CN117737091A - 一种牛cybb基因的单碱基错义突变及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种牛CYBB基因的单碱基错义突变，单碱基错义突变的牛CYBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。牛CYBB功能基因的重要单核苷酸突变，达到了降低结核分支杆菌感染巨噬细胞引发铁死亡的作用，同时，降低了的分支杆菌在细胞内的增殖能力。

Description

一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用。

背景技术

我国奶牛养殖业疫病问题突出，常规育种和现有疫病防控措施无法解决结核病等重大疫病防控难题；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染所致的结核病，目前是重大危及人体健康的国际性重要感染疾病；全球约1/4人口是Mtb的潜伏感染者。同时，牛结核病(Bovine tuberculosis，bTB)是一种由细胞内牛分枝杆菌(M.bovis)感染引起的家畜慢性呼吸道传染病，特别在奶牛中，据保守预测，该疾病每年将为全世界农民造成多达30亿美金的经济损失。目前挖掘奶牛抗结核的功能基因非常有限。

CYBB基因(也称为gp91phox、NOX2等)编码Cytochrome B-245Beta Chain，是人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶复合物的重要组成部分。它主要在吞噬细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)中表达，属于蛋白编码基因，其突变易导致遗传性免疫缺陷病症—X-CGD(X连锁慢性肉芽肿病)；CYBB又是MSMD(遗传性分枝杆菌易感综合征mendelian susceptibility to mycobacterial disease)的重要基因，但机理尚未可知。同时，CYBB是铁死亡重要驱动基因。Mtb感染巨噬细胞引起细胞发生铁死亡是否与CYBB基因调控有关，Mtb是否通过CYBB调控从而获得胞内铁等具体机制尚未得知。

因此，提供一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛CYBB基因的单碱基错义突变，单碱基错义突变的牛CYBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，含有所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变的载体。

进一步，含有所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变的宿主菌。

进一步，所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、所述的载体或所述的宿主菌在制备抗结核病制剂中的应用。

进一步，所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、所述的载体或所述的宿主菌在制备抗结核分枝杆菌感染制剂中的应用。

进一步，所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、所述的载体或所述的宿主菌在制备降低结核分枝杆菌在巨噬细胞中增殖制剂中的应用。

进一步，牛CYBB基因的单碱基错义突变通过控制宿主铁死亡降低结核分枝杆菌在巨噬细胞中的增殖。

进一步，所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、所述的载体或所述的宿主菌在抗结核病奶牛育种中的应用。

通过结核分支杆菌H37Ra感染巨噬细胞RAW264.7和J774A.1细胞，发现牛CYBB基因的野生型(bCYBB-WT)和c.105614637A&T单碱基突变体(bCYBB-mut)均能极显著降低H37Ra感染24h内胞内Fe²⁺的浓度；然而，bCYBB-WT延续了细胞在感染24h后的胞内Fe²⁺含量，而与pCMV-HA空载和bCYBB-WT相比，bCYBB-mut却能极显著降低感染24h后胞内Fe²⁺的含量。此外，bCYBB-mut能降低胞内因为结合分支杆菌感染而引起的大量脂质过氧化物丙二醛MDA，同时能清除线粒体释放的大量活性氧ROS。从而抑制H37Ra在细胞内的增殖，实现巨噬细胞对结核分支杆菌的免疫作用。

该基因重要单碱基突变以及发现突变体得出重要功能，有望利用基因编辑技术，创制高产、抗病奶牛育种新材料，提升种业自筹创新能力。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种牛CYBB基因的单碱基错义突变及其应用，牛CYBB功能基因的重要单核苷酸突变，达到了降低结核分支杆菌感染巨噬细胞引发铁死亡的作用，同时，降低了的分支杆菌在细胞内的增殖能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明CYBB基因T和A等位基因在全世界52个牛品种中的地理分布；

图2附图为本发明pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut的Sanger测序图谱；

图3附图为本发明pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut的载体图谱；

图4附图为本发明FerroOrange胞内亚铁离子荧光探针检测结果；

其中，A：RAW264.7细胞；B：J774A.1细胞；

图5附图为本发明RAW264.7和J774A.1细胞内总铁和亚铁测定结果；

其中，bCYBB-WT：pCMV-HA-bCYBB-WT；bCYBB-mut：pCMV-HA-bCYBB-mut；

图6附图为本发明RAW264.7和J774A.1细胞内MDA测定结果；

其中，bCYBB-WT：pCMV-HA-bCYBB-WT；bCYBB-mut：pCMV-HA-bCYBB-mut；

图7附图为本发明RAW264.7和J774A.1细胞内活性氧测定结果；

其中，A：RAW264.7细胞；B：J774A.1细胞；

图8附图为本发明RAW264.7和J774A.1细胞攻菌后CFU实验结果；

其中，bCYBB-WT：pCMV-HA-bCYBB-WT；bCYBB-mut：pCMV-HA-bCYBB-mut。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

现在对奶牛抗结核的功能基因的挖掘非常有限，本发明通过全基因组关联数据GWAS，大数据挖掘发现CYBB基因一个潜在功能位点。

从来自全球52个牛品种的GWAS数据中挖掘出CYBB基因中一个潜在关键错义突变，这个等位基因突变在欧洲牛和中国普通牛中高度受选择。CYBB基因T和A等位基因(c.105614637A&T,rs435291920)在全世界52个牛品种中的地理分布见图1；该位点普通牛是亮氨酸(L)，瘤牛是甲硫氨酸(M)。(注：瘤牛抗结核能力强于普通牛)。

CYBB(Bos taurus，cytochrome b-245beta chain)CDS序列：1713bp。

其中，CDS序列第709位为A，为瘤牛(单碱基错义突变)，如SEQ ID NO.1所示。若CDS序列第709位为T，则为普通牛(野生型)。

ATGGGGAACTGGGTTGTGAATGAGGGCATCTCCATCTTTGTCATTCTGGTATGGCTGGGGATGAACGTCTTCCTTTTTGTCTGGTACTACCGGGTTTATGATATCCCAGATAAGTTCTTTTACACTCGAAAACTTCTTGGGTCAGCGCTGGCCCTGGCCAGAGCCCCTGCAGCCTGCCTGAATTTCAACTGCATGCTGATTCTGCTGCCTGTCTGTCGAAATCTGCTCTCCTTCCTCAGGGGTTCCAGTGCGTGCTGCTCAACAAGAATTCGGAGACAACTGGACAGGAACCTCACCTTTCATAAAATGGTGGCATGGATGATTGCACTTCACACTGCAATTCATACCATTGCACATCTATTTAATGTGGAGTGGTGTGTGAATGCCCGAGTCAACAATTCTGATCCTTATTCAATAGCACTCTCTGACATTGGAGATAAGCCTAATGAAACTTACCTCAATTTTGTTCGACAGAGAATCAAGAATCCTGAAGGAGGCCTGTATGTGGCTGTGACTCGGTTGGCAGGCATCACTGGAGTCGTCATTACACTGTGCCTGATATTAATTATCACATCCTCCACCAAAACCATCCGGAGGTCTTATTTTGAAGTGTTTTGGTACACACACCATCTCTTTGTGATCTTCTTCATTGGTCTCGCCATCCATGGAGCTCAGCGGATTGTACGTGGGCAGACTGCAGAGAGTTTGATGAAACACCAACCAAGAAACTGTTATCAAAACATCTCACAGTGGGGAAAAATAGAGAACTGCCCAATCCCAGAGTTCTCTGGGAACCCTCCTATGACTTGGAAATGGATAGTGGGTCCCATGTTCCTGTATCTCTGTGAGAGGTTGGTACGGTTTTGGAGATCTCAACAGAAGGTGGTCATCACCAAGGTGGTCACTCACCCTTTCAAAACCATCGAGCTCCAGATGAAGAAGAAAGGATTCAAGATGGAGGTGGGCCAATACATTTTCGTCAAGTGTCCCGTGGTGTCCAAGCTGGAGTGGCACCCTTTCACCCTGACCTCTGCCCCTGAGGAAGACTTCTTTAGCATCCATATCCGCATCGTGGGGGACTGGACAGAGGGACTCTTCAAAGCTTGTGGCTGTGATAAGCAGGAGTTTCAAGATGCCTGGAAACTACCAAAGATAGCTGTTGACGGGCCCTTTGGCACTGCCAGTGAGGACGTGTTCAGTTACGAGGTGGTGATGTTAGTGGGAGCAGGGATCGGGGTTACGCCCTTTGCATCCATCCTCAAGTCGGTCTGGTACAAATATTGCAATAAAGCCCCAAATCTGAGGCTCAAAAAGATCTACTTCTACTGGCTGTGCCGGGACACACATGCCTTTGAGTGGTTTGCGGACCTGCTGCAGCTGCTGGAAACACAGATGCAGGAGAAGAACAACACGGACTTCCTCAGCTACAACATCTGCCTCACTGGCTGGGATGAGTCTCAGGCCAGTCACTTTGCTATGCATCATGACGAGGAGAAAGATGTAATCACAGGCCTGAAACAAAAGACCTTGTATGGACGACCCAACTGGGATAACGAGTTCAAGACCATTGGAAGTCAACATCCCAATACCAGAATAGGAGTCTTCCTCTGCGGACCGGAAGCCTTGGCTGACACCCTTAATAAGCAGTGCATCTCCAACTCCGACTCTGGCCCCAGGGGAGTGCATTTCATTTTCAACAAGGAAAACTTCTAA；SEQ ID NO.1。

实施例2bCYBB-WT/mut的载体构建

(一)bCYBB-WT的载体构建

1)牛肺部组织RNA提取：

(1)新鲜胎牛肺组织装入含生理盐水的保温瓶中，四小时内送入实验室，用75％酒精过3～5秒，37℃生理盐水清洗三次；

(2)放入提前紫外杀菌好的超净工作台中，分离牛胎儿的肺部组织后放入1.5mL的EP管，转入液氮，研钵用液氮预冷，组织和液氮混合研磨，成粉末状后转l.5mL EP管中，加1mL Trizol，震荡混匀后室温静置5min；

(3)加200μL氯仿/管，剧烈震荡15s，观察其充分乳化后冰上静置10min；

(4)4℃，12000rpm/min，15min，将上层水相转入新的1.5mL EP管；

(5)加100μL冷异丙醇/管，上下颠倒10～15次后冰上放置10min；

(6)4℃，12000rpm/min，10min，吸弃掉上清；

(7)加200μL冷的75％乙醇/管，轻柔混匀1min；

(8)4℃，7500rpm/min，5min，弃掉酒精，冰上晾干RNA沉淀；

(9)加40μL的DEPC H₂O溶解RNA沉淀；

(10)分光光度计检测RNA浓度，电泳检测RNA是否降解；260/280在1.8-2.0之间，没有降解。

2)RNA反转录cDNA：

(1)基因组DNA的去除体系见表1。

表1反应体系

PCR反应条件为：在42℃，2min。

(2)逆转录反应获得cDNA：在步骤(1)得到的16μL反应液中加入4μL5×HiScriptIIQrt superMix II(诺唯赞公司)混匀，设置反应条件在PCR仪中为：55℃孵育15min；85℃，5s。

3)以cDNA为模板进行PCR扩增：

扩增模板是牛肺部的cDNA，用2×Taq PCR MasterMix对牛CYBB基因进行PCR扩增，引物序列如下：

pCMV-HA-bCYBB-WT-F：

5′-GTCGACgATGGGGAACTGGGTTGTGAA-3′；SEQ ID NO.2；

pCMV-HA-bCYBB-WT-R：

5′-GGTACCTTAGAAGTTTTCCTTGTTGA-3′；SEQ ID NO.3；

反应体系见表2，反应条件见表3。

表2目的基因PCR扩增体系

表3目的基因PCR扩增反应条件

PCR终产物经凝胶电泳检测，获得1713bp的条带。

4)扩增产物回收与鉴定：

PCR扩增产物胶回收(OMEGA公司的Gel Extraction Kit D2500)

(l)在凝胶成像系统的UV照射下，40s内切下目的条带凝胶，转2mL EP管；

(2)加Binding Buffer(XP2)使其能完全覆盖过胶块，置于55℃加热器，期间轻摇晃，等凝胶完全溶解，转移冰上放3min；

(3)溶解液以每次700μL的体积转提前备好的HiBindcTMDNA柱+收集管，12000rpm/min，30s离心，弃去液体，加完所有溶胶液为止；

(4)向吸附柱子中加入300μL XP2，12000rpm/min，1min离心，弃液；

(5)向柱中加700μL SPW Washbuffer清洗，12000rpm/min，1min，弃液；

(6)重复步骤5；

(7)12000rpm/min空离1min，甩干残余液体，弃收集管；

(8)吸附柱转至新1.5mL离心管，37℃烘箱中2min后加入20μL，55℃的去离子H₂O，12000rpm/min，2min离心，检测产物浓度，-20℃保存备用。

胶回收产物送上海生工公司进行测序。

5)测序成功的CYBB片段用SalⅠ、KpnI酶切连接的方法构建到pCMV-HA空载体得到pCMV-HA-bCYBB-WT载体。

对目的条带和骨架载体进行双酶切，酶切体系见表4。

表4酶切反应体系

酶切反应程序：在PCR仪中37℃孵育1h，之后进行琼脂糖电泳，回收符合预期的条带，获得1713bp的条带。

载体连接：采用诺唯赞Ligation Mix DNA连接酶试剂盒进行载体构建。将酶切后的线性化载体：1个或者多个片段的摩尔质量＝1：3的比例进行混合，随后加入同源重组酶，在PCR仪中37℃孵育30min进行连接。连接体系见表5。

表5连接体系

计算公式为：线性化载体质量＝[0.02×载体碱基数]ng，目的片段质量＝[0.06×目的片段碱基数]ng。其中线性化载体pCMV-HA的使用量为0.03pmol，所有插入目的片段的总量为0.09pmol。

(二)构建bCYBB-mut载体：

1)pCMV-HA-bCYBB-WT载体为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：

pCMV-HA-CYBB-mut-F-1：

5′-GTCGACgATGGGGAACTGGGTTGTGAA-3′；SEQ ID NO.4；

pCMV-HA-CYBB-mut-R-1：

5′-TGGTGTTTCATCAAACTCTC-3′；SEQ ID NO.5；

pCMV-HA-CYBB-mut-F-2：

5′-GAGAGTTTGATGAAACACCA-3′；SEQ ID NO.6；

pCMV-HA-CYBB-mut-R-2：

5′-GGTACCTTAGAAGTTTTCCTTGTTGA-3′；SEQ ID NO.7。

扩增体系和反应条件同上述扩增CYBB基因，先分别扩增出1片段(引物pCMV-HA-bCYBB-mut-F-1、pCMV-HA-bCYBB-mut-R-1)和2片段(引物pCMV-HA-bCYBB-mut-F-2、pCMV-HA-bCYBB-mut-R-2)。1和2片段中都包含T-A突变位点。然后用1片段上游引物pCMV-HA-bCYBB-mut-F-1和2片段的下游引物pCMV-HA-bCYBB-mut-R-2为PCR引物，以1和2片段作为底物扩增bCYBB-mut片段。酶切连接反应体系同上。将带有酶切位点的片段构建到pCMV-HA空载体得到pCMV-HA-bCYBB-mut载体。

(三)转化、涂板及摇菌：

取10μL连接反应液(野生型或突变体载体)加到100μL新解冻的Trans1-T1细胞中，轻轻吹吸几次，冰上30min后42℃水浴锅中90s，而后冰上2min，加900μL复苏液，37℃，200rpm/min恒温摇床摇晃1h；12000rpm/min离心1min，弃上清800μL，剩下的液体用移液枪轻轻吹打混匀，滴到含氨苄抗性的LB琼脂平板均匀涂开，37℃培养箱中过夜。8-12h后，用10μL枪头挑取单个大小合适的菌落，移入500μL含氨苄抗性的肉汤中，37℃，200rpm/min的恒温摇床中培养10h。

(四)菌液PCR鉴定及送测序：

取1μL菌液进行PCR，反应体系同PCR扩增体系一样，后进行琼脂糖凝胶电泳，挑选与预期一致的样品，取200μL菌液送测序，判定载体构建是否成功。pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut的测序结果见图2，表明载体构建成功。载体图谱见图3。

(五)去内毒素质粒的提取：

将测序成功的菌液进行扩大培养，并使用OMEGA公司的去内毒素质粒小提试剂盒E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini KitⅠ提取质粒。

(1)将扩大培养的菌液在室温12000rpm/min离心5min，弃上清，留沉淀；

(2)在沉淀中加500μL Solution I，轻吹至完全混匀，转移至2mL EP管；

(3)加500μL Solution II，上下混匀至液体变清，室温放置2min；

(4)加250μL预冷的N3 Buffer，颠倒混匀后会出现白色絮状沉淀，4℃，12000rpm/min离心10min；

(5)上清转至新2mL EP管，加0.1倍体积的ETR液，冰上10min，期间上下摇晃4次；

(6)42℃孵育5min，后室温12000rpm/min离心3min；

(7)上清转至新的2mL EP管，加0.5倍体积无水乙醇混匀，室温2min；

(8)每次取700μL的液体加入柱+管中，12000rpm/min离心1min，弃废液，滤完全部液体；

(9)柱子中加500μL HB Buffer，以去除残留的蛋白质，室温下12000rpm/min离心1min，弃废液；

(10)加700μL DNA Wash Buffer，室温12000rpm/min离心1min；

(11)重复(10)，12000rpm/min空离2min，放入37℃烘箱2min；

(12)向吸附柱中加30μL 56℃的三蒸水，12000rpm/min离心2min，分别获得pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut质粒，测量浓度后用于后续试验。

实施例3结核菌培养与细胞感染

分别以小鼠巨噬细胞RAW264.7和J774A.1细胞为细胞模型，结核菌株H37Ra购自美国标准细胞库(ATCC 25177)，于7H9培养液(Fluka-SigmaAldrich,USA)中在37℃条件下培养到对数时期，按照MOI为20(细胞数：细菌数＝1：20)加入H37Ra(此为0点)，37℃孵育4h，而后用PBS清洗3遍除掉未感染成功的细菌，添加含有50μg/mL庆大霉素的DMEM细胞培养液作用1h后换新鲜培养液继续培养细胞。上述为攻菌实验操作流程，用于后续实施例的攻菌实验。7H9液体培养基：90ml水+0.47g 7H9+80μl Tween；高压灭菌后等温度降到60μ以下，加索莱宝公司10ml一管的增菌液和2ml过氧化氢液。7H9试剂均购自Millipore Sigma公司。

实施例4FerroOrange胞内亚铁离子荧光探针检测实验

铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注，游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子(Fe²⁺)和铁离子(Fe³⁺)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe²⁺的水溶性时，了解Fe²⁺的行为比了解Fe³⁺的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe²⁺进行荧光成像。

所需材料：二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)或乙醇，HBSS，无血清培养基，微量移液器

溶液制备：在含有24μg FerroOrange的管中加入35μl DMSO，用移液器吹打混匀，配制得到1mmol/l FerroOrange溶液。用HBSS(或无血清培养基)溶液稀释1mmol/l的FerroOrange溶液，制备得到1μmol/l的FerroOrange工作液。(DMF或乙醇也可以代替DMSO进行制备。该溶液在-20℃稳定1个月。1mol/l FerroOrange工作液不稳定。需要现配现用，并尽快使用。*必要时，可使用无血清培养基代替HBSS，血清会增加背景)。

操作步骤：

1)分别接种RAW264.7和J774A.1细胞于荧光培养皿中，在37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

2)弃去上清液，并用PBS洗涤细胞1次。

3)更换新鲜的DMEM细胞培养基，使用3000试剂，按照试剂说明分别转染pCMV-HA空载、pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut质粒到细胞中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后进行结合分支杆菌H37Ra攻菌实验。

4)在攻菌36h时，去除培养基，用HBSS或无血清培养基清洗3次。

5)加入浓度为1μmol/l的FerroOrange工作液(如果光弱，可在1-5μmol/l范围内摸索最佳染色浓度)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养30分钟。*无需清洗，培养后直接进行观察。

6)在荧光显微镜下观察细胞，结果如图4所示。图4结果显示，在两种巨噬细胞中，bCYBB-mut能显著降低因为结核分支杆菌感染而引发的胞内大量增加的二价铁离子(橙色荧光是二价铁离子染色)。

实施例5RAW264.7和J774A.1细胞内总铁和亚铁测定

利用细胞总铁比色法测试盒(Cell Total Iron ColorimetricAssay Kit)、/>细胞亚铁比色法测试盒(Cell Ferrous Iron ColorimetricAssay Kit)按照说明进行测定，酶标仪(590-600nm，最佳检测波长为593nm)。

分别以小鼠巨噬细胞RAW264.7和J774A.1细胞为细胞模型，分别转染pCMV-HA空载、pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut质粒，在攻菌后1、6、12、24、36和48h分别收集细胞，按照上述总铁和亚铁试剂盒测定胞内总铁和亚铁离子含量，结果如图5所示。发现牛CYBB基因的野生型(bCYBB-WT)和c.105614637A&T单碱基突变体(bCYBB-mut)均能极显著降低H37Ra感染24h内胞内Fe²⁺的浓度；然而，bCYBB-WT延续了细胞在感染24h后的胞内Fe²⁺含量，而与pCMV-HA空载和bCYBB-WT相比，bCYBB-mut却能极显著降低感染24h后胞内Fe²⁺的含量。

实施例6RAW264.7和J774A.1细胞内脂质过氧化物测定

丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是脂质过氧化物分解后形成的一种化合物。因此，MDA是检测细胞和组织中脂质过氧化物的最常见的指标之一，在氧化应激、铁死亡等领域的研究中被广泛使用。MDA Assay Kit可以检测样品中的MDA浓度，通过硫代巴比妥酸(TBA)与水解产生的MDA反应形成的TBA复合体的吸光度或荧光强度来检测样品中的丙二醛(MDA)。实验设计为五组重复，每组4样品。

操作步骤：

(1)Substrate stock solution的制备:向试剂盒中的Substrate管(红盖)中加入400μl DMSO，超声振荡至完全溶解。*配制好的Substrate stock solution在-20℃保存。(可稳定保存2个月)

(2)Antioxidant PBS solution的制备：向微管中加入PBS。向含有PBS的管中加入Antioxidant并混匀。

(3)Working solution的制备：向锥形管内加入DilutionBuffer。向含有DilutionBuffer的锥形管中加入Substrate。*配制好的Working solution无法长期保存，当天内用完。

(4)细胞样品的制备：1)将细胞悬液(RAW264.7：2.5×10⁷cells，J774A.1：1.5×10⁷cells)加至1.5ml微管中；2)用离心机300×g离心5min，去除上清。3)加入1ml PBS，吹打形成均匀的细胞悬液后，300×g离心5min，去除上清。4)加入100μl Antioxidant PBSsolution，吹打混匀。

(5)检测：1)向样品管和标准品管中加入100μl Lysis Buffer，用涡旋振荡器充分混匀后室温静置5min。*由于溶液的粘性较高，只靠吹打无法充分混匀，请务必使用涡旋振荡器。2)各微管中加入250μl Working solution，涡旋振荡器充分混匀。3)在95℃下，培养15min。4)冰浴上冷却5min。5)用离心机10,000×g离心10min。取100μl上清加至96孔板(黑板)中。6)用荧光酶标仪检测检测荧光强度(Ex:540nm,Em:590nm)。

结果如图6所示，分别以小鼠巨噬细胞RAW264.7和J774A.1细胞为细胞模型，将实验分为Control等四组，实验组分别转染pCMV-HA空载、pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut质粒，结果发现CYBB-mut能显著降低因为结核分支杆菌感染而引发的胞内过量脂质过氧化物丙二醛MDA。

实施例7RAW264.7和J774A.1细胞内活性氧测定

ROS(Reactive Oxygen Species)主要是在线粒体中合成ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面，ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。最近的研究发现，由二价铁所诱发的芬顿反应所引起的一种新的细胞死亡方式(铁死亡，Ferroptosis)的研究领域里ROS也被广泛关注，检测ROS的需求和意义也在不断升高。目前在检测ROS时，使用最多的试剂是DCFH-DA。但是DCFH-DA往往有灵敏度低、样品荧光与背景的差别不明显等问题。ROS AssayKit-Highly Sensitive DCFH-DA高灵敏度活性氧检测试剂盒是一种高灵敏度的ROS检测试剂盒，而且配套使用本试剂盒内附带的Buffer，可以在相对更低的细胞毒性下对ROS进行高灵敏度检测。

操作步骤：

(1)Loading Buffer solution的配制：用超纯水10倍稀释Loading Buffer(10x)制成Loading Buffer solution。

(2)Highly Sensitive DCFH-DA Working solution的配制：用Loading Buffersolution 1000倍稀释Highly Sensitive DCFH-DA Dye，制成Working solution。

(3)细胞处理：对转染了bCYBB的RAW264.7和J774A.1细胞进行攻菌36h后，去除培养基，用PBS清洗细胞2次。去除上清，添加配制好的Working solution，37℃、5％CO₂培养箱内培养30min。去除Working solution，用PBS清洗细胞2次后再次加入PBS在激光共聚焦显微镜下检测(Ex:488nm；Em:500-550nm)。

分别以小鼠巨噬细胞RAW264.7和J774A.1细胞为细胞模型，将实验分为Control等四组，实验组分别转染pCMV-HA空载、pCMV-HA-bCYBB-WT和pCMV-HA-bCYBB-mut质粒；实验结果如图7所示，在两种巨噬细胞中，CYBB-mut能显著降低因为结核分支杆菌感染而引发的胞内线粒体释放的活性氧ROS(绿色荧光)。

实施例8RAW264.7和J774A.1细胞攻菌后CFU实验

菌落形成单位(CFU,colony forming units)，是指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数量的单位。

(1)在12Well板中按照RAW264.7：6×10⁵个/well，J774A.1：2.9×10⁵个/well铺好细胞。攻菌完成(4h、12h、24h、36h、48h、72h)。PBS清洗3-5次；

(2)加入1ml 0.1％Triton X-100的PBS裂解细胞，室温裂解5min，吹下来4500g离心5min，弃上清，沉淀用100μl PBS重悬(原液)。

(3)根据攻菌时间的不同，在攻菌4h将原液稀释到10^-1，12h将原液稀释到10^-2，24h将原液稀释到10^-2，36h将原液稀释到10^-3，48h将原液稀释到10^-4，72h将原液稀释到10^-4，将收集的原液稀释到不同数量级进行7H10固体培养基中涂板，培养3天统计单个菌落数。

(7H10固体培养基：90ml ddH₂O+1.947g 7H10+500μl甘油；高压灭菌后等温度降到60℃以下，加入索莱宝公司的10ml一管的增菌液和2ml过氧化氢液，混匀后倒板四度储存)；7H10试剂均购自Millipore Sigma公司。

实验结果如图8所示，在两种巨噬细胞中，CYBB-mut能显著降低结核分支杆菌在细胞内的增殖。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种牛CYBB基因的单碱基错义突变，其特征在于，单碱基错义突变的牛CYBB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变的载体。

3.含有权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变的宿主菌。

4.权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、权利要求2所述的载体或权利要求3所述的宿主菌在制备抗结核病制剂中的应用。

5.权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、权利要求2所述的载体或权利要求3所述的宿主菌在制备抗结核分枝杆菌感染制剂中的应用。

6.权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、权利要求2所述的载体或权利要求3所述的宿主菌在制备降低结核分枝杆菌在巨噬细胞中增殖制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，牛CYBB基因的单碱基错义突变通过控制宿主铁死亡降低结核分枝杆菌在巨噬细胞中的增殖。

8.权利要求1所述的牛CYBB基因的单碱基错义突变、权利要求2所述的载体或权利要求3所述的宿主菌在抗结核病奶牛育种中的应用。