CN117756898A - 重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白及其应用，涉及生物基因工程技术领域。本发明首次克隆获得阿克曼氏菌Amuc_1631基因，并成功构建该基因重组表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用上述重组菌株在体外获得产量和纯度均较高的重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白。该重组蛋白能够抑制脂肪合成相关基因accl和pparγ的表达，上调脂肪分解相关基因hsl，cptl，lpl和pparα的表达，实现对鱼类脂肪肝的代谢调节作用，该重组蛋白有望开发成预防或治疗鱼类脂肪肝的益生蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白及应用。
背景技术
嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是一种粘蛋白分解细菌，它栖息在人类和许多其他动物的肠道中。菌株MucT于2004年由DERRIEN分离，为卵圆形、革兰阴性的厌氧菌。作为在粪便中发现的疣微菌门的代表，嗜粘蛋白阿克曼氏菌能以肠上皮表面的肠黏液作为其唯一的碳源、氮源和生长能量来源。近年来，一些流行病学和动物实验研究都表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌在调节代谢紊乱中发挥重要作用，鉴于此，有学者指出嗜粘蛋白阿克曼氏菌有望成为继乳酸菌、双歧杆菌之后的下一代益生菌。
益生菌阿克曼氏菌除菌体本身外，由其基因组和蛋白质组还分析鉴定出由特定的IV型菌毛基因簇编码的蛋白质，为外膜蛋白的主要成分，该类表面蛋白也能发挥多种生理功能。有研究报道，阿克曼氏菌Amuc_2172蛋白可用于治疗溃疡性结肠炎，阿克曼氏菌Amuc_1100蛋白可有望成为新型的可预防肥胖、2型糖尿病的生物制剂。
鱼类作为人类优质的蛋白质来源，一直深受人们的喜爱。在养殖中为了追求效益，降低饲料成本，可增加饲料中脂肪和糖类的添加水平以节约蛋白质用量。但过多糖类和脂肪的供给极易造成体内能量过剩、脂肪过度沉积和代谢紊乱，导致鱼类脂肪肝发生率升高和免疫力下降，从而引发鱼类的代谢疾病。因此解决鱼类脂肪肝问题是鱼类营养代谢的一个重要关注点。长期的生产实践证明，饲料中添加促进脂质代谢物质能解决鱼类的脂肪肝问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白及其作为解决鱼类脂肪肝问题的代谢调节剂的应用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
第一方面，本发明提供了重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白，所述重组表达的阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白是重组菌pET21a-Amuc_1631-BL21通过诱导表达并纯化获得，所述重组菌pET21a-Amuc_1631-BL21是将重组质粒pMD20-T-Amuc_1631转化大肠杆菌BL21获得，所述重组质粒pMD20-T-Amuc_1631是将目的基因Amuc_1631导入pET21a质粒汇总获得。
所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：1所示。
所述目的基因Amuc_1631的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
第二方面，本发明提供了重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白用于制备治疗鱼类脂肪肝的代谢调剂节的应用。
所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白通过抑制脂肪合成相关基因accl和ppary的表达，上调脂肪分解相关基因hsl，cptl，lpl和ppara的表达，实现对脂肪肝鱼类的代谢调节。
(三)有益效果
本发明首次克隆获得阿克曼氏菌Amuc_1631基因，并成功构建该基因重组表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用上述重组菌株在体外获得产量高、纯度高的重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白。该重组蛋白能够抑制脂肪合成相关基因accl和pparγ的表达，上调脂肪分解相关基因hsl，cptl，lpl和pparα的表达，实现对鱼类脂肪肝的代谢调节作用，该重组蛋白有望开发成预防或治疗鱼类脂肪肝的益生蛋白。
附图说明
图1.以阿克曼氏菌基因组为模板进行PCR扩增Amuc_1631ORF片段产物的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；NC：阴性对照。
图2.A是带酶切位点Amuc_1631的PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；NC：阴性对照；B是重组质粒pET21a-Amuc_1631的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pET21a-Amuc_1631未酶切；2：pET21a-Amuc_1631NotI和XhoI双酶切。
图3.A是重组株pET21a-Amuc_1631-BL21表达产物Amuc_1631的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker；NC：空载体对照；1、2、3、4、5：重组株pET21a-Amuc_1631-BL21诱导表达0、1、2、3、4小时表达产物；B是重组株pET21a-Amuc_1631-BL21表达产物Amuc_1631纯化产物的Western blot鉴定图；其中：M：蛋白Marker；NC：空载体对照；1、2、3、4、5：重组株pET21a-Amuc_1631-BL21诱导表达0、1、2、3、4小时表达产物进行Western blot；C是重组株pET21a-Amuc_1631-BL21表达产物Amuc_1631纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图；其中，M：蛋白Marker；1、2、3、4：纯化后蛋白进行SDS-PAGE。
图4.是重组Amuc_1631对鲤原代肝脏细胞脂肪代谢相关基因的影响；A是acc1；B是pparγ；C是hsl；D是cpt1；E是lpl；F是pparα。其中“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01；“***”表示P＜0.001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1阿克曼氏菌Amuc_1631基因ORF的克隆
根据阿克曼氏菌基因组数据库进行搜索，根据搜索得到的基因片段设计克隆阿克曼氏菌Amuc_1631ORF的引物，上游引物F-ORF的核苷酸序列为5'-ATGGAAAAAAACGCACCC-3'(SEQ ID NO：3)、下游引物R-ORF的核苷酸序列为5'-TTATTTTCCGGAGGATTC-3'(SEQ ID NO：4)，以阿克曼氏菌基因组为模板做PCR。PCR条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，35个循环；72℃10min；4℃∞。经过PCR后把得到的产物与pMD20-T载体连接在一起为pMD20-T-Amuc_1631。如图1所示,克隆得到的Amuc_1631基因的条带单一，说明已成功克隆Amuc_1631基因。
2带酶切位点的阿克曼氏菌Amuc_1631基因合成
根据已克隆到的阿克曼氏菌Amuc_1631基因的序列及限制性内切酶NotI和XhoI的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATCATCATCATCATCATGCTACGGACTTCAACCAG-3'(SEQ ID NO：5)是在阿克曼氏菌Amuc_1631基因的成熟肽序列前添加NotI酶切识别位点和6×His标签，下游引物R为5'-CCGCTCGAGTTATTTTCCGGAGGATTCC-3'(SEQ ID NO：6)是在阿克曼氏菌Amuc_1631基因成熟肽序列后添加终止密码子及XhoI酶切识别位点。利用已构建的pMD20-T-Amuc_1631为模板进行PCR反应，PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃3min，35个循环；72℃10min；4℃∞。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2A，结果显示Amuc_1631成熟肽条带单一，说明已成功构建含有酶切位点和6×His标签的Amuc_1631成熟肽基因片段。
3含阿克曼氏菌Amuc_1631基因的大肠杆菌表达载体pET21a-Amuc_1631的构建
PCR产物用限制性内切酶NotI和XhoI双酶切后，酶切产物用GelExtraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化阿克曼氏菌Amuc_1631基因片段；载体质粒pET21a经限制性内切酶NotI和XhoI双酶切后分离纯化，与分离纯化阿克曼氏菌Amuc_1631基因片段混合，用NEB T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶NotI和XhoI双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与阿克曼氏菌Amuc_1631基因和表达载体pET21a大小相同，证明阿克曼氏菌Amuc_1631基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET21a中，重组质粒命名为pET21a-Amuc_1631。酶切分析图分别见图2B，结果显示酶切后载体和Amuc_1631成熟肽基因都为单一条带，说明已成功构建含有酶切位点和6×His标签的Amuc_1631成熟肽的pET21a的表达载体。
4高效表达阿克曼氏菌Amuc_1631的大肠杆菌重组株pET21a-Amuc_1631-BL21的构建
制备好的重组质粒pET21a-Amuc_1631用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，在含Ampicillin的LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取单克隆接种在10ml LB液体培养基中，37℃，200转/分培养14-16小时，按照1:100接种在10ml LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养0、1、2、3、4小时时分别取1ml，5000g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用50μlPBS缓冲液悬浮，加入50μl 2×Loading buffer混匀，沸水浴10min，进行SDS-PAGE验证，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pET21a转化BL21后长出的单克隆培养后的菌液，结果见图3A，该结果表明构建的pET21a-Amuc_1631表达载体能在BL21菌株中表达目的蛋白，并已鉴定筛选出能高效表达阿克曼氏菌Amuc_1631的大肠杆菌重组株pET21a-Amuc_1631-BL21。
5利用大肠杆菌基因工程菌pET21a-Amuc_1631-BL21生产重组阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白
将重组阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行鉴定。一抗为鼠抗His单克隆抗体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。结果见图3B，结果显示目的条带单一，说明构建的pET21a-Amuc_1631-BL21工程菌能够特异的表达Amuc_1631。
挑取大肠杆菌工程菌pET21a-Amuc_1631-BL21单菌落接种在10ml LB液体培养基中，37℃，200转/分培养14-16小时，然后按照1:100的比例接种于500ml LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600到0.5-0.8，然后加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集超声破碎后12000g离心10min收集上清，用GE公司的His-bind Resin进行纯化处理，经分离纯化得到重组阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白。结果见图3C，结果显示目的条带单一，说明采用的纯化方法合理，能够得到纯度较高的目的蛋白。
6重组阿克曼氏菌Amuc_1631对鲤原代肝脏细胞代谢相关基因的影响
分离鲤原代肝脏细胞后，用加入含有10％FBS的DMEM/F12培养基把细胞浓度调成1.0×105细胞/ml，然后在24孔板中每孔加入1ml，在28℃的生化培养箱中培养过夜后，换成500μl的无FBS的DMEM/F12培养基饥饿1小时，然后向处理组中每孔分别加入500μl的DMEM/F12培养基，其中含有分离纯化后的重组阿克曼氏菌Amuc_1631浓度分别为20、100、200μg/ml，对照组加入等体积的无血清培养基，在28℃的生化培养箱中培养6小时用Trizol(购自ThermoFisher Scientific公司)裂解细胞后完全收取裂解液。提取样品中的总RNA，并用反转录试剂盒(购自Takara公司)对RNA进行反转录。用荧光定量PCR(购自Takara公司)试剂盒在LightCycler480Ⅱ(罗氏公司)上进行荧光定量PCR反应，以18S rRNA作为内参，计算对照组和处理组之间代谢相关基因的变化情况。结果显示，用纯化后重组阿克曼氏菌Amuc_1631处理原代肝脏细胞后能够显著抑制脂肪合成相关基因acc1和pparγ的表达，而显著促进脂肪分解相关基因hsl，cpt1，lpl和pparα的基因表达，结果如图4，该结果表明通过上述方案得到的Amuc_1631蛋白能够参与鱼类肝脏细胞脂质代谢基因的表达调控。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白，其特征在于，所述重组表达的阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白是重组菌pET21a-Amuc_1631-BL21通过诱导表达并纯化获得，所述重组菌pET21a-Amuc_1631-BL21是将重组质粒pMD20-T-Amuc_1631转化大肠杆菌BL21获得，所述重组质粒pMD20-T-Amuc_1631是将目的基因Amuc_1631导入pET21a质粒汇总获得。
2.根据权利要求1所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白，其特征在于，所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白，其特征在于，所述目的基因Amuc_1631的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白用于制备治疗鱼类脂肪肝的代谢调节剂的应用。
5.根据权利要求3所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白用于制备治疗鱼类脂肪肝的代谢调剂剂的应用，其特征在于，所述重组表达阿克曼氏菌Amuc_1631蛋白通过抑制脂肪合成相关基因accl和ppary的表达，上调脂肪分解相关基因hsl，cptl，lpl和ppara的表达，实现对脂肪肝鱼类的代谢调节。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117965391A (zh) * | 2024-03-27 | 2024-05-03 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1及其用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020076136A2 (ko) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | 서울대학교산학협력단 | 아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이의 용도 |
| CN113330109A (zh) * | 2018-10-11 | 2021-08-31 | Ko生物技术有限公司 | 嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株及其用途 |
| CN115698043A (zh) * | 2020-04-24 | 2023-02-03 | Ko生物技术有限公司 | 具有glp-1诱导活性的蛋白质变体及其用途 |
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- 2023-12-04 CN CN202311643241.3A patent/CN117756898A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020076136A2 (ko) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | 서울대학교산학협력단 | 아커만시아 뮤시니필라 균주 및 이의 용도 |
| CN113330109A (zh) * | 2018-10-11 | 2021-08-31 | Ko生物技术有限公司 | 嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株及其用途 |
| CN115698043A (zh) * | 2020-04-24 | 2023-02-03 | Ko生物技术有限公司 | 具有glp-1诱导活性的蛋白质变体及其用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BAE M等: "Akkermansia muciniphila phospholipid induces homeostatic immune responses.", 《NATURE.》, vol. 608, no. 7921, 31 August 2022 (2022-08-31), pages 168 - 173, XP037926235, DOI: 10.1038/s41586-022-04985-7 * |
| NAM, Y.-D.等: "CP024740", 《GENBANK》, 29 January 2019 (2019-01-29) * |
| 王亚娓等: "嗜黏蛋白阿克曼菌对鲤糖代谢的调控机制", 《水产学报》, vol. 48, no. 2, 1 February 2024 (2024-02-01) * |
| 董新燕;刘曼妮;刘雪;刘敏;张翔凌;王国庆;: "嗜粘蛋白阿克曼菌Amuc_1100蛋白对高脂饲料联合链脲佐菌素干预大鼠的预防保护作用", 卫生研究, no. 05, 15 September 2020 (2020-09-15) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117965391A (zh) * | 2024-03-27 | 2024-05-03 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1及其用途 |
| CN117965391B (zh) * | 2024-03-27 | 2024-06-07 | 四川厌氧生物科技有限责任公司 | 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1及其用途 |
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