CN117736990A

CN117736990A - 一种实现细胞分化的体外培养法以及由此得到的细胞群及其用途

Info

Publication number: CN117736990A
Application number: CN202211110084.5A
Authority: CN
Inventors: 周琪; 李伟; 胡宝洋; 王昱凯; 郝捷; 于娟; 王柳; 田瑶
Original assignee: Beijing Institute Of Stem Cell And Regenerative Medicine; Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Beijing Institute Of Stem Cell And Regenerative Medicine; Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本申请具体涉及一种角膜内皮细胞的获得方法，初始细胞可以为多能干细胞来源，也可以为神经嵴细胞来源。具体地，本申请公开了使用化学成分完全明确的培养基将多能干细胞定向高效地诱导生成角膜内皮细胞。本申请还涉及一种CEC细胞及其在治疗角膜内皮病中的应用。

Description

一种实现细胞分化的体外培养法以及由此得到的细胞群及其用途

技术领域

背景技术

目前，全球因角膜内皮损伤需要角膜移植的患者高达650万，而实际得到移植的只占2％，角膜供需严重失衡。2018年Kinoshita发表于“新英格兰” 的一项工作表明，体外培养的人原代角膜内皮细胞(CEC)移植于患者体内具有显著的治疗效果。多能干细胞(PSC)分化获得的角膜内皮细胞，不需依赖捐献的角膜，在治疗角膜内皮病方面具有重大的临床应用价值。科学家们已经尝试使用人胚干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(iPSC)分化获得角膜内皮细胞，主要是模拟体内发育分为两个阶段：第一阶段，将hESCs 或iPSC诱导分化为神经嵴细胞(NCC)；第二阶段，由神经嵴分化获得成熟的角膜内皮细胞。从目前已发表工作看，第一阶段比较成熟，但第二阶段 (包括从多能干细胞向角膜内皮细胞分化，虽部分文章未提及神经嵴细胞，但同样经历了此中间过程)的分化方法良莠不齐、大多依赖于共培养，培养基成分不明确、含有动物源性，且涉及的分化通路不明晰。

发明内容

本申请提供了：

1.用于在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞时加入培养基的组合物，其包括：TGF-β抑制剂、WNT激活剂以及TGF-β激活剂；可选地包括ROCK抑制剂。

2.如项1所述的组合物，其中，

所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自SB431542、SB505124、 A83-01中的一种或两种或三种；

所述WNT激活剂选自GSK3β抑制剂、Wnt3A、Wnt1中的一种或两种或三种；所述GSK3β抑制剂选自CHIR99021、GSK3β抑制剂IX、GSK3β 抑制剂VII、Indirubin、L803-mts、TWS119、AZD2858、AR-A014418、 TDZD-8、LY2090314、2-D08、IM-12、1-Azakenpaullone、SB216763中的一种或两种或三种以上；

所述TGF-β激活剂选自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、SRI-011381(氢氯化物)中一种或两种或三种以上；

优选所述ROCK抑制剂为Y-27632。

3.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的组合物，其包括： TGF-β抑制剂、WNT抑制剂以及bFGF抑制剂；可选地包括ROCK抑制剂。

4.如项3所述的组合物，其中，

所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自SB431542、SB505124、 A83-01中的一种、两种或三种；

所述WNT抑制剂为DKK2多肽或WNT信号通路抑制剂，其选自 XAV-939、IWR-1中的一种或两种；

所述bFGF抑制剂为选自：VEGFR抑制剂、FGFR1抑制剂以及PDGFRβ 抑制剂中的一种、两种或三种；优选地，所述bFGF抑制剂为SU-5402；

优选所述ROCK抑制剂为Y-27632。

5.用于将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的培养基，其包括：如项1 或2所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

b)血清替代物、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)、非必需氨基酸、L-抗坏血酸和维生素C合剂 (L-AA)；

其中，所述TGF-β抑制剂的加入至培养基的浓度为1μM-100mM；所述WNT激活剂的加入至培养基的浓度为：10nM–100μM；所述TGF-β激活剂的加入至培养基的浓度为：0.1ng/ml–100μg/ml；所述ROCK抑制剂的加入至培养基的浓度为10nM-100μM。

6.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的培养基，其包括：如项3或4所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

其中，所述TGF-β抑制剂在培养基中的浓度为1μM-100mM；当所述 WNT抑制剂是蛋白时，其在培养基中的浓度为1ng/ml-100μg/ml，当所述 WNT抑制剂是小分子化合物时，其在培养基中的浓度为10nM-10μM；所述bFGF抑制剂的在培养基中的浓度为10nM-10μM；所述ROCK抑制剂在培养基中的浓度为10nM-100μM。

7.如项5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物为选自下组的一项或多项：KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser^TM G。

8.如项5或6所述的培养基，其中，所述非必需氨基酸为选自下组的一项或多项：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、 L-脯氨酸、L-丝氨酸。

9.如项5或6所述的培养基，其中，所述基础培养基为选自下组的一项或多项：KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、α-MEM、F-12、 MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM。

10.如项5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物占所述基础培养基的1％-50％；所述谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽占所述基础培养基的1％-20％；所述ITS占所述基础培养基的1％-20％；所述非必需氨基酸占所述基础培养基的1％-20％；所述维生素合剂(L-AA)占所述基础培养基的0.1％-10％。

11.一种通过体外培养使多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)的方法，其包括：使用如项1或2所述的组合物或项5、以及引用项5时的项7-10的任一项所述的培养基对多能干细胞进行培养。

12.一种通过体外培养使神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC) 的方法，其包括：使用项3或4所述的组合物或项6、以及引用项6时的项7-10 的任一项所述的培养基对多能干细胞进行培养。

13.一种通过体外培养法使多能干细胞分化为角膜内皮细胞(CEC) 的方法，其中，所述方法为两阶段培养法，首先在第一阶段多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)，然后在第二阶段神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC)，其中第一阶段使用项11的方法而第二阶段采用项12 的方法。

14.一种角膜内皮细胞(CEC)，所述角膜内皮细胞表达下述标志物的一种或多种：DCN、LUM、SPARCL1、SERPINF1、SERPING1、CXCL3、AEBP1、 RARRES2、PCOLCE、HTRA1、FTL、ANGPTL7、LOX、PMP22、VMO1、 EMP3、ARNT、SDC2、COLEC12、ANXA5、JUN、SQSTM1、CTSZ、PLPP3、CTSL、LMNA、GADD45A、ABCA6、TSC22D1和TIMP3。

15.一种药物组合物，其包含如项14所述的CEC细胞以及药学上可接受的辅料。

16.如项14所述的CEC细胞或如项15所述的组合物在制备用于治疗与角膜内皮细胞相关的疾病的药物中的用途。

17.如项16所述的用途，其中所述与角膜内皮细胞相关的疾病包括： Fuchs角膜内皮营养不良、虹膜角膜内皮综合症、后部多形性角膜营养不良、先天性遗传性角膜内皮营养不良、以及需角膜内皮移植治疗的继发性疾病。

本申请取得的有益技术效果

本申请建立了一种成分明确、不含动物源性，无需共培养，仅由小分子或因子诱导就可获得角膜内皮细胞的分化方法，并描述了该细胞的新型标志物，为治疗角膜内皮病提供基础，更好地解决全球角膜短缺的困境。

附图说明

图1显示了由人胚干细胞向角膜内皮细胞分化的示意图，其中标示了分化各阶段细胞表面标志物表达情况。

图2显示了人胚干细胞向神经嵴细胞的分化；其中，A：优化后的神经嵴细胞分化体系；B：D10神经嵴细胞形态特征；C：流式细胞术分析 D10神经嵴细胞标志物；D：免疫荧光染色分析D10神经嵴细胞标志物。

图3显示了神经嵴细胞向角膜内皮细胞的分化。

图4显示了分化的角膜内皮细胞标志物鉴定；其中，A：流式细胞术分析ZO-1的表达比例；B：免疫荧光染色分析ZO-1,Na+/K+ATPase, FOXC1,PITX2,N-Cadherin的表达。

图5显示了分化角膜内皮细胞分化不同时间点RNA-seq数据分析；在此，图5A显示了聚类分析和PCA分析结果：分化不同时间点的角膜内皮细胞与已发表文献中原代角膜内皮细胞的数据作比对，结果显示分化D23 天的角膜内皮细胞与原代角膜内皮细胞更相似；而图5B显示了角膜内皮基因热图结果。

图6显示了SU-5402对于角膜内皮细胞分化的重要作用；在此，图 6A显示，如在角膜内皮细胞分化体系中添加SU-5402，标志物Na+/K+ ATPase表达比例高；而未添加SU-5402的角膜内皮细胞不表达Na+/K+ ATPase；图6B显示，使用100nM SU-5402分化角膜内皮细胞，特异性基因相对表达量最高；图6C中，q-PCR结果也证明，使用高浓度(10μM) SU-5402分化角膜内皮细胞，特异性基因相对表达量与100nM SU-5402 相比，差异并不显著；图6D显示，标志物Na+/K+ATPase表达比例最高， PITX2出现表达。

图7显示了神经嵴分化阶段加入TGFβ2对角膜内皮细胞分化效率的影响。

图8为角膜内皮细胞的体内功能评估；其中，A为术后不同时间点的角膜透明度；B为术后不同时间点的角膜厚度，角膜透明度统计图；C为术后 D28裂隙灯检查，角膜内皮共聚焦和光学相干断层成像；D为术后D28角膜取材，冰冻切片后的免疫荧光染色鉴定。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。

如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。

在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和 “和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。

贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

除非另有说明，否则本发明的实践可以使用在本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。可以通过参考下文的实施例来获得适当技术的具体说明。但是，当然也可以使用其他等效的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准的实验室手册中找到，例如：分子遗传学和遗传工程中的普通方法可参见例如 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等，ColdSpring Harbor； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，Miller和Calos编；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，Wiley&Sons；细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可参见例如Current Protocols in Protein Science，J.E.Colligan等编，Wiley&Sons；Current Protocols in Cell Biology， J.S.Bonifacino等，Wiley&Sons和Current Protocols in Immunology， J.E.Colligan等编，Wiley&Sons；细胞培养方法通常参见Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，R.I.Freshney编，Wiley&Sons；General Techniques of Cell Culture，M.A.Harrison和I.F.Rae，Cambridge Univ.Press和 Embryonic Stem Cells：Methods and Protocols，K.Turksen编，Humana Press。其它感兴趣的参考文献包括Culture Is Our Business，M.McLuhan，Ballantine Books，1970)；和Understanding Media，M.McLuhan，Signet，1970；所有这些文献出于所有目的通过引用整体并入本文。

本申请在第一方面提供了一种诱导分化组合物(多能干细胞至NCC)。

在一个具体实施方式中，提供了一种用于在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞时加入培养基的组合物，其包括：TGF-β抑制剂、WNT激活剂以及TGF-β激活剂；可选地包括ROCK抑制剂。

在本说明书的上下文中，术语“多能干细胞”是指来源于人或非人动物的多能干细胞，具体可以为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。胚胎干细胞来源可以是人或非人动物。在本说明书的上下文中，术语“神经嵴细胞”和“NCC”可互换使用，是一种胚胎发育过程中的过渡性细胞，这种细胞经诱导后可分化为角膜内皮细胞。NCC可通过现有的标志物进行鉴定，例如，SOX10、AP2、 HNK1、PAX3、PAX7和P75(NGFR)，以及低表达或不表达PAX6。

在本说明书的上下文中，TGF-β激活剂具体地为TGFβ2，TGFβ2具体地在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的过程的后半段才被加入培养基中，这样的添加方式有利于在随后的使神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC)的过程中更顺利地生成CEC。

在又一具体实施方式中，提供了一种组合物，该组合物可以为诱导分化的目的加入培养基，其中，所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自 SB431542、SB505124、A83-01中的一种或两种或三种；所述TGF-β抑制剂的加入至培养基的浓度为1μM-100mM；具体地，该浓度可以为1μM、2μM、 5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、2mM、5mM、 10mM、20mM、50mM、100mM。

所述WNT激活剂选自GSK3β抑制剂、Wnt3A、Wnt1中的一种或两种或三种；所述GSK3β抑制剂选自CHIR99021、GSK3β抑制剂IX、GSK3β抑制剂VII、Indirubin、L803-mts、TWS119、AZD2858、AR-A014418、TDZD-8、 LY2090314、2-D08、IM-12、1-Azakenpaullone、SB216763中的一种或两种或三种以上；所述WNT激活剂的加入至培养基的浓度为：10nM-100μM；具体地，该浓度可以为10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、 2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

所述TGF-β激活剂选自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、SRI-011381(氢氯化物)中一种或两种或三种以上；所述TGF-β激活剂的加入至培养基的浓度为：0.1ng/ml–100μg/ml；具体地，该浓度可以为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、 1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、 500ng/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。

优选所述ROCK抑制剂为Y-27632，所述ROCK抑制剂的加入至培养基的浓度为10nM-100μM；具体地，该浓度可以为10nM、20nM、50nM、100nM、 200nM、500nM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

在本说明书的上下文中，所述GSK3β抑制剂IX又称6-溴靛玉红-3’- 肟，BIO(BIO是GSK3β抑制剂IX的缩写)；所述GSK3β抑制剂VII又称4-二溴苯乙酮。

在本说明书的上下文中，“加入浓度”是指所提及的大分子或者小分子物质在相应的培养基中的质量浓度或摩尔浓度。

本申请在第二方面涉及一种诱导分化组合物(NCC至CEC)。

在一个具体实施方式中，提供了一种用于在将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞时加入培养基的组合物，其包括：TGF-β抑制剂、WNT抑制剂以及bFGF抑制剂；可选地包括ROCK抑制剂。

如本文所用，术语“角膜内皮细胞”和“CEC”可互换使用，又称眼前房内皮，角膜后上皮，是紧贴于后弹力层后面的一层单层细胞。其示例性标志物包括但不限于：Na+/K+ATPase、ZO-1、KLF13、AQP1、CollagenVIII、SLC16A3、 CFTR、NBC1、CA2、AE2/SCL4A2、SLC16A1、CA12、CA4和FOXC1。

在又一具体实施方式中，提供了一种组合物，该组合物可以为诱导分化的目的加入培养基，其中，所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自SB431542、SB505124、A83-01中的一种、两种或三种；所述TGF-β 抑制剂的加入至培养基的浓度为1μM-100mM；具体地，该浓度可以为1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、2mM、 5mM、10mM、20mM、50mM、100mM。

所述WNT抑制剂为DKK2多肽或WNT信号通路抑制剂，其选自 XAV-939、IWR-1中的一种或两种；所述WNT抑制剂在培养基中的浓度为1ng/ml-100μg/ml(蛋白)、10nM-10μM(小分子化合物)；具体地，当所述WNT抑制剂是蛋白质时，该浓度可以为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、2μg/ml、 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml；具体地，当所述WNT抑制剂是小分子化合物时，该浓度可以为10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、 500nM、1μM、2μM、5μM、10μM。

所述bFGF抑制剂为选自：VEGFR抑制剂、FGFR1抑制剂以及PDGFRβ 抑制剂中的一种、两种或三种；优选地，所述bFGF抑制剂为SU-5402；所述bFGF抑制剂的加入至培养基的浓度为10nM-10μM；具体地，该浓度可以为10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、2μM、5μM、 10μM。

本申请在第三方面涉及一种诱导分化培养基(多能干细胞至NCC)。

在一个具体实施方式中，提供了用于将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的培养基，其包括：如在第一方面所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

b)血清替代物、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)、非必需氨基酸、L-抗坏血酸和维生素C合剂 (L-AA)。

如本文所用，术语“基础培养基”是指本领域已知用于支持体外细胞生长的任何已知的细胞培养基，一般地，其是包含规定的基础溶液的培养基，其包含盐、糖类、氨基酸和维持培养物中的细胞处于存活状态所需的任何其他营养物。可以根据本发明使用的商业上可获得的基础培养基的非限制性实例包括但不限于MEM、α-MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12(DF12)、Neurobasal和knockout DMEM(KODMEM)。基础培养基可以补充有本领域已知的处理细胞培养物的多种试剂。

本申请在第四方面涉及一种诱导分化培养基(NCC至CEC)。

在一个具体实施方式中，提供了用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的培养基，其包括：如第四方面所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

上面所述的第三方面和第四方面的培养基还具有下述特征：

在一个具体实施方式中，所述血清替代物为选自下组的一项或多项： KOSR、MSC无血清添加剂、UltroserTMG。

在又一具体实施方式中，所述非必需氨基酸为选自下组的一项或多项：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、 L-丝氨酸。

在另一具体实施方式中，所述基础培养基为选自下组的一项或多项： KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、 RPMI 1640、G-MEM。

在一个具体实施方式中，所述血清替代物占所述基础培养基的 1％-50％；所述谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽占所述基础培养基的1％-20％；所述ITS占所述基础培养基的1％-20％；所述非必需氨基酸占所述基础培养基的1％-20％；所述维生素合剂(L-AA)占所述基础培养基的0.1％-10％。

本申请在第五方面涉及诱导细胞分化的方法。

在一个具体实施方式中，提供了一种通过体外培养使多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)的方法，其包括：使用第一方面所述的组合物或第三方面所述的培养基对多能干细胞进行培养，且在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的过程的后半段才加入TGFβ2。

在本说明书的上下文中，“在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的过程的后半段”特指神经嵴分化阶段的第六日之后至该分化阶段结束之间的任何时间段；例如，在神经嵴分化阶段的第6日至第10日才加入TGFβ2；或者在第7日至第10日才加入TGFβ2；或者在第8日至第10日才加入TGFβ2；或者在第9日至第10日才加入TGFβ2。

在又一具体实施方式中，提供了一种通过体外培养使神经嵴细胞(NCC) 分化为角膜内皮细胞(CEC)的方法，其包括：使用第二方面所述的组合物或第四方面所述的培养基对多能干细胞进行培养。

在再一具体实施方式中，提供了一种通过体外培养法使多能干细胞分化为角膜内皮细胞(CEC)的方法，其中，所述方法为两阶段培养法，首先在第一阶段多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)，然后在第二阶段神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC)。

本申请在第六方面涉及一种角膜内皮细胞。

在一个具体实施方式中提供了一种角膜内皮细胞(CEC)，所述角膜内皮细胞表达下述标志物的一种或多种：DCN、LUM、SPARCL1、SERPINF1、 SERPING1、CXCL3、AEBP1、RARRES2、PCOLCE、HTRA1、FTL、ANGPTL7、 LOX、PMP22、VMO1、EMP3、ARNT、SDC2、COLEC12、ANXA5、JUN、 SQSTM1、CTSZ、PLPP3、CTSL、LMNA、GADD45A、ABCA6、TSC22D1 和TIMP3。

本申请在第七方面涉及一种药物组合物。

在一个具体实施方式中提供了一种药物组合物，其包含上述CEC细胞以及药学上可接受的辅料。

本申请在第八方面涉及CEC细胞的用途。

在一个具体实施方式中，提供了上述CEC细胞或上述药物组合物在制备用于治疗与角膜内皮细胞相关的疾病的药物中的用途。

在又一具体实施方式中，提供了上述用途，其中所述与角膜内皮细胞相关的疾病包括：Fuchs角膜内皮营养不良、虹膜角膜内皮综合症、后部多形性角膜营养不良、先天性遗传性角膜内皮营养不良、以及需角膜内皮移植治疗的继发性疾病。

实施例1角膜内皮细胞分化实验

实验材料：

人胚干细胞，6孔板；

试剂：

Essential 6,Knockout DMEM Medium,KOSR,CTS–GlutaMax,ITS, NEAA,L-Ascorbic acid(L-AA),SB431542,CHIR 99021,DKK2,SU-5402；

仪器设备：

生物安全柜，CO₂培养箱，流式细胞仪，荧光共聚焦显微镜。

NCC分化基础培养基

试剂比例 50mL中添加量

Essential 6 Medium 99％ 49.5ml

CTS-GlutaMax 1％ 0.5ml

CEC分化基础培养基

第一阶段：

NCC分化(参照Barber,K.,et al.(2019).“Derivation of enteric neuronlineages from human pluripotent stem cells.”NatProtoc 14(4):1261-1279.)

D0-D10基础培养基：Essential 6+1％GlutaMax+10μM SB431542；

D0-D1:+0.6μM CHIR99021；

D2-D5:+1.5μM CHIR99021；

D6-D10：+1.5μM CHIR99021+10ng/ml TGFβ2。

第二阶段：CEC分化

D11-D23基础培养基：KODMEM+15％KOSR+1％GlutaMax+1％ ITS+1％NEAA+0.1％L-AA+10μM SB431542+10ng/ml DKK2+100nM SU-5402；

D11:+10μM Y-27632；

D12-D23:只加基础培养基。

具体操作步骤如下：

D0：D0前两天以6×10⁴/cm²的密度将ESC接种到6孔板中，D0每孔加入3ml培养基Essential 6+1％GlutaMax+10μM SB431542+0.6μM CHIR99021；

D1：弃去D0培养基每孔加入3ml培养基Essential 6+1％GlutaMax+ 10μMSB431542+0.6μM CHIR99021；

D2-D5：每次弃去前一天培养基，每孔加入3.5ml培养基Essential 6+ 1％GlutaMax+10μM SB431542+1.5μM CHIR99021；

D6-D10：每次弃去前一天培养基，每孔加入3.5ml培养基Essential 6+ 1％GlutaMax+10μM SB431542+1.5μM CHIR99021+10ng/ml TGFβ2；

D11：将分化成熟的NCC消化为单细胞，以1×10⁵/cm²的密度接种到6 孔板中，每孔加入2ml培养基KODMEM+15％KOSR+1％GlutaMax+1％ ITS+1％NEAA+0.1％L-AA+10μMSB431542+10ng/ml DKK2+100nM SU-5402+10μMY-27632；

D12-D23：弃去前一天培养基，每孔加入2ml培养基KODMEM+1％ GlutaMax+1％NEAA+0.1％L-AA+10μM SB431542+10ng/ml DKK2+ 100nM SU-5402，隔天换液。

RNA-seq测序：取分化D15、D19和D23的角膜内皮细胞进行RNA-seq 测序。选取其中高表达、未在以往人或鼠源角膜内皮细胞中报道的、非管家基因进行进一步qPCR验证。

qPCR验证：对RNA-seq测序中找到的基因设计引物，以分化的角膜内皮细胞为实验组，以成纤维细胞或多能干细胞为对照进行qPCR，从CT值和相对表达量验证该基因确实在角膜内皮细胞中表达。

实验结果

第一阶段，人胚干细胞向神经嵴细胞的分化。图2A显示优化后的神经嵴细胞分化体系，仅使用2种小分子就可分化获得神经嵴细胞，分化10-11 天后成熟。D0-D10分化所用基础培养基为Essential 6,1％GlutaMax,10μM SB431542；D0-D1在基础培养基基础上添加0.6μM CHIR99021,D2-D10在基础培养基基础上添加1.5μM CHIR99021。分化D10的细胞致密、形态均一(图2B)，并且对分化D10的细胞进行了标志物的流式检测(图2C)和免疫荧光鉴定(图2D)，结果显示分化D10的神经嵴细胞各个特异性标志物表达比例高。获得高比例的神经嵴细胞可以为角膜内皮细胞的分化提供良好的基础。其中，流式细胞术分析显示，神经嵴细胞标志物P75阳性率高达 95％以上，HNK1阳性率高达99％以上；免疫荧光鉴定结果显示，神经嵴细胞标志物P75,NESTIN,SOX10和AP2α表达比例高，说明我们获得了高纯度的神经嵴细胞。

第二阶段，为了由神经嵴细胞分化获得成熟的角膜内皮细胞，我们参考已发表文献并进行了大量的通路和小分子筛选，建立了角膜内皮细胞的分化体系(图3A)。首先，在第一阶段D2-D10培养基基础上，从D6开始添加 10ng/ml TGFβ2直至D10；D11-D23分化所用基础培养基为KODMEM,15％ KOSR,1％GlutaMax,1％ITS,1％NEAA,0.1％L-AA,10μMSB431542,10 ng/ml DKK2,100nM SU-5402；D11接种细胞需要在基础培养基基础上添加 10μMY-27632,D12-D23只加基础培养基即可。分化D23的角膜内皮细胞形态呈六边形，10倍镜下观察形态呈铺路石状，放大到20倍和40倍镜下可观察到细胞形态呈清晰的六边形(图3B)。说明我们分化获得了与原代角膜内皮细胞形态相似的角膜内皮细胞。同时，我们对角膜内皮细胞的表面标志物进行了流式检测(图4A)以及免疫荧光鉴定(图4B)，其中，流式细胞术分析ZO-1和Na+/K+ATPase的表达比例，免疫荧光染色分析ZO-1, Na+/K+ATPase,N-Cadherin和Aquaporin 1的表达。结果显示，分化D23的角膜内皮细胞可表达其标志物ZO-1,Na+/K+ATPase,N-Cadherin和 Aquaporin 1，标志物ZO-1阳性率高达98％以上，Na+/K+ATPase阳性率高达99％以上，二者双阳性率高达99％以上，说明我们获得了成熟的角膜内皮细胞。

同时，我们在角膜内皮细胞分化阶段，选取不同的时间点对细胞取样，进行RNA-seq数据分析，并与文献报道中的原代角膜内皮细胞的数据进行比对(图5)。其中图5A显示聚类分析和PCA分析结果。分化不同时间点的角膜内皮细胞与已发表文献中原代角膜内皮细胞的数据作比对，结果显示分化D23天的角膜内皮细胞与原代角膜内皮细胞更相似。图5B显示角膜内皮基因热图结果。分化D23的角膜内皮细胞与原代角膜内皮细胞基因表达模式更相似。并且，从RNA-seq数据中，我们还寻找到了角膜内皮细胞的新型标志物DCN,LUM,SPARCL1,SERPINF1,SERPING1,CXCL3,AEBP1, RARRES2,PCOLCE,HTRA1等(见表1)。

DCN	LUM	SPARCL1	SERPINF1
				SERPING1	CXCL3	AEBP1	RARRES2
PCOLCE	HTRA1	FTL	ANGPTL7
				LOX	PMP22	VMO1	EMP3
ARNT	SDC2	COLEC12	ANXA5
				JUN	SQSTM1	CTSZ	PLPP3
CTSL	LMNA	GADD45A	ABCA6
				TSC22D1	TIMP3

表1根据本申请的方法得到的角膜内皮细胞的标志物

实施例2培养基中添加剂对角膜内皮细胞分化的影响

1.SU-5402对角膜内皮细胞分化的影响

参照实施例1中方法，对ESC进行诱导培养。调整D11-D23培养基中 SU-5402浓度以评价其对于角膜内皮细胞分化的影响，结果见图6。

结果显示，角膜内皮细胞分化体系中添加SU-5402，标志物Na+/K+ ATPase表达比例高；而未添加SU-5402的角膜内皮细胞不表达Na+/K+ ATPase(图6A)。

使用100nM SU-5402分化角膜内皮细胞，特异性基因相对表达量(图 6B)最高，标志物Na+/K+ATPase表达比例最高，PITX2出现表达(图6D)。同时，q-PCR结果也证明，使用高浓度(10μM)SU-5402分化角膜内皮细胞，特异性基因相对表达量与100nM SU-5402相比，差异并不显著(图6C)。

2.TGFβ2对角膜内皮细胞分化效率的影响。

参照实施例1中方法，对ESC进行诱导培养。调整D6-D10培养基中 TGFβ2浓度以评价其对角膜内皮细胞分化效率的影响，结果见图7。

结果显示，在神经嵴分化阶段，D6-D10期间分别用不同浓度的TGFβ2 处理，再进行角膜内皮细胞的分化。q-PCR结果显示，当用10ng/ml的TGFβ2 处理神经嵴细胞时，角膜内皮细胞特异性基因相对表达量高。

表2“两阶段法”中使用的用于细胞诱导分化的组合物的总结

实施例3角膜内皮细胞治疗角膜内皮病的实验结果

为了评估角膜内皮细胞的体内功能，选取兔作为动物模型，机械刮除其自身角膜内皮细胞后，将分化的角膜内皮细胞用DiI(一种红色细胞膜探针) 标记，移植到兔眼内。术后D7可观察到，移植组的角膜开始恢复透明，D28 移植组角膜透明度明显恢复，而对照组角膜则始终保持严重混浊状态(图 8A)。同时，分别在不同时间点对两组动物的角膜厚度和角膜透明度进行统计，结果显示术后D21天移植组与对照组相比，角膜厚度存在显著差异，且术后移植组始终比对照组角膜透明程度高(图8B)。术后D28对两组动物分别做角膜检查，裂隙灯观察(SL)结果显示移植组比对照组角膜透明程度高；角膜内皮共聚焦(HRT3)结果显示移植组可观察到大量角膜内皮细胞，对照组不存在角膜内皮细胞；光学相干断层成像(OCT)结果显示，移植组比对照组的角膜厚度明显偏低(图8C)。体内观察结束后，对所有移植组和对照组的动物角膜取材，冰冻切片后进行免疫荧光染色鉴定，结果显示角膜内皮细胞标志物(ZO-1)、细胞膜标记(DiI)和人源细胞标志物(Stem121) 共表达(图8D)。这说明角膜内皮细胞对角膜内皮病具有一定的治疗效果。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims

1.用于将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的组合物，其包括：TGF-β抑制剂、WNT激活剂以及TGF-β激活剂；可选地包括ROCK抑制剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自SB431542、SB505124、A83-01中的一种或两种或三种；

所述WNT激活剂选自GSK3β抑制剂、Wnt3A、Wnt1中的一种或两种或三种；所述GSK3β抑制剂选自CHIR99021、GSK3β抑制剂IX、GSK3β抑制剂VII、Indirubin、L803-mts、TWS119、AZD2858、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、IM-12、1-Azakenpaullone、SB216763中的一种或两种或三种以上；

优选所述ROCK抑制剂为Y-27632。

3.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的组合物，其包括：TGF-β抑制剂、WNT抑制剂以及bFGF抑制剂；可选地包括ROCK抑制剂。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，

所述TGF-β抑制剂为ALK4受体抑制剂，其选自SB431542、SB505124、A83-01中的一种、两种或三种；

所述WNT抑制剂为DKK2多肽或WNT信号通路抑制剂，其选自XAV-939、IWR-1中的一种或两种；

所述bFGF抑制剂为选自：VEGFR抑制剂、FGFR1抑制剂以及PDGFRβ抑制剂中的一种、两种或三种；优选地，所述bFGF抑制剂为SU-5402；

优选所述ROCK抑制剂为Y-27632。

5.用于将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的培养基，其包括：如权利要求1或2所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

b)血清替代物、谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)、非必需氨基酸、L-抗坏血酸和维生素C合剂(L-AA)；

其中，所述TGF-β抑制剂在培养基中的浓度为1μM-100mM；所述WNT激活剂在培养基中的浓度为：10nM–100μM；所述TGF-β激活剂在培养基中的浓度为：0.1ng/ml–100μg/ml；所述ROCK抑制剂在培养基中的浓度为10nM-100μM。

6.用于将神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮细胞的培养基，其包括：如权利要求3或4所述的组合物；还包括：

a)基础培养基；以及

其中，所述TGF-β抑制剂在培养基中的浓度为1μM-100mM；当所述WNT抑制剂是蛋白时，其在培养基中的浓度为1ng/ml-100μg/ml，当所述WNT抑制剂是小分子化合物时，其在培养基中的浓度为10nM-10μM；所述bFGF抑制剂的在培养基中的浓度为10nM-10μM；所述ROCK抑制剂在培养基中的浓度为10nM-100μM。

7.如权利要求5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物为选自下组的一项或多项：KOSR、MSC无血清添加剂、Ultroser^TM G。

8.如权利要求5或6所述的培养基，其中，所述非必需氨基酸为选自下组的一项或多项：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

9.如权利要求5或6所述的培养基，其中，所述基础培养基为选自下组的一项或多项：KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM。

10.如权利要求5或6所述的培养基，其中，所述血清替代物占所述基础培养基的1％-50％；所述谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的稳定化二肽占所述基础培养基的1％-20％；所述ITS占所述基础培养基的1％-20％；所述非必需氨基酸占所述基础培养基的1％-20％；所述维生素合剂(L-AA)占所述基础培养基的0.1％-10％。

11.一种通过体外培养使多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)的方法，其包括：使用如权利要求1或2所述的组合物或权利要求5、以及引用权利要求5时的权利要求7-10的任一项所述的培养基对多能干细胞进行培养，且在将多能干细胞诱导分化为神经嵴细胞的过程的后半段才加入TGFβ2。

12.一种通过体外培养使神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC)的方法，其包括：使用权利要求3或4所述的组合物或权利要求6、以及引用权利要求6时的权利要求7-10的任一项所述的培养基对多能干细胞进行培养。

13.一种通过体外培养法使多能干细胞分化为角膜内皮细胞(CEC)的方法，其中，所述方法为两阶段培养法，首先在第一阶段多能干细胞分化为神经嵴细胞(NCC)，然后在第二阶段神经嵴细胞(NCC)分化为角膜内皮细胞(CEC)，其中第一阶段使用权利要求11的方法而第二阶段采用权利要求12的方法。

14.一种角膜内皮细胞(CEC)，所述角膜内皮细胞表达下述标志物的一种或多种：DCN、LUM、SPARCL1、SERPINF1、SERPING1、CXCL3、AEBP1、RARRES2、PCOLCE、HTRA1、FTL、ANGPTL7、LOX、PMP22、VMO1、EMP3、ARNT、SDC2、COLEC12、ANXA5、JUN、SQSTM1、CTSZ、PLPP3、CTSL、LMNA、GADD45A、ABCA6、TSC22D1和TIMP3。

15.一种药物组合物，其包含如权利要求14所述的CEC细胞以及药学上可接受的辅料。

16.如权利要求14所述的CEC细胞或如权利要求15所述的组合物在制备用于治疗与角膜内皮细胞相关的疾病的药物中的用途。

17.如权利要求16所述的用途，其中所述与角膜内皮细胞相关的疾病包括：Fuchs角膜内皮营养不良、虹膜角膜内皮综合症、后部多形性角膜营养不良、先天性遗传性角膜内皮营养不良、以及需角膜内皮移植治疗的继发性疾病。