术领域，包括以下原料：改性叶酸、亚甲基蓝、氢氧化钠、吐温80、抗坏血酸、羧甲基壳聚糖、葡萄糖、中性红、冰乙酸、过氧化氢溶液和无菌去离子水。使用改性叶酸、亚甲基蓝、吐温80和羧甲基壳聚糖等成分制备了新型人体上皮组织肿瘤细胞染色液，通过对叶酸进行改性和形成钠盐的方式，使其具有良好的水溶性。在壳聚糖上接枝亲水性官能团，提高其亲水性，避免了传统染色液中溶剂的使用，降低了染色液在应用于人体时产生的刺激性，降低了不适感。所制得的染色液具有操作简便、识别率高，使用无刺激，稳定性好，储存时间长等特点。

Description

一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞染色制备技术领域，具体为一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法。

背景技术

宫颈癌是妇科最常见疾病，对女性危害仅次于乳腺癌，且为目前唯一已知发病原因的恶性肿瘤。其发病机制主要由人类乳头瘤病毒(HPV)以表皮接触式进行传播，持续的HPV 感染可以使HPV与宫颈上皮细胞的DNA整合，转录产生致癌蛋白，引起宫颈上皮细胞异常增生，导致癌变。宫颈病变是子宫颈的癌前病变，早期对于宫颈病变进行诊断并给予适当治疗可以降低宫颈癌的发生率。

传统宫颈病检测借助病理检查及PCR技术，尚不能在宫颈检查当时得出结果，做出初步判断，且液基细胞学(TCT)结合HPV检测价格较高，不便于门诊就诊患者及体检患者的常规筛查和及时分流。目前还有一些针对肿瘤细胞的多种染色法可以检测出细胞的良恶性程度，常见的有乙酸白化反应，碘实验、吖啶橙荧光染色等，有不同的优缺点，比如溶剂易挥发，反应较慢，虽灵敏度高，但特异性低等。

叶酸受体介导的宫颈特殊染色法(FRD)是一种近些年才应用于临床的人体上皮组织肿瘤细胞的活细胞染色诊断技术，由叶酸及其衍生物、亚甲基蓝等组成，其原理是利用肿瘤细胞表面叶酸受体高表达和细胞内处于高氧化应激状态这两个特征，用叶酸衍生物包裹还原态亚甲蓝(黄棕色)制成活细胞染色剂，染色剂被肿瘤细胞摄取后，叶酸衍生物参与代谢，还原态亚甲蓝被氧化后(蓝色)逸出细胞外，通过观察检测前后染色液颜色的变化，医生可以实时对宫颈是否有异常病变直接给出判断。亚甲基蓝对肿瘤细胞及黑色素有高度亲和性，其氧化还原性使亚甲基蓝在肿瘤组织的氧化还原态中表现不同的变色反应光谱。但现有的FRD染色液稳定性有限，识别率低，且暴露在空气中的还原态亚甲基蓝极易被氧化显色，影响生产过程及检测结果的准确性，导致产品质量参差不齐；此外，该类染色剂需涂抹于人体组织，染色液常用的溶剂如二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇等都存在一定的毒性作用，其中DMSO可以与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感。

为此需要一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法，以改善临床使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液及其制备方法，以解决背景技术中提出的问题。使用改性叶酸、亚甲基蓝、吐温80和羧甲基壳聚糖等成分制备了新型人体上皮组织肿瘤细胞染色液，通过对叶酸进行改性和形成钠盐的方式，使其具有良好的水溶性。在壳聚糖上接枝亲水性官能团，提高其亲水性，避免了传统染色液中二甲基亚砜、丙二醇等溶剂的使用，降低了染色液在应用于人体时产生的刺激性，降低了不适感。所制得的染色液具有操作简便、识别率高，使用无刺激，稳定性好，储存时间长等特点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，包括以下质量份原料：

0.1-12份改性叶酸、0.1-2份亚甲基蓝、0.05-14份氢氧化钠、5-20份吐温80、2-20份抗坏血酸、0.1-12份羧甲基壳聚糖、5-30份葡萄糖、0.02-0.5份中性红、0.02-0.1份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和30份无菌去离子水。

进一步地，所述细胞染色液包括以下质量份原料：

2-8份改性叶酸、0.5-1.3份亚甲基蓝、3-10份氢氧化钠、5-20份吐温80、2-20份抗坏血酸、0.1-12份羧甲基壳聚糖、10-25份葡萄糖、0.2-0.3份中性红、0.03-0.06份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和30份无菌去离子水。

进一步地，所述细胞染色液包括以下质量份原料：

6.0份改性叶酸、1.0份亚甲基蓝、6.5份氢氧化钠、13.0份吐温80、10.0份抗坏血酸、6.0份羧甲基壳聚糖、20份葡萄糖、0.23份中性红、0.05份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和30份无菌去离子水。

进一步地，改性叶酸由以下步骤制得：

A1、将0.585g 0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸和0.0876g 0.05mol/L NaCl加入30mL无菌去离子水中，使用NaOH溶液调节体系pH值为5.1，得到2-吗啉乙磺酸缓冲液，备用；

A2、将叶酸、EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和盐酸多巴胺溶解在10mL 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在室温和惰性气体氛围下充分搅拌24小时，即得改性叶酸。

上述反应过程中，利用EDC/NHS体系对叶酸中羧基进行活化并与盐酸多巴胺上的氨基进行反应生成酰胺键，从而将盐酸多巴胺上的邻苯二酚基团接枝在叶酸末端。

进一步地，A2步骤中，叶酸和盐酸多巴胺的质量比为(0.1-1.0)g：(0.1-2.0)g。

一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液的制备方法，包括以下制备步骤：

S1、称取配方份亚甲基蓝加入无菌去离子水中，在室温条件下搅拌均匀后加入部分吐温80，添加量为配方份质量的6%，随后继续搅拌至均匀后加入抗坏血酸、羧甲基壳聚糖、葡萄糖组分，搅拌均匀后静置15分钟，得到亚甲基白水溶液；

S2、将改性叶酸、剩余吐温80、氢氧化钠加入无菌去离子水中，在室温下搅拌均匀后与步骤S1中获得的亚甲基白水溶液以30rpm速率搅拌，并在搅拌过程中滴加冰乙酸调节体系pH值为5.8-6.8后，边震荡边滴加5%过氧化氢直至体系中蓝色、墨绿色或紫黑色消失，随后加入中性红，继续搅拌至均匀，得到染色液；

S3、将S2步骤中得到的染色液使用紫外灭菌器灭菌后的一体式分泌物预处理采样容器进行封装，使用铝箔袋密封保存，即得一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液。

上述反应过程中，使用亚甲基蓝在体系中制得亚甲基白溶液，随后与改性叶酸等组分混合制备染色液；改性叶酸上末端的羧基更容易被反应，所以使用氢氧化钠与改性叶酸形成叶酸钠盐，使改性叶酸易溶于水。由于邻苯二酚基团具有还原性，容易使亚甲基白变蓝，所以使用过氧化氢强氧化剂增加亚甲基蓝中亚甲基的氧化程度，并且将邻苯二酚大部分氧化成邻苯二酚醌，降低体系中邻苯二酚基团的浓度，避免亚甲基白被还原。

进一步地，步骤S1中亚基甲蓝与吐温80的质量比为1：(3-5)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明技术方案中，使用改性叶酸、亚甲基蓝、吐温80和羧甲基壳聚糖等成分制备了新型人体上皮组织肿瘤细胞染色液，通过对叶酸进行改性和形成钠盐的方式，使其具有良好的水溶性。在壳聚糖上接枝亲水性官能团，提高其亲水性，避免了传统染色液中二甲基亚砜、丙二醇等溶剂的使用，降低了染色液在应用于人体时产生的刺激性，降低了不适感。所制得的染色液具有操作简便、识别率高，使用无刺激，稳定性好，储存时间长等特点；

使用盐酸多巴胺对叶酸进行改性，使得叶酸表面含有邻苯二酚基团。盐酸多巴胺是一种具有低过敏风险的物质，应用于人体组织可以很快被代谢，具有较高的安全性，并且邻苯二酚基团具有较高的极性可以增加其在无菌去离子水体系中的溶解度，已达到与亚甲蓝成分相容性更好和更快接近肿瘤细胞的效果，并且部分经过氧化邻苯二酚基团会以邻苯二酚醌的形式与肿瘤细胞表面蛋白质中的活性胺个硫代烷基通过迈克尔加成的方式与其结合，使得蛋白质变性、起到固定细胞的作用，防止肿瘤细胞溶解，达到更精确的检测效果；

亚甲基蓝在氢氧化钠体系中，其上的亚甲基基团被氧化成亚胺基团，形成亚甲基白溶液；改性叶酸上末端的羧基更容易被反应，所以使用氢氧化钠与改性叶酸形成叶酸钠盐，使改性叶酸易溶于水。由于邻苯二酚基团具有还原性，容易使亚甲基白变蓝，所以使用过氧化氢强氧化剂增加亚甲基蓝中亚甲基的氧化程度，并且将邻苯二酚大部分氧化成邻苯二酚醌，降低体系中邻苯二酚基团的浓度，避免亚甲基白被还原。此外，配方中使用的吐温80成分属于两亲型表面活性剂，具有较强的增溶性，能有效提高叶酸及亚甲基蓝的溶解，促进结合，加强氧化还原反应的稳定性。在储存过程中体系中余下的邻苯二酚基团可以保护亚甲蓝白，避免其被环境氧化，提高其贮存稳定和使用稳定性；

壳聚糖经羧甲基化改性后，提高了水溶性，尤其是在中性和碱性溶液中的溶解性显著增强，使其具有成膜、增稠、保湿、螯合等的特性。体系中的邻苯二酚和邻苯二酚醌基团可以与羧甲基壳聚糖通过氢键相互作用具有良好的相容性，染色过程中羧甲基壳聚糖和改性叶酸可以利用其含有的亲水基团，与亲水性较强的肿瘤细胞接触，增加染色液在细胞膜上的渗透性。并且正常细胞具有天然的疏水性，可以降低非癌变上皮细胞对染料的非特异性积累，增加染料的精确度。并且，由于有机大分子吐温80可以提高细胞膜的水通量，也可以促进染色液与肿瘤细胞更加充分的结合，对于处在N/A瘤变期的上皮细胞也具有更好的检测效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例和对比例中所用试剂均为分析级，盐酸多巴胺由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，CAS号为62-31-7。

实施例1、改性叶酸由以下步骤制得：

A2、将0.1g叶酸、0.192g EDC、0.115g N-羟基琥珀酰亚胺和0.1g盐酸多巴胺溶解在10mL 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在室温和N₂气体氛围下充分搅拌24小时，即得改性叶酸。

实施例2、改性叶酸由以下步骤制得：

A2、将0.66g叶酸、0.192g EDC、0.115g N-羟基琥珀酰亚胺和0.95g盐酸多巴胺溶解在10mL 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在室温和N₂气体氛围下充分搅拌24小时，即得改性叶酸。

实施例3、改性叶酸由以下步骤制得：

A2、将1g叶酸、0.192g EDC、0.115g N-羟基琥珀酰亚胺和2g盐酸多巴胺溶解在10mL 2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在室温和N₂气体氛围下充分搅拌24小时，即得改性叶酸。

实施例4、一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，包括以下质量份原料：

0.1份实施例1中制备的改性叶酸、0.1份亚甲基蓝、0.05份氢氧化钠、5份吐温80、2份抗坏血酸、0.1份羧甲基壳聚糖、5份葡萄糖、0.02份中性红、0.02份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和无菌去离子水。

其制备方法包括以下步骤：

S1、称取配方份原料，随后将亚甲基蓝加入10份无菌去离子水中，在室温条件下搅拌均匀后加入0.3份吐温80，继续搅拌至均匀后加入抗坏血酸、羧甲基壳聚糖、葡萄糖组分，搅拌均匀后静置15分钟，得到亚甲基白水溶液；

S2、将实施例1中制备的改性叶酸、剩余4.7份吐温80、氢氧化钠加入30份无菌去离子水中，在室温下搅拌均匀后与步骤S1中获得的亚甲基白水溶液以30rpm速率搅拌混合，并在搅拌过程中滴加冰乙酸调节体系pH值为5.8后，边震荡边滴加5%过氧化氢直至体系中蓝色、墨绿色或紫黑色消失，随后加入中性红，继续搅拌至均匀，得到染色液；

实施例5、本实施例与实施例4的区别在于，细胞染色液包括以下质量份原料：

6.0份实施例2中制备的改性叶酸、1.0份亚甲基蓝、6.5份氢氧化钠、13.0份吐温80、10.0份抗坏血酸、6.0份羧甲基壳聚糖、20份葡萄糖、0.23份中性红、0.05份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和无菌去离子水；S1步骤中，亚基甲蓝与吐温80的质量比为1：4；S2步骤中，使用冰乙酸调节体系pH值为6.3。

实施例6、本实施例与实施例4的区别在于，细胞染色液包括以下质量份原料：

12份实施例3中制备的改性叶酸、2份亚甲基蓝、14份氢氧化钠、20份吐温80、20份抗坏血酸、12份羧甲基壳聚糖、30份葡萄糖、0.5份中性红、0.1份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和无菌去离子水；S1步骤中，亚基甲蓝与吐温80的质量比为1：5；S2步骤中，使用冰乙酸调节体系pH值为6.8。

对比例1

本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中不对叶酸进行改性，配方中不添加过氧化氢组分。

对比例2

本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中不在配方中添加吐温80组分。

对比例3

本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中不在配方中添加羧甲基壳聚糖组分。

现对实施例4-6和对比例1-3中制备的细胞染色液进行储存稳定性测试。将实施例4-6和对比例1-3中制备的染色液样品在阴凉干燥处避光密封储存48小时，随后观察染色液外观变化，并检测其中pH值变化，以判断细胞染色液的储存稳定性。每个样品获得五个读数并取平均值，测试结果如下表1所示。

表1实施例4-6和对比例1-3中制备的细胞染色液储存稳定性测试

。

由表1中的结果可知，实施例4-6中制备的细胞染色液都具有良好的贮存稳定性，pH基本无变化。由对比例1中的结果可知，染色液中还原性质的亚甲蓝已经被氧化，染色液显示蓝色，pH值由于亚甲蓝分解降低。由对比例2和3中的结果可知，吐温80和羧甲基壳聚糖组分的使用与改性叶酸在提高染色液储存稳定性方面具有协同作用。

现在对实施例4-6和对比例1-3中制备的细胞染色液进行检测准确率测试。通过420例排除宫颈表面出血或有出血倾向、有宫颈手术或子宫切除史、妊娠及其他肿瘤病史的临床病例进行测试。将病例分别分为6组，使用实施例4-6和对比例1-3中制备的染色液检测试剂盒进行检测，检测完毕后使用HPV E6/E7检测试剂盒再次进行检测，HPV E6/E7检测的试剂盒和采样耗材由美国豪洛捷公司提供，使用无菌子宫颈刷在宫颈表面顺时针方向轻柔旋转５圈，然后将刷头折断放入专用保存液中，密封后送实验室，根据试剂盒说明书进行检测，若检测中有任何一项为阳性的病例均进行阴道镜检查，并在镜下取多点病理活检，如阴道镜检查不满意同时进行宫颈管诊刮，病理诊断结果使用 CIN命名系统，诊断结果包括：N/A(无异常病变或炎症)、CIN1(轻度非典型增生)、CIN2(中度非典型增生)、CIN3(重度非典型增生及原位癌)、CA(浸润癌)，在CIN2及以上判读为阳性。

其中，本发明中细胞染色液检测步骤为：

1.放置阴道扩张器，暴露宫颈口；

2.撕开铝箔袋，取出一体式分泌物预处理采样装置，打开容器，使上皮组织染色液完全潜入到下部棉签套管中；

3.待溶液完全流出，棉签充分吸取溶液后，然后用力在宫颈附近上皮组织表面涂抹3-5圈，在涂抹过程中稍压尾管补充棉签溶液，最后在宫颈口按压3-5秒；

4.立即取出棉签，对照比色卡立刻观察并记录颜色，存留于上皮组织的多余液体，用干棉签擦干。

对检测结果进行记录，阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%，阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。测试结果如下表2所示。

表2实施例4-6和对比例1-3中染色剂试剂盒检测准确率测试

由表2中的结果可知，实施例4-6中制备的细胞染色液在检测CIN2、CIN3和CA患者的准确率上都表现良好。由对比例1-3和HPV E6/E7的结果可知，检测液对N/A患者的检测准确度不是很高，偏差较为严重。经过对叶酸的改性和吐温80、羧甲基壳聚糖成分的协同作用下，可以利用炎症细胞与肿瘤细胞相同的亲水性高的特点，和蛋白质表达水平较高的特点，促进与细胞蛋白质结合，对N/A患者的检测准确度更高。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，其特征在于，包括以下质量份原料：

0.1-12份改性叶酸、0.1-2份亚甲基蓝、0.05-14份氢氧化钠、5-20份吐温80、2-20份抗坏血酸、0.1-12份羧甲基壳聚糖、5-30份葡萄糖、0.02-0.5份中性红、0.02-0.1份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和30份无菌去离子水；其中，改性叶酸由以下步骤制得：

A1、将2-吗啉乙磺酸和NaCl加入无菌去离子水中，使用NaOH溶液调节体系pH值为5.1，得到2-吗啉乙磺酸缓冲液，备用；

A2、将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和盐酸多巴胺溶解在2-吗啉乙磺酸缓冲液中，在室温和惰性气体氛围下充分搅拌24小时，即得改性叶酸；

其中，使用过氧化氢控制体系中亚甲基蓝的氧化程度，并且将邻苯二酚大部分氧化成邻苯二酚醌，降低体系中邻苯二酚基团的浓度，避免亚甲基白被还原。

2.根据权利要求1所述的一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，其特征在于，所述染色液包括以下质量份原料：

3.根据权利要求1所述的一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，其特征在于，所述染色液包括以下质量份原料：6.0份改性叶酸、1.0份亚甲基蓝、6.5份氢氧化钠、13.0份吐温80、10.0份抗坏血酸、6.0份羧甲基壳聚糖、20份葡萄糖、0.23份中性红、0.05份冰乙酸、若干份过氧化氢溶液和30份无菌去离子水。

4.根据权利要求1所述的一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液，其特征在于，A2步骤中，叶酸和盐酸多巴胺的质量比为(0.1-1.0)g：(0.1-2.0)g。

5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的叶酸受体介导上皮组织细胞染色液的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

S1、称取配方份亚甲基蓝加入无菌去离子水中，在室温条件下搅拌均匀后加入部分吐温80，继续搅拌至均匀后加入抗坏血酸、羧甲基壳聚糖、葡萄糖组分，搅拌均匀后静置，得到亚甲基白水溶液；

S2、将改性叶酸、剩余吐温80、氢氧化钠加入无菌去离子水中，在室温下搅拌均匀后与步骤S1中获得的亚甲基白水溶液搅拌混合，并在搅拌过程中滴加冰乙酸调节体系pH值为5.8-6.8后，边震荡边滴加过氧化氢直至体系中蓝色、墨绿色或紫黑色消失，随后加入中性红，继续搅拌至均匀，得到染色液；

6.根据权利要求5所述的一种叶酸受体介导上皮组织细胞染色液的制备方法，其特征在于，步骤S1中，亚基甲蓝与吐温80的质量比为1：(3-5)。