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CN117730149A - 单链rna纯化方法 - Google Patents

单链rna纯化方法 Download PDF

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CN117730149A
CN117730149A CN202280048643.6A CN202280048643A CN117730149A CN 117730149 A CN117730149 A CN 117730149A CN 202280048643 A CN202280048643 A CN 202280048643A CN 117730149 A CN117730149 A CN 117730149A
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CN
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rna
mol
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antibody
dsrna
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Application number
CN202280048643.6A
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English (en)
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迈克尔·T·切尔托
艾伦·大卫·爱德华兹
约瑟夫·路易斯·巴尔贝里欧
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
2 Savinti Biology
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Publication date
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Abstract

本公开涉及经改进的治疗性RNA组合物。更具体地，本公开涉及用于纯化治疗性RNA和相关治疗性RNA制剂的经改进的方法。

Description

单链RNA纯化方法
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2021年6月14日提交的美国临时申请第63/210,101号的权益，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入到本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为BLUE-136_PC_SL.txt。文本文件大小为39,804字节，于2022年6月9日创建并且通过EFS-Web以电子方式与本说明书同时提交。
背景
技术领域
本公开涉及经改进的RNA组合物。更具体地，本公开涉及用于纯化治疗性RNA和相关治疗性RNA制剂的经改进的方法。
背景技术
在过去的30至40年中，基于RNA的技术缓慢出现，近年来随着用于RNA递送的新方法的开发和证明体内有效，所述技术已得到越来越多的关注。例如，已经使用RNAi(例如，siRNA、shRNA或miRNA)、核酶、适体和相关技术来降低疾病相关蛋白的表达或调节其活性。在其它情况下，为了治疗目的，RNA已经用于体外、离体或体内表达蛋白质。然而，在某些情况下双链RNA(dsRNA)对细胞是有毒的。仍然需要开发用于从RNA制剂中特异性去除dsRNA的经改进的方法，特别是用于体内治疗用途。
发明内容
本公开总体上部分涉及包括dsRNA去除步骤的RNA纯化方法/过程。在一些实施例中，所述方法/过程包括一个或多个oligo dT纯化步骤和dsRNA去除步骤。
一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及纯化所述单链RNA。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及纯化所述单链RNA；由此产生治疗性RNA。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括编码核酸酶的单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及纯化所述单链RNA；其中与由未与和dsRNA结合的抗体接触的RNA编码的核酸酶的编辑速率相比，所述核酸酶的编辑速率提高。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及纯化所述单链RNA；其中所述RNA在施用于细胞或受试者时的免疫原性和/或毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体接触时施用于细胞或受试者的RNA的免疫原性和/或毒性。在一些实施例中，所述受试者是人。
在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。
在各个实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括在使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触之前的聚腺苷酸化步骤。
在各个实施例中，所述方法包括：使聚腺苷酸化的RNA样品与第一寡核苷酸dT(oligo dT)探针接触，所述oligo dT探针与聚腺苷酸化的RNA结合；以及在使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触之前，从所述样品中去除未结合的RNA。
在各个实施例中，所述方法进一步包括在与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触之后，使所述聚腺苷酸化的RNA与第二寡核苷酸dT探针接触。
在各个实施例中，所述RNA样品是通过化学合成从头获得的。在一些实施例中，所述RNA样品是从体外转录反应中获得的。
在各个实施例中，经纯化的RNA在施用于细胞时的如通过阻抗测量的细胞毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触时施用于细胞的RNA的所述细胞毒性。
在各个实施例中，所述第一寡核苷酸dT探针和/或所述第二寡核苷酸dT探针与表面结合。在一些实施例中，所述第一寡核苷酸dT探针和/或所述第二寡核苷酸dT探针与所述表面共价连接。
在各个实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。在一些实施例中，所述RNA是从体外转录反应中获得的并被共转录地加帽。在一些实施例中，所述帽是帽0或帽1。在一些实施例中，所述帽是ARCA帽或经修饰的ARCA帽。在一些实施例中，使用加帽酶、鸟苷三磷酸和S-腺苷基-L-甲硫氨酸对所述样品中的所述RNA在其5'端处进行加帽。在特定实施例中，所述加帽酶是牛痘鸟苷酸转移酶。在一些实施例中，所述加帽包括鸟苷三磷酸。在一些实施例中，所述加帽包括S-腺苷基-L-甲硫氨酸。在一些实施例中，所述加帽包括2'-O-甲基转移酶。
在各个实施例中，所述与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、美洲驼Ig、羊驼Ig、Ig NAR、Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、迷你抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)。在一些实施例中，所述与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗体选自由以下组成的组：J2、J5、K1、K2、1D3、CABT-B212和9D5。在特定实施例中，所述抗体是J2。
在各个实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与至少约1.5mol％、至少约2mol％、至少约2.5mol％、至少约3mol％、至少约3.5mol％、至少约4mol％、至少约4.5mol％、至少约5mol％、至少约5.5mol％、至少约6mol％、至少约6.5mol％、至少约7mol％、至少约7.5mol％、至少约15mol％、至少约30mol％或至少约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与至少约1.5mol％、至少约7.5mol％、至少约15mol％、至少约30mol％或至少约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与至少约7.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％、约5mol％、约5.5mol％、约6mol％、约6.5mol％、约7mol％、约7.5mol％、约15mol％、约30mol％或约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约2mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约2.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约3mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约3.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约4mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约4.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约5.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约6mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约6.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约15mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约30mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约30mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约15mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约7.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约7mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约6.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约6mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约5.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约4.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约4mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约3.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约3mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约2.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约2mol％的抗体接触。
在各个实施例中，通过基于抗体的亲和色谱法将所述dsRNA:抗体复合物与所述单链RNA分离。在一些实施例中，所述基于抗体的亲和色谱法包括1ml柱。在一些实施例中，所述基于抗体的亲和色谱法包括5ml柱。在一些实施例中，所述基于抗体的亲和色谱法包括10ml柱。
在各个实施例中，所述方法包括在IVT步骤之前的质粒消化步骤。
在各个实施例中，所述方法进一步包括用DNA酶处理所述样品以去除残留质粒DNA模板的步骤。在一些实施例中，所述DNA酶处理步骤在IVT步骤之后和/或在加帽步骤之后发生。
在各个实施例中，所述方法进一步包括一个或多个超滤/渗滤(UF/DF)步骤。在一些实施例中，所述UF/DF步骤在质粒消化步骤、体外转录步骤、帽反应步骤或亲和色谱法步骤(例如，dT或J2)之后。
在各个实施例中，所述方法进一步包括最终无菌过滤步骤。在一些实施例中，所述最终无菌过滤步骤包括通过0.22μm过滤器过滤。
在各个实施例中，所述核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。在一些实施例中，所述核酸酶是归巢核酸内切酶、megaTAL、CRISPR相关核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些实施例中，所述CRISPR相关核酸酶是Cas9或其变体。
在各个实施例中，施用所述经纯化的RNA的受试者体内的天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的AST水平。
在各个实施例中，施用所述经纯化的RNA的受试者体内的IL-6水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的IL-6水平。
在各个实施例中，施用所述经纯化的RNA的受试者体内的MCP-1水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的MCP-1水平。
附图说明
图1A-1F示出了用于说明性RNA纯化方法的不同单元操作。
图2A示出了使用不同色谱法柱体积以去除过量抗dsRNA抗体的纯化的mRNA的dsRNA斑点印迹分析。
图2B示出了使用不同色谱法柱体积以去除过量抗dsRNA抗体的纯化的mRNA的样品中dsRNA含量％。
图2C示出了使用荧光标记的次级对经纯化的mRNA进行斑点印迹分析以直接对残留的抗dsRNA抗体进行印迹分析。
图3A和3B示出了使用不同量的抗dsRNA抗体的经纯化的mRNA样品中的dsRNA含量％。
图3C和3D示出了使用不同量的抗dsRNA抗体的经纯化的mRNA的体外细胞毒性。
图4A示出了通过不同方法纯化的样品中的全长mRNA ％。
图4B示出了通过不同方法纯化的样品中的dsRNA含量％。
图4C示出了通过不同方法纯化的mRNA样品的体外细胞毒性。
图4D示出了在通过不同方法纯化的由mRNA编码的PCSK9 megaTAL和Trex2进行体内编辑之后的INDEL变化倍数％。
图4E示出了通过不同方法纯化的PCSK9 megaTAL和Trex2 mRNA的体内毒性。
图4F示出了由通过不同方法纯化的PCSK9 megaTAL和Trex2 mRNA诱导的免疫原性(细胞因子/趋化因子释放)的程度。
图5A示出了通过不同方法纯化的样品中的全长mRNA％。
图5B示出了通过不同方法纯化的样品中的dsRNA含量％。
图5C示出了通过不同方法纯化的mRNA样品的体外细胞毒性。
图5D示出了在通过不同方法纯化的由mRNA编码的PD-1megaTAL进行离体编辑之后的INDEL％。
图5E示出了在通过不同方法纯化的由mRNA编码的PD-1megaTAL进行离体编辑之后的PD-1表面表达％。
图6A示出了不同RNA纯化方法中的dsRNA含量％。
图6B示出了RNA制剂的细胞毒性与dsRNA含量％之间的相关性。
序列标识符简要说明
SEQ ID NO:1是TCRαmegaTAL DNA序列。
SEQ ID NO:2是TCRαmegaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:3是TCRαmegaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:4是PD1 megaTAL DNA序列。
SEQ ID NO:5是PD1 megaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:6是PD1 megaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:7是PCSK9 megaTAL DNA序列。
SEQ ID NO:8是PCSK9 megaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:9是PCSK9 megaTAL RNA序列。
SEQ ID NO:10是Trex2 DNA序列。
SEQ ID NO:11是Trex2 RNA序列。
SEQ ID NO:12是Trex2 RNA序列。
在前述序列中，X(如果存在的话)是指任何氨基酸或不存在氨基酸。
具体实施方式
A.概述
本公开总体上部分涉及RNA纯化和RNA组合物制备的经改进的方法。更具体地，本公开涉及用于将双链RNA(dsRNA)与治疗性单链治疗性RNA和相关治疗性单链RNA组合物分离的经改进的方法。RNA制剂可以用于体外、离体或体内。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人已经发现，使用抗dsRNA抗体(例如，基于抗体的亲和色谱法)的RNA纯化在纯化单链RNA和降低离体和体内递送至细胞的RNA的免疫原性和细胞毒性方面令人惊讶地有效。在特定实施例中，所述RNA纯化方法包括一个或多个oligo dT纯化步骤和基于抗dsRNA抗体的去除步骤。
因此，RNA免疫原性和毒性的问题通过利用抗dsRNA抗体去除和/或oligo dT纯化来解决，如本文进一步所描述的。使用特定实施例中考虑的组合物和方法纯化的RNA适于体外、离体或体内应用。
一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及纯化所述RNA。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。在一些实施例中，所述方法包括：使所述RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的一种或多种寡核苷酸dT(oligo dT)探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化单链聚腺苷酸化的RNA。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；以及从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；由此纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种RNA纯化方法，其包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及使所述样品与第二寡核苷酸dT探针接触以捕获单链聚腺苷酸化的RNA；由此纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
在特定实施例中，所述RNA是治疗性RNA(例如，mRNA)。在特定实施例中，所述RNA编码治疗性多肽。
另一方面，提供了一种用于提高核酸酶编辑效率的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA；其中与由未与和dsRNA结合的抗体接触的RNA编码的核酸酶的编辑速率相比，所述核酸酶的编辑速率提高。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种用于提高核酸酶编辑效率的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；以及从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；其中与由未与和dsRNA结合的抗体接触的RNA编码的核酸酶的编辑速率相比，所述核酸酶的编辑速率提高。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种用于提高核酸酶编辑效率的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及使所述样品与第二寡核苷酸dT探针接触以捕获单链聚腺苷酸化的RNA；其中与由未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的RNA编码的核酸酶的编辑速率相比，所述核酸酶的编辑速率提高。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
在各个实施例中，核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。在一些实施例中，所述核酸内切酶是归巢核酸内切酶、megaTAL、CRISPR相关核酸酶(例如，Cas9和其变体)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
另一方面，提供了一种用于降低向细胞或受试者施用的RNA的免疫原性和/或毒性的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA；其中所述RNA在施用于细胞或受试者时的免疫原性和/或毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体接触时施用于细胞或受试者的RNA的免疫原性和/或毒性。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种用于降低向细胞或受试者施用的RNA的免疫原性和/或毒性的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；以及从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；其中所述RNA在施用于细胞或受试者时的免疫原性和/或毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体接触时施用于细胞或受试者的mRNA的免疫原性和/或毒性。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
另一方面，提供了一种用于降低向细胞或受试者施用的RNA的免疫原性和/或毒性的方法，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及使所述样品与第二寡核苷酸dT探针接触以捕获单链聚腺苷酸化的RNA；其中所述RNA在施用于细胞或受试者时的免疫原性和/或毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体接触时施用于细胞或受试者的RNA的免疫原性和/或毒性。在各个实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在一些实施例中，所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括聚腺苷酸化步骤。在一些实施例中，所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
在本文所考虑的实施例中的任何实施例中，抗dsRNA抗体选自由以下组成的组：J2、J5、K1、K2、1D3、CABT-B212和9D5，或其功能衍生物或片段。在特定实施例中，抗dsRNA抗体是J2。
在实施例中的任何实施例中，本文所考虑的方法、程序或过程可以包括另外的步骤，例如质粒线性化/消化、体外转录、渗滤、超滤和最终过滤。
用于重组(即，经工程化的)DNA、肽和寡核苷酸合成、免疫测定、组织培养、转化(例如，电穿孔、脂质转染)、酶促反应、纯化的技术以及相关技术和程序总体上可以如本说明书通篇引用和讨论的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫学中的各种通用且更具体的参考文献中所描述的来执行。参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰·威利父子出版公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I卷和第II卷(美国牛津大学出版社IRL出版社(IRL Press,Oxford Univ.Press USA),1985)；《当代免疫学手册(Current Protocols in Immunology)》,编辑：John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,DavidH.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober 2001纽约州纽约市约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,NY,NY)；《实时PCR：当前技术和应用(Real-Time PCR:CurrentTechnology and Applications)》,编辑：Julie Logan,Kirstin Edwards和NickSaunders,2009,英国诺福克凯斯特学术出版社(Caister Academic Press,Norfolk,UK)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(纽约学术出版社公司(Academic Press,New York),1992)；Guthrie和Fink,《酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)》,(纽约学术出版社公司,1991)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸：杂交(Nucleic Acid The Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,《分子克隆实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；《下一代基因组测序(Next-Generation Genome Sequencing)》(Janitz,2008Wiley-VCH出版社(Wiley-VCH))；《PCR方案(分子生物学方法)(PCR Protocols(Methods in Molecular Biology))》(Park编辑,第3版,2010,胡马纳出版社(Humana Press))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)》(IRL出版社,1986)；论文《酶学方法(Methods In Enzymology)》(纽约学术出版社公司)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors For MammalianCells)》(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,冷泉港实验室出版社)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(纽约冷泉港冷泉港实验室出版社,1998)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)》(Mayer和Walker编辑,伦敦学术出版社公司(Academic Press,London),1987)；《实验免疫学手册(HandbookOf Experimental Immunology)》,第I-IV卷(D.M.Weir和CC Blackwell编辑,1986)；Roitt,《基础免疫学(Essential Immunology)》,第6版,(牛津布莱克韦尔科学出版社(BlackwellScientific Publications,Oxford),1988)；《当代免疫学手册》(Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》；以及如《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。
B.定义
在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施例，但本文中描述组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
本文所使用的冠词“一(a/an)”是指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种)或一个(种)或多个(种))该冠词的语法对象。举例来说，“要素”意指一个要素或一个或多个要素。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所使用的，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
在一个实施例中，范围，例如，1至5、约1至5或约1至约5是指所述范围所涵盖的每个数值。例如，在一个非限制性且仅说明性实施例中，范围“1至5”相当于表达1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
如本文所使用的，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。在一个实施例中，“基本上相同”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用，例如，生理作用与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同。
在本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则“包括(comprise/comprises/comprising)”一词应理解为暗指包括所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或任何其它组步骤或要素。“由…组成”意指包含且限于短语“由…组成”之后的事物。因此，短语“由…组成”指示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由…组成”意指包含在所述短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中对所列要素指定的活动或动作的其它要素。因此，短语“基本上由…组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列要素的活动或动作的其它要素。
贯穿本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步的实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部是指同一个实施例。此外，特定特征、结构或特性可以通过任何适合方式组合于一个或多个实施例中。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。
术语“离体(ex vivo)”通常是指在生物体外发生的活动，如在生物体外的人工环境中的活组织中或上进行的实验或测量，优选地具有最小的自然条件改变。在特定实施例中，“离体”程序涉及从生物体取得并在实验室设备中通常在无菌条件下并且通常在几小时或高达约24小时但包含高达48小时或72小时(视情况而定)内培养或调节的活细胞或活组织。在某些实施例中，可以收集和冷冻此类组织或细胞，并且随后将其解冻用于离体治疗。使用活细胞或组织持续时间长于几天的组织培养实验或程序通常被视为“体外”，但在某些实施例中，这个术语可以与离体互换使用。
术语“体内”一般是指在生物体内部进行的活动。在一个实施例中，细胞基因组在体内被工程化、编辑或修饰。
“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包含是由媒剂或对照组合物产生的应答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂或对照物产生的应答的增加。
“减小的”或“减少的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包含是由媒剂、对照组合物或特定细胞谱系中的应答产生的应答(参考应答)的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂或对照物产生的应答(参考应答)的减少。
“保持”或“保存”或“维持”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著降低”是指与参考应答、媒剂或对照无显著差异或可测量差异的应答。
如本文所使用的术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specificallybinds)”或“特异性结合(specifically bound)”或“特异性结合(specific binding)”或“特异性靶向”描述了以相比于背景结合更大的结合亲和力的一种分子与另一种分子的结合，例如，抗体与双链RNA(dsRNA)的结合，核苷酸(例如，oligo dT)与poly(A)-尾的结合，或大范围核酸酶(或结合结构域)与靶位点的结合。如果抗体、核苷酸或结合结构域以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的以1/M为单位的平衡缔合常数)与另一分子(例如，DNA、RNA或多肽)结合或缔合，则所述抗体、核苷酸或结合结构域与所述另一分子“特异性结合”。在某些实施例中，结合结构域以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka与靶位点结合。“高亲和力”结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大的那些结合结构域。
术语“选择性结合(selectively binds)”或“选择性结合(selectively bound)”或“选择性结合(selectively binding)”或“选择性地靶向(selectively targets)”描述了在存在多个脱靶分子的情况下一个分子与靶分子的优先结合(中靶结合)。在特定实施例中，抗dsRNA抗体或其片段与dsRNA选择性结合的频率是抗dsRNA抗体与单链RNA(ssRNA)结合的约5、10、15、20、25、50、100或1000倍。
术语“抗体”是指属于包括至少轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段特异性地识别抗原的一个或多个表位并与其结合，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。在一些实施例中，抗体是抗dsRNA抗体。在特定实施例中，抗dsRNA抗体和dsRNA形成dsRNA:抗体复合物。
术语“抗体”涵盖任何天然存在的、重组的、经修饰的或经工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或其抗原结合片段或部分，或其衍生物，如本文其它地方进一步描述的。因此，所述术语是指与靶抗原特异性结合的免疫球蛋白分子，并且包含例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。完整抗体将通常包括至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可以包含更少的链，如骆驼科中天然存在的抗体，其可以仅包括重链。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。
术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指保留与抗原(例如，dsRNA)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。抗原结合片段包含但不限于与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白。在一些实施例中，抗体的抗原结合部分可以例如使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选地抗体恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术源自完整抗体分子。
“分离的抗体或其抗原结合片段”是指已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体或其抗原结合片段。
如本文所使用的，“所关注的基因”或“所关注的多核苷酸”是指编码所关注的多肽或蛋白质的多核苷酸。根据上下文，所关注的基因是指脱氧核糖核酸，例如，DNA模板中可以被转录成RNA转录物的所关注的基因，或核糖核酸，例如，RNA转录物中可以被翻译成体外、体内、原位或离体产生经编码的所关注的多肽的所关注的基因。如下文更详细描述的，所关注的多肽包含但不限于生物制品、抗体、疫苗、治疗性蛋白质或肽、核酸内切酶、核酸外切酶等。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如，编码所关注的基因的多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列引导与第二序列相对应的核酸的转录。例如，与RNA聚合酶启动子可操作地连接的所关注的基因允许所关注的基因的转录。
如本文所使用的，除非相反地规定，否则术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义使用，即，作为氨基酸序列。多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以通过合成产生，例如通过修饰多肽序列的一个或多个氨基酸。
如本文所使用的，“poly A尾”、“poly(A)尾”或“poly(A)”是指腺嘌呤核苷酸链。所述术语可以是指将要添加到RNA转录物上的聚腺苷酸尾，或者可以是指已经存在于RNA转录物3'端的poly(A)尾(例如，DNA编码的poly(A)尾)。如下文更详细描述的，poly(A)尾的长度通常为5-300个核苷酸(SEQ ID NO:13)。
术语“多核苷酸”可与术语“核酸”互换，并且包含包括核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。因此，术语“多核苷酸”或“核酸”包含但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA，包含具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-LNA和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-LNA)或其杂交体。
在本公开通篇阐述了另外的定义。
C.方法
如本公开通篇所讨论的，本发明人认识到dsRNA是RNA组合物中免疫原性增加和细胞毒性增加的原因，特别是在体内治疗性RNA应用的情况下。此外，本发明人令人惊讶地发现了从RNA制剂中去除dsRNA的经改进的方法/过程。
无论所述方法是用于一般的RNA纯化还是用于特定的应用(例如，体内治疗性mRNA处理或用于改进体内基因编辑的方法)，所述方法通常包括：使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化单链RNA。
一方面，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化单链聚腺苷酸化的RNA。
另一方面，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；以及从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；由此纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA。
在又另一方面，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及使所述样品与第二寡核苷酸dT探针接触以捕获单链聚腺苷酸化的mRNA；由此纯化所述单链加帽的聚腺苷酸化的RNA。
如下文进一步描述的，所述方法可以包括其它步骤，例如，质粒线性化/消化、体外转录、聚腺苷酸化、加帽、渗滤、超滤和最终过滤。在一些实施例中，所述RNA可以用于体外、离体或体内方法。在一些实施例中，所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。在特定实施例中，所述RNA是mRNA。
1.DNA
本文所公开的方法必须具有RNA来源。RNA可以从细胞或组织中获得或分离。可替代地，可以通过化学合成从头制备RNA。在各个实施例中，RNA可以是根据DNA来源(例如，分离的基因组DNA、质粒DNA或线性/线性化的DNA)体外转录。在各个实施例中，RNA是使用线性化质粒DNA通过体外转录(IVT)测定获得的。在一些实施例中，RNA是使用线性DNA/载体通过体外转录(IVT)测定获得的。
如本文所使用的，术语“质粒DNA”或“质粒DNA载体”是指环状核酸分子，优选地是指人工/重组DNA分子。在一些实施例中，质粒DNA载体可以被线性化。可替代地，“线性DNA”、“线性DNA载体”或“线性载体”是指线性核酸分子，优选地是指人工/重组线性DNA分子。本公开上下文中的质粒或线性DNA载体适于掺入或含有期望的所关注的核酸序列或基因，如包括编码RNA的序列和/或编码至少一种所关注的多肽或基因的开放阅读框(ORF)的核酸序列。可用于本文所描述的方法的示例性质粒包含但不限于基于pUC的载体，例如，pUC19。示例性线性DNA载体线性包含但不限于(LucigenTM)和DoggyboneTM/dbDNATM(Touchlight公司(Touchlight))载体。
在被称为RNA体外转录的过程中，表达载体可以用于产生如RNA等表达产物，例如，mRNA。例如，表达载体可以包括载体的序列段的RNA体外转录所需的序列，如启动子序列，例如，RNA启动子序列。
优选地，DNA载体包括多克隆位点、RNA启动子序列、RNA poly(A)尾、任选的选择标志物(如抗生素抗性因子)和适于载体增殖的序列，如复制起点。在特定实施例中，DNA载体或表达载体包括DNA依赖性RNA聚合酶的启动子，例如，T3、T7和Sp6。质粒DNA还可以包括用于线性化的限制性位点。
如本文所使用的，术语“模板DNA”(或“DNA模板”)是指包括编码要体外转录的RNA序列的核酸序列的DNA分子。因此，模板DNA包括体外转录所必需的所有元件，特别是用于与DNA依赖性RNA聚合酶结合以及与其可操作地连接的启动子元件，例如，编码靶RNA序列的DNA序列的T3、T7和SP6 RNA聚合酶5'。模板DNA还可以包含编码位于所关注的基因3'的poly(A)尾的序列。
用于产生、复制和克隆本文所描述的重组模板或质粒DNA的方法是本领域已知的。
术语“模板DNA”还可以是指包括编码RNA序列的核酸序列的质粒DNA载体。此外，“模板DNA”可以是线性或环状DNA分子。在特定实施例中，模板DNA是线性化/消化的质粒DNA分子。
可以通过在合适的条件下使质粒DNA与限制性酶接触来获得线性化的模板DNA质粒，使得限制性酶在其识别位点处切割质粒DNA并破坏质粒结构。如果质粒DNA仅含有一个用于限制性酶的识别位点，则线性化的模板DNA的核苷酸数量与质粒DNA的核苷酸数量相同。如果质粒DNA含有多于一个的用于限制性酶的识别位点，则线性化的模板DNA的核苷酸数量比质粒DNA的核苷酸数量少。然后，线性化的模板DNA是质粒DNA的片段，其含有RNA体外转录所必需的元件，即RNA转录的启动子元件和模板DNA元件。适于切割DNA和/或质粒DNA线性化的限制性酶是本领域已知的，包含但不限于BciVI、XbaI、SpeI、HindIII、NotI、EcoRI、NdeI、BsaI、AfIII、HindIII和SapI。在一些实施例中，限制性酶是IIS型限制性酶。IIS型限制性酶包含但不限于AcuI、ALwI、BoaeI、BbsI、BbsI-HF、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspMI、MspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphhI、HpyAV、MboII、MlyI、MmeI、MnlI、NmeAIII、PaqCI、PleI、PpiI、PsrI、SapI、SfaNI。在特定实施例中，限制性酶是BsaI。
线性DNA载体/模板还可能受到核酸内切酶的限制。在一些实施例中，线性DNA载体/模板与限制性酶接触以产生末端腺嘌呤(A)核苷酸。
在一些实施例中，在限制之后，将质粒或线性DNA模板过滤(例如，通过超滤和/或渗滤)到合适的溶剂中，例如，水、TE(Tris-EDTA)、Tris HCl pH 7.5、HEPES/磷酸盐等。
线性化或线性DNA模板可以在用作体外转录的模板之前纯化。例如，线性化或线性DNA模板可以通过苯酚/氯仿提取用随后的醇沉淀，色谱方法或过滤方法或基于二氧化硅的DNA捕获方法来纯化。此步骤还确保了减少来自先前制造步骤的杂质(例如，蛋白质)，包含大肠杆菌蛋白、限制性酶和BSA(包含在反应缓冲液中)。
在各个实施例中，所述方法进一步包括用DNA酶处理所述样品以去除残留质粒DNA模板(环状或线性残留DNA)的步骤。在一些实施例中，所述DNA酶处理步骤在IVT步骤之后和/或在加帽步骤之后发生。在特定实施例中，所述DNA酶是DNA酶I。
2.RNA产生
在特定实施例中，线性化的DNA可以用于体外转录(IVT)系统，以产生用于本文所描述的方法的RNA。IVT系统通常包括转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和RNA聚合酶。用于体外转录的方法在本领域是已知的。参见，例如，Beckert等人,《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》2011；703:29-41。用于IVT的示例性商业供应的试剂盒包含但不限于HiScribeTMT7快速高产量RNA合成试剂盒(New England BiolabsTM)、T7试剂盒(ThermoFisher ScientificTM)、TranscriptAid T7高产量转录试剂盒(ThermoFisher ScientificTM)、或RiboMAXTMRNA产生系统(PromegaTM)、AmpliScribeTM T7转录试剂盒和RNAMaxxTM(Agilent TechnologiesTM)。
可替代地，通过分别获得每种组分并使用本领域已知的方法，可以在内部组装和执行IVT测定。NTP可以内部制造或从商业供应商(例如，和NewEngland)购买。任何数量的RNA聚合酶或其变体可以用于本文所描述的方法中，并且可通过商业供应商(例如，NewEnglandThermoFisher ScientificTM和MilliporeSigmaTM容易获得。聚合酶可以选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和/或突变体聚合酶，如但不限于能够掺入经修饰的核酸的聚合酶。
典型的体外转录反应包含以下：RNA聚合酶，例如，T7 RNA聚合酶；DNA模板；核苷酸(NTP)；MgCl2；和缓冲液，例如，HEPES或Tris。IVT反应还可以包含二硫苏糖醇(DTT)和/或亚精胺、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和/或EDTA。允许体外转录反应进行，例如，在37℃下持续混合4小时。
3.加帽反应
在一些实施例中，本文所描述的方法中使用的RNA被加帽。加帽RNA通过增加稳定性和减少降解最大化细胞中的表达效率。在一些实施例中，通过在存在加帽酶系统的情况下温育未加帽的RNA，体外合成用于所描述的方法的RNA分子。在一些实施例中，在体外转录之后，RNA在5'端处酶促加帽。在一些实施例中，RNA在5'端处共转录酶促加帽。因此，加帽可以在RNA的进一步纯化，例如，oligo dT纯化之前或之后执行。在一些实施例中，在加帽反应之前执行oligo dT亲和力纯化和超滤/渗滤。
如本文所使用的，术语“5'帽”或“5'帽结构”或“5'帽部分”是指掺入mRNA的5'端处的化学修饰。5'帽涉及核输出、mRNA稳定性和翻译。
在特定实施例中，本文所考虑的mRNA包括5'帽，其包括在末端鸟苷帽残基与mRNA分子的5'-末端转录有义核苷酸之间连接的5'-ppp-5'-三磷酸。然后可以将此5'-鸟苷酸帽甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。
适用于本文所考虑的mRNA多核苷酸的特定实施例的5'帽的说明性实例包含但不限于：未甲基化的5'帽类似物，例如，G(5')ppp(5')G、G(5')ppp(5')C、G(5')ppp(5')A；甲基化的5'帽类似物，例如，m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')C和m7G(5')ppp(5')A；二甲基化的5'帽类似物，例如，m2,7G(5')ppp(5')G、m2,7G(5')ppp(5')C和m2,7G(5')ppp(5')A；三甲基化的5'帽类似物，例如，m2,2,7G(5')ppp(5')G、m2,2,7G(5')ppp(5')C和m2,2,7G(5')ppp(5')A；二甲基化的对称5'帽类似物，例如，m7G(5')pppm7(5')G、m7G(5')pppm7(5')C和m7G(5')pppm7(5')A；和抗反向5'帽类似物，例如，抗反向帽类似物(ARCA)帽，命名为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G、2'O-Me-m7G(5')ppp(5')G、2'O-Me-m7G(5')ppp(5')C、2'O-Me-m7G(5')ppp(5')A、m72'd(5')ppp(5')G、m72'd(5')ppp(5')C、m72'd(5')ppp(5')A、3'O-Me-m7G(5')ppp(5')C、3'O-Me-m7G(5')ppp(5')A、m73'd(5')ppp(5')G、m73'd(5')ppp(5')C、m73'd(5')ppp(5')A和其四磷酸盐衍生物)(参见，例如，Jemielity等人,《RNA》,9:1108-1122(2003))。
在特定实施例中，mRNA包括通过三磷酸桥与第一转录核苷酸的5'-端连接的为7-甲基鸟苷酸(“m7G”)的5'帽，产生m7G(5')ppp(5')N，其中N为任何核苷。
在一些实施例中，mRNA包括5'帽，其中帽是帽0结构(帽0结构缺少与碱基1和碱基2连接的核糖的2'-O-甲基残基)、帽1结构(帽1结构在碱基2处具有2'-O-甲基)或帽2结构(帽2结构具有与碱基2和碱基3两者连接的2'-O-甲基残基)。
例如，可以使用牛痘鸟苷酸转移酶、鸟苷三磷酸和S-腺苷基-L-甲硫氨酸在RNA的5'端处酶促加帽，以产生帽0结构。通过5'至5'三磷酸桥添加倒置的7-甲基鸟苷帽。可替代地，使用2'O-甲基转移酶和牛痘鸟苷酸转移酶产生帽1结构，其中除了帽0结构之外，倒数第二核苷酸上的2'OH基团被甲基化。S-腺苷基-L-甲硫氨酸(SAM)是用作甲基转移试剂的辅因子。
在一个实施例中，mRNA包括m7G(5')ppp(5')G帽。
在一个实施例中，mRNA包括ARCA帽或经修饰的ARCA帽。
在各个实施例中，RNA在单独的反应中共转录地加帽或酶促加帽。5'末端帽可以包含内源帽或帽类似物。5'末端帽可以包括鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包含但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
5'帽结构的另外的实例包含甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4',5'亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤式呋喃糖基)核苷酸、4'-硫核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰的碱基核苷酸、苏-戊呋喃糖基核苷酸、非环状3',4'-断核苷酸、非环状3,4-二羟丁基核苷酸、非环状3,5二羟基苯基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向无碱基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向无碱基部分、1,4-磷酸丁二醇、3'-氨基磷酸酯、磷酸己酯、磷酸氨乙酯、3'-磷酸盐、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。可以用于本发明上下文的另外的经修饰的5'-帽结构是CAP1(m7GpppN的邻近核苷酸的核糖的甲基化)、CAP2(m7GpppN下游的第2核苷酸的核糖的甲基化)、CAP3(m7GpppN下游的第3核苷酸的核糖的甲基化)、CAP4(m7GpppN下游的第4核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物)、经修饰的ARCA(例如，硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在真核生物中，需要至少三种酶活性才能产生功能性帽0(RNA三磷酸酶(TPA酶)、RNA鸟苷酸转移酶(GTA酶)和鸟嘌呤-N7甲基转移酶(鸟嘌呤-N7 MTA酶))。对于帽1结构，需要另外的m7G-特异性2'O甲基转移酶(2'O MTA酶)来甲基化核糖的2'O位置处的+1核糖核苷酸。真核生物加帽酶是本领域已知的(《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,第44卷,第16期,2016年9月19日,第7511-7526页)。
病毒RNA加帽酶也是本领域已知的。在一些情况下，已知病毒加帽酶将酶活性偶联到多功能蛋白质中。例如，黄病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和副粘病毒将GTA酶和MTA酶活性偶联到其RNA聚合酶(RdRp)中。可替代地，牛痘病毒加帽酶和蓝舌病毒加帽酶与RNA加帽的所有必需的酶活性偶联以产生帽0或帽1。因此，由于其简单性和有效性，牛痘病毒加帽酶牛痘鸟苷酸转移酶通常是优选的加帽酶，但不是必需的。本领域已知的其它病毒加帽酶包含但不限于小球藻病毒、α病毒、弹状病毒和水泡性口炎病毒加帽酶。在一些实施例中，使用牛痘鸟苷酸转移酶、鸟苷三磷酸和S-腺苷基-L-甲硫氨酸(SAM)对聚腺苷酸化的mRNA在5'端处进行加帽以产生帽0结构。在一些实施例中，使用牛痘鸟苷酸转移酶、鸟苷三磷酸、S-腺苷基-L-甲硫氨酸(SAM)和2'-O-甲基转移酶对聚腺苷酸化的mRNA在5'端处进行加帽以产生帽1结构。
加帽方法和条件是本领域已知的(参见，例如，《威利跨学科综述-RNA(WileyInterdiscip Rev RNA)》,2010年7月-8月；1(1):152-172；和《自然评论微生物学(Nat RevMicrobiol.)》2011年12月5日；10(1):51-65。示例性加帽反应可以包含以下：S-腺苷甲硫氨酸氯化物(SAM)；RNA酶抑制剂；缓冲液(例如，NEB加帽缓冲液)；GTP；牛痘酶；mRNA帽2'-O-甲基转移酶；和EDTA。所述反应在37℃下在持续混合下运行。
4.亲和色谱法
迄今为止，用于纯化如单克隆抗体、治疗性蛋白质、疫苗等生物产物和其它生物产物(包含DNA和RNA)的主要方法已经通过使用捕获色谱法，例如，亲和色谱法。如本文所使用的，术语“捕获色谱法”和“亲和色谱法”是指涉及将期望产物(例如，RNA)与柱结合和从柱上洗脱的色谱法组分或相关方法步骤。捕获或亲和色谱法通常使用分析物与特定分子(例如，与色谱介质偶联的特定配体)之间的选择性非共价相互作用。例如，捕获或亲和色谱法可以使用蛋白质A、蛋白质G、抗体(例如，抗dsRNA抗体)、特异性底物/探针(例如，oligo dT)、配体或抗原作为捕获试剂。然后将捕获试剂移动到柱内的树脂/表面(与柱内的树脂/表面连接或结合)，并且样品经过树脂/表面(即，通过柱)。然后将结合的产物从柱上洗脱。
用于色谱法(例如，液相色谱法)，例如，高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UHPLC)和快速蛋白质液相色谱法的系统(FPLC；例如，AKTATM系统)是本领域的技术人员已知的。适用于本文所描述的方法的色谱法柱也是本领域的技术人员已知的。柱可以是任何合适的体积/大小，例如，0.2mL、1.0mL、5.0mL或10mL。色谱柱、系统和材料的示例性制造商包含但不限于Sigma-AldrichTM、ThermoFisher ScientificTM、WatersTM、Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories)、和思拓凡(Cytiva)。
柱可以包括合适的树脂/表面以保留底物或探针。合适的树脂/表面材料是本领域已知的。可以用作表面的示例性材料包含但不限于丙烯酸树脂、碳(例如，石墨、碳纤维)、纤维素(例如，乙酸纤维素)、陶瓷、可控孔玻璃、交联多糖(例如，琼脂糖或SEPHAROSETM)、凝胶、玻璃(例如，经修饰的或功能化玻璃)、金(例如，原子光滑的Au(111))、石墨、无机玻璃、无机聚合物、乳胶、金属氧化物(例如，Si02、Ti02、不锈钢)、准金属、金属(例如，原子光滑的Au(111))、云母、硫化钼、纳米材料(例如，高度取向的热解石墨(HOPG)纳米片)、硝化纤维、NYLONTM、光纤束、有机聚合物、纸、塑料、聚丙烯酰吗啉、聚(4-甲基丁烯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(丁酸乙烯酯)、聚丁烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯、聚甲醛、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、聚氨酯、聚偏氟乙烯(PVDF)、石英、人造纤维、树脂、珠粒、橡胶、半导体材料、二氧化硅、硅(例如，表面氧化硅)、硫化物和TEFLONTM。
在各个实施例中，使用oligo脱氧胸苷(dT)探针或底物通过色谱方法纯化RNA。纯化机制涉及在高盐条件下RNA的poly(A)尾与寡核苷酸配体(oligo dT)的杂交。DNA模板和/或其它杂质将不结合。另外，不含poly(A)延伸段的RNA转录物将不会与树脂结合，并且也将不会与亲和配体形成双链体。然后可以利用低离子强度缓冲液或竞争性结合寡核苷酸溶液将聚腺苷酸化的RNA从树脂上洗脱。因此，在一些实施例中，所述方法包括使RNA样品与在色谱柱内移动的第一oligo dT探针/底物或第二oligo dT探针/底物接触，由此形成oligodT:聚腺苷酸化的RNA复合物。在一些实施例中，所述方法包括将未结合的RNA和/或污染物与oligo dT:聚腺苷酸化的RNA复合物分离。在一些实施例中，所述方法包括将聚腺苷酸化的RNA从柱上洗脱，并保留洗脱的RNA用于进一步纯化。
在特定实施例中，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及纯化单链聚腺苷酸化的mRNA。
在一些实施例中，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；以及从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；由此纯化所述单链聚腺苷酸化的RNA。
在各个实施例中，本文所描述的方法包括多于一个oligo dT探针或纯化步骤。在一些实施例中，本文所描述的方法包括2个oligo dT探针或纯化步骤。在一些实施例中，所述方法包括使包括RNA和双链RNA(dsRNA)的样品与第一寡核苷酸dT探针接触，所述第一寡核苷酸dT探针与聚腺苷酸化的RNA结合。在一些实施例中，使用亲和色谱法使与dsRNA:抗体复合物分离的聚腺苷酸化的RNA与第二寡核苷酸dT探针接触。
在特定实施例中，所述方法包括：使包括单链聚腺苷酸化的RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和聚腺苷酸化的RNA结合的第一寡核苷酸dT探针接触；以及从所述样品中去除未结合的RNA；使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及使所述样品与第二寡核苷酸dT探针接触以捕获单链聚腺苷酸化的RNA；由此纯化所述单链聚腺苷酸化的mRNA。
在一些实施例中，所述第一寡核苷酸dT探针和/或所述第二寡核苷酸dT探针与表面结合。在一些实施例中，所述第一寡核苷酸dT探针与表面结合。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸dT探针与表面结合。在一些实施例中，oligo dT探针与纤维素树脂结合或共价连接。在一些实施例中，使用预填充的oligo dT柱。用于色谱法的预填充的oligo dT柱是本领域已知的并且是可商购的，例如，POROSTMGoPureTM(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))。
Oligo dT底物/探针的长度可以不同，例如，可以包括约15至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约16至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligodT底物/探针包括约17至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约18至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约19至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约20至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligodT底物/探针包括约21至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约22至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约23至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约24至约30个胸苷残基。在一些实施例中，oligodT底物/探针包括约25至约30个胸苷残基。
在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约29个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约28个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约27个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约26个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约25个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约24个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约23个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约22个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约21个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15至约20个胸苷残基。
在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约21至约29个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约22至约28个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约23至约27个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约24至约26个胸苷残基。
Oligo dT底物/探针的长度可以不同，例如，可以包括至少约15个胸苷残基、至少约16个胸苷残基、至少约17个胸苷残基、至少约18个胸苷残基、至少约19个胸苷残基、至少约20个胸苷残基、至少约21个胸苷残基、至少约22个胸苷残基、至少约23个胸苷残基、至少约24个胸苷残基、至少约25个胸苷残基、至少约26个胸苷残基、至少约27个胸苷残基、至少约28个胸苷残基、至少约29个胸苷残基或至少约30个胸苷残基。
在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约15个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约16个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约17个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约18个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约19个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约20个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约21个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约22个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约23个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约24个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约25个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约26个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约27个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约28个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括约29个胸苷残基。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括或约30个胸苷残基。在优选的实施例中，oligo dT底物/探针包括23或25个胸苷残基(分别为SEQ ID NO:16和15)。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括23个胸苷残基(SEQ ID NO:16)。在一些实施例中，oligo dT底物/探针包括25个胸苷残基(SEQ ID NO:15)。
在各个实施例中，本文所描述的方法包括另外的色谱法步骤，以进一步从RNA制剂中去除dsRNA。在一些实施例中，所述方法包括使含有单链RNA(例如，加帽的聚腺苷酸化的mRNA)和dsRNA的样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触；以及将dsRNA:抗体复合物与所述单链RNA(例如，加帽的聚腺苷酸化的mRNA)分离。
在各个实施例中，通过亲和色谱法将所述dsRNA:抗体复合物与所述单链RNA分离。在一些实施例中，所述亲和色谱法包括1ml柱。在一些实施例中，所述亲和色谱法包括5ml柱。在一些实施例中，所述亲和色谱法包括10ml柱。
可以与抗dsRNA抗体结合的任何树脂/柱可以用于本文所描述的方法中，以从RNA样品中耗竭抗体:dsRNA复合物和游离抗体。例如，蛋白A或蛋白G结合树脂最常用于捕获抗体和抗体复合物。蛋白A和蛋白G是最初与细菌分离的免疫球蛋白结合蛋白。在优选实施例中，树脂是蛋白A结合的树脂或珠粒。蛋白A树脂或珠粒在本领域中是已知的，并且是可商购的，例如，MabCaptureTMA Select ProATM树脂)。
在一些实施例中，与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、美洲驼Ig、羊驼Ig、Ig NAR、Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、迷你抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)。在一些实施例中，所述与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗体选自由以下组成的组：J2、J5、K1、K2、1D3、CABT-B212和9D5。在特定实施例中，所述抗体是J2。
与dsRNA结合的抗体是已知的，并且是可商购的。出售一种或多种以上所列举的dsRNA抗体的商业供应商包含但不限于密理博西格玛公司(MilliporeSigma)、耶拿生物科学公司(Jena Bioscience)、Scicons公司(Scicons)、赛默飞世尔科技公司、绝对抗体公司(Absolute Antibody)和Creative
在各个实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与至少约1.5mol％、至少约2mol％、至少约2.5mol％、至少约3mol％、至少约3.5mol％、至少约4mol％、至少约4.5mol％、至少约5mol％、至少约5.5mol％、至少约6mol％、至少约6.5mol％、至少约7mol％、至少约7.5mol％、至少约15mol％、至少约30mol％或至少约60mol％的抗体接触。例如，可以通过将样品内的RNA的总质量除以RNA转录物的分子量(MW)来确定RNA的摩尔数。RNA转录物的分子量可以通过其预测长度乘以330g/mol(RNA核苷酸的平均MW)来确定。可以通过260nm处的UV吸光度来确定RNA浓度，然后可以将所述RNA浓度乘以体积以得到样品中的RNA的总质量。可以类似地确定抗dsRNA抗体的摩尔数。如果抗dsRNA抗体的浓度未知，则其可以通过280nm处的UV吸光度来确定。如果抗dsRNA抗体的浓度和体积是已知的，则可以简单地用总质量除以抗体的MW以得到抗体的总摩尔数。一旦确定了RNA的总摩尔数和抗dsRNA抗体的摩尔数，就可以向RNA的样品中添加适当百分比的抗dsRNA抗体(例如，7.5mol％、15mol％、30mol％或60mol％的抗dsRNA抗体)。例如，如果样品中有100摩尔的RNA，则可以向RNA样品中添加60摩尔的抗dsRNA抗体以获得60mol％的抗dsRNA。
在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与至少约1.5mol％、至少约7.5％mol％、至少约15％mol％、至少约30％mol％或至少约60％mol的抗体接触。在特定实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与至少约7.5mol％的抗体接触。
在各个实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％、约5mol％、约5.5mol％、约6mol％、约6.5mol％、约7mol％、约7.5mol％、约15mol％、约30mol％或约60mol％的抗体接触。在特定实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约7.5mol％的抗体接触。在特定实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约15mol％的抗体接触。在特定实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约30mol％的抗体接触。在特定实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约60mol％的抗体接触。
在各个实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约2mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约2.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约3mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约3.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约4mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约4.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约5.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约6mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约6.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约7mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约7.5mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约15mol％至约60mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约30mol％至约60mol％的抗体接触。
在各个实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约30mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约15mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约7.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约7mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约6.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约6mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约5.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约4.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约4mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约3.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约3mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约2.5mol％的抗体接触。在一些实施例中，与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA样品与约1.5mol％至约2mol％的抗体接触。
5.过滤
在本文所描述的方法中的一个或多个步骤期间，可以滤除RNA制剂中的杂质。例如，RNA制剂可以经过膜(例如，超滤膜)以从先前的反应中去除不需要的蛋白质(例如，酶/蛋白质)和/或增加制剂中的RNA浓度。
如本文所使用的，术语“超滤”或“UF”是指使溶液或悬浮液经受半透膜的任何技术，所述半透膜保留大分子，同时允许溶剂和小溶质分子经过。术语“超滤膜”和“UF膜”是指孔径在约10纳米至约100纳米(即，约0.01微米至约0.1微米)范围内的膜。超滤可以用于增加样品中的RNA的浓度和/或去除杂质(例如，蛋白质)。RNA超滤技术和方法是本领域已知的(参见，例如,Fernandez等人,“中空纤维膜对RNA提取物的交叉流过滤”,《生物物理学报(Acta Biotechnol.)》,12:49-56,1992)。
可替代地，渗滤可以用于执行缓冲液交换和/或浓缩RNA制剂。通常，渗滤是使用膜将盐或溶剂的浓度从含有蛋白质、肽、核酸和其它生物分子的溶液中去除、替换或降低的技术。因此，如本文所使用的，术语“渗滤”或“DF”是指其中用溶剂稀释保留物并再次过滤，以降低可溶性渗透物组分的浓度的专门过滤类别。术语“保留物”是指样品/制剂或进料中已经被膜保留的部分，并且保留物是富含保留物种的流。
例如，在连续渗滤中，以与产生滤液相同的速率向保留物中连续添加溶剂。在这种情况下，保留物体积和保留的组分的浓度在过程期间不变。另一方面，在不连续或连续稀释渗滤中，在超滤步骤之后向保留物侧添加溶剂；如果添加到保留物侧的溶剂的体积不等于或大于产生的滤液的体积，则保留的组分将具有高浓度。
渗滤可以用于改变大分子的溶液或悬浮液的pH、离子强度、盐组合物、缓冲液组合物或其它性质。
如本文所使用的，术语“超滤/渗滤”或“UF/DF”是指按序或同时完成超滤和/或渗滤的任何工艺、技术或技术组合。UF/DF技术、方法和膜是本领域已知的。参见，例如，Eon-Duval等人,《分析生物化学(Anal Biochem.)》2003年5月1日；316(1):66-73。
在各个实施例中，超滤、渗滤和/或UF/DF步骤利用切向流过滤(例如，切向流超滤/渗滤)。切向流过滤(TFF)是基于大小、分子量或其它差异而使用膜来分离液体溶液或悬浮液(例如，进料样品)中的组分的过程。在这些过程中，进料样品沿膜表面切向泵送，太大而不能通行经过膜的颗粒或分子被保留并返回到中间贮槽以便另外多次通过膜(即，再循环)直至进料样品被充分澄清、浓缩或纯化。TFF的错流性质使膜污染最小化，从而允许每批的高容量处理。
适于超滤和/或渗滤的膜可以由本领域已知的各种不同的底物或聚合物制成。例如，在一些实施例中，TFF盒或中空纤维筒包括由聚砜、聚醚砜、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚偏二氟乙烯、经修饰的纤维素、再生纤维素、δ再生纤维素、乙酸纤维素和/或本领域的技术人员已知的其它聚合物或底物制成的膜。在一些实施例中，膜是聚砜膜。在一些实施例中，膜是聚醚砜膜。在一些实施例中，膜是聚(甲基丙烯酸甲酯)膜。在一些实施例中，膜是聚偏二氟乙烯膜。在一些实施例中，膜是经修饰的纤维素膜。在一些实施例中，膜是再生纤维素膜。在一些实施例中，膜是δ再生纤维素膜。在一些实施例中，膜是乙酸纤维素膜。在优选实施例中，膜是中空纤维膜。
可用于本文特定实施例中所考虑的方法的示例性TFF盒/膜包含但不限于由密理博西格玛公司(马萨诸塞州伯灵顿(Burlington,Mass.))、颇尔公司(Pall Corporation)(纽约州华盛顿港(Port Washington,N.Y.))、通用电气医疗集团生物科学股份公司(GEHealthcare Bio-Sciences)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,N.J.))和赛多利斯公司(Sartorius AG)(纽约州波西米亚(Bohemia,N.Y.))供应的TFF盒。示例性密理博西格玛公司TFF盒包含但不限于具有BiomaxTM膜、UltracelTM膜或膜的盒(例如，2盒、2迷你盒、2Maxi盒、3盒)。示例性颇尔公司TFF盒包含但不限于CentrasetteTM盒和CadenceTM一次性使用盒。示例性通用电气医疗集团生物科学股份公司TFF盒包含但不限于KvickTMFlow盒。示例性赛多利斯公司盒包含但不限于盒。
在各个实施例中，本文所考虑的方法包括另外的过滤步骤。在一些实施例中，过滤步骤包括最终过滤器(即，所述方法中的最后一个过滤器)。在一些实施例中，过滤器是灭菌过滤器。在一些实施例中，过滤器包括微滤膜。在一些实施例中，过滤器包括超滤膜。在一些实施例中，过滤器包括纳滤膜。在一些实施例中，过滤器是0.22μm过滤器。
D.RNA以及相关治疗性基因和蛋白质
核糖核酸(RNA)是核酸分子，即，由核苷酸单体组成的聚合物。这些核苷酸通常是通过分子主链相互连接的腺苷-单磷酸盐(AMP)、尿苷-单磷酸盐(UMP)、鸟苷-单磷酸盐(GMP)和胞苷-单磷酸盐(CMP)单体或其类似物。主链由每个核苷酸单体(碱基)的糖部分，即，核糖之间的磷酸二酯键形成。
如本文所使用的，术语“核苷酸”是指与磷酸化糖呈N-糖苷连接的杂环含氮碱基。核苷酸被理解成包含天然碱基和多种多样的本领域所认可的经修饰的碱基。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置处。核苷酸通常包括碱、糖和磷酸基团。在核糖核酸(RNA)中，糖是核糖，并且在脱氧核糖核酸(DNA)中，糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的羟基的糖。示例性天然含氮碱基包含嘌呤、腺苷(A)和胍(G)以及嘧啶、胞苷(C)和胸苷(T)(或在RNA的背景下，尿嘧啶(U))。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。可以在糖、磷酸和/或碱基部分不修饰或修饰核苷酸(也互换地称为核苷酸类似物、核苷酸衍生物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸和非标准核苷酸；参见例如，WO92/07065和WO 93/15187)。由Limbach等人,(1994,《核酸研究》22,2183-2196)总结了经修饰的核酸碱基的实例。
核苷酸也可以被认为是核苷的磷酸酯，酯化发生在与糖的C-5附接的羟基上。如本文所使用的，术语“核苷”是指与糖呈N-糖苷连接的杂环含氮碱基。核苷在本领域中被认为包含天然碱基并且还包含公知的经修饰的碱基。此类碱基通常位于核苷糖部分的1'位置处。核苷通常包括碱基和糖基。核苷可以是未经修饰的或者在糖和/或碱基部分进行修饰(也可互换地被称为核苷类似物、核苷衍生物、经修饰的核苷、非天然核苷或非标准核苷)。也如上文所述，由Limbach等人,(1994,《核酸研究》22,2183-2196)总结了经修饰的核酸碱基的实例。
信使RNA(mRNA)是与基因的遗传序列相对应的RNA的单链分子。mRNA可以通过例如，细胞内的DNA序列的转录获得。在细胞中，DNA的转录通常导致过早mRNA的产生，其随后被加工成成熟mRNA。将过早RNA加工成成熟信使RNA通常包括剪接、5'加帽、聚腺苷酸化和从核或线粒体输出。可替代地，mRNA可以体外(如上文所描述的)或体内从重组DNA转录。在这种情况下，翻译的重组DNA序列通常不包括内含子，因此在加工期间不需要外显子剪接。
成熟mRNA通常提供核苷酸序列，所述核苷酸序列可以被翻译成特定肽或蛋白质的氨基酸序列。通常，成熟mRNA包括5'-帽、任选地5'UTR、开放阅读框、任选地3'UTR和poly(A)序列。
在本文所提供的方法/过程中有用的RNA(例如，mRNA)可以是DNA转录的产物(例如，RNA转录物)或化学合成的。RNA转录物(例如，体外转录的mRNA)是体外转录反应的多核苷酸产物。
如本文所使用的，“RNA转录物”是指通过使用DNA模板和RNA聚合酶的体外转录反应产生的核糖核酸。RNA转录物通常包含用于所关注的基因和poly(A)尾的编码序列。RNA转录物可以包含修饰，例如，经修饰的核苷酸。如本文所使用的，术语RNA转录物包含mRNA并且可与mRNA互换，无论是从DNA模板转录还是化学合成的。
RNA转录物和mRNA通常是单链的(ssRNA)，然而双链RNA(dsRNA)是转录(例如，体外转录)的常见副产物。据推测，dsRNA可以以多种方式发生，包含但不限于周转转录(顺式)、无效转录物的随机引发(顺式/反式)和/或DNA的反义转录。尽管存在dsRNA形成的机制，但已知dsRNA通常对细胞有毒性，例如，当体内施用dsRNA时，受体细胞可以将其感知为入侵病毒，这会触发免疫应答。
在本文所描述的方法/过程中要纯化的RNA转录物(例如，mRNA样品)不受RNA来源的限制。在一些实施例中，通过体外转录包括在线性化或线性质粒载体中克隆的基因的DNA模板，或通过体外转录通过PCR或RT-PCR(即，通过PCR扩增产物的IVT)合成的DNA模板来合成RNA。RNA可以如上文所描述的被加帽。在一个实施例中，RNA转录物包含通常在转录后添加的5'帽。
在某些实施例中，RNA是聚腺苷酸化的(poly(A))。poly(A)可以被编码到DNA模板中或在转录之后添加。在特定实施例中，本文所考虑的RNA包括poly(A)尾，以帮助保护RNA免于核酸外切酶降解、稳定RNA并且促进翻译。在某些实施例中，RNA包括3'poly(A)尾结构。用于聚腺苷酸化RNA的方法是本领域已知的(PL Wigley等人,《分子细胞生物学(Mol CellBiol.)》1990年4月；10(4):1705-1713；和Wakiyama等人,《生物化学(Biochimie)》1997年12月；79(12):781-5)。
在特定实施例中，poly(A)尾的长度为至少约10个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或至少约500个或更多个腺嘌呤核苷酸或者任何中间数量的腺嘌呤核苷酸。在特定实施例中，poly(A)尾的长度为至少约125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、202个、203个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个或275个或更多个腺嘌呤核苷酸。
在特定实施例中，poly(A)尾的长度为约10个至约500个腺嘌呤核苷酸、约50个至约500个腺嘌呤核苷酸、约100个至约500个腺嘌呤核苷酸、约150个至约500个腺嘌呤核苷酸、约200个至约500个腺嘌呤核苷酸、约250个至约500个腺嘌呤核苷酸、约300个至约500个腺嘌呤核苷酸、约50个约450个腺嘌呤核苷酸、约50个至约400个腺嘌呤核苷酸、约50个至约350个腺嘌呤核苷酸、约100个至约500个腺嘌呤核苷酸、约100个至约450个腺嘌呤核苷酸、约100个至约400个腺嘌呤核苷酸、约100个至约350个腺嘌呤核苷酸、约100个至约300个腺嘌呤核苷酸、约150个至约500个腺嘌呤核苷酸、约150个至约450个腺嘌呤核苷酸、约150个至约400个腺嘌呤核苷酸、约150个至约350个腺嘌呤核苷酸、约150个至约300个腺嘌呤核苷酸、约150个至约250个腺嘌呤核苷酸、约150个至约200个腺嘌呤核苷酸、约200个至约500个腺嘌呤核苷酸、约200个至约450个腺嘌呤核苷酸、约200个至约400个腺嘌呤核苷酸、约200个至约350个腺嘌呤核苷酸、约200个至约300个腺嘌呤核苷酸、约250个至约500个腺嘌呤核苷酸、约250个至约450个腺嘌呤核苷酸、约250个至约400个腺嘌呤核苷酸、约250个至约350个腺嘌呤核苷酸或约250个至约300个腺嘌呤核苷酸或者任何中间范围的腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，RNA转录物包含5'UTR和3'UTR。
描述多核苷酸(例如，RNA转录物或mRNA)的取向的术语包含：5'(通常是具有游离磷酸基团的多核苷酸的端)和3'(通常是具有游离羟基(OH)基团的多核苷酸的端)。多核苷酸序列可以以5'-3'取向或3'-5'取向注释。对于DNA和mRNA，5'至3'链被命名为“有义”、“正”或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列相同[RNA中的尿嘧啶(U)而非DNA中的胸腺嘧啶(T)除外]。对于DNA和mRNA，作为由RNA聚合酶转录的链的互补3'至5'链被指定为“模板”链、“反义”链、“负”链或“非编码”链。如本文所使用的，术语“相反取向”是指以3'至5'取向书写的5'至3'序列或以5'至3'取向书写的3'至5'序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'AG T C A T G 3'的互补链是3'T C AG T AC 5'。后一序列通常被书写为左边是5'端并且右边是3'端的反向补体5'C ATG AC T 3'。与其反向补体相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配，或者核酸之间可以是“完全”或“全部”的互补性。
此外，本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多可以编码多肽或其变体片段的核苷酸序列，如本文所考虑的。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施例中具体地设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。在一个实施例中，提供了包括特定等位基因序列的多核苷酸。等位基因是由于如核苷酸的缺失、添加和/或取代等一种或多种突变而改变的内源性多核苷酸序列。
RNA转录物可以是编码RNA(例如，mRNA)，其编码蛋白质或其片段或变体，包含但不限于分泌蛋白、质膜蛋白、细胞质或细胞骨架蛋白、胞内膜结合蛋白、与人类疾病相关的蛋白、靶向部分、融合蛋白、酶、核酸内切酶、核酸外切酶、CRISPR相关核酸酶(例如，Cas9和其变体)、大范围核酸酶或归巢核酸内切酶(HE)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、megaTAL、锌指核酸酶、肿瘤抗原、病原抗原、过敏抗原、自身免疫抗原或由人类基因组编码的那些蛋白质。本领域的技术人员通过使用公共和私人数据库，例如NCBI GenBank或PubMed，可以容易地鉴定编码肽或蛋白质的RNA序列。在特定实施例中，编码RNA可以是，例如，mRNA、病毒RNA或复制子RNA。
在各个实施例中，RNA转录物或mRNA编码核酸酶(例如，核酸内切酶或核酸外切酶)。术语“核酸内切酶”是指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。多核苷酸可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA和RNA的双链混杂体、以及合成DNA(例如，含有除A、C、G和T以外的碱基)。核酸内切酶可以对称地切割多核苷酸，留下“平”端，或者在不直接相对的位置，产生可以被称为“粘性端”的突出端。本文所描述的方法和组合物可以应用于由核酸内切酶产生的切割位点。核酸内切酶包含但不限于基因编辑酶，如大范围核酸酶、归巢核酸内切酶(HE)、megaTAL、TALEN、锌指核酸酶、CRISPR相关核酸酶或其功能变体。
在各个实施例中，RNA转录物或mRNA编码基因编辑核酸内切酶。在一些实施例中，基因编辑核酸内切酶是大范围核酸酶、归巢核酸内切酶(HE)、megaTAL、TALEN、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶(例如，Cas9)。在特定实施例中，基因编辑核酸内切酶是大范围核酸酶、归巢核酸内切酶(HE)或megaTAL。
术语“归巢核酸内切酶”和“大范围核酸酶”可互换使用，并且是指识别12-45个碱基对切割位点(例如，靶位点)并且通常基于序列和结构基序分为五个家族的天然存在的核酸酶：LAGLIDADG(SEQ ID NO:14)、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒子和PD-(D/E)XK。参见，例如，Stoddard《结构(Structure.)》，2011年1月12日；19(1):7-15。
“megaTAL”是指包括TALE DNA结合结构域和归巢核酸内切酶变体的多肽，所述归巢核酸内切酶变体与靶基因中的DNA靶序列结合并对其进行切割。参见，例如，Boissel等人《分子生物学方法》(2015)；1239:171-96。在一些实施例中，megaTAL进一步包括一个或多个连接子和/或另外的功能结构域，例如，表现出5'-3'核酸外切酶、5'-3'碱性核酸外切酶、3'-5'核酸外切酶(例如，Trex2、ExoI或ExoX)、5'瓣状核酸内切酶、解旋酶或模板非依赖性DNA聚合酶活性的端加工酶的端加工酶结构域。
术语“成簇的规则间隔的短回文重复序列”或“CRISPR”是指最初存在于如细菌和古细菌等原核生物的基因组中的DNA序列家族，并且用于检测和破坏来自噬菌体的DNA。与核酸酶(例如，Cas核酸酶；CRISPR-Cas)组合的CRISPR序列也可以用于编辑生物体内的基因，并在研究、基因编辑和治疗中有多种应用。参见，例如，《自然生物技术(NatureBiotechnology)》第38卷,第824-844页(2020)。
术语“CRISPR相关核酸酶”和“Cas核酸酶”可互换使用，并且是指RNA指导的序列特异性核酸酶，其使用CRISPR序列作为在DNA中产生特异性单链或双链断裂的向导。通常，通过CRISPR-Cas系统的靶向需要在靶DNA位点附近出现的被称为原间隔子邻近基序(PAM)的短序列。
术语“锌指核酸酶”(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化成与期望的靶位点结合。在一些实施例中，切割结构域包括Fokl的非特异性切割结构域。在其它实施例中，切割结构域包括另一种核酸酶的全部或活性部分。
术语“TAL效应子核酸酶”(TALEN)是指包括与核酸酶结构域融合的TAL效应子结构域(TALE)的核酸酶。已描述了从植物病原体黄单胞菌分离的TAL效应子DNA结合结构域(参见Boch等人,(2009)《科学(Science)》2009年10月29日(10.1126/science.117881)以及Moscou和Bogdanove,(2009)《科学》2009年10月29日(10.1126/science.1178817))。这些DNA结合结构域可以被工程化以与期望的靶标结合并与核酸酶结构域，如Fokl核酸酶结构域融合，以衍生TAL效应子结构域-核酸酶融合蛋白。
“靶位点(target site)”或“靶序列(target sequence)”是染色体或染色体外核酸序列，其限定核酸的结合分子将与其结合和/或将切割的一部分，条件是存在充分的结合和/或切割条件。当参考多核苷酸序列或参考仅引用靶位点或靶序列的一条链的SEQ ID NO时，将应理解，由核酸酶变体结合和/或切割的靶位点或靶序列是双链的并且包括参考序列及其互补体。在各个实施例中，所述靶位点位于免疫系统检查点基因、珠蛋白基因、编码有助于抑制γ-珠蛋白基因表达和/或HbF的多肽的基因或免疫抑制信号传导基因中。
在各个实施例中，所述核酸酶(例如，核酸内切酶、HE、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR-Cas)靶位点位于免疫系统检查点基因、珠蛋白基因、编码有助于抑制γ-珠蛋白基因表达和HbF的多肽的基因或免疫抑制信号传导基因内。在一些实施例中，所述靶位点位于选自由以下组成的组的基因内：程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；PDCD1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、带T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CCR5、TRAC(TCRα)、TCRβ、IL10Rα、IL10Rβ、TGFBR1、TGFBR2、CBL-B、PCSK9、AHR、BTK、α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白和BCL11A基因。
在一些实施例中，靶位点是人TRAC基因中的序列。在一些实施例中，靶位点是PD1基因中的序列。在一些实施例中，靶位点是PCSK9基因中的序列。在一些实施例中，靶位点是BCL11A中的序列。在一些实施例中，靶位点是BCL11A中的序列。
其它靶基因可以包含但不限于α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、BCL11A、KLF1、SOX6、GATA1、LSD1、α叶酸受体(FRα)、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3(CD276)、B7-H6、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、C型凝集素样分子-1(CLL-1)、CD2子集1(CS-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原1(CTAGE1)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白40(EGP40)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、A型肝配蛋白受体2(EPHA2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、Fc受体样5(FCRL5)、胎儿乙酰胆碱酯酶受体(AchR)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、IL-11Rα、IL-13Rα2、κ、癌/睾丸抗原2(LAGE-1A)、λ、路易斯-Y(Lewis-Y，LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤抗原基因(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGEA10、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MART1)、间皮素(MSLN)、MUC1、MUC16、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)、黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、滑膜肉瘤、X断点2(SSX2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、TEM5、TEM8、滋养层糖蛋白(TPBG)、UL16结合蛋白(ULBP)1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、威尔姆斯瘤1(Wilmstumor 1，WT-1)基因和威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)基因。
在一些实施例中，所述核酸酶(例如，核酸内切酶、HE、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR-Cas)靶位点位于选自由以下组成的组的基因内：程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；PDCD1)、淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域蛋白3(TIM-3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、带T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序结构域(TIGIT)、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CCR5、TRAC(TCRα)、IL10Rα、TGFBR2、CBL-B、PCSK9、AHR、BTK、α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白和BCL11A基因。
在各个实施例中，所述核酸酶(例如，核酸内切酶、HE、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR-Cas)靶位点位于TRAC(TCRα)基因、PDCD1(PD-1)基因或PCSK9基因内。在特定实施例中，TCRαmegaTAL RNA包括SEQ ID NO:2或3中所示的序列(参见，例如，WO/2018/071565，所述文献通过引用整体并入本文)。在特定实施例中，PD-1megaTAL RNA包括SEQ ID NO:5或6中所示的序列(参见，例如，WO/2018/049226，所述文献通过引用整体并入本文)。在特定实施例中，PCSK9 megaTAL RNA包括SEQ ID NO:8或9中所示的序列(参见，例如，WO/2019/070974，所述文献通过引用整体并入本文)。
在各个实施例中，RNA转录物编码核酸外切酶、端加工酶或其片段或变体。在一些实施例中，RNA转录物是选自由以下组成的组的核酸外切酶、端加工酶或其片段或变体：Trex2、Trex1、不含跨膜结构域的Trex1、Apollo、Artemis、DNA2、ExoI、ExoT、ExoIII、ExoX、Fen1、Fan1、MreII、Rad2、Rad9、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)、PNKP、RecE、RecJ、RecQ、λ核酸外切酶、Sox、牛痘DNA聚合酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII、NDK1、NDK5、NDK7、NDK8、WRN、T7-核酸外切酶基因6、禽类成髓细胞瘤病毒整合蛋白(IN)、Bloom、热敏磷酸酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶(PNK)、ApeI、绿豆核酸酶、Hex1、TTRAP(TDP2)、Sgs1、Sae2、CUP、Polμ、Polλ、MUS81、EME1、EME2、SLX1、SLX4以及UL-12。在一些实施例中，所述核酸外切酶是Trex2或其生物活性片段。在特定实施例中，Trex2 RNA包括SEQ ID NO:11或12中所示的序列。
在各个实施例中，RNA转录物可以编码与疾病相关的蛋白或多肽(例如，治疗活性蛋白或多肽)。在一些实施例中，治疗活性蛋白或多肽是α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、FVIII或抗血友病因子(AHF)、ATP结合盒D亚家族成员1(ABCD1)、腺苷脱氨酶、白介素2受体γ、三肽基肽酶1、α-L艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
可替代地，所选RNA序列可以是如本文所定义的任何RNA，特别是信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反义RNA、CRISPR RNA、环状RNA(circRNA)、核酶、适体、核糖开关、免疫刺激RNA、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微RNA(miRNA)或Piwi相互作用RNA(piRNA)。在一些实施例中，RNA可以包括天然存在的和/或经修饰的核苷酸。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷：假尿苷、吡啶-4-酮核糖核、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基尿苷、1-牛磺酰甲基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代尿苷、1-牛磺酰甲基-4-硫代尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷以及N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷：假尿苷、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酰甲基尿苷、1-牛磺酰甲基-假尿苷、5-牛磺酰甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酰甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷以及4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、折布拉林、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷以及4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤以及2-甲氧基-腺嘌呤。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一种或多种选自由以下组成的组的经修饰的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷以及N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一个实施例中，RNA(例如，mRNA)包括一个或多个假尿苷、一个或多个5-甲基-胞嘧啶和/或一个或多个5-甲基-胞苷。在一个实施例中，mRNA包括一个或多个假尿苷。在一个实施例中，mRNA包括一个或多个5-甲基-胞苷。在一个实施例中，mRNA包括一个或多个5-甲基-胞嘧啶。
E.序列表
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式稍为详细地描述了前述实施例，但是根据本文设想的教导，本领域的普通技术人员将容易清楚的是，可以在不脱离随附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。本领域的技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
实例
实例1
用于从治疗性RNA制剂中去除DSRNA的新方法
开发了新的和经改进的用于去除dsRNA的方法/过程，所述方法/过程令人惊讶地有效并降低了体内细胞毒性。图1A-1F示出了说明性方法单元操作。简而言之，所述方法使用非扩增的线性DNA(例如，来自消化的质粒或其它质粒)作为编码所关注的基因的模板。使用体外转录反应(例如，使用T7噬菌体聚合酶和核苷酸三磷酸)从线性DNA合成RNA转录物。使用加帽酶，例如牛痘鸟苷酸转移酶、鸟苷三磷酸和S-腺苷基-L-甲硫氨酸，在翻译(或共转录)后将RNA转录物在5'端处酶促加帽以产生帽0结构。可替代地，可以使用2'O-甲基转移酶产生帽1结构。帽1结构含有甲基化的2'OH基团倒数第二核苷酸。在一些实施例中，使用已知方法和/或可商购的产物(例如，)进行共转录加帽。
然后，将与dsRNA结合的抗体与RNA转录物分批温育以与dsRNA杂质结合。使用树脂(例如，MabCaptureTMA Select ProATM树脂)从样品中耗竭抗体-dsRNA复合物和游离抗体。RNA转录物也在反应单元操作之间通过使用oligo dT亲和柱/树脂(例如，oligo dT纤维素树脂/柱或POROSTMOligo(dT)25柱(SEQ ID NO:15))的亲和色谱法进行层析纯化，并渗滤到期望的调配物缓冲液中。作为最终步骤，通过0.22μm过滤器过滤mRNA。
实例2
J2抗体加OLIGO DT亲和色谱法有效地从RNA制剂中去除DSRNA
使用实例1中描述的工艺单元操作纯化TCRa megaTAL mRNA(SEQ ID NO:2)(还参见图1C)。具体地，使用与MabCaptureTMA Select ProATM树脂(ThermoFisher ScientifiTM)结合的抗dsRNA抗体J2从RNA样品中去除dsRNA。测试了1mL和5ml ProA树脂/J2抗体柱(“1xProA柱”和“5x ProA柱”)，以及在J2抗体纯化步骤(“5x ProA柱+dT”)之后使用5ml柱(ProA树脂/J2抗体)和另外的亲和色谱法纯化步骤(oligo dT)。dsRNA含量通过如Kariko等人,《核酸研究》2011年11月；39(21):e142中所描述的dsRNA斑点印迹测定来测量。简而言之，将mRNA批次印迹到带电的NytranTM膜上，旁边是合成的100％双链RNA对照。将膜干燥、阻断并与J2抗dsRNA IgG2a单克隆抗体一起温育过夜。在几次洗涤之后，然后使用荧光次级抗体与J2抗体结合。在多次洗涤之后，使用LI-COR Odyssey CLx成像系统捕获图像，并且通过与100％对照的荧光强度比较来分析mRNA批次中双链RNA百分比。
在使用1mL柱的情况下，dsRNA含量显著耗竭，如荧光减少所指示的(图2A和2B)。通过增加ProA树脂的体积，即，通过使用5mL柱，观察到抗体:dsRNA复合物的进一步耗竭。然而，令人惊讶的是，通过在J2抗体纯化步骤之后添加亲和色谱法纯化步骤(即，oligo dT纯化步骤)，实现了抗体:dsRNA复合物的进一步耗竭(图2B)。此外，用荧光标记的次级对样品进行的直接斑点印迹表明，图2B斑点印迹检测到的残留荧光信号是由于穿过ProA柱的残留J2抗体(图2C)。因此，通过dsRNA斑点印迹对dsRNA含量的评估显示，当如上文所描述的组合基于抗体和oligo dT的纯化时，mRNA样品中的dsRNA的百分比不可通过测定检测到。
实例3
J2抗体滴定
执行J2滴定实验以确定用于双链RNA(dsRNA)清除的J2 mAb的有效量。使用内部mRNA产生过程制备PD1 megaTAL(SEQ ID NO:5)；约3000nt)和Trex2(SEQ ID NO:11；约1000nt)mRNA。简而言之，mRNA材料通过体外转录产生，并在J2滴定实验之前在5'端处用帽0结构加帽。根据mRNA分子(至多60mol％)计算J2的量。将样品与适当量的J2在室温下温育30分钟，然后添加ProA树脂以捕获抗体:dsRNA复合物(在室温下温育1小时)。然后通过真空歧管收集经纯化的mRNA材料。执行J2斑点印迹(如上文所描述的)和阻抗测定(如下文所描述的)以确定dsRNA含量和对BJ成纤维细胞的毒性。
使用BJ成纤维细胞和来自ACEA生物科学有限公司(ACEA Biosciences,Inc.)的xCELLigenceTM RTCA MP仪器，通过细胞阻抗测定对mRNA批次的细胞毒性执行评估。xCELLigence仪器使用无创电阻抗监测，以“细胞指数”值的形式连续测量细胞活力。将细胞粘附到含有叉指状电极的ACEA的E板上，并给予24小时以增殖。然后用mRNA批次和双链mRNA杀伤对照转染细胞，并在转染后监测72小时。ACEA软件用于分析转染后72小时窗口内每个孔的细胞指数值，并报告细胞指数的斜率值。将给定mRNA批次的细胞指数的斜率与仅LNP和双链杀伤对照的细胞指数的斜率进行比较，以给出细胞毒性的指示。
使用两种mRNA构建体的滴定实验表明，在≥7.5mol％J2下的有效dsRNA清除(图3A和3B)。另外，体外毒性结果与dsRNA含量密切相关，表明在较低的dsRNA水平下的细胞毒性降低(图3C和3D)。
实例4
体内基因编辑和MRNA特性
将内部产生的PCSK9 megaTAL和Trex2 mRNA(分别为SEQ ID NO:8和11)粗体外转录(IVT)RNA材料送至商业供应商处，以用硅胶树脂(商用-二氧化硅)或HPLC(商用-HPLC)对其进行加帽和纯化。如上文所描述的，同样的粗IVT材料还通过poly(A)mRNA分离(oligo dT纯化)和dsRNA耗竭(J2纯化)进行内部纯化。将使用三种方法纯化的PCSK9 megaTAL mRNA在三个单独的体外测定中进行比较(图4A-4F)。按照制造商推荐的方案，使用其标准RNA分析试剂，通过在基于高级分析毛细管电泳的片段分析仪上运行mRNA来测量mRNA长度。使用ProSize软件(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies,Inc))测量曲线下面积，并绘制三个复制品的选定峰的平均总面积百分比(图4A)。
双链mRNA(dsRNA)在体内递送时可能是有毒的。为了测量mRNA制剂中dsRNA的量，如上文所描述的执行dsRNA斑点印迹测定。J2/dT mRNA产生过程产生的mRNA具有检测不到的dsRNA水平，类似于或优于HPLC和二氧化硅纯化的mRNA(图4B)。
使用ACEA生物科学有限公司的RTCA iCELLigenceTM基于阻抗的组件，在体外细胞生长测定中测量mRNA毒性。将人BJ成纤维细胞(ATCC、CRL-2522)细胞接种到iCELLigence板中并使其粘附18-24小时。按照制造商推荐的方案将mRNA调配成LipofectamineMessengerMax转染试剂并用于转染细胞。测量细胞生长量48小时，并将生长斜率绘制为毒性的指标(图4C)。
使用三种方法纯化的PCSK9 megaTAL和Trex2 mRNA与液体纳米颗粒(LNP)(Acuitas医药公司(Acuitas Therapeutics))以1.0:1.0的摩尔比调配。将mRNA/LNP调配物稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并以1mg/kg的剂量(通过尾静脉注射)向每种条件下的五只Balb/C小鼠施用(图4D-4F)。使用下一代扩增子测序执行INDEL分析，并绘制成与二氧化硅条件相比的变化倍数(图4D)。
通过在给药后24小时从动物的下颌取血并测量天冬氨酸转氨酶(AST)酶水平来测定每种mRNA制剂的相对毒性(图4E)。通过使用基于EMD Millipore的MILLIPLEX MAP小鼠细胞因子/趋化因子磁珠的Luminex板(目录号：MCYTOMAG-70KM)定量在mRNA调配物给药之后四小时收集的血清中的趋化因子和细胞因子水平(即，IL-6和MCP-1)来测量经纯化的mRNA的体内免疫原性(图4F)。
总的来说，包括poly(A)mRNA纯化和dsRNA耗竭的内部(J2/dT)方法产生的mRNA在体外mRNA特性或体内活性和毒性/免疫原性测定中与商业来源的二氧化硅或HPLC纯化的mRNA质量相同或更好。
实例5
体外基因编辑和MRNA特性
将内部产生的PD1 megaTAL mRNA(SEQ ID NO:5)粗体外转录(IVT)RNA材料送至商业供应商处，以用硅胶树脂(商用-二氧化硅)或HPLC(商用-HPLC)对其进行加帽和纯化。同样的粗IVT材料还通过poly(A)mRNA分离(oligo dT纯化)和dsRNA耗竭(J2纯化)进行内部纯化。将使用三种方法制备的mRNA在三个单独的测定中进行比较，以评估mRNA质量(图5A-5C)。还在T细胞中评估mRNA，以比较功效的差异(图5D和5E)。用αCD3和αCD28抗体刺激来自三个供体的PBMC。在37℃下72小时之后，使用Amaxa 4D-Nucleofector以50μg/mL剂量用mRNA对T细胞进行电穿孔。对于三个供体中的每个供体，一式三份地对每个mRNA进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞置于30℃下用于过夜回收，并且然后第二天移至37℃。在电穿孔之后96小时，将细胞分成两个板。将一个板用PMA/离子霉素刺激24小时，并且然后进行FACS分析，以观察PD1 megaTAL mRNA处理的细胞中的PD-1敲低(图5E)。通过NGS处理剩余的板以进行INDEL分析(图5D)。
实例6
不同纯化方法之间的DSRNA水平的比较
比较了不同纯化方法产生的mRNA之间的dsRNA水平(图6A)。商业供应商使用其平台二氧化硅或HPLC纯化方法(商用-二氧化硅或商用-HPLC)制备多种mRNA构建体。另外，使用蓝鸟公司(bluebird)的J2/dT工艺(商用-J2)进一步纯化每种二氧化硅纯化的mRNA的一部分。使用J2/dT工艺的两批内部产生的mRNA包含在比较中。分析表明，另外的J2/dT纯化令人惊讶地降低了二氧化硅纯化的材料的dsRNA水平。此外，通过J2/dT纯化的内部产生的材料表现出最低的dsRNA水平。
除了通过斑点印迹进行的dsRNA分析之外，通过使用BJ成纤维细胞进行的基于阻抗的测定来评估选择性mRNA材料组的体外细胞毒性。以细胞生长指数的斜率表示的细胞毒性结果显示了与mRNA材料的dsRNA水平的强相关性(图6B)。
通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例连同此类权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求书并不受本公开的限制。
序列表
<110> 2赛文缇生物公司 (2SEVENTY BIO, INC.)
<120> RNA纯化方法
<130> BLUE-136.PC
<140>
<141>
<150> 63/210,101
<151> 2021-06-14
<160> 16
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 2721
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 1
cctccgaaga agaagcggaa agtcgtggac ctccggaccc tgggttactc tcagcagcag 60
caggagaaga tcaagccgaa ggtgcggtcg actgtggccc agcatcacga ggccctggtg 120
ggacacggct tcacccacgc ccacattgtg gccctgagcc agcacccggc agcgctggga 180
accgtggccg tgacctacca gcacatcatt actgccctgc ctgaagcgac ccacgaggat 240
atcgtgggcg tcggaaagca gtggtccgga gccagagcct tggaggctct gctgactgac 300
gccggagagc tgcggggccc gcccctgcaa ctggataccg gccagctcgt gaaaatcgcc 360
aagagaggag gagtgaccgc catggaagcc gtgcatgcat cccgcaatgc actgactggt 420
gcacccctga acctcactcc tgaccaggtc gtcgctatcg caagcaacat cggagggaaa 480
caagctctcg agacagtgca gcgcctcctg ccagtgcttt gccaggacca cggcctgact 540
ccagaccagg tggtcgctat tgcgtcgaac attggaggga agcaagccct tgaaaccgtg 600
cagaggctgc tcccggtgct gtgccaagac catggactca ccccggacca agtggtggct 660
attgctagca acattggcgg taagcaggcg ctggagacag tccagcggct gctgccggtg 720
ttgtgccaag atcacggtct taccccagac caagtcgtgg cgattgcctc caacggtggc 780
ggcaagcaag cactcgaaac tgtccagaga ctgctccctg tgctctgtca agaccacggg 840
ttgacccccg accaagtggt ggccatcgcc tcccatgatg gaggaaagca ggccctcgag 900
actgtccagc gactgctccc cgtgttgtgt caggatcatg gattgacgcc cgatcaggtc 960
gtggccattg cctcccacga cggtggaaag caagcgctgg aaactgtgca gcggttgctg 1020
ccggtcctgt gccaggacca cggactgact ccggaccagg tggtcgccat cgcatccaac 1080
attggtggca agcaggctct cgaaaccgtc caacgcctgt tgccggtgct gtgtcaggat 1140
catggactga ccccggacca agtggtggct atcgcctcca acaacggggg caaacaggcc 1200
ctggaaaccg tgcaacgcct gctgcccgtc ctctgccagg accacggtct gacccctgac 1260
caggtcgtcg cgatcgcgtc aaatgggggg ggcaaacagg ctctggaaac ggtgcagcgg 1320
ctccttccgg tgttatgcca ggaccacggg ctgactcccg accaggtggt ggcgatcgcc 1380
tcgaacaacg gaggcaaaca agccctggag actgtgcaga gactcctgcc cgtgctgtgc 1440
caagaccatg ggctcacccc tgatcaggtg gtggcaatcg cctcaaacat cggcgggaag 1500
caggcactgg aaactgtgca gagactcctg cccgtgctgt gccaagacca tgggctgacc 1560
ccggaccaag tggtggctat cgcctcccac gacgggggca aacaggccct ggaatccatc 1620
gtcgctcagc tgagccggcc tgacccagca ctcgccgccc tgaccaatga ccatctggtc 1680
gccctggcct gcctgggagg cagacccgcg atggacgcgg tcaagaaggg tctgccgcac 1740
gcccctgagc ttattcggag agtgaacagg cgcatcggtg aacgcacctc ccatcgggtc 1800
gcaatctcta gagtgggcgg atcgtcccgg cgggagtcca tcaatccttg gatcctgacc 1860
ggcttcgccg acgccgaagg ctccttcatc ctggacatca ggaacaggaa caacgagtca 1920
aacaggtacc gcacctccct tcggttccag attactctgc acaacaagga taagtccatc 1980
ctcgagaaca tccagtcaac ctggaaagtg ggcaagatca ctaactcctc ggaccgcgca 2040
gtgatgctcc gggtgacccg cttcgaggac ctgaaggtga tcattgacca cttcgagaag 2100
taccctctca taacccagaa gctgggagat tacaagctgt ttaagcaggc gttctccgtg 2160
atggagaaca aagaacacct taaggagaat gggattaagg aactggtccg cattaaggcc 2220
aagatgaact ggggactgaa cgacgagttg aaaaaggcat ttcctgaaaa catctccaag 2280
gaacggccgc tcatcaacaa gaacattccc aatttcaagt ggctggcggg gttcactgcc 2340
ggggacggac acttcggagt gaacctgaag aaggtgaagg gcaccgccaa ggtgtacgtg 2400
ggcctgcggt tcgcgatcag ccagcacatc cgggataaga acctgatgaa cagcctcatc 2460
acctacctgg gatgcggaag catccgggag aagaacaagt cagaattccg atggctggaa 2520
tttgaagtga ccaagttctc cgacatcaac gacaagatca tccccgtgtt ccaggagaac 2580
accctcattg gagtgaagct ggaggacttc gaggactggt gcaaggtggc caagctcatc 2640
gaagagaaga agcacctgac cgaaagcggc ctggatgaga ttaagaagat taagctcaac 2700
atgaacaagg gaagatagta g 2721
<210> 2
<211> 2957
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 2
ggggccgcca ccaugggauc cgccccuccg aagaagaagc ggaaagucgu ggaccuccgg 60
acccuggguu acucucagca gcagcaggag aagaucaagc cgaaggugcg gucgacugug 120
gcccagcauc acgaggcccu ggugggacac ggcuucaccc acgcccacau uguggcccug 180
agccagcacc cggcagcgcu gggaaccgug gccgugaccu accagcacau cauuacugcc 240
cugccugaag cgacccacga ggauaucgug ggcgucggaa agcagugguc cggagccaga 300
gccuuggagg cucugcugac ugacgccgga gagcugcggg gcccgccccu gcaacuggau 360
accggccagc ucgugaaaau cgccaagaga ggaggaguga ccgccaugga agccgugcau 420
gcaucccgca augcacugac uggugcaccc cugaaccuca cuccugacca ggucgucgcu 480
aucgcaagca acaucggagg gaaacaagcu cucgagacag ugcagcgccu ccugccagug 540
cuuugccagg accacggccu gacuccagac cagguggucg cuauugcguc gaacauugga 600
gggaagcaag cccuugaaac cgugcagagg cugcucccgg ugcugugcca agaccaugga 660
cucaccccgg accaaguggu ggcuauugcu agcaacauug gcgguaagca ggcgcuggag 720
acaguccagc ggcugcugcc gguguugugc caagaucacg gucuuacccc agaccaaguc 780
guggcgauug ccuccaacgg uggcggcaag caagcacucg aaacugucca gagacugcuc 840
ccugugcucu gucaagacca cggguugacc cccgaccaag ugguggccau cgccucccau 900
gauggaggaa agcaggcccu cgagacuguc cagcgacugc uccccguguu gugucaggau 960
cauggauuga cgcccgauca ggucguggcc auugccuccc acgacggugg aaagcaagcg 1020
cuggaaacug ugcagcgguu gcugccgguc cugugccagg accacggacu gacuccggac 1080
cagguggucg ccaucgcauc caacauuggu ggcaagcagg cucucgaaac cguccaacgc 1140
cuguugccgg ugcuguguca ggaucaugga cugaccccgg accaaguggu ggcuaucgcc 1200
uccaacaacg ggggcaaaca ggcccuggaa accgugcaac gccugcugcc cguccucugc 1260
caggaccacg gucugacccc ugaccagguc gucgcgaucg cgucaaaugg ggggggcaaa 1320
caggcucugg aaacggugca gcggcuccuu ccgguguuau gccaggacca cgggcugacu 1380
cccgaccagg ugguggcgau cgccucgaac aacggaggca aacaagcccu ggagacugug 1440
cagagacucc ugcccgugcu gugccaagac caugggcuca ccccugauca ggugguggca 1500
aucgccucaa acaucggcgg gaagcaggca cuggaaacug ugcagagacu ccugcccgug 1560
cugugccaag accaugggcu gaccccggac caaguggugg cuaucgccuc ccacgacggg 1620
ggcaaacagg cccuggaauc caucgucgcu cagcugagcc ggccugaccc agcacucgcc 1680
gcccugacca augaccaucu ggucgcccug gccugccugg gaggcagacc cgcgauggac 1740
gcggucaaga agggucugcc gcacgccccu gagcuuauuc ggagagugaa caggcgcauc 1800
ggugaacgca ccucccaucg ggucgcaauc ucuagagugg gcggaucguc ccggcgggag 1860
uccaucaauc cuuggauccu gaccggcuuc gccgacgccg aaggcuccuu cauccuggac 1920
aucaggaaca ggaacaacga gucaaacagg uaccgcaccu cccuucgguu ccagauuacu 1980
cugcacaaca aggauaaguc cauccucgag aacauccagu caaccuggaa agugggcaag 2040
aucacuaacu ccucggaccg cgcagugaug cuccggguga cccgcuucga ggaccugaag 2100
gugaucauug accacuucga gaaguacccu cucauaaccc agaagcuggg agauuacaag 2160
cuguuuaagc aggcguucuc cgugauggag aacaaagaac accuuaagga gaaugggauu 2220
aaggaacugg uccgcauuaa ggccaagaug aacuggggac ugaacgacga guugaaaaag 2280
gcauuuccug aaaacaucuc caaggaacgg ccgcucauca acaagaacau ucccaauuuc 2340
aaguggcugg cgggguucac ugccggggac ggacacuucg gagugaaccu gaagaaggug 2400
aagggcaccg ccaaggugua cgugggccug cgguucgcga ucagccagca cauccgggau 2460
aagaaccuga ugaacagccu caucaccuac cugggaugcg gaagcauccg ggagaagaac 2520
aagucagaau uccgauggcu ggaauuugaa gugaccaagu ucuccgacau caacgacaag 2580
aucauccccg uguuccagga gaacacccuc auuggaguga agcuggagga cuucgaggac 2640
uggugcaagg uggccaagcu caucgaagag aagaagcacc ugaccgaaag cggccuggau 2700
gagauuaaga agauuaagcu caacaugaac aagggaagau aguagcgccg uacggaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940
aaaaaaaaaa aaaaaaa 2957
<210> 3
<211> 2721
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 3
ccuccgaaga agaagcggaa agucguggac cuccggaccc uggguuacuc ucagcagcag 60
caggagaaga ucaagccgaa ggugcggucg acuguggccc agcaucacga ggcccuggug 120
ggacacggcu ucacccacgc ccacauugug gcccugagcc agcacccggc agcgcuggga 180
accguggccg ugaccuacca gcacaucauu acugcccugc cugaagcgac ccacgaggau 240
aucgugggcg ucggaaagca gugguccgga gccagagccu uggaggcucu gcugacugac 300
gccggagagc ugcggggccc gccccugcaa cuggauaccg gccagcucgu gaaaaucgcc 360
aagagaggag gagugaccgc cauggaagcc gugcaugcau cccgcaaugc acugacuggu 420
gcaccccuga accucacucc ugaccagguc gucgcuaucg caagcaacau cggagggaaa 480
caagcucucg agacagugca gcgccuccug ccagugcuuu gccaggacca cggccugacu 540
ccagaccagg uggucgcuau ugcgucgaac auuggaggga agcaagcccu ugaaaccgug 600
cagaggcugc ucccggugcu gugccaagac cauggacuca ccccggacca agugguggcu 660
auugcuagca acauuggcgg uaagcaggcg cuggagacag uccagcggcu gcugccggug 720
uugugccaag aucacggucu uaccccagac caagucgugg cgauugccuc caacgguggc 780
ggcaagcaag cacucgaaac uguccagaga cugcucccug ugcucuguca agaccacggg 840
uugacccccg accaaguggu ggccaucgcc ucccaugaug gaggaaagca ggcccucgag 900
acuguccagc gacugcuccc cguguugugu caggaucaug gauugacgcc cgaucagguc 960
guggccauug ccucccacga cgguggaaag caagcgcugg aaacugugca gcgguugcug 1020
ccgguccugu gccaggacca cggacugacu ccggaccagg uggucgccau cgcauccaac 1080
auugguggca agcaggcucu cgaaaccguc caacgccugu ugccggugcu gugucaggau 1140
cauggacuga ccccggacca agugguggcu aucgccucca acaacggggg caaacaggcc 1200
cuggaaaccg ugcaacgccu gcugcccguc cucugccagg accacggucu gaccccugac 1260
caggucgucg cgaucgcguc aaaugggggg ggcaaacagg cucuggaaac ggugcagcgg 1320
cuccuuccgg uguuaugcca ggaccacggg cugacucccg accagguggu ggcgaucgcc 1380
ucgaacaacg gaggcaaaca agcccuggag acugugcaga gacuccugcc cgugcugugc 1440
caagaccaug ggcucacccc ugaucaggug guggcaaucg ccucaaacau cggcgggaag 1500
caggcacugg aaacugugca gagacuccug cccgugcugu gccaagacca ugggcugacc 1560
ccggaccaag ugguggcuau cgccucccac gacgggggca aacaggcccu ggaauccauc 1620
gucgcucagc ugagccggcc ugacccagca cucgccgccc ugaccaauga ccaucugguc 1680
gcccuggccu gccugggagg cagacccgcg auggacgcgg ucaagaaggg ucugccgcac 1740
gccccugagc uuauucggag agugaacagg cgcaucggug aacgcaccuc ccaucggguc 1800
gcaaucucua gagugggcgg aucgucccgg cgggagucca ucaauccuug gauccugacc 1860
ggcuucgccg acgccgaagg cuccuucauc cuggacauca ggaacaggaa caacgaguca 1920
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uacccucuca uaacccagaa gcugggagau uacaagcugu uuaagcaggc guucuccgug 2160
auggagaaca aagaacaccu uaaggagaau gggauuaagg aacugguccg cauuaaggcc 2220
aagaugaacu ggggacugaa cgacgaguug aaaaaggcau uuccugaaaa caucuccaag 2280
gaacggccgc ucaucaacaa gaacauuccc aauuucaagu ggcuggcggg guucacugcc 2340
ggggacggac acuucggagu gaaccugaag aaggugaagg gcaccgccaa gguguacgug 2400
ggccugcggu ucgcgaucag ccagcacauc cgggauaaga accugaugaa cagccucauc 2460
accuaccugg gaugcggaag cauccgggag aagaacaagu cagaauuccg auggcuggaa 2520
uuugaaguga ccaaguucuc cgacaucaac gacaagauca uccccguguu ccaggagaac 2580
acccucauug gagugaagcu ggaggacuuc gaggacuggu gcaagguggc caagcucauc 2640
gaagagaaga agcaccugac cgaaagcggc cuggaugaga uuaagaagau uaagcucaac 2700
augaacaagg gaagauagua g 2721
<210> 4
<211> 2511
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 4
ccgccgaaga agaagcgcaa ggtggtggat ctgagaaccc tgggatacag ccagcagcag 60
caggagaaga tcaagccgaa ggtccggtct accgtggccc agcaccatga ggcccttgtg 120
ggccacggct tcacacatgc acacatcgtc gccctgtcgc agcatcccgc cgccctgggg 180
accgtggccg tgacctatca acacatcatt accgccctgc cggaggccac ccacgaggac 240
atcgtgggtg tggggaagca gtggagcgga gccagggcac tcgaagccct cctcactgac 300
gctggagaac tgcgcggacc gcctctccag ctggacaccg gacagctggt gaaaatcgcc 360
aagcggggag gagtgaccgc catggaagcc gtgcacgcct cgaggaacgc gctgactggc 420
gcccctctga acctgacccc tgatcaggtc gtggctatcg cctcaaacaa cgggggtaag 480
caggcgctgg agacagtgca acgacttctg ccagtgcttt gtcaggacca tggtctgacc 540
cccgaccagg tcgtcgccat tgcatccaac aatggtggca agcaggcact ggagactgtc 600
cagaggctgc tcccggtgct gtgccaggac cacgggctca ccccggacca agtggtcgcc 660
atcgcctcca acggaggagg aaaacaagct ctggagactg tgcaacgcct gctgcctgtg 720
ttgtgccaag accacggact gacgcccgat caggtggtgg cgatcgcatc gaacaacgga 780
ggaaagcaag cgctggaaac cgtgcagcgc ctcctgcccg tcctctgcca ggatcacggc 840
ctgactccgg accaggtggt cgcgatcgcc agcaataacg gggggaagca agccctcgag 900
actgtgcagc ggttgctgcc cgtgctctgc caagatcatg gccttacccc agaccaagtc 960
gtggccattg cttccaacaa cggtggcaaa caggcgctcg aaaccgtcca gcggctgttg 1020
cccgtgcttt gccaggatca cggactcacc cctgatcagg tggtggcaat tgcgtccaac 1080
aacggtggaa agcaggccct ggaaacggtg cagcggctgc ttccggtcct gtgtcaggat 1140
catgggctga ctcccgacca ggtcgtcgcc attgcatccc acgatggggg taaacaggcc 1200
ctcgaaacag tgcagagact cctgccagtc ctgtgccaag accacggact taccccggat 1260
caggtggtgg ccatagcctc gaacggcggc gggaaacagg ctctggaaac tgtgcaaaga 1320
ctcctcccgg tgttgtgtca agaccatgga ctgaccccag atcaggtggt ggctattgcc 1380
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cccgcactgg ctgccctgac gaatgaccat ctggtggcgc tggcctgcct gggagggagg 1500
ccagcgatgg atgcggtgaa gaagggactg ccccatgctc cggagctgat tcggagagtg 1560
aataggcgca tcggagagag aacttcacat cgggtggcca tttctagagt gggcggcagc 1620
tcccggcgcg agtccattaa cccctggatc ctgaccggct ttgccgacgc cgaagggtcc 1680
ttcggcctct cgatcctgaa ccggaaccgg ggtaccgctc ggtaccacac cagactgtcc 1740
ttcaccatcg tgctgcacaa caaggacaag agcatcctcg aaaacattca gtcaacgtgg 1800
aaggtgggaa ttattactaa cgacggcgac agatacgtgc gcctgtgcgt gacccggttt 1860
gaggacctga aggtcattat cgaccacttc gagaagtacc ccctcgtgac tcagaagctg 1920
ggagactaca agctgttcaa gcaggcgttc tcggtgatgg aaaacaagga gcacctgaag 1980
gagaacggca tcaaggagct cgcccggatc aaggccaaga tgaactgggg cctgaatgat 2040
gaactcaaga aggcgttccc tgaaaacatc ggtaaagaac ggcccctgat caacaagaac 2100
atcccgaact tcaagtggct tgccggattc acctccggcg acggatcctt cttcgtccgg 2160
ctgcgcaagt ccaacgtgaa cgcgagagtg cgggtgcaat tggtctttga aatctcacag 2220
cacatcaggg acaagaattt gatgaactcc ctcatcacct acctgggttg cggacacatc 2280
tacgaaggca ataagtcgga gcggagctgg ctgcagtttc gcgtggaaaa gttctccgac 2340
attaacgaca agatcatccc agtgttccag gaaaacactc tgattggcgt gaagcttgag 2400
gatttcgagg actggtgcaa ggtggccaag ctgattgaag agaagaagca cctgaccgag 2460
tccggcctgg acgaaatcaa gaaaatcaag ctgaacatga acaagggacg g 2511
<210> 5
<211> 2789
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 5
ggggccgcca ccaugggaag cugccgguac cccuacgacg ucccugacua cgccccgccg 60
aagaagaagc gcaagguggu ggaucugaga acccugggau acagccagca gcagcaggag 120
aagaucaagc cgaagguccg gucuaccgug gcccagcacc augaggcccu ugugggccac 180
ggcuucacac augcacacau cgucgcccug ucgcagcauc ccgccgcccu ggggaccgug 240
gccgugaccu aucaacacau cauuaccgcc cugccggagg ccacccacga ggacaucgug 300
ggugugggga agcaguggag cggagccagg gcacucgaag cccuccucac ugacgcugga 360
gaacugcgcg gaccgccucu ccagcuggac accggacagc uggugaaaau cgccaagcgg 420
ggaggaguga ccgccaugga agccgugcac gccucgagga acgcgcugac uggcgccccu 480
cugaaccuga ccccugauca ggucguggcu aucgccucaa acaacggggg uaagcaggcg 540
cuggagacag ugcaacgacu ucugccagug cuuugucagg accauggucu gacccccgac 600
caggucgucg ccauugcauc caacaauggu ggcaagcagg cacuggagac uguccagagg 660
cugcucccgg ugcugugcca ggaccacggg cucaccccgg accaaguggu cgccaucgcc 720
uccaacggag gaggaaaaca agcucuggag acugugcaac gccugcugcc uguguugugc 780
caagaccacg gacugacgcc cgaucaggug guggcgaucg caucgaacaa cggaggaaag 840
caagcgcugg aaaccgugca gcgccuccug cccguccucu gccaggauca cggccugacu 900
ccggaccagg uggucgcgau cgccagcaau aacgggggga agcaagcccu cgagacugug 960
cagcgguugc ugcccgugcu cugccaagau cauggccuua ccccagacca agucguggcc 1020
auugcuucca acaacggugg caaacaggcg cucgaaaccg uccagcggcu guugcccgug 1080
cuuugccagg aucacggacu caccccugau cagguggugg caauugcguc caacaacggu 1140
ggaaagcagg cccuggaaac ggugcagcgg cugcuuccgg uccuguguca ggaucauggg 1200
cugacucccg accaggucgu cgccauugca ucccacgaug gggguaaaca ggcccucgaa 1260
acagugcaga gacuccugcc aguccugugc caagaccacg gacuuacccc ggaucaggug 1320
guggccauag ccucgaacgg cggcgggaaa caggcucugg aaacugugca aagacuccuc 1380
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2789
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<211> 2511
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<220>
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gactacgact ttcccctcct gtgtaccgag ctgcagagac tcggagccca tctgccacag 420
gatactgtgt gcctcgacac tctgcctgcg ctcagaggac ttgatcgggc acactcccat 480
ggaaccaggg ctcagggaag aaagtcctac agcttggcct cgctgttcca ccggtacttc 540
caggcagaac catcggccgc acattcagct gagggcgatg tgcacaccct gctgctgatc 600
ttccttcacc gcgcacctga actgctggct tgggcagacg aacaagctag atcctgggcg 660
cacattgagc ctatgtacgt gcctccggat ggacctagcc tcgaggccta g 711
<210> 11
<211> 964
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 11
ggggccgcca ccaugucaga accaccucgc gcugagacuu ucguguuccu ugaccuugaa 60
gccacaggac ugcccaacau ggacccggaa aucgccgaga ucagccucuu cgcggugcau 120
cggucauccc uggagaaccc cgaacgggac gauuccgggu cacugguguu gccucgcgug 180
cuggauaagc ugacucucug caugugcccu gaaaggccgu ucaccgccaa agcgucggaa 240
aucaccgguc ugucguccga aucccugaug cauugcggaa aggccggguu caauggugcc 300
gucgucagaa cccugcaggg auuccuguca cggcaggaag guccuaucug ccugguggca 360
cacaacggcu ucgacuacga cuuuccccuc cuguguaccg agcugcagag acucggagcc 420
caucugccac aggauacugu gugccucgac acucugccug cgcucagagg acuugaucgg 480
gcacacuccc auggaaccag ggcucaggga agaaaguccu acagcuuggc cucgcuguuc 540
caccgguacu uccaggcaga accaucggcc gcacauucag cugagggcga ugugcacacc 600
cugcugcuga ucuuccuuca ccgcgcaccu gaacugcugg cuugggcaga cgaacaagcu 660
agauccuggg cgcacauuga gccuauguac gugccuccgg auggaccuag ccucgaggcc 720
uaguuaauua acgagcaucu uaccgccauu uauaccguac ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaa 964
<210> 12
<211> 711
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 12
augucagaac caccucgcgc ugagacuuuc guguuccuug accuugaagc cacaggacug 60
cccaacaugg acccggaaau cgccgagauc agccucuucg cggugcaucg gucaucccug 120
gagaaccccg aacgggacga uuccggguca cugguguugc cucgcgugcu ggauaagcug 180
acucucugca ugugcccuga aaggccguuc accgccaaag cgucggaaau caccggucug 240
ucguccgaau cccugaugca uugcggaaag gccggguuca auggugccgu cgucagaacc 300
cugcagggau uccugucacg gcaggaaggu ccuaucugcc ugguggcaca caacggcuuc 360
gacuacgacu uuccccuccu guguaccgag cugcagagac ucggagccca ucugccacag 420
gauacugugu gccucgacac ucugccugcg cucagaggac uugaucgggc acacucccau 480
ggaaccaggg cucagggaag aaaguccuac agcuuggccu cgcuguucca ccgguacuuc 540
caggcagaac caucggccgc acauucagcu gagggcgaug ugcacacccu gcugcugauc 600
uuccuucacc gcgcaccuga acugcuggcu ugggcagacg aacaagcuag auccugggcg 660
cacauugagc cuauguacgu gccuccggau ggaccuagcc ucgaggccua g 711
<210> 13
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(300)
<223> 该序列可包含5-300个核苷酸
<400> 13
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知物
<220>
<223> 未知物的描述："LAGLIDADG"家族肽基序序列
<400> 14
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 15
tttttttttt tttttttttt ttttt 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 16
tttttttttt tttttttttt ttt 23

Claims (78)

1.一种RNA纯化方法，其包括：
(a)使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；
(b)从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及
(c)纯化所述单链RNA。
2.一种用于产生治疗性RNA的方法，所述方法包括：
(a)使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；
(b)从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及
(c)纯化所述单链RNA；
由此产生治疗性RNA。
3.一种用于提高核酸酶编辑效率的方法，所述方法包括：
(a)使包括编码核酸酶的单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；
(b)从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及
(c)纯化所述单链RNA；
其中与由未与和dsRNA结合的抗体接触的RNA编码的核酸酶的编辑速率相比，所述核酸酶的编辑速率提高。
4.一种用于降低向细胞或受试者施用的RNA的免疫原性和/或毒性的方法，所述方法包括：
(a)使包括单链RNA和双链RNA(dsRNA)的RNA样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触，由此形成dsRNA:抗体复合物；
(b)从所述样品中去除所述dsRNA:抗体复合物；以及
(c)纯化所述单链RNA；
其中所述RNA在施用于细胞或受试者时的免疫原性和/或毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体接触时施用于细胞或受试者的RNA的免疫原性和/或毒性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受试者是人。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述单链RNA是单链环状RNA、单链mRNA或单链非编码RNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述单链RNA被聚腺苷酸化和/或所述方法包括在使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触之前的聚腺苷酸化步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法包括：使聚腺苷酸化的RNA样品与第一寡核苷酸dT(oligo dT)探针接触，所述oligo dT探针与聚腺苷酸化的RNA结合；以及在使所述样品与和dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段接触之前，从所述样品中去除未结合的RNA。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括在与和dsRNA结合的所述抗体或其抗原结合片段接触之后，使所述聚腺苷酸化的RNA与第二寡核苷酸dT探针接触。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述RNA样品是通过化学合成从头获得的。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述RNA样品是从体外转录反应中获得的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中经纯化的RNA在施用于细胞时的如通过阻抗测量的细胞毒性小于在所述RNA尚未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触时施用于细胞的RNA的所述细胞毒性。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸dT探针和/或所述第二寡核苷酸dT探针与表面结合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一寡核苷酸dT探针和/或所述第二寡核苷酸dT探针与所述表面共价连接。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述RNA被加帽和/或所述方法包括对所述样品中的所述RNA进行加帽。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述RNA是从体外转录反应中获得的并被共转录地加帽。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述帽是帽0或帽1。
18.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述帽是ARCA帽或经修饰的ARCA帽。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中使用加帽酶、鸟苷三磷酸和S-腺苷基-L-甲硫氨酸对所述样品中的所述RNA在其5'端处进行加帽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述加帽酶是牛痘鸟苷酸转移酶。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述加帽包括鸟苷三磷酸。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述加帽包括S-腺苷基-L-甲硫氨酸。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述加帽包括2'-O-甲基转移酶。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、美洲驼Ig、羊驼Ig、Ig NAR、Fab'片段、F(ab')2片段、双特异性Fab二聚体(Fab2)、三特异性Fab三聚体(Fab3)、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、迷你抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、骆驼科动物VHH、纳米抗体)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述与dsRNA结合的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：J2、J5、K1、K2、1D3、CABT-B212和9D5。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述抗体是J2。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA与至少约1.5mol％、至少约2mol％、至少约2.5mol％、至少约3mol％、至少约3.5mol％、至少约4mol％、至少约4.5mol％、至少约5mol％、至少约5.5mol％、至少约6mol％、至少约6.5mol％、至少约7mol％、至少约7.5mol％、至少约15mol％、至少约30mol％或至少约60mol％的抗体接触。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述RNA与至少约1.5mol％、至少约7.5mol％、至少约15mol％、至少约30mol％或至少约60mol％的抗体接触。
30.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与至少约7.5mol％的抗体接触。
31.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％、约5mol％、约5.5mol％、约6mol％、约6.5mol％、约7mol％、约7.5mol％、约15mol％、约30mol％或约60mol％的抗体接触。
32.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7.5mol％的抗体接触。
33.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约60mol％的抗体接触。
34.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约2mol％至约60mol％的抗体接触。
35.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约2.5mol％至约60mol％的抗体接触。
36.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约3mol％至约60mol％的抗体接触。
37.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约3.5mol％至约60mol％的抗体接触。
38.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约4mol％至约60mol％的抗体接触。
39.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约4.5mol％至约60mol％的抗体接触。
40.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约5mol％至约60mol％的抗体接触。
41.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约5.5mol％至约60mol％的抗体接触。
42.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约6mol％至约60mol％的抗体接触。
43.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约6.5mol％至约60mol％的抗体接触。
44.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7mol％至约60mol％的抗体接触。
45.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约7.5mol％至约60mol％的抗体接触。
46.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约15mol％至约60mol％的抗体接触。
47.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约30mol％至约60mol％的抗体接触。
48.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约30mol％的抗体接触。
49.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约15mol％的抗体接触。
50.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约7.5mol％的抗体接触。
51.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约7mol％的抗体接触。
52.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约6.5mol％的抗体接触。
53.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约6mol％的抗体接触。
54.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约5.5mol％的抗体接触。
55.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约5mol％的抗体接触。
56.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约4.5mol％的抗体接触。
57.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约4mol％的抗体接触。
58.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约3.5mol％的抗体接触。
59.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约3mol％的抗体接触。
60.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约2.5mol％的抗体接触。
61.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中与所述样品内的RNA的总摩尔数相比，所述样品与约1.5mol％至约2mol％的抗体接触。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中通过基于抗体的亲和色谱法将所述dsRNA:抗体复合物与所述单链RNA分离。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述基于抗体的亲和色谱法包括1ml柱。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述基于抗体的亲和色谱法包括5ml柱。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述基于抗体的亲和色谱法包括10ml柱。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在IVT步骤之前的质粒消化步骤。
67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用DNA酶处理所述样品以去除残留质粒DNA模板的步骤。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述DNA酶处理步骤在IVT步骤之后和/或在加帽步骤之后发生。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括一个或多个超滤/渗滤步骤。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述UF/DF步骤在质粒消化步骤、体外转录步骤、帽反应步骤或亲和色谱法步骤(例如，dT或J2)之后。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括最终无菌过滤步骤。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述最终无菌过滤步骤包括通过0.22μm过滤器过滤。
73.根据权利要求3和6至72中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。
74.根据权利要求3和6至73中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是归巢核酸内切酶、megaTAL、CRISPR相关核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9或其变体。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的方法，其中施用所述经纯化的RNA的受试者体内的天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的AST水平。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法，其中施用所述经纯化的RNA的受试者体内的IL-6水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的IL-6水平。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的方法，其中施用所述经纯化的RNA的受试者体内的MCP-1水平低于施用未与和dsRNA结合的抗体和/或第二oligo dT接触的经纯化的RNA的受试者体内的MCP-1水平。
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