CN117769438A - 包含不可吸收或可缓慢吸收聚合物的组织充填用衍生化或可快速聚合胶原蛋白组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了组织充填用衍生化或可快速聚合胶原蛋白组合物，其包含不可吸收或可缓慢吸收的聚合物。还提供了制备所述组合物的方法，以及用所述组合物充填软组织的方法。

Description

包含不可吸收或可缓慢吸收聚合物的组织充填用衍生化或可 快速聚合胶原蛋白组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年5月13日提交的美国临时申请号63/188,261的优先权，其通过引用全部纳入本文用于所有目的。

技术领域

本发明描述了采用可注射的衍生化胶原蛋白基制剂或可原位聚合的胶原凝胶来充填软组织的组合物。可溶性衍生化胶原组合物或可原位聚合的胶原凝胶可包含胶原纤维，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球，或包含或由聚乙二醇(PEG)组成的可缓慢吸收生物球，或聚丙交酯(PLA)和聚乳酸(PLG)聚合物和其共聚物(PLGA)的球，或包含或由其他聚合物组成的粒子(granule)，所述其他聚合物为例如，L-丙交酯/三甲基碳酸酯或羟基磷灰石钙球或聚(ε-己内酯)(PCL)球或聚对二氧环已酮(PDO)球。

衍生化的胶原组合物或可原位聚合胶原凝胶提供不同程度的体内耐久性(longevity)，这取决于纤维状胶原蛋白的稳定性和/或球形颗粒、粒子或纳米颗粒的生物降解特征。

背景技术

生物可吸收材料在面部软组织充填中的应用可追溯至20世纪80年代初，其时牛胶原蛋白被引入到纹路、皱纹和体积缺陷的处理中。自此以后，已批准了多种非永久性、可吸收性皮肤填充物和面部植入物，且它们在世界范围内被使用(例如透明质酸、胶原和猪小肠黏膜下层)。也已开发了半永久和永久皮肤填充物。半永久材料包括羟基磷灰石和聚L-乳酸。不可吸收性材料，例如PMMA微球和PTFE面部植入线也已被用于矫正面部缺陷。

胶原蛋白基组合物是众所周知的皮肤填充物，并已由Cockerham和Hsu(FacialPlastic Surgery,25:106-113,2009)以及Denton和Shoman(Office Based CosmeticProcedures&Technology,Section 3,pp 59-64,2010)充分综述。可注射胶原蛋白皮肤填充物包括牛源性Zyderm和Zyplast，人细胞源性胶原蛋白，Cosmoderm和Cosmoplast，人组织源性Autologen、Dermalogen和Cymetra，猪源性Evolence，以及最近的快速聚合胶原凝胶，这些凝胶在植入组织后清晰透明并迅速形成胶原纤维(见美国专利号10,111,981)。这些胶原蛋白基皮肤填充产品包含可注射胶原纤维。

Artefill(现在为Bellafill)是一种永久皮肤填充物，其含有与变性胶原蛋白载体组合的PMMA球。有数篇印刷出版物描述了该产品(见参考文献)。Derma Veil(Tagle等)是乙醇酸和聚乳酸组合的产品。聚乳酸和乙醇酸共同协作以1)刺激胶原蛋白的产生；2)为皮肤外层补水(Tagle等)。该组合不包含胶原蛋白载体。

本发明描述了化学衍生化胶原或可快速聚合胶原凝胶作为完整胶原蛋白原纤维(fibril)/纤维(fiber)、PMMA、PEG和PLGA球和颗粒的载体的应用。

虽然Miyata(美国专利4,164,559)和DeVore等(美国专利4,713,446、4,851,513、4,969,912、5,067,961、5,104,957、5,201,764、5,219,895、5,332,809、5,354,336、5,476,515、5,480,427、5,631,243和6,161,544)都已描述了化学衍生化胶原蛋白组合物的制备，但这些公开无一教导了衍生化胶原蛋白组合物用作皮肤填充物或作为PMMA、PEG、PLG和类似合成组合物的球体和颗粒的载体的应用。美国专利No.10,111,981中描述了可快速聚合胶原凝胶的制备。

发明内容概述

本发明涉及用于软组织充填(augmentation)和组织再生的可注射化学衍生胶原溶液或可快速聚合胶原凝胶，其包含胶原纤维、非生物可吸收PMMA微球(32-50μm直径)，或可缓慢吸收的PGA或L-丙交酯/D-丙交酯或L-丙交酯/乙交酯共聚物PLGA(20-50μm直径)或羟基磷灰石钙球或聚ε-己内酯(PCL)球或聚对二氧环已酮(poly(p-dioxanone，PDO)球。

化学衍生化胶原蛋白或可快速聚合胶原凝胶可由牛、猪或人胶原包括重组人胶原溶液制得。

该组合物可通过25-30号针头注射到真皮和皮下组织中，以补充或矫正诸如与皱纹和褶皱相关的皮肤组织缺陷。

附图简要说明

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式和附图，其中：

图1：实施例2中可溶性胶原蛋白溶液的原纤维形成过程中的光吸收变化。

图2：戊二酸酐改性的胶原蛋白(GA-胶原蛋白)的SDS-PAGE显示各条带的分子量均增加(泳道1：标志物，泳道2：3mg/mL牛去端肽胶原蛋白标准品，泳道3&4：猪去端肽胶原蛋白，泳道5：GA-胶原蛋白)。

图3：戊二酸酐改性的胶原蛋白(GA-胶原蛋白，左)、可快速聚合胶原蛋白(RPC，中)和GA-胶原蛋白与RPC的1:1(v:v)混合物(GA-胶原蛋白+RPC，右)的外观。

图4：RPC(上)和GA-胶原蛋白+RPC(下)的体外原纤维形成显示该组合的纤维单元比单独的RPC更厚。

图5：兔耳内RPC(20％重量的纤维状胶原蛋白)的体内原纤维形成：RPC植入兔耳5分钟的TEM(中切)，D条带显示胶原蛋白分子的自组装。

具体实施方式

以下描述和实施例详细说明了本发明的实施方式。应理解，本发明并不限于本文所述的特定实施方式，并因此可以改变。本领域技术人员将认识到的是，本发明存在许多变化和修改，而它们都包含在本发明范围内。

所有专利、专利申请和参考文献通过引用以其全文纳入本文。

本发明提供了具有塑性特征的生物相容性胶原反应(collagenous reaction)产品，该产品通过将乙烯基化不饱和或聚合性取代基掺入胶原蛋白来形成。这些取代基通过将适合的胶原蛋白与包含乙烯部分的酰化剂或富含酰化基团的聚合物反应掺入。在所得胶原蛋白溶液中补充不可降解的PMMA球或可缓慢降解的球，例如由聚乙二醇或丙交酯和乙交酯共聚物组成的可缓慢降解的球。

本文中还可采用可快速聚合胶原(RPC)凝胶，例如US10,111,981B2中所描述的那些。RPC可包含中性溶液，该溶液包含酸溶性胶原蛋白、EDTA和多元醇，且其中该酸溶性胶原包括选自下组的胶原蛋白：I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及其组合。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所适用领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但是描述了优选的方法和材料。

本文所用术语“一个”或“一种”旨在表示“一个(种)”或“多个(种)”(即，至少一个(种))该冠词在语法上的宾语。除非上下文中另有定义，否则单数表述包括复数表述。例如，“一(种)要素/元素”表示一个(种)要素/元素或者多于一个(种)要素/元素。

“约”或“大约”意指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度相对于参比数量、水平、数值、数目、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度的差异可达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

除非另有说明，否则“或”表示“和/或”。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”应理解为暗示包括规定步骤或要素或者步骤组或要素组，并且不排除任何其他步骤或要素或步骤组或要素组。

短语“由......组成”旨在包括且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”是指示所列出要素是必需的或强制性的，并且可以存在其他要素。

如本文所用，术语“生物相容性”是指根据本发明改性的胶原蛋白(即胶原反应产物，collagenous reaction product)或根据本发明调配的胶原蛋白组合物，其在掺入或植入对象生物组织或放置于对象生物组织附近时是稳定的，在所述掺入、植入或放置后不会诱发免疫应答或有害的组织反应或不会随时间而明显劣化。

如本文所用，术语“可注射胶原蛋白组合物”是指可注射的化学改性的生物相容性胶原蛋白组合物以及补充有非生物可吸收性或可吸收性微球的此类组合物，其在注射入组织时，充填缺陷的组织，例如皮肤纹路和褶皱。术语“生物相容性”是指根据本发明调配的胶原蛋白组合物，其在掺入或植入对象生物组织或放置于对象生物组织附近时，在所述掺入、植入或放置后不会诱发免疫应答或有害的组织反应或不会随时间而明显劣化。

DeVore等(美国专利4,713,446和4,851,513)以及Miyata等(美国专利4,748,152)已开发出了胶原蛋白基粘弹性溶液，其中所述胶原蛋白在赖氨酰氨基酸处衍生以提高其在中性pH时的可溶性。DeVore等(美国专利10,111,981)中描述了胶原凝胶的制备和一般应用，所述胶原凝胶在植入组织后立即形成胶原纤维单位。

DeVore等(同上)教导了生产适用于粘弹性溶液的胶原蛋白的方法，所述方法用单官能和双官能试剂的组合使胶原的赖氨酰氨基酸酰化。该酰化处理的结果是一些胶原蛋白赖氨酸氨基基团被修饰以羧酸基代替碱性氨基功能。赖氨酸氨基残基与同一或相邻胶原蛋白分子的赖氨酸氨基共价连接。粘弹性溶液通过在生理盐水溶液中重构这种衍生的胶原蛋白而产生。

使胶原溶解的优选酰化反应教导于美国专利4,851,513和4,713,446。同样优选的是采用戊二酸酐的酰化(反应pH为约7.0-约9.0)。

酰化剂的有效量将在有限范围内变化，但通常包括占溶液中胶原总量的约0.5-约20重量％，优选占溶液中胶原总量的约5-约10重量％。酰化剂的有效量将基于溶液中胶原蛋白的总量。

胶原蛋白的酰化在碱性pH下进行，例如在约8.0-约10.0pH、优选约9.0pH等pH下进行。为了实现完全酰化所处理的胶原蛋白，应过滤和溶解胶原蛋白，完全酰化是有利的，因其会使最终成形的植入物具有更好的性能，即更好地将所掺入单体的特性赋予最终的植入物)。可采用常规过滤装置(例如孔径3μm的密理博(millipore)过滤器)过滤胶原蛋白，以去除杂质和污染物。然后可以将过滤后的胶原蛋白溶于(即溶解或分散)合适的蛋白水解溶液中，例如胃蛋白酶。

还发现胶原蛋白和酰化剂之间的反应可能需要多于一个反应“轮次”。即可以在初始反应混合物(即初始胶原蛋白和初始酰化剂)中添加额外的酰化剂，以继续反应直至完成，即完全酰化所处理的胶原蛋白。

胶原蛋白酰化的反应时间可根据很多因素发生变化，这些因素包括(仅例举几个因素)：待酰化的胶原蛋白量、酰化剂的类型、反应混合物的pH和温度等。此外，将酰化剂添加到合适胶原蛋白的方法也会影响反应时间。例如，添加固体形式的酰化剂或合适溶液形式的酰化剂会分别延长和缩短反应时间。添加固体或粉末形式的酰化剂所需的反应时间通常更长。

通常，酰化反应应当在约5-约90分钟、优选约20-约40分钟内完全进行。酰化反应通常应在约4-约37℃、优选约4-25℃的温度下进行。

可通过pH的降低来监控酰化反应。当pH稳定在9.0时，完全反应。还可通过取出等份样品并测试沉淀和洗涤的胶原蛋白产物中游离氨基的浓度来监控酰化反应。

可将pH调整到12.0、持续2分钟破坏酰化剂，从而终止反应。然后通过用盐酸、乙酸、硝酸、硫酸或其他酸降低pH，使改性胶原蛋白沉淀。

所加酸的量应足以使得反应混合物的pH跌至低于pH 5.0，优选约pH 4.0-约4.5等。当在混合物中加入酸时，建议分少量加入，例如逐滴，混合物应变得浑浊，表明当改性或经反应的胶原蛋白“从溶液中析出”时胶原蛋白混合物向酸性pH的改变。

本发明化学改性胶原蛋白组合物的生物稳定性可受起始胶原蛋白溶解特性和化学改性程度的影响。在实验室测试条件下，完全溶解的改性胶原蛋白通常不会产生抗高浓度中性蛋白水解酶的组合物。因此，在实施本发明时，在化学改性之前，将溶解的胶原蛋白溶液转化为部分纤维状胶原蛋白。化学改性部分纤维状胶原蛋白溶液产生澄清、透明且可注射的改性胶原蛋白组合物。使用部分原纤维化的胶原蛋白作为改性过程的优选起始材料使得可注射组合物的抗中性蛋白水解酶(如胰蛋白酶)降解能力改进。

为了制备部分原纤维化的胶原蛋白溶液，将溶解的胶原蛋白溶液的pH调整到约7.0-7.6、优选约7.4，并允许其在约25-40℃、优选约37℃的温度下进行时长为约10-30分钟、优选约20分钟的受限的原纤维形成。

原纤维形成的程度可以通过吸收光谱测量溶解的胶原蛋白溶液的浊度或光吸收增加来确定(例如，如图1所示)。一般来说，允许原纤维形成继续进行，直到溶液的浊度比初始溶液的吸光度增加约20％-60％，优选增加约25％。

化学改性后，部分纤维状胶原蛋白组合物失去其浊度，变得澄清且透明。在化学修饰的部分纤维状胶原蛋白溶液中，胶原蛋白微原纤维不能再在显微镜下观察到。据信改性的部分纤维状胶原蛋白溶液包括改性的胶原蛋白分子和含有胶原蛋白分子的改性胶原蛋白聚集体

已采用酰化反应来衍生溶解和非溶解性胶原蛋白，且在DeVore等的系列专利(美国专利4,713,446；4,851,513；4,969,912；5,067,961；5,104,957；5,201,764；5,219,895；5,332,809；5,354,336；5,476,515；5,480,427；5,631,243；和6,161,544)中已有描述。然而，这些专利都没有描述化学衍生的胶原蛋白与不可吸收或可缓慢吸收的物质诸如PMMA球、PLG球或颗粒，或其他不可吸收或可缓慢吸收的颗粒或球组合使用以治疗软组织缺陷或缺损。

在本发明中，使用与去质子化游离胺，特别是赖氨酸上的游离胺反应的试剂，酰化反应已用于衍生可溶性胶原蛋白。磺酸、酸酐、磺酰氯和酸性氯化物是能够与蛋白质的游离胺反应以使得特定化学部分与蛋白质共价附着的化合物类型。这些化合物通常被称为酰化剂。

已采用特定酰化剂来改变蛋白质的净电荷和电荷密度。某些试剂可以使净电荷由正电荷变为负电荷。

某些试剂可将每个反应位点的净电荷从+1改变为-2。特定试剂包括但不限于3,5-二羧基苯磺酰氯和其他试剂。

适用于本发明的酰化剂包括脂族、非环状和芳香族酸酐或酰卤。酰化剂的非限制性例子包括戊二酸酐、丁二酸酐、月桂酸酐、二乙醇酸酐、甲基丁二酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐、琥珀酰氯、戊二酰氯、十二酰氯、邻苯二甲酸酐、甲基丙烯酸酐、三氟乙酸酐、苯乙烯/马来酸酐共聚物和乙烯/马来酸酐共聚物。这些化学品可从奥尔德里奇化学公司(Aldrich Chemical Company)(密尔沃基，威斯康星州)。本发明中使用的优选酰化剂是戊二酸酐、甲基丙烯酸酐、三氟乙酸酐、乙烯/马来酸酐共聚物和邻苯二酸酐。酰化剂的有效量大致为占溶液中胶原蛋白总重的约0.5-20重量％，优选胶原蛋白总重的约3-10重量％。

可用作辅助酰化剂的有用磺化剂包括但不限于脂肪族、无环和芳族磺酸或磺酰卤。用于本发明的磺化剂的非限制性实例包括蒽醌-1,5-二磺酸、2-(氯磺酰基)-蒽醌、8-羟基喹啉磺酸、2-萘-磺酰氯、β-苯乙烯磺酰氯、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、苯胺-2-磺酸、氟磺酰基苯磺酰氯和聚(乙烯基)磺酸。这些化学品也可从例如奥尔德里奇化学公司(密尔沃基，威斯康星州)购得。磺化剂的有效量大致为占溶液中胶原蛋白总量的约0.5-约20重量％，优选胶原蛋白总重的约1-约10重量％。

酰化剂和/或磺化剂组合的非限制性示例包括：戊二酸酐/β-苯乙烯磺酰氯/甲基丙烯酸酐；戊二酸酐/乙烯/马来酸酐共聚物/甲基丙烯酸酐；戊二酸酐/聚乙烯磺酸/甲基丙烯酸酐；以及戊二酸酐/乙烯/马来酸酐共聚物/苯乙烯/马来酸酐共聚物。用于本发明的优选组合为：戊二酸酐/β-苯乙烯磺酰氯；戊二酸酐/邻苯二甲酸酐；和戊二酸酐/苯胺-2-磺酸。

当用两种或多种酰化剂、磺化剂或酰化剂和磺化剂混合物的组合制备改性胶原组合物时，化学改性剂的总量优选为占溶液中胶原的约3-10wt重量％。超过该优选范围的过量化学改性剂可能导致胶原蛋白组合物在生物学上不稳定且对组织蛋白酶敏感。

胶原蛋白的改性在pH范围为约7.5-10.0，优选约8.5-9.5，最优选约pH 9.0的碱性pH下进行。酰化反应可以通过pH的降低来监控。当pH值保持稳定在约5-8，优选约6.5-7.5时，终止反应。还可以通过取出等分样品并测量与胶原蛋白起始溶液相比的改性胶原蛋白溶液的游离胺浓度来监测反应。

改性反应应在约5-90分钟，优选约20-40分钟内完成。反应应在约0-37℃，优选约4-25℃的温度下进行。

反应可以通过调节pH至约12.0，持续2分钟来停止。这可破坏残留的、未反应的化学改性剂。然后通过用盐酸、乙酸、硝酸、硫酸或其他酸降低pH，使改性胶原蛋白沉淀。

酸的量必须足以沉淀出化学改性的胶原蛋白。通常，沉淀在约3.5-6.0，优选约4.0-5.0的pH下发生。

采用常规技术(例如离心或过滤)从混合物中回收已反应胶原蛋白的沉淀物，此时该已反应胶原蛋白中包含与胺基团(原先的ε-氨基基团)反应的取代基团。以约3,000-15,000rpm进行约20-60分钟的离心，优选以约4,000-12,000进行约20-30分钟的离心，提供了沉淀物的有效回收。

回收后，用去离子水洗涤沉淀物，然后将其溶于生理溶液中，例如pH约7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中。可能需要将pH值调整到约7.0-7.5。例如，这可以通过加入氢氧化钠溶液来实现。

沉淀物溶解后，通常通过常规过滤装置(例如5微米滤器)对溶液进行过滤，然后离心以去除气泡。此时，所得到的含有化学改性胶原蛋白分子和聚集体的溶液表现出粘稠的稠度，不同程度的透明度和净度。在约25℃的温度下测得的可注射改性胶原蛋白溶液的粘度范围很广，约为30,000厘泊-300,000厘泊，优选约75,000-150,000厘泊。溶液的粘度可以通过加入缓冲液或胶原蛋白沉淀物来调节。

改性的程度可以通过改变化学改性剂的量、pH、温度和反应时间来调整。此外，改性剂的加入方式也会影响反应。如果化学试剂以固体或粉末的形式加入，而不是以溶液的形式加入，反应通常较慢。

改性的程度也可通过胶原蛋白基组合物的生物稳定性来确定。完全改性得到在中性蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)存在下迅速降解的胶原蛋白溶液。已发现胶原蛋白组合物的生物稳定性可通过控制化学改性程度来操控。

改性胶原溶液是假塑性的，因此溶液随着剪切速率的增加而呈现出剪切稀释，这对于假塑性溶液是很典型的。改性胶原溶液也是触变性的，因此此类溶液在因剪切(例如通过注射器注射)而稀释之后会恢复其原始粘度。

可将化学改性胶原蛋白组合物注射入真皮浅层(superficial dermis)、中皮层(mid-dermis)或深皮层(deep dermis)以矫正面部皮肤中的轮廓缺陷，或者可将此类组合物注射入唇部肌肉周围松弛的结缔组织，或者注射入唇体以改善唇部外观。胶原蛋白组合物能够注射通过30号针头。该材料保持无色，并提供了持久的临床效果。可将胶原蛋白组合物预包装在包含具有多种不同耐久度的材料的即用型针筒中。

为了制备耐久性延长的衍生化胶原蛋白组合物，在胶原蛋白溶液中补充胶原纤维，10-30％ PMMA球(直径25-50μm)，10-30％ PEG球或颗粒(直径约25-50μm)或10-30％具有相似尺寸的丙交酯/丙交酯或丙交酯/乙交酯球或颗粒。含有胶原纤维的衍生胶原蛋白溶液提供了具有与以往胶原蛋白产品类似耐久性的软组织填充物，补充有PMMA的组合物提供了具有永久耐久性的软组织填充物。PEG和丙交酯/乙交酯组合物(PLGA)提供了相比未经补充的衍生化胶原蛋白溶液或含有纤维胶原蛋白单元的衍生化胶原蛋白溶液耐久性延长的柔性皮肤填充物。

除了衍生化的胶原蛋白，可快速聚合胶原(RPC)凝胶也可用于本发明的组合物。如本文所用，术语“可快速聚合胶原凝胶”是指这样的可注射的酸溶性胶原蛋白组合物，其包括含有酸溶性胶原蛋白、EDTA和多元醇的中性溶液，其中所述组合物可在中性pH下注射，并且所述酸溶性胶原蛋白在暴露于含离子液体时聚合。在一些实施方式中，可快速聚合胶原凝胶描述于US10,111,981B2中。

在一些实施方式中，酸溶性胶原蛋白包含选自下组的胶原蛋白：I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及其组合。在一些实施方式中，RPC凝胶包含浓度为5-70mg/ml，优选25-65mg/ml，更优选20-40mg/ml的酸溶性胶原蛋白。

在一些实施方式中，RPC凝胶中包含的EDTA是EDTA二钠。在一些实施方式中，RPC凝胶中EDTA的浓度为约10mM-约50mM，优选约25mM-约40mM，更优选约30mM-约35mM。

在一些实施方式中，RPC凝胶中所含多元醇为糖醇，例如D-甘露糖醇。在一些实施方式中，RPC凝胶中多元醇的浓度为约2.5％-4％(w/v)，优选约3.0％-3.9％(w/v)。在一些实施方式中，RPC凝胶还包含二糖、果糖或其组合。

在一些实施方式中，RPC凝胶的浓度具有280-360mmol/kg的渗透压。

在一些实施方式中，RPC凝胶在注射入软组织缺陷时迅速形成不透明的胶原纤维基质。在一些实施方式中，软组织缺陷选自：皱纹、皮肤皱褶、皮肤松弛、皮肤轮廓缺陷、皮肤细纹、皮肤沟纹和皮肤粗糙。在一些实施方式中，软组织缺陷位于唇部或面部皮肤。在一些实施方式中，RPC凝胶形成填充软组织缺陷的胶原原纤维基质。

在一些实施方式中，RPC凝胶接触组织后形成胶原原纤维基质，且该基质在注射后至少4周，优选至少12周，更优选至少6个月中保持耐久性。

在一些实施方式中，RPC凝胶的注射刺激组织再生。在一些实施方式中，注射的RPC凝胶与该组织的基质整合。

为了制备耐久性延长的胶原蛋白组合物，在RPC胶原蛋白溶液中补充胶原纤维，10-30％ PMMA球(直径25-50μm)，10-30％ PEG球或颗粒(直径约25-50μm)或10-30％具有相似尺寸的丙交酯/丙交酯或丙交酯/乙交酯球或颗粒。含有胶原纤维的RPC溶液提供了具有与以往胶原蛋白产品类似耐久性的软组织填充物，补充有PMMA的组合物提供了具有永久耐久性的软组织填充物。PEG和丙交酯/乙交酯组合物(PLGA)提供了相比未经补充的衍生化胶原蛋白溶液或含有纤维胶原蛋白单元的衍生化胶原蛋白溶液耐久性延长的柔性皮肤填充物。

下文列举的实施方式是本发明的代表：

1.一种用于软组织充填应用的组合物，其包含：

(i)衍生化胶原蛋白溶液或可快速聚合胶原凝胶(在经历原纤维形成之前)或交联或未交联胶原纤维；以及

(ii)包含于部分(i)中的不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子。

2.如项目1所述的组合物，其中用于部分(i)的胶原蛋白的来源选自下组：同种异体、哺乳动物皮或海洋物种或蝾螈(axolotl)皮衍生的基质；和/或

所述胶原蛋白选自全胶原蛋白或去端肽胶原蛋白，或来自微生物、植物、昆虫细胞或动物细胞的重组胶原蛋白或重组胶原肽，或胶原蛋白模拟肽。

3.如项目1所述的组合物，其中所述衍生化胶原蛋白经酰化剂衍生从而改变胶原蛋白的pKa，且具有如下一个或多个特征：

(a)在中性pH(例如6.5-7.5)可溶；

(b)在生理pH下未经历原纤维形成；和/或

(c)在酸性pH(例如3.5-5.5，优选4.0-5.0)下沉淀。

4.如项目1所述的组合物，其中所述衍生化胶原蛋白经一种或多种选自下组的试剂衍生：戊二酸酐、丁二酸酐、马来酸酐、柠檬酸酸酐、草酸酸酐和乙二胺四乙酸酐。

5.如项目1所述的组合物，其中所述可快速聚合胶原凝胶如US10,111,981B2中所描述；和/或

所述可快速聚合胶原凝胶包含中性溶液，该溶液包含酸溶性胶原蛋白、EDTA和多元醇，且其中所述酸溶性胶原蛋白包括选自下组的胶原蛋白：I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及其组合。

6.如项目5所述的组合物，其中所述酸溶性胶原蛋白的浓度为5-70mg/ml；和/或

其中所述EDTA为EDTA二钠；和/或

其中所述EDTA的浓度为10-50mM；和/或

其中所述多元醇为糖醇，例如D-甘露糖醇；和/或

其中所述多元醇的浓度为2.5％-4％(w/v)；和/或

其中所述可快速聚合胶原凝胶还包含二糖、果糖或其组合；和/或

其中所述可快速聚合胶原凝胶的渗透压为280-360mmol/kg。

7.如项目1所述的组合物，其中所述交联胶原蛋白通过一种或多种选自下组的化学试剂交联：醛，如甲醛、乙二醛、戊二醛和丁烯醛；或环烯醚萜，如京尼平(genipin)；或碳二亚胺，如双环己基碳二亚胺；或环氧化物，如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)，或酰基叠氮；或糖，如核糖或葡萄糖。

8.如项目1所述的组合物，其中不可吸收或可缓慢吸收颗粒、球体或粒子选自下组的一种或多种：

重构或交联的胶原原纤维；

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球；

聚甲基丙烯酸甲酯-羟基磷灰石微球；

由乳化交联反应、双乳化蒸发法、微流控交联反应、压印法制备的交联透明质酸微球；

聚乙二醇(PEG)微球；

PEG-羟基磷灰石微球；

聚-L-丙交酯(PLA)微球；

PEG-PLA共聚物微球；

聚-L-丙交酯-羟基磷灰石微球；

聚乙醇酸(PGA)微球；

聚-L-丙交酯-羟基磷灰石微球；

聚丙交酯和聚乙交酯聚合物和共聚物(PLGA)微球；

聚ε-己内酯(PCL)微球；

PCL-PLA共聚物微球；

聚ε-己内酯-羟基磷灰石微球；

聚(对-二氧杂环己酮)(PDO)微球；

聚(对-二氧杂环己酮)-羟基磷灰石微球；

羟基磷灰石钙；以及

L-丙交酯/三亚甲基碳酸酯共聚物粒子。

9.如项目8所述的组合物，其中透明质酸微球的交联剂选自下组：二乙烯砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、对亚苯基双碳二亚胺(p-phenylene biscarbodiimide)、1,2,7,8-二环氧辛烷(diepoxyoctane)或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)。

10.如项目8所述的组合物，其中交联透明质酸微球经生物可降解聚合物包被，例如聚-L-丙交酯(PLA)、聚乙二醇(PEG)或PLGA或聚(对-二氧杂环己酮)(PDO)。

11.如项目1所述的组合物，其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子的尺寸为5-150μm，优选20-50μm；和/或

其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子通过喷雾-沉降技术、乳液、双乳液蒸发法、微流控反应、固体-凝胶法、熔体挤出技术、烧结工艺或压印成形得到的；和/或

其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子通过热湿灭菌、伽马辐照或环氧乙烷灭菌法进行灭菌。

12.如项目1所述的组合物，其中，以所述组合物的总重为基准计，部分(i)中胶原蛋白的量为0.1wt％-10wt％，部分(ii)的量为1wt％-55wt％。

13.如项目1所述的组合物，其还包括一种或多种添加剂，以所述组合物的总重为基准计，所述添加剂的量为0-5wt％。

14.如项目1所述的组合物，其中，所述添加剂选自下组：

局部麻醉药物，例如利多卡因(lidocaine)、普鲁卡因(procaine)，优选浓度为0.1重量％-0.5重量％；和/或

多元醇稳定剂，例如甘油、甘露醇、丁二醇、山梨糖醇，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

具有螯合能力的稳定剂，例如EDTA、EGTA、柠檬酸、柠檬酸钠，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

硫稳定剂或溶解促进剂，例如硫酸软骨素钠(CS)、硫酸葡萄糖胺(GS)或甲基磺酰甲烷(MSM)，浓度优选为0.1重量％-5重量％；和/或

可溶性小分子，其通过透析过程、超滤或切向流超滤用有机膜或陶瓷膜以MWCO>10KDa添加。

15.如项目1所述的组合物，其中部分(ii)利用真空行星式混合器加于部分(i)，形成可注射的均质凝胶，其转速优选为200rpm-1400rpm，自转速优选为100rpm-700rpm，真空混合时间优选为10～30分钟。

16.如项目1所述的组合物，其中部分(ii)通过透析或超透析或超滤过程加于部分(i)的盐或pH沉淀物，形成均质可注射凝胶。

17.一种制备项目1-16中任一项所述的组合物的方法，其包括：合并部分(i)和部分(ii)，例如通过如下方式进行合并：

利用真空行星式混合器将部分(ii)加于部分(i)，形成可注射的均质凝胶，其转速优选为200rpm-1400rpm，自转速优选为100rpm-700rpm，真空混合时间优选为10～30分钟；和/或

通过透析或超透析或超滤过程将部分(ii)加于部分(i)的盐或pH沉淀物，形成均质可注射凝胶。

18.一种在有需要的对象中充填软组织的方法，其包括将项目1-16中任一项所述的组合物注射到需要充填的部位。

19.如项目18所述的方法，其中将所述组合物注射入软组织以矫正软组织缺陷；和/或

其中将所述组合物注射入皮肤以矫正软组织缺陷，包括皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、不均匀、面部消瘦、脂肪萎缩、脸颊凹陷、眼窝凹陷或其组合；和/或

其中将所述组合物注射入非皮肤的其他组织，包括软骨，以矫正组织缺陷。

20.如项目14所述的方法，其中所述组合物能够通过25-30号针头或套筒，例如25、27或30号针头或套筒注射。

下面列出的实施例旨在说明本发明而不限制其范围。

本文引用的出版物及其中援引相关的材料都具体通过引用整体纳入本文。除非另有说明，所有试剂均是可商购的。除非另有说明，所有份数和百分数均以重量计。除非另有说明，显示结果的平均值。除非另有定义，本文使用的缩写是常规的。

实施例

实施例1.戊二酸酐改性胶原蛋白的制备

将200mL 3mg/mL的纯化可溶性胶原蛋白(Porcogen，批号#531131080)通过0.45μm和0.2μm筒式过滤器过滤。将经过滤的胶原蛋白置于500mL烧杯中，用10N和1N NaOH调整pH为9.0。在室温搅拌5分钟后，将压成细粉的戊二酸酐粉末(Sigma，>95％)以等于10％胶原蛋白的浓度(60mg)缓慢加入搅拌中的胶原蛋白溶液中。通过滴加10N NaOH将胶原蛋白溶液的pH保持在pH 9.0。戊二酸酐反应持续15分钟，此时滴加6N HCl和1N HCl将pH降低至约4.5以沉淀出衍生化胶原蛋白。

然后将衍生化胶原蛋白置于50mL离心管中，3,500-5,000rpm离心以沉淀衍生化胶原蛋白。然后通过滴加10N NaOH和1N NaOH将pH调节至7.2使得回收的沉淀物溶解。在NaOH与衍生化胶原蛋白沉淀物混合时监控pH。然后将中性澄清透明胶原凝胶置于50mL离心管中，离心除气泡。SDS-PAGE显示α1、α2分子和二聚体的分子量均增加(图2)。将澄清脱气胶原凝胶保存在2-10℃，直到补充胶原原纤维、PMMA球、PEG球和颗粒或丙交酯/乙交酯球。

实施例2.胶原原纤维的制备和添加

胶原原纤维的制备将300mL纯化可溶性胶原蛋白(Porcogen，批号#531131080)通过0.45μm和0.2μm筒式过滤器过滤。将胶原蛋白溶液置于预洗透析管(FisherBrand，分子量截断值为12,000-14,000)中，并在NaCl存在下(调整终浓度至0.15M)置于含有磷酸盐缓冲液(0.1M Na₂HPO₄,0.05M柠檬酸，pH7.2)的1L瓶中。持续透析24小时，形成不透明纤维团块。从透析管中取出纤维状胶原蛋白，置于50mL离心管中。以3500rpm离心纤维状胶原蛋白15分钟来浓缩胶原原纤维。通过测定干重来估计浓度。

将纤维状胶原蛋白(20重量％)混合到衍生胶原蛋白凝胶中，然后低速离心以去除气泡。

纤维状胶原蛋白通常在中性pH下诱导非纤维状胶原原纤维形成，但戊二酸酐改性的胶原蛋白在加入纤维状胶原后仍保持清澈、透明和流动。

胶原蛋白分子能够自组装成有序的超分子结构，这与胶原蛋白固有的三股螺旋结构、独特的粘性末端、分子手性以及分子间相互作用力氢键、静电相互作用、疏水相互作用密切相关。胶原蛋白浓度、温度、离子强度和pH是影响胶原原纤维形成的主要因素。一旦在合适的条件下(pH＝7.2-7.4，0.1-0.2M NaCl提供离子强度)触发原纤维形成(自组装)，如图1所示，胶原蛋白分子的自组装会自动在溶液中扩散，使得材料的外观和相变有序稳定。

实施例3.PMMA球的添加

1.将直径为32-50μm的PMMA微球(Phosphorex)以占胶原凝胶20重量％的量混入衍生化胶原蛋白溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头(female-female syringe adapter)连接的注射器将微球均匀混入胶原凝胶中。PMMA-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

2.将直径为32-50μm的PMMA微球(Phosphorex)以占胶原凝胶10重量％的量混入衍生化胶原蛋白溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将微球均匀混入胶原凝胶中。PMMA-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例4.PLGA微球的添加

将直径为20-40μm的PLGA微球(Phosphorex)以占胶原凝胶20重量％的量混入衍生化胶原蛋白溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将微球均匀混入胶原凝胶中。PLGA-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例5.聚乙二醇(PEG)微球的添加

将直径为45-105μm的聚乙二醇微球以占胶原凝胶20重量％的量混入衍生化胶原蛋白溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将微球均匀混入胶原凝胶中。PEG-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例6.L-丙交酯/三亚甲基碳酸酯共聚物粒子的添加

将直径为20-40μm的L-丙交酯/三亚甲基碳酸酯共聚物粒子(8812Polymer)以占胶原凝胶20重量％的量混入衍生化胶原溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将粒子均匀混入胶原凝胶中。L-丙交酯/三亚甲基碳酸酯共聚物-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例7.羟基磷灰石钙球的添加

将直径为25-45μm的羟基磷灰石钙球(获自Merz Biomaterials)以占胶原凝胶20重量％的量混入衍生化胶原蛋白溶液中。采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将粒子均匀混入胶原凝胶中。羟基磷灰石钙-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例8.可快速聚合胶原蛋白加衍生化胶原蛋白组合物

可快速聚合胶原蛋白的制备

纯的可溶性猪I型胶原购自SunMax Biotechnology,LTD。将饱和氯化钠溶液加入胃蛋白酶消化的可溶性胶原蛋白溶液(3mg/mL)至浓度为0.8M，以沉淀胶原蛋白。在5000RPM下离心15分钟，回收白色不透明沉淀物。将浓缩的胶原蛋白沉淀物置于分子量截断值为10,000道尔顿的透析管中，或置于分子量截断值为20,000道尔顿的透析盒中，并在0.5M的乙酸中透析至少16-18小时，再在0.1M的乙酸中透析至少16-18小时。然后用0.035M(35mM)EDTA(乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物，SigmaUltra～-99％)透析所得澄清粘稠再溶解的胶原浓缩物。重要的是用浓度至少为25mM且优选达到35mM的EDTA二钠进行透析。起始pH为5.0±0.2。持续透析至少12小时。然后将透析管或盒转移到含有35mM EDTA，pH为5.5±0.2的透析室中，透析至少12小时。然后将透析管或盒再次转移到含有35mM EDTA，pH为6.0的透析室中，透析至少12小时。随后在pH 6.5和7.2下用35mM EDTA透析，使最终的胶原蛋白pH值达到约7.0。最终的澄清粘稠胶原蛋白在室温下的pH为7.1，且未经历原纤维形成。直到胶原蛋白接触生理液体或含有触发胶凝和聚合反应的离子的液体，才会触发胶原原纤维形成。

在可快速聚合胶原(RPC)中补充衍生化胶原蛋白(DC)，得到80％(v/v)可快速聚合胶原蛋白和20％衍生化胶原蛋白的混合物。将混合物离心，并注射到中性pH磷酸钠缓冲液中进行检测。注射入缓冲液后，白色纤维单位立即形成。然而，与不添加衍生化胶原蛋白的可快速聚合胶原蛋白所形成的纤维单位相比，该纤维单位更厚且密度更低(图4)。该组合的胶原蛋白组合物似乎为治疗组织凹陷提供了额外的体积。

在随后的动物实验中，对与衍生化胶原蛋白组合的可快速聚合胶原蛋白的持续时间进行了评估。研究了不同比例的RPC和DC。结果表明，混合物的持续时间取决于RPC而不是DC，然而，添加DC有助于在注射前稳定未聚合的RPC，而不会影响RPC在PBS和体内的聚合能力(图3和图4)。

实施例9.衍生化胶原蛋白加交联透明质酸微球

通过乳化交联反应得到交联透明质酸微球。将1～3重量％透明质酸(MW>1500kDa)的PBS溶液与交联剂ε-聚赖氨酸和4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)在0.9％氯化钠溶液中按相同摩尔比与HA混合，在5倍体积的有机油硅油和Span 80混合物(v:v＝1.0～2.0:25)中反应，并在30-45℃下以1000-1500rpm搅拌24小时以上。搅拌速度越快，产生的微球直径越小。额外的有机油用正己烷和乙酸乙酯洗涤3次，用无水乙醇洗涤3次。交联HA微球通过8000～10000rpm离心10分钟后聚集。经PBS复水化后，对交联HA微球悬浮液进行过滤，收集合适尺寸(20～50μm)的微球。乙醇沉淀并经中性PBS复水化之后，得到白色HA微球粉末。

采用两个通过双头内螺纹接头连接的注射器将HA微球均匀混入(v:v＝1:1)胶原凝胶(如实施例1中所制备)中。HA微球-胶原凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27和30号针头测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

实施例10.浓缩可快速聚合胶原蛋白和PMMA微球混合物

含有高浓度胶原蛋白的RPC或衍生化胶原凝胶通常具有较高的储存模量，高于1200Pa(5Hz)，具有很高的动态粘度。大批量混合胶原凝胶和微球是一个挑战。真空行星式搅拌器通过适当的速度和时间设置，可以容易地将粉末和粘性凝胶适当混合在一起，不会产生任何气泡。

将直径为32-50μm的PMMA微球(Phosphorex)以占胶原凝胶20重量％的量混入RPC溶液(如实施例8中所制备)中。组合物用THINKY混合器在带有冷却器适配器的容器中以1000rpm的转速(自转速为转速的一半)在无菌条件下混合10分钟，进行3次。得到了无任何气泡的均质内聚(cohesive)复合材料。RPC-PMMA凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。通过挤出通过27号针头(薄壁)测定可注射性。将样品置于1.0mL注射器中用于兔耳模型中的后续测试。

将0.2mL RPC-PMMA或Bellafill(对照；SUNEVA Medical提供的一种商业产品，含有中性牛胶原蛋白和PMMA微球)皮下注射到兔耳(避免靠近血管)。分别于注射前、注射后立即(第0天)、第1天、第7天、第14天、第21天测定兔耳厚度和植入肿块的长度、宽度和厚度。所有测量均由同一人用游标卡尺进行三次，并计算平均值以作进一步评价。植入高度和估算体积根据下式计算：

植入高度(mm)＝耳和植入的厚度—耳的厚度

植入体积估算(mm³)＝1/6π×植入高度×植入长度×植入宽度

与商业产品相比，RPC在中性pH值下具有独特的非纤维状状态，可以使用注射器针头挤出高浓度的胶原蛋白加PMMA微球制剂。

注射后，RPC在5分钟内原位聚合。(图5)RPC启动的原纤维形成生成储存模量增加(体外5Hz下可达3,000Pa，体内5,000～15,000Pa)的凝胶，植入物形成与真皮中天然胶原蛋白支架高度相似的多维支架。

RPC胶原蛋白支架使得细胞立即浸润而不发生任何植入移位。RPC相比Bellafill具有意想不到的更长的耐久性，缩短或克服了意识到胶原蛋白刺激效果前的充填效应显现期(yielding period)。(表1)

表1：RPC-PMMA和Bellafill在兔耳3周内的植入形态变化(测量植入体积估算和植入高度)。

后来，微球刺激下的新胶原蛋白取代了植入物，充填了皮肤缺陷，最终在胶原蛋白缓慢降解后，具有新胶原生成的PMMA仍能维持植入和自然充填效果。

实施例11.浓缩可快速聚合胶原蛋白和交联透明质酸微球复合材料

通过乳化交联反应得到交联透明质酸微球(如实施例9所述)。将1～3％交联剂ε-聚赖氨酸和4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)的0.9％氯化钠溶液和1～3％透明质酸(MW>1500kDa)溶液混合，在5倍体积的有机油(例如橄榄油或硅油)与spam 80混合物(v:v＝1.0～2.0:25)中反应，并在30℃～45℃下以1000～1500rpm搅拌24小时。转速越高，得到的微球直径越小。额外的有机油用正己烷和乙酸乙酯洗涤3次，无水乙醇洗涤3次，并通过以8000～10000rpm离心10分钟聚集交联HA微球。经PBS复水化后，对交联HA微球悬浮液进行过滤，收集合适尺寸的微球。

含有高浓度胶原蛋白的RPC凝胶通常具有较高的储存模量，高于1200Pa(5Hz)，具有非常高的动态粘度。大批量混合胶原凝胶和微球是一个挑战。真空行星式搅拌器通过适当的速度和时间设置，可以容易地将粉末和粘性凝胶适当混合在一起，不会产生任何气泡。

将直径为20-50μm的HA微球以占胶原凝胶20重量％的量混入RPC溶液(实施例8)(胶原蛋白浓度超过5％)中。组合物用THINKY混合器在带有冷却器适配器的容器中以1000rpm的转速(自转速为转速的一半)在无菌条件下混合10分钟，进行3次。得到了无任何气泡的均质内聚复合材料。HA-RPC凝胶组合物样品的显微镜检显示，胶原凝胶中具有密集浓度的微球。

其它实施方式

虽然参考优选实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员很容易确定本发明的基本特征而不会偏离本发明的精神和范围，且能够对本发明进行各种改变和修饰以使其适于各种用途和条件。本领域技术人员会明白或能够确定采用常规实验即可获得的本文所述本发明具体实施方式的众多等同形式。这些等同形式也意在包含于本发明的范围内。

本说明书中提到的所有参考文献，包括专利、出版物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇独立的出版物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

参考文献

出版物

Cockerham和Hsu(Facial Plastic Surgery,25:106-113,2009)

Denton和Shoman(Office Based Cosmetic Procedures&Technology,第3部分,pp59-64,2010).

Tagle等(2010).J.5,2010年2月5日，J.Aesthetic and Clinical Dermatology

专利

Miyata(美国专利4,164,559)

DeVore等(美国专利4,713,446,4,851,513,4,969,912,5,067,961,5,104,957,5,201,764,5,219,895,5,332,809,5,354,336,5,476,515,5,480,427,5,631,243,6,161,544和10,111,981)。

Claims (20)

1.一种用于软组织充填应用的组合物，其包含：

(i)衍生化胶原蛋白溶液或可快速聚合胶原凝胶(在经历原纤维形成之前)或交联或未交联胶原纤维；以及

(ii)包含于部分(i)中的不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子。

2.如权利要求1所述的组合物，其中用于部分(i)的胶原蛋白的来源选自下组：同种异体、哺乳动物皮或海洋物种或蝾螈皮衍生的基质；和/或

所述胶原蛋白选自全胶原蛋白或去端肽胶原蛋白，或来自微生物、植物、昆虫细胞或动物细胞的重组胶原蛋白或重组胶原肽，或胶原蛋白模拟肽。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述衍生化胶原蛋白经酰化剂衍生从而改变胶原蛋白的pKa，且具有如下一个或多个特征：

(a)在中性pH(例如6.5-7.5)可溶；

(b)在生理pH下未经历原纤维形成；和/或

(c)在酸性pH(例如3.5-5.5，优选4.0-5.0)下沉淀。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述衍生化胶原蛋白经一种或多种选自下组的试剂衍生：戊二酸酐、丁二酸酐、马来酸酐、柠檬酸酸酐、草酸酸酐和乙二胺四乙酸酐。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述可快速聚合胶原凝胶如US10,111,981B2中所描述；和/或

所述可快速聚合胶原凝胶包含中性溶液，该溶液包含酸溶性胶原蛋白、EDTA和多元醇，且其中所述酸溶性胶原蛋白包括选自下组的胶原蛋白：I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及其组合。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述酸溶性胶原蛋白的浓度为5-70mg/ml；和/或

其中所述EDTA为EDTA二钠；和/或

其中所述EDTA的浓度为10-50mM；和/或

其中所述多元醇为糖醇，例如D-甘露糖醇；和/或

其中所述多元醇的浓度为2.5％-4％(w/v)；和/或

其中所述可快速聚合胶原凝胶还包含二糖、果糖或其组合；和/或

其中所述可快速聚合胶原凝胶的渗透压为280-360mmol/kg。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述交联胶原蛋白通过一种或多种选自下组的化学试剂交联：醛，如甲醛、乙二醛、戊二醛和丁烯醛；或环烯醚萜，如京尼平；或碳二亚胺，如双环己基碳二亚胺；或环氧化物，如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)，或酰基叠氮；或糖，如核糖或葡萄糖。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子选自下组的一种或多种：

重构或交联的胶原原纤维；

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球；

聚甲基丙烯酸甲酯-羟基磷灰石微球；

由乳化交联反应、双乳液蒸发法、微流控交联反应、压印法制备的交联玻尿酸微球；

聚乙二醇(PEG)微球；

PEG-羟基磷灰石微球；

聚-L-丙交酯(PLA)微球；

PEG-PLA共聚物微球；

聚-L-丙交酯-羟基磷灰石微球；

聚乙醇酸(PGA)微球；

聚-L-丙交酯-羟基磷灰石微球；

聚丙交酯和聚乙交酯聚合物和共聚物(PLGA)微球；

聚ε-己内酯(PCL)微球；

PCL-PLA共聚物微球；

聚ε-己内酯-羟基磷灰石微球；

聚(对-二氧杂环己酮)(PDO)微球；

聚(对-二氧杂环己酮)-羟基磷灰石微球；

羟基磷灰石钙；以及

L-丙交酯/三亚甲基碳酸酯共聚物粒子。

9.如权利要求8所述的组合物，其中透明质酸微球的交联剂选自下组：二乙烯砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、对亚苯基双碳二亚胺、1,2,7,8-二氧辛烷或富含氨基的低聚物(如聚赖氨酸或聚精氨酸或γ-聚谷氨酸)。

10.如权利要求8所述的组合物，其中交联透明质酸微球经生物可降解聚合物包被，例如聚-L-丙交酯(PLA)、聚乙二醇(PEG)或PLGA或聚(对-二氧杂环己酮)(PDO)。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子的尺寸为5-150μm，优选20-50μm；

其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子通过喷雾-沉降技术、乳化法、双乳化蒸发法、微流控反应、固体-凝胶法、熔体挤出技术、烧结工艺或压印成形得到的；和/或

其中所述不可吸收或可缓慢吸收的颗粒、球体或粒子通过热湿灭菌、伽马辐照或环氧乙烷灭菌法进行灭菌。

12.如权利要求1所述的组合物，其中以所述组合物的总重为基准计，部分(i)中胶原蛋白的量为0.1wt％-10wt％，部分(ii)的量为1wt％-55wt％。

13.如权利要求1所述的组合物，其还包括一种或多种添加剂，以所述组合物的总重为基准计，所述添加剂的量为0-5wt％。

14.如权利要求1所述的组合物，其中，所述添加剂选自下组：

局部麻醉药物，例如利多卡因、普鲁卡因，优选浓度为0.1重量％-0.5重量％；和/或

多元醇稳定剂，例如甘油、甘露醇、丁二醇、山梨糖醇，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

具有螯合能力的稳定剂，例如EDTA、EGTA、柠檬酸、柠檬酸钠，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

硫稳定剂或溶解促进剂，例如硫酸软骨素钠(CS)、硫酸葡萄糖胺(GS)或甲基磺酰甲烷(MSM)，优选浓度为0.1重量％-5重量％；和/或

可溶性小分子，其通过透析过程、超滤或切向流超滤用有机膜或陶瓷膜以MWCO>10KDa添加。

15.如权利要求1所述的组合物，其中部分(ii)利用真空行星式混合器加于部分(i)，形成可注射的均质凝胶，其转速优选为200rpm-1400rpm，自转速优选为100rpm-700rpm，真空混合时间优选为10～30分钟。

16.如权利要求1所述的组合物，其中部分(ii)通过透析或超透析或超滤过程加于部分(i)的盐或pH沉淀物，形成均质可注射凝胶。

17.一种制备如权利要求1-16中任一项所述的组合物的方法，其包括：合并部分(i)和部分(ii)，例如通过如下方式进行合并：

利用真空行星式混合器将部分(ii)加于部分(i)，形成可注射的均质凝胶，其转速优选为200rpm-1400rpm，自转速优选为100rpm-700rpm，真空混合时间优选为10～30分钟；和/或

通过透析或超透析或超滤过程将部分(ii)加于部分(i)的盐或pH沉淀物，形成均质可注射凝胶。

18.一种在有需要的对象中充填软组织的方法，其包括将权利要求1-16中任一项所述的组合物注射到需要充填的部位。

19.如权利要求18所述的方法，其中将所述组合物注射入软组织以矫正软组织缺陷；和/或

其中将所述组合物注射入皮肤以矫正软组织缺陷，包括皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、不均匀、面部消瘦、脂肪萎缩、脸颊凹陷、眼窝凹陷或其组合；和/或

其中将所述组合物注射入非皮肤的其他组织，包括软骨，以矫正组织缺陷。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述组合物能够通过25-30号针头或套筒，例如25、27或30号针头或套筒注射。