CN117715923A

CN117715923A - Rsv f蛋白突变体及其应用

Info

Publication number: CN117715923A
Application number: CN202380011931.9A
Authority: CN
Inventors: 王弈; 毕帅; 许铮; 刁云珍; 单栢强; 李丹丹; 万季; 赵钊; 潘有东
Original assignee: Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd; Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
Current assignee: Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd; Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-03-15
Also published as: WO2023208206A1

Abstract

本申请公开了RSV F蛋白突变体及其应用，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为：1)至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合；或2)至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；位置编号是基于SEQ ID NO:1所示的序列，所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代，所述的突变体相对于野生型RSV F蛋白，能够显著提高融合前构象F的蛋白表达量，并且具有增加的融合前构象的稳定性。

Description

RSV F蛋白突变体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种RSV F蛋白突变体及其应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，以下简称RSV)感染导致婴幼儿和老年人的大量发病率和死亡率，全球每年估计有6400万例感染和160,000例死亡，RSV感染引起的肺炎是导致临床死亡病例的首要原因。迄今为止，单克隆抗体的被动预防部分由于其适度的功效而仅仅限于高风险婴儿。目前还没有批准上市的针对RSV感染的安全有效的疫苗，突出了对诱导或提供保护性免疫应答的RSV疫苗的迫切需求。

RSV表达两种主要的表面糖蛋白：融合蛋白(F蛋白)和黏附蛋白(G蛋白)。两者在RSV感染过程中发挥不可或缺的作用，并且均显示出诱导保护性中和抗体应答，是主要的保护性抗原。由于F蛋白的氨基酸序列在与人感染有关的RSV亚型间约90％的保守性，遗传稳定性远远高于G蛋白，此外F蛋白是诱导机体产生CD8+T细胞的重要靶点。因此RSV F蛋白是开发RSV疫苗的重要靶点。

RSV通过F蛋白介导的病毒颗粒与被感染细胞膜融合进入细胞，及在被感染细胞表面大量表达的F蛋白介导相邻细胞融合形成合胞体。野生型F蛋白的全长序列有574个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其中，第1-513位氨基酸是F蛋白的胞外区，第514-574位氨基酸是F蛋白的穿膜区和胞内区。成熟的RSV F蛋白最初存在于亚稳的融合前(pre-fusion F)构象中，之后经历构象变化，导致疏水性融合肽插入宿主细胞膜中。随后将F重折叠成稳定的、伸长的融合后构象(post-fusion F)导致病毒和宿主细胞膜的融合。由于F蛋白融合前构象固有的不稳定性，融合前构象F蛋白具有在溶液中和在病毒表面上均过早触发成构象稳定的融合后构象F形式。目前研究通过蛋白质工程已经实现了融合前构象F的稳定化，在动物模型中稳定化的融合前构象F诱导比融合后构象F更高滴度的中和抗体。目前主要通过形成分子内不同氨基酸之间的二硫键和疏水空腔位置氨基酸的突变实现融合前构象F的稳定化。但是目前的融合前构象F的稳定化突变方案存在蛋白表达量低，融合前构象稳定性不足的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请提供了一种野生型RSV F蛋白的突变体，所述突变体显著提高融合前构象F的蛋白表达量，并且具有增加的融合前构象的稳定性。

本申请具体技术方案如下：

本申请提供了一种野生型RSV F蛋白的突变体，其中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为：

1)至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合；或

2)至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；

其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；

所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代；

位置编号是基于SEQ ID NO:1所示的序列。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述空腔填充突变还包括：

位置54的氨基酸被H取代；和/或

位置207或296的氨基酸被L或I取代。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述静电突变包括：

位置486的氨基酸被S取代。

优选地，对于上述所述的变体，其中，所述氨基酸突变还包括：位置215的氨基酸被P取代。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述突变体呈三聚体形式。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比融合前F蛋白具有更高的表达水平，并且具有增加的融合前构象的稳定性。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述野生型RSV为亚型A或亚型B。

优选地，对于上述所述的突变体，其中，所述氨基酸突变是选自以下突变的组合：

(1)S466C、S443C和S190F的组合；

(2)S466C、S443C、S190F和V296I的组合；

(3)S466C、S443C、S190F和V207L的组合；

(4)S466C、S443C、S190F、V207L和S215P的组合；

(5)S466C、S443C、S190F、V296I和S215P的组合；

(6)S466C、S443C、S190F和T54H的组合；

(7)S466C、S443C、S190F和D486S的组合；

(8)S466C、S443C、S190F、T54H和D486S的组合；

(9)S466C、S443C、S190F、D486S和V296I的组合；

(10)S466C、S443C、S190F、V296I和T54H的组合；

(11)S466C、S443C、S190F、V296I、T54H和D486S的组合；

(12)S466C、S443C、S190F、V207L和V296I的组合；

(13)S466C、S443C、S190F、V207L和T54H的组合；

(14)S466C、S443C、S190F、V207L和D486S的组合；

(15)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和T54H的组合；

(16)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和D486S的组合；

(17)S466C、S443C、S190F、V207L、T54H和D486S的组合；

(18)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I、T54H和D486S的组合；和

(19)S466C、S443C、S190F和S215P的组合。

在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白的突变体包含如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列或由如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列组成。在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白的突变体包含如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列的第1-513位氨基酸序列组成的胞外区。在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白的突变体为包含如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列的第1-513位氨基酸序列组成的胞外区以及野生型F蛋白穿膜区和胞内区的全长F蛋白。

另一方面，本申请也提供了野生型RSV F蛋白突变体的胞外区多肽，该胞外区多肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列的第1-513位氨基酸或由如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种序列的第1-513位氨基酸组成。本申请提供了一种核酸分子，其编码上述所述的突变体。

本申请提供了一种表达载体或细胞，其包含上述所述的核酸分子。

本申请提供了一种针对病毒感染对人受试者进行免疫接种的试剂盒，其包含上述所述的突变体。

优选地，对于上述所述的试剂盒，其中，所述病毒感染是RSV感染。

本申请提供了一种药物组合物，其包含上述所述的突变体或上述所述的核酸分子或者上述所述的表达载体或细胞和药学上可接受的载体。

优选地，对于上述所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。

本申请提供了上述所述的药物组合物用于在诱导对抗RSV感染的免疫应答中的用途。

本申请提供一种预防或治疗RSV感染的方法，包括给药受试者有效量的上述所述的突变体或上述所述的药物组合物。

本申请提供了上述所述的突变体或上述所述的药物组合物在制备预防或治疗RSV感染的药物或疫苗中的用途。

发明的效果

本申请所述的突变体相对于野生型RSV F蛋白，能够显著提高融合前构象F的蛋白表达量，并且具有增加的融合前构象的稳定性。

附图说明

图1A至图1C是各突变体重组质粒表达的不同构象F蛋白的表达量的示意图，其中，图1A是各突变体重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图，图1B是各突变体重组质粒表达的pre-fusion构象的、三聚化的F蛋白的表达量的示意图，图1C是各突变体重组质粒表达的post-fusion构象F蛋白的表达量的示意图。

图2A至图2C是不同突变体表达被pre-fusion构象抗体D25识别的pre-fusion构象F蛋白的量的示意图。

图3是不同突变体表达pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图。

图4是不同突变体表达pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图。

图5是ELISA检测细胞培养上清中pre-fusion构象F蛋白的稳定性的示意图。

图6A至图6D是编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象F蛋白的各个中和表位的表达图谱示意图，其中，图6A是编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site)的表达图谱示意图，图6B是编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象三聚体F蛋白的中和表位(Site IV和Site V)的表达图谱示意图，图6C是编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site III)的表达图谱示意图，图6D是编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site V)的表达图谱示意图。

图7是编码突变体的重组质粒图谱示意图。

图8A至图8B是流式细胞术检测细胞表面表达的pre-fusion构象F蛋白与抗体D25或者抗体AM14结合的平均荧光强度(MFI)的示意图。其中，图8A是细胞表面表达的pre-fusion构象F蛋白与抗体D25结合的平均荧光强度示意图，图8B是细胞表面表达的pre-fusion构象三聚体F蛋白与抗体AM14结合的平均荧光强度示意图。

图9A至图9B是野生型和突变体F蛋白mRNA-LNP疫苗免疫BALB/c小鼠诱导血清F蛋白特异性结合抗体IgG以及免疫BALB/c小鼠诱导血清中和抗体的示意图，其中，图9A是野生型和突变体F蛋白mRNA-LNP疫苗免疫BALB/c小鼠诱导血清F蛋白特异性结合抗体的示意图，图9B是野生型和突变体F蛋白mRNA-LNP疫苗免疫BALB/c小鼠诱导血清中和抗体的示意图。

具体实施方式

下面结合附图所描述的实施方式对本申请做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

定义

如本文所用，术语“突变”是指与参照蛋白或多肽的氨基酸序列相比，蛋白或多肽的氨基酸序列中缺失、添加或取代氨基酸残基。在本申请的说明书和权利要求书中，在蛋白序列中第一个特定位置取代氨基酸使用注释“(野生型蛋白中的氨基酸残基)(氨基酸位置)(工程改造的蛋白中的氨基酸残基)”来表示，例如S466C是指参照蛋白的氨基酸序列的第466位的丝氨酸(S)残基被半胱氨酸(C)残基取代(在参照蛋白的突变体中)。

如本文所用，术语“野生型”蛋白、序列或多肽是指未通过选择性突变人工修饰的天然存在的蛋白、序列或多肽。

如本文所用，术语“免疫原性”是指物质在佐剂存在或不存在的情况下，在动物中引起、引发、刺激或诱导针对特定抗原的免疫应答的能力。

如本文所用，术语“糖蛋白”是指含有共价附接至多肽侧链的寡糖链(聚糖)的蛋白。碳水化合物以称为糖基化的共翻译或翻译后修饰附接至蛋白。聚糖是多糖或寡糖，聚糖也可以用于指糖缀合物(诸如糖蛋白、糖脂或蛋白多糖)的碳水化合物部分。

如本文所用，术语“野生型RSV F蛋白的突变体”是指相对于野生型F蛋白所引入的突变且具有针对野生型F蛋白的免疫原性的多肽。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指在与活性成分组合时与活性成分相容并在施用于个体、尤其哺乳动物时不引起毒性或其他不期望繁体的材料或者组合物。在一些实施方式中，药学上可接受的载体可以为溶剂、表面活性剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣和/或稳定剂。

如本文所用，术语“融合前特异性抗体”是指特异性结合成融合前构象的RSV F糖蛋白、但不结合呈融合后构象的RSV F蛋白的抗体。在一些实施方式中，融合前特异性抗体为D25。

如本文所用，术语“免疫应答”是指宿主哺乳动物的免疫系统的一个或多个细胞对刺激(诸如免疫原)的任何可检测应答，包括但不限于先天免疫应答(例如，Toll受体信号转达级联的活化)、细胞介导的免疫应答(例如，免疫系统的T细胞(诸如抗原特异性T细胞)和非特异性细胞介导的应答)和体液性免疫应答(例如，B细胞介导的反应，诸如生成抗体并分泌至血浆、淋巴和/或组织液中)。免疫应答的实例包括以下的改变(例如，增加)：Toll样受体活化、淋巴因子(例如，细胞因子(例如Th1、Th2或Th17型细胞因子)或趋化因子)表达或分泌、巨噬细胞活化、树突细胞活化、T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)活化、NK细胞活化、B细胞活化(例如，抗体生成和/或分泌)、免疫原(例如，抗原(例如，免疫原性多肽))与MHC分子的结合、细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答的诱导、B细胞应答(例如，抗体产生)的诱导和免疫系统的细胞(例如T细胞和B细胞)的扩增(例如，细胞群体的生长)，以及抗原呈递细胞的增加的抗原处理和呈递。如本文所用，术语“免疫应答”还涵盖在体外脊椎动物的免疫系统的一个或多个组分对特定物质(诸如抗体或免疫原)的任何可检测应答。

如本文所用，在抗体结合给定靶分子的情况下，术语“特异性结合”是指抗体以高于其与测试的其他物质结合的亲和力与靶分子，例如，特异性结合呈融合前构象的RSV F蛋白的抗体是以高于其结合呈融合后构象的RSV F蛋白的亲和力结合呈融合前构象的RSV F蛋白的抗体。

如本文所用，术语“疫苗”是指包含能够在个体中引发预防性或治疗性免疫应答的免疫原的药物组合物，通常，疫苗引发针对病原体、例如病毒病原体抗原特异性免疫应答。

如本文所用，术语“表达载体”是指能够在靶细胞中表达插入物，且通常含有驱动插入物的表达的控制序列(诸如增强子、启动子和终止子序列)的载体。外来核酸分子被称为“插入物”。表达载体通常由插入物和用作载体的骨架的较大序列组成。基于载体的结构或来源，主要类型的载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(诸如λ噬菌体)、病毒载体(诸如腺病毒(Ad)载体)和人工染色体。

如本文所用，术语“保守取代”是指用化学相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸取代是本领域众所周知的。以下6组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

如本文所用，术语“有效量”是指试剂的足以生成期望应答的量。例如，这可以是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中可繁殖载体且表达其DNA或RNA的细胞，该细胞可以是原核或真核的。

如本文所用，术语“同一性”时指在比较且比对用于最大对应性时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。一旦比对，通过计数两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定匹配数。序列同一性百分比通过以下方式来确定：将匹配数除以鉴定的序列中所述的序列长度，或除以联接的长度(诸如来自鉴定的序列中所述序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将所得值乘以100。例如，在与具有1554的氨基酸的测试序列比对时具有1166个匹配的肽序列与测试序列75％相同(1166÷1554*100＝75.0)。

用于比较的序列的最佳比对可通过例如以下方法来实施：局部同源性算法，Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；同源性比对算法，Needleman和Wunsch,Mol.Biol.48:443,1970；类似性搜索方法，Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)；或人工比对和目视检查(参见例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第4版，Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York，增刊104,2013))。

RSV F蛋白突变体

本申请提供了一种野生型RSV F蛋白的突变体，其中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个空腔填充突变的组合或者至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；

其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；

所述工程改造的二硫化物突变包括位置466和443的氨基酸被C取代；

位置编号是基于SEQ ID NO:1所示的序列。

在一些实施方式中，所述突变体相对于相应野生型F蛋白对融合前构象F蛋白具有更高的表达水平，并且具有增加的融合前构象的稳定性。

所述RSV F蛋白从mRNA翻译为单一574个氨基酸的多肽前体(称为“F0”或“F0前体”)，所述RSV F0多肽包括N端信号肽(氨基酸残基1-25)、F2多肽(氨基酸残基26-109)、pep27多肽(氨基酸残基110-136)和包括F1胞外结构域(氨基酸残基137-524)、跨膜结构域(525-550)和胞质尾的F1多肽(氨基酸残基551-574)。所述“F0多肽”(F0)是指RSV F蛋白的前体多肽。极少例外，已知RSV毒株的F0多肽由574个氨基酸组成。术语“F1多肽”(F1)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F1包括RSV F0前体的近似残基137-574且由(从N-末端到C-末端)细胞外区域(近似残基137-524)、跨膜结构域(近似残基525-550)和细胞质结构域(近似残基551-574)组成。如本文所用，该术语包括天然F1多肽和来自天然序列的包括修饰(例如，氨基酸取代、插入或缺失)的F1多肽，所述修饰例如被设计以稳定F突变体或增强F突变体的免疫原性的修饰。术语“F2多肽”(F2)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F2包括RSV F0前体的近似残基26-109。如本文所用，该术语包括天然F2多肽和来自天然序列的包括修饰(例如，氨基酸取代、插入或缺失)的F2多肽，所述修饰例如被设计以稳定F突变体或增强F突变体的免疫原性的修饰。在天然RSV F蛋白中，F2多肽通过两个二硫键连接至F1多肽以形成F2-F1异二聚体。在一些实施方式中，所述RSV F蛋白由三聚化形成多聚蛋白质的F1/F2异二聚体构成。

术语“糖蛋白”是指含有共价附接至多肽侧链的寡糖链(聚糖)的蛋白。碳水化合物以称为糖基化的共翻译或翻译后修饰附接至蛋白。术语“糖基化位点”是指多肽(诸如蛋白)的表面上的氨基酸序列，其容纳聚糖的附接。N- 连接的糖基化位点是NX(S/T)的三倍体序列，其中N是天冬酰胺，X是除脯氨酸以外的任何残基，且(S/T)是丝氨酸或苏氨酸残基。聚糖是多糖或寡糖。聚糖也可用于指糖缀合物(例如糖蛋白、糖脂或蛋白多糖)的碳水化合物部分。

来自于不同RSV亚型的众多种天然RSV F蛋白的氨基酸序列以及编码此类蛋白的核酸序列是本领域已知的。天然RSV F蛋白在RSV亚型间展现显著序列保守性。例如，RSV亚型A和B具有＞90％序列同一性，在RSV亚型内，F0序列同一性甚至更高；例如在RSV A、B-RSV F0前体蛋白具有约98％序列同一性。几乎所有鉴定的RSV F0前体序列都由574个氨基酸长度组成，且长度通常由于C-末端胞质尾区的长度而有微小差异。各种天然RSV F蛋白间的序列同一性是本领域已知的(参见，例如，WO2014/160463)。

鉴于RSV F序列的实质性保守性，本领域普通技术人员可以容易地比较不同天然RSV F序列之间的氨基酸位置以鉴定不同RSV毒株和亚型之间的相应RSV F氨基酸位置。例如，在几乎所有鉴定的天然RSV F0前体蛋白中，弗林蛋白酶切割位点落在相同氨基酸位置中。因此，天然RSV F蛋白序列在毒株和亚型间的保守性允许使用参照RSV F序列来比较RSV F蛋白中特定位置的氨基酸。出于本申请的目的(除非上下文另有指示)，RSV F蛋白氨基酸位置参照SEQ ID NO:1中所述F0前体多肽的序列(RSV A2毒株的全长天然F前体多肽的氨基酸序列)。然而，应注意到，且本领域技术人员将理解，例如，如果与SEQ ID NO:1相比添加或移除额外氨基酸残基，则不同RSV F0序列可以具有不同编号系统。因此，应理解，在通过其编号提及特定氨基酸残基时，该氨基酸残基不仅限于依据SEQ ID NO:1编号位置的氨基酸，其还涵盖所有RSV F序列中与SEQ ID NO:1比对获得的对应/等效/相应的氨基酸残基，即使该残基不在相同精确编号位置，例如如果RSV序列短于或长于SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1相比具有插入或缺失的情况。

SEQ IN NO:1的氨基酸序列如下所示：

所述“工程改造的二硫键突变”是指野生型RSV F蛋白中一对氨基酸残基突变为一对半胱氨酸残基。引入的半胱氨酸残基对允许在引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代，例如S466C和S443C。

所述“空腔填充突变”是指某些野生型RSV F蛋白内部存在一些空腔，对这些空腔附近的氨基酸进行突变后，导致这些空腔大小改变或者消失。在一些应用中，此类空腔填充突变有助于稳定RSV F蛋白突变体的融合前构象。待替代用于空腔填充突变的氨基酸通常包括小脂族氨基酸(例如Gly、Ala和Val)或小极性氨基酸(例如Ser和Thr)。其还可包括包埋于融合前构象中、但以融合后构象暴露于溶剂的氨基酸。替代氨基酸可以是大脂族氨基酸(Ile、Leu和Met)或大芳族氨基酸(His、Phe、Tyr和Trp)。在一些实施方式中，所述突变体包括至少一个空腔填充突变。在一些实施方式中，所述突变体包括至少两个空腔填充突变。在一些实施方式中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代(例如S190F或N190F)。在一些实施方式中，所述空腔填充突变还可以为：位置54的氨基酸被H取代，例如T54H；和/或位置207或296的氨基酸被L或I取代，例如V207L和V296L。

所述“静电突变”是指引入野生型RSV F蛋白中的氨基酸突变，所述氨基酸突变减少在折叠结构中彼此靠近的残基之间的离子排斥或增加所述残基之间的离子吸引。在一个实例中，可引入静电突变以改善融合前构象的稳定性。

融合前或融合前三聚体构象中的不利静电相互作用可通过本领域已知方法来鉴定，诸如通过目视检查融合前或融合前三聚体构象的RSV F的晶体结构，或通过使用计算蛋白设计软件(诸如BioLuminate[BioLuminate,Schrodinger LLC,New York,2015]、Discovery Studio[Discovery Studio Modeling Environment,Accelrys,SanDiego,2015]、MOE[Molecular Operating Environment,Chemical Computing GroupInc.,Montreal,2015.]和Rosetta[Rosetta,University of Washington,Seattle,2015.])。

在一些实施方式中，所述氨基酸突变还包括：位置215的氨基酸被P取代，例如S215P。

在一些实施方式中，所述氨基酸突变为至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合或至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合或至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变以及位置215的氨基酸被P取代的组合。

在一些实施方式中，所述突变体呈三聚体形式。

在一些方式中，所述氨基酸突变是选自以下突变的组合：

(1)S466C、S443C和S190F的组合；

(2)S466C、S443C、S190F和V296I的组合；

(3)S466C、S443C、S190F和V207L的组合；

(4)S466C、S443C、S190F、V207L和S215P的组合；

(5)S466C、S443C、S190F、V296I和S215P的组合；

(6)S466C、S443C、S190F和T54H的组合；

(7)S466C、S443C、S190F和D486S的组合；

(8)S466C、S443C、S190F、T54H和D486S的组合；

(9)S466C、S443C、S190F、D486S和V296I的组合；

(10)S466C、S443C、S190F、V296I和T54H的组合；

(11)S466C、S443C、S190F、V296I、T54H和D486S的组合；

(12)S466C、S443C、S190F、V207L和V296I的组合；

(13)S466C、S443C、S190F、V207L和T54H的组合；

(14)S466C、S443C、S190F、V207L和D486S的组合；

(15)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和T54H的组合；

(16)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和D486S的组合；

(17)S466C、S443C、S190F、V207L、T54H和D486S的组合；

(18)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I、T54H和D486S的组合；和

(19)S466C、S443C、S190F和S215P的组合。

在一些实施方式中，所述突变体包含如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30 中的任一种以上的序列或由如SEQ ID NO:7、8、14-28和29-30中的任一种以上的序列组成。

本申请提供的RSV F蛋白突变体可通过本领域已知的常规方法来制备，诸如通过在重组宿主系统中使用合适载体表达。合适重组宿主细胞包括例如昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、细菌和酵母细胞。合适昆虫细胞的实例包括例如Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(衍生自亲代粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物(Invitrogen))。合适哺乳动物细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类胚肾细胞(HEK293或Expi 293细胞，其通常通过剪切的腺病毒5型DNA转化)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞和HeLa细胞。合适禽类细胞包括例如鸡胚胎干细胞(例如，EBx.RTM.细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鹌鹑成纤维细胞(例如ELL-O)和鸭细胞。合适昆虫细胞表达系统、诸如杆状病毒载体系统为本领域技术人员已知且描述于例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)中。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法尤其可以试剂盒形式购自Invitrogen,San Diego Calif。禽类细胞表达系统也是本领域技术人员已知且描述于例如美国专利号5,340,740；5,656,479；5,830,510；6,114,168和6,500,668中。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知且描述于例如Yeast Genetic Engineering(Barr等人编辑，1989)Butterworths,London中。

用于在昆虫或哺乳动物细胞中表达重组蛋白的多种合适载体是本领域众所周知的。合适载体可含有多种组分，包括但不限于以下中的一种或多种：复制起点；可选标记物基因；一种或多种表达控制元件，诸如转录控制元件(例如，启动子、增强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号；和用于在所选宿主细胞(例如，哺乳动物来源或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中靶向至分泌途径的信号序列或前导序列。例如，对于在昆虫细胞中表达，使用合适杆状病毒表达载体、诸如pFastBac(Invitrogen)来产生重组杆状病毒颗粒。杆状病毒颗粒经扩增并用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。对于在哺乳动物细胞中表达，使用将在期望哺乳动物宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)中驱动构建体表达的载体。

RSV F蛋白突变体多肽可使用任何合适方法纯化。例如，通过免疫亲和色谱纯化RSV F蛋白突变体多肽的方法是本领域已知的。Ruiz-Arguello等人， J.Gen.Virol.,85:3677-3687(2004)。纯化期望蛋白的合适方法是本领域众所周知的，包括沉淀和各种类型的色谱，诸如疏水相互作用色谱、离子交换色谱、亲和色谱、螯合色谱和大小排阻色谱。合适纯化方案可使用这些或其它合适方法中的两种或更多种产生。如果期望，RSV F蛋白突变体多肽可包括有助于纯化的“标签”，诸如表位标签或组氨酸(HIS)标签。此类标记的多肽可便捷地纯化，例如从条件化培养基通过螯合色谱或亲和色谱纯化。

在一些实施方式中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合或者至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代。在一些实施方式中，所述空腔填充突变还包括：位置54的氨基酸被H取代；和/或位置207或296的氨基酸被L或I取代。

在一些实施方式中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合或者至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代。在一些实施方式中，所述空腔填充突变还包括：位置54的氨基酸被H取代；和/或位置207或296的氨基酸被L或I取代。在一些实施方式中，所述静电突变包括：位置486的氨基酸被S取代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变还包括：位置215的氨基酸被P取代。

在一些实施方式中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合或者至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代；位置编号是基于SEQ ID NO:1所示的序列。在一些实施方式中，所述空腔填充突变还包括：位置54的氨基酸被 H取代；和/或位置207或296的氨基酸被L或I取代。在一些实施方式中，所述静电突变包括：位置486的氨基酸被S取代。在一些实施方式中，所述氨基酸突变还包括：位置215的氨基酸被P取代。在一些实施方式中，所述突变体呈三聚体形式。在一些实施方式中，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比对融合前F蛋白具有更高的表达水平，并且具有增加的融合前构象的稳定性。在一些实施方式中，所述野生型RSV为亚型A或亚型B。在一些实施方式中，所述氨基酸突变是选自以下突变的组合：

(1)S466C、S443C和S190F的组合；

(2)S466C、S443C、S190F和V296I的组合；

(3)S466C、S443C、S190F和V207L的组合；

(4)S466C、S443C、S190F、V207L和S215P的组合；

(5)S466C、S443C、S190F、V296I和S215P的组合；

(6)S466C、S443C、S190F和T54H的组合；

(7)S466C、S443C、S190F和D486S的组合；

(8)S466C、S443C、S190F、T54H和D486S的组合；

(9)S466C、S443C、S190F、D486S和V296I的组合；

(10)S466C、S443C、S190F、V296I和T54H的组合；

(11)S466C、S443C、S190F、V296I、T54H和D486S的组合；

(12)S466C、S443C、S190F、V207L和V296I的组合；

(13)S466C、S443C、S190F、V207L和T54H的组合；

(14)S466C、S443C、S190F、V207L和D486S的组合；

(15)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和T54H的组合；

(16)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和D486S的组合；

(17)S466C、S443C、S190F、V207L、T54H和D486S的组合；

(18)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I、T54H和D486S的组合；和

(19)S466C、S443C、S190F和S215P的组合。

在本申请中，野生型RSV F蛋白使用的是亚型A的A2毒株，其序列如SEQ ID NO:1所示。

本申请所述的突变体与野生型RSV F蛋白相比，具有更高水平的融合前蛋白表达量，并且具有增加的融合前蛋白构象的稳定性。

核酸分子、表达载体以及试剂盒

本申请提供了编码上述所述的RSV F蛋白突变体的核酸分子。这些核酸分子包括DNA、cDNA和RNA序列。可以将核酸分子并入载体、诸如表达载体中。在一些实施方案中，所述核酸分子编码前体F0多肽，其在适当细胞中表达时被处理为本申请的RSV F突变体。在一些实施方式中，所述核酸分子编码前体F0多肽，其在适当细胞中表达时被处理为RSV F突变体，其中所述前体F0多肽从N-末端到C-末端包括信号肽、F2多肽、Pep27多肽和F1多肽。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码选自下述的突变体：

(1)至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合的突变体，其中，空腔填充突变的位置190的氨基酸被F取代，工程改造的二硫键突变位置466和443的氨基酸被C取代；

(2)至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合的突变体，其中，空腔填充突变的位置190的氨基酸被F取代，工程改造的二硫键突变位置466和443的氨基酸被C取代。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述空腔填充突变为位置54的氨基酸被H取代；和/或位置207或296的氨基酸被L或I取代的突变体。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码所述静电突变为位置486的氨基酸被S取代的突变体。

在一些实施方中，所述核酸分子编码氨基酸突变还包括位置215的氨基酸被P取代的突变体。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码选自下述的突变体：

(1)S466C、S443C和S190F的组合的突变体；

(2)S466C、S443C、S190F和V296I的组合的突变体；

(3)S466C、S443C、S190F和V207L的组合的突变体；

(4)S466C、S443C、S190F、V207L和S215P的组合的突变体；

(5)S466C、S443C、S190F、V296I和S215P的组合的突变体；

(6)S466C、S443C、S190F和T54H的组合的突变体；

(7)S466C、S443C、S190F和D486S的组合的突变体；

(8)S466C、S443C、S190F、T54H和D486S的组合的突变体；

(9)S466C、S443C、S190F、D486S和V296I的组合的突变体；

(10)S466C、S443C、S190F、V296I和T54H的组合的突变体；

(11)S466C、S443C、S190F、V296I、T54H和D486S的组合的突变体；

(12)S466C、S443C、S190F、V207L和V296I的组合的突变体；

(13)S466C、S443C、S190F、V207L和T54H的组合的突变体；

(14)S466C、S443C、S190F、V207L和D486S的组合的突变体；

(15)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和T54H的组合的突变体；

(16)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和D486S的组合的突变体；

(17)S466C、S443C、S190F、V207L、T54H和D486S的组合的突变体；

(18)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I、T54H和D486S的组合的突变体；和

(19)S466C、S443C、S190F和S215P的组合的突变体。

本申请提供了一种表达载体，其包含上述所述的核酸分子。

组合物

本申请提供了一种药物组合物，其包含上述所述的突变体或者上述所述的核酸分子或者上述所述的表达载体和药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述药物组合物为疫苗。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含免疫调节剂，例如佐剂。合适佐剂的实例包括铝盐，诸如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，诸如MF59(参见，例如，WO 90/14837)；皂苷制剂，诸如例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见，例如，美国专利号5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-去酰化MPL(3dMPL)、含CpG-基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，诸如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT或者脂质纳米颗粒等。也可以通过使用编码C4结合蛋白(C4bp)的寡聚化结构域与目标抗原的融合物的异源核酸来使用编码载体的佐剂(例如Solabomi等人，2008,Infect Immun 76：3817-23)。在某些实施方式中，其组合物包含铝作为佐剂，例如呈氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为每剂量0.05mg-5mg(例如0.075mg-1.0mg)的铝含量。

在一些实施方中，本申请提供了引发受试者针对RSV的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的RSV F蛋白突变体、编码RSV F蛋白突变体的核酸分子或包含核酸分子的表达载体。在一些实施方式中，所述受试者为人类。在一些实施方式中，人类是儿童，诸如婴儿。在一些实施方式中，人类是女性，尤其怀孕女性。

在一些实施方式中，所述药物组合物可在施用或不施用佐剂的情况下施用于受试者。施用于受试者的有效量是足以引发受试者针对RSV抗原、诸如RSV F蛋白的免疫应答的量。可经选择用于治疗的受试者包括由于暴露于或可能暴露于RSV而具有发生RSV感染的风险的那些。由于几乎所有人类到2岁时都被RSV感染，所以包括全部出生群组作为免疫相关群体。这可通过例如以下方式来进行：在从出生至6个月龄中的任一时间、从6个月龄至5岁中的任一时间、在怀孕女性(或育龄女性)中(以通过抗体的被动转移来保护其婴儿)、新生婴儿的家庭成员或仍在子宫内的那些和大于50岁的个体中开始免疫方案。具有最大RSV感染风险且具有严重症状(例如需要住院)的受试者包括患有早产、支气管肺发育不良和先天心脏病的儿童。

本申请提供的药物组合物的施用可使用标准施用途径来实施。非限制性实施方式包括肠胃外施用，诸如真皮内、肌内、皮下、透皮、粘膜或经口施用。

在一次施用期间提供至受试者的药物组合物的总剂量可以变化，如技术人员已知的剂量变化。也可以提供一种或多种疫苗组合物的一次或多次加强施用。如果进行加强疫苗接种，则此加强疫苗接种通常将在首次向个体施用组合物(其在此类情形中称作“初免疫苗接种”)后1周和10年之间、优选2周和6个月之间的时刻施用于同一受试者。在替代加强方案中，也可以在初免疫苗接种后向受试者施用不同载体，例如一种或多种腺病毒，或其它载体，诸如修饰的Ankara的牛痘病毒(MVA)或DNA或蛋白。例如，可以向受试者施用其重组病毒载体作为初免，并用包含RSV F蛋白的组合物进行加强。

在某些实施方式中，所述施用包含初免施用和至少一次加强施用。在某些其它实施方式中，每年提供施用。在其它实施方式中，每年与流感疫苗一起提供施用。

本申请提供的药物组合物可与一种或多种其它疫苗一起使用。例如，在成人中，其可与流感疫苗、Prevnar、破伤风疫苗、白喉疫苗和百日咳疫苗一起使用。对于儿科用途，本申请提供的疫苗可与经指示用于儿科患者的任何其它疫苗一起使用。

本申请提供了上述所述的药物组合物用于在诱导对抗RSV F蛋白的免疫应答中使用。

实施例

本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1突变体的制备

基于RSV A2株的F蛋白序列，如SEQ IN NO:1所示的氨基酸序列中选取F蛋白的氨基酸序列第1-513位(其对应的核酸序列为SEQ IN NO:2的核酸序列的第1-1539位)，在氨基酸序列的C末端，由N末端至C末端顺次融合了T4 fibritin trimerization motif,thrombin site,6x His-tag和Streptag II，编码上述融合序列的核酸序列与质粒pcDNA^TM3.1(+)(invitrogen公司产品：Catalog nos.V790-20)构建成重组质粒pcDNA3.1-WT(SEQ ID NO:80)，编码和表达RSV野生型F(WT)蛋白胞外区融合蛋白(SEQ ID NO:81)。利用点突变的方法对表1所示对应突变位点氨基酸的核酸序列进行突变，得到含有编码突变体的核酸序列的重组质粒(SEQ ID NO:35-62)，将重组质粒分别转染培养于24孔板的HEK293T细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，1101HUM-PUMC000091)，质粒转染剂量为0.3μg/孔和1μg/孔。转染后第3天，收集培养上清，并按照本领域常规的方法进行纯化以及鉴定得到突变体，其编号为NeoC-RF-1-11,NeoC-RF-19-33以及NeoC-RF-35-40，其如表1所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3-34所示。

表1突变体的突变位点

实施例2 ELISA检测分子内工程改造的二硫键突变和一个空腔填充突变组合的突变体重组质粒F蛋白的表达和构象表位的表达。

本申请利用单克隆抗体D25(D25使用McLellan,J.S.,Chen,M.,Leung,S.,Graepel,K.W.,Du,X.,Yang,Y.,Zhou,T.,Baxa,U.,Yasuda,E.,Beaumont,T.,Kumar,A.,Modjarrad,K.,Zheng,Z.,Zhao,M.,Xia,N.,Kwong,P.D.,&Graham,B.S.(2013).Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody.Science(New York,N.Y.),340(6136),1113–1117.https://doi.org/10.1126/science.1234914公开的方法制备得到)与F蛋白的结合表征处于Pre-fusion构象表位的F蛋白表达水平；利用单克隆抗体AM14(AM14使用Gilman,M.S.,Moin,S.M.,Mas,V.,Chen,M.,Patel,N. K.,Kramer,K.,Zhu,Q.,Kabeche,S.C.,Kumar,A.,Palomo,C.,Beaumont,T.,Baxa,U.,Ulbrandt,N.D.,Melero,J.A.,Graham,B.S.,&McLellan,J.S.(2015).Characterization of a Prefusion-Specific Antibody That Recognizes a Quaternary,Cleavage-Dependent Epitope on the RSV Fusion Glycoprotein.PLoS pathogens,11(7),e1005035.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005035公开的方法制备得到)与F蛋白的结合表征处于Pre-fusion三聚化构象表位的F蛋白表达水平；利用单克隆抗体4D7(4D7使用Flynn,J.A.,Durr,E.,Swoyer,R.,Cejas,P.J.,Horton,M.S.,Galli,J.D.,Cosmi,S.A.,Espeseth,A.S.,Bett,A.J.,&Zhang,L.(2016).Stability Characterization of a Vaccine Antigen Based on the Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein.PloS one,11(10),e0164789.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164789公开的方法制备得到)与F蛋白的结合表征处于Post-fusion构象表位的F蛋白表达水平。

如实施例1所述重组质粒分别转染培养于24孔板的HEK293T细胞，质粒转染剂量为0.3μg/孔和1μg/孔。转染后第3天，收集细胞培养上清；将100μl培养上清加入Ni预包被的ELISA板孔(Thermo Scientific^TM)中室温孵育2小时，每孔加入250μL PBST洗涤3遍，加入100μL/孔单克隆抗体D25(3μg/ml)，或者单克隆抗体AM14(3μg/ml)，或者单克隆抗体4D7(10μg/ml)室温孵育2hr，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入100μL/孔Goat Anti-Mouse IgG Human ads-HRP(Southern Biotech，货号：1030-05，)(0.2μg/mL)室温孵育1小时，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入TMB显色液50μL/孔室温孵育10分钟，加入50μl/孔终止液。通过检测OD值(OD₄₅₀-OD₆₃₀)表示表达不同构象F蛋白的表达量，其结果如图1A至图1C所示，其中，图1A是各突变体重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图，图1B是各突变体重组质粒表达的pre-fusion构象的、三聚化的F蛋白的表达量的示意图，图1C是各突变体重组质粒表达的post-fusion构象F蛋白的表达量的示意图。

结果显示：各突变体重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的表达量均显著高于野生型(WT)序列蛋白(SEQ ID NO:1)，结果见图1A。用pre-fusion构象F蛋白三聚体特异性抗体AM14的研究显示，NeoC-RF-35，NeoC-RF-37，NeoC-RF-39和NeoC-RF-40突变体重组质粒表达的pre-fusion构象的、三聚化的F蛋白高于WT序列蛋白，而且NeoC-RF-35突变体显著高于 NeoC-RF-37，NeoC-RF-39和NeoC-RF-40，结果如图1B所示。用post-fusion构象F蛋白特异性抗体4D7的研究显示，NeoC-RF-39和NeoC-RF-40表达显著升高的post-fusion构象F蛋白，而NeoC-RF-35则几乎不表达post-fusion构象F蛋白，参见图1C。pre-fusion构象F蛋白形成稳定的三聚体形式有助于进一步提高F蛋白诱导中和抗体的能力，而当F蛋白构象不稳定时，极易由pre-fusion构象转变为post-fusion构象。处于post-fusion构象的F蛋白由于丧失了关键的中和表位，将大大降低或丧失诱导产生中和抗体的能力。从图1A-1C的结果可见，NeoC-RF-35突变体表达显著提高的具有稳定的pre-fusion构象的三聚化F蛋白。

实施例3ELISA检测突变体重组质粒表达的pre-fuison构象F蛋白的表达量以及pre-fuison构象F蛋白稳定性的测定

(1)ELISA检测突变体重组质粒表达的pre-fuison构象F蛋白表达量

如实施例1所述重组质粒分别转染培养于24孔板的HEK293T细胞，质粒转染剂量为0.3μg/孔和1μg/孔。转染后第3天，收集细胞培养上清；将100μl培养上清加入Ni预包被的ELISA板孔中室温孵育2小时后每孔加入250μL PBST洗涤3遍，加入100μL/孔pre-fuison构象的抗体D25(单克隆抗体D25)(10μg/ml)室温孵育2hr，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入100μL/孔单克隆抗体D25(10μg/ml)室温孵育2hr，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入100μL/孔Goat Anti-Mouse IgG Human ads-HRP(Southern Biotech,货号：1030-05)，浓度为0.2μg/mL，室温孵育1小时，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入50μL/孔TMB显色液孵育10分钟，加入50μl/孔终止液，通过检测OD₄₅₀-OD₆₃₀检测pre-fuison构象的F蛋白的表达量，结果如图2A至图2C以及图3至图4所示，其中，图2A是工程改造的二硫键突变和空腔填充的组合的突变体表达pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图，图2B是工程改造的二硫键突变、空腔填充以及静电突变的组合的突变体表达pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图，图2C是工程改造的二硫键突变、空腔填充和位置215的氨基酸被P取代的组合的突变体表达pre-fusion构象F蛋白的表达量的示意图。

从图2A可以看出，与WT F蛋白相比，只含有一对工程改造的二硫键的突变体(NeoC-RF-7，NeoC-RF-8，NeoC-RF-9)突变体或者只含有两对工程改造的二硫键的突变体(NeoC-RF-10)并不能提升pre-fusion构象F蛋白的表达量；含有一对工程改造的二硫键与至少一个空腔填充组合的突变体(NeoC-RF-5、NeoC-RF-6、NeoC-RF-21、NeoC-RF-25、NeoC-RF-27、NeoC-RF-28、NeoC-RF-30和NeoC-RF-35)显著表达更高水平的pre-fusion构象F蛋白；

与WT相比，含有一对工程改造的二硫键与至少一个空腔填充及静电突变组合的突变体显著表达更高水平的pre-fusion构象F蛋白；

与WT相比，含有一对工程改造的二硫键与至少一个空腔填充及215位氨基酸突变为脯氨酸的突变组合的突变体显著表达更高水平的pre-fusion构象F蛋白。

从图3至图4可以看出，本申请所述的突变体能够显著提高pre-fusion构象F蛋白的表达量。

综上所述，本申请的工程改造的二硫键突变与空腔突变的组合，和/或与静电突变组合，和/或与215位氨基酸突变为脯氨酸的突变组合均能有效提升pre-fusion构象F蛋白的表达量。

(2)ELISA检测突变体表达的Pre-fusion构象F蛋白稳定性

将实施例1中的突变体转染细胞培养上清置于4℃保存，分别在转染后第3，10，17，30天，ELISA检测细胞培养上清中pre-fusion构象F蛋白的量，其结果如图5所示，其中，在结果分析中，将转染后第3天各突变体表达的pre-fusion构象F蛋白的含量设为1，其它时间点各突变体的蛋白含量表示为相对第3天pre-fusion构象F蛋白含量的百分数。

从图5可以看出，工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合(NeoC-RF-5，NeoC-RF-6，NeoC-RF-30，NeoC-RF-35)，工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合(NeoC-RF-29)以及工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和位置215的氨基酸被脯氨酸取代的组合(NeoC-RF-19，NeoC-RF-20，NeoC-RF-36)的突变体表达的Pre-fusion构象F蛋白的稳定性均显著升高，而仅有空腔填充的突变体(NeoC-RF-11)的Pre-fusion构象F蛋白的时间稳定性则显著降低。

实施例4.编码突变体的重组质粒表达pre-fusion构象F蛋白的各中和表位的表达图谱

选取pre-fusion构象F蛋白表达水平高的突变体重组质粒(NeoC-RF-5，NeoC-RF-6，NeoC-RF-19，NeoC-RF-20，NeoC-RF-36)和野生型F蛋白(WT)重组质粒转染培养于24孔板的HEK293T细胞，质粒转染剂量为1μg/孔。转染后第3天，收集细胞培养上清；将100μl培养上清加入至Ni预包被的ELISA板孔(Thermo Scientific^TM)中室温孵育2小时，每孔加入250μL PBST洗涤3遍，分别加入100μL/孔抗体D25(10μg/ml)、AM14、MPE8(MPE8使用Joyce,M.G.,Zhang,B.,Ou,L.,Chen,M.,Chuang,G.Y.,Druz,A.,Kong,W.P.,Lai,Y.T.,Rundlet,E.J.,Tsybovsky,Y.,Yang,Y.,Georgiev,I.S.,Guttman,M.,Lees,C.R.,Pancera,M.,Sastry,M.,Soto,C.,Stewart-Jones,G.B.E.,Thomas,P.V.,Van Galen,J.G.,Kwong,P.D.(2016).Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine against RSV.Nature structural&molecular biology,23(9),811–820.https://doi.org/10.1038/nsmb.3267公开的方法制备得到)和hRSV90(hRSV90使用Mousa,J.J.,Kose,N.,Matta,P.,Gilchuk,P.,&Crowe,J.E.,Jr(2017).A novel pre-fusion conformation-specific neutralizing epitope on the respiratory syncytial virus fusion protein.Nature microbiology,2,16271.https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.271公开的方法制备得到)，分别识别SiteSite IV和Site V，Site III和Site V表位，室温孵育2hr，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入100μL/孔Goat Anti-Mouse IgG Human ads-HRP(Southern Biotech,货号：1030-05),浓度为0.2μg/mL，室温孵育1小时，每孔加入250μL/孔PBST洗涤3遍，加入TMB显色液50μL/孔室温孵育10分钟，加入50μl/孔终止液。通过检测OD值(OD₄₅₀)表示pre-fusion构象F蛋白的中和表位的表达量，其结果如图6A至图6C所示，其中，图6A是编码突变体的重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site)的表达图谱示意图，图6B是编码突变体的重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site IV和Site V)的表达图谱示意图，图6C是编码突变体的重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site III)的表达图谱示意图，图6D是编码突变体的重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的中和表位(Site V)的表达图谱示意图。

从图6A至图6D可以看出，突变体重组质粒表达的pre-fusion构象F蛋白的各个中和表位的表达均显著高于野生型pre-fusion构象F蛋白的各个中和表达的表达。

实施例5.编码突变体F蛋白的mRNA转染细胞，在细胞表面表达pre-fusion构象的F蛋白。

5.1突变体mRNA质粒模板制备

将编码RSV F蛋白全长序列(SEQ IN NO:1)的核酸序列(SEQ IN NO:2)通过基因合成的方案插入pNeoCura-Bvac质粒载体的Bam HⅠ和SacⅠ序列之间，得到重组质粒pNeoCura-Bvac-WT，作为制备编码野生型F蛋白mRNA的质粒模板，其中，pNeoCura-Bvac-WT的序列如SEQ ID NO:68所示，其对应的mRNA序列(mRNA-NeoC-WT)如SEQ ID NO:69所示。将突变体(NeoC-RF-5，NeoC-RF-6，NeoC-RF-19，NeoC-RF-20，NeoC-RF-36)所示的突变位点，分别在重组质粒pNeoCura-Bvac-WT上进行对应的氨基酸位置进行点突变，得到对应的DNA序列，即为突变体的重组质粒(SEQ IN NO:70-74，分别为DNA-NeoC-RF-5，DNA-NeoC-RF-6，DNA-NeoC-RF-19，DNA-NeoC-RF-20和DNA-NeoC-RF-36)，编码对应的突变体mRNA序列(SEQ ID NO:63-67，分别为mRNA-NeoC-RF-5，mRNA-NeoC-RF-6，mRNA-NeoC-RF-19，mRNA-NeoC-RF-20，mRNA-NeoC-RF-36)和全长F蛋白突变体序列(SEQ IN NO:75-79，分别为蛋白序列-NeoC-RF-5，蛋白序列-NeoC-RF-6，蛋白序列-NeoC-RF-19，蛋白序列-NeoC-RF-20，蛋白序列-NeoC-RF-36)。

5.2制备mRNA

5.2.1.线性化模板制备

取突变体的重组质粒(SEQ ID NO：70-74)，分别采用限制性内切酶BspQ I(NEB,货号：R0712L)进行酶切，使用VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞(Vazyme)，N411-01)对酶切后线性化质粒进行纯化，其质粒图谱如图7所示。

5.2.2.体外转录得到RNA

使用体外转录试剂盒T7 High Yield RNA Transcription Kit(N1-Me-Pseudo UTP)(诺唯赞，DD4202)进行体外转录得到RNA。使用VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme,N412-01)对RNA纯化。

5.2.3加帽及纯化

取纯化后的RNA使用加帽试剂盒mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase(诺唯赞，DD4110)进行加帽反应。使用VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme,货号：N412-01)对加帽后的RNA纯化，得到对应序列的mRNA，即SEQ ID:63-67。

5.3体外mRNA表达

5.3.1 HEK293T细胞铺板

细胞接种24孔板(2.5～3×10⁵/孔))，采用含10％血清和1％双抗的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)37℃，5％CO₂培养16-18小时，转染前细胞密度达到80％融合度。

5.3.2转染

更换为无血清的Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，mRNA(0.3μg，1μg RNA/孔)与Lipofectamine^TM Messenger MAX^TM转染试剂(Thermo Fisher Scientific)混合后转染HEK293T细胞，培养6小时后，将培养基替换为含10％血清和1％青链霉素的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，继续培养24小时。

5.3.3流式细胞术检测细胞表面pre-fusion构象的F蛋白的表达

转染24小时后，1000g离心10分钟，收集细胞。流式细胞术(BD，FACS Celesta)检测细胞表面表达的pre-fusion构象F蛋白与抗体D25或者抗体AM14结合的平均荧光强度(MFI)，其结果如图8A至图8B所示，其中，图8A是细胞表面表达的pre-fusion构象F蛋白与抗体D25结合的平均荧光强度示意图，图8B是细胞表面表达的pre-fusion构象F蛋白与抗体AM14结合的平均荧光强度示意图。

结果显示：与表达野生型F蛋白的mRNA-WT相比，mRNA-NeoC-RF-5,mRNA-NeoC-RF-6,mRNA-NeoC-RF-19,mRNA-NeoC-RF-20,mRNA-NeoC-RF-36表达pre-fusion构象F蛋白显著升高，并且与AM14结合的水平更高，说明具有更高的三聚化水平。

实施例6野生型和突变体的F蛋白的mRNA-LNP(脂质纳米颗粒)制备以及使用mRNA-LNP免疫BALB/c小鼠诱导血清抗体和中和抗体

(1)野生型和突变体F蛋白的mRNA-LNP(脂质纳米颗粒)制备

1.1将野生型和突变体F蛋白的mRNA置于冰上溶解，用配好的50mM枸橼酸钠缓冲液稀释至100ng/μL，为水相；使用无水乙醇为溶剂配制乙醇相，按照SM102：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000＝50：10：38.5：1.5的比例进行配制，使得乙醇相中SM102浓度为6.22mg/ml，总脂质体浓度为10.87mg/ml。(SM102：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司，CAS号：06040008800；DSPC：艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号：S01005；CHO-HP(胆固醇)：艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号：O01001；DMG-PEG2000：艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号：O02005)。

1.2将水相和乙醇相按照流速比水相：醇相＝3:1，总流速为12mL/min，使用纳米药物制备系统(INano L，迈安纳(上海)仪器科技有限公司)进行包被，收集LNP。将收集的LNP使用RNase-free water稀释3倍，置于100kd透析袋内，再将透析袋放入200倍体积LNP的1×PBS中进行透析，磁力搅拌器300rpm，室温18h；收集透析袋内的LNP使用0.22μm滤膜进行除菌过滤；过滤后的LNP使用100kd超滤管，3000rpm，4℃，离心90min，收集超滤管内LNP，使用1×PBS冲洗管内残留LNP，与之前LNP混合后即为野生型和突变体F蛋白的mRNA-LNP，避光保存于2-8℃。

(2)mRNA-LNP免疫BALB/c小鼠诱导血清抗体和中和抗体

2.1 mRNA-LNP免疫BALB/c小鼠诱导血清抗体

2.1.1免疫方案

6-8周龄雌性BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分为7组，每组5-10只小鼠。阴性对照组为不包有mRNA的空载LNP，野生型和突变体F蛋白的mRNA-LNP疫苗各组免疫剂量为10μg/次/只小鼠。各组小鼠分别在实验第1天(Prime)，第21天(Boost)采用肌肉注射的方式免疫，免疫体积为50μL。免疫分组及剂量见表2。

表2 注：各剂量组的剂量为RNA的剂量。

2.1.2 mRNA-LNP疫苗免疫BALB/c小鼠诱导血清F蛋白特异性结合抗体。

在实验第35天各实验组小鼠经眼眶后静脉丛取血，分离血清样本，56℃加热30分钟灭活，灭活血清采用PBS缓冲液进行2倍梯度稀释，得到供试血清样本。用ELISA方法检测小鼠血清中抗原特异性抗体，结果如图9A所示。结果显示：各mRNA LNP免疫小鼠后均诱导产生高滴度的F蛋白特异性IgG，阴性对照组未产生抗体。

2.2 mRNA-LNP免疫BALB/c小鼠诱导血清中和抗体(活病毒中和抗体滴度检测)

取实验第35天分离的小鼠灭活血清，采用RSV A2毒株检测小鼠免疫血清的中和抗体滴度，半数中和效价(ID50)结果如图9B所示，其中，中和抗体滴度的测定方法如下：

第一天：准备HEp-2细胞(ATCC，货号：CCL-23)，保证第二天的细胞汇合度为90％；

第二天：将样本首孔稀释40倍后进行3倍比稀释，共8个浓度梯度；每孔输入与样本体积一致的RSV A2株病毒(ATCC,货号VR-1540)，病毒加入量为500pfu，37℃、5％CO₂培养箱中放置2小时之后弃掉病毒和样本混合物，每孔加入100μ0的2％胎牛血清(Excell,货号：FSP500)的DMEM培养基(Gibco,货号：C11995500BT)至细胞中；

第三天：弃上清，将细胞固定后加入荧光标记的检测抗体(Vazyme，F6-6-488)，使用荧光(酶联)免疫斑点分析仪(CTL,型号：S6Ultra M2)读板，根据荧光读值计算中和抗体滴度。当实验组荧光强度小于未加小鼠血清组荧光强度一半时，该实验数据为阳性。每组中抗体稀释倍数最大的阳性值，其稀释倍数为该组最终中和抗体滴度。

结果显示：突变体F蛋白的mRNA-LNP疫苗免疫小鼠均诱导产生显著高于野生型F蛋白的mRNA-LNP疫苗的中和抗体滴度。

综上所述，本申请实施例所述呼吸道合胞病毒RSV F蛋白的突变体与野生型F蛋白相比，具有更加稳定的融合前构象，表达水平更高。三聚化融合前蛋白的表达水平和稳定性也显著优于野生型F蛋白。呼吸道合胞病毒RSV F蛋白的突变体在多个中和表位的呈现上也显著优于于野生型F蛋白。在动物实验中，通过稳定融合前构象及其他中和表位，表达呼吸道合胞病毒RSV突变体F蛋白的mRNA疫苗显著诱导更高水平的中和抗体滴度；因此本申所述的F蛋白突变体适用于以RSV F蛋白为抗原的各种疫苗形式，如：mRNA疫苗、DNA疫苗、蛋白疫苗、腺病毒疫苗及重组病毒颗粒疫苗。

表3序列表注释：如无特殊说明，mRNA中的碱基U可以用碱基T代替。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims

一种野生型RSV F蛋白的突变体，其中，所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，所述氨基酸突变为：

1)至少一个工程改造的二硫键突变和至少一个空腔填充突变的组合；或2)至少一个工程改造的二硫键突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；

其中，所述空腔填充突变包括：位置190的氨基酸被F取代；

所述工程改造的二硫键突变包括位置466和443的氨基酸被C取代；

位置编号是基于SEQ ID NO:1所示的序列。
根据权利要求1所述的突变体，其中，所述空腔填充突变还包括：

位置54的氨基酸被H取代；和/或

位置207或296的氨基酸被L或I取代。
根据权利要求1或2所述的突变体，其中，所述静电突变包括：

位置486的氨基酸被S取代。
根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中，所述氨基酸突变还包括：位置215的氨基酸被P取代。
根据权利要求1-4中任一项所述的突变体，其中，所述突变体呈三聚体形式。
根据权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中，所述突变体与野生型RSV F蛋白相比融合前F蛋白具有更高的表达水平，并且具有增加的融合前构象的稳定性。
根据权利要求1-6中任一项所述的突变体，其中，所述野生型RSV为亚型A或亚型B。
根据权利要求1-7中任一项所述的突变体，其中，所述氨基酸突变是选自以下突变的组合：

(1)S466C、S443C和S190F的组合；

(2)S466C、S443C、S190F和V296I的组合；

(3)S466C、S443C、S190F和V207L的组合；

(4)S466C、S443C、S190F、V207L和S215P的组合；

(5)S466C、S443C、S190F、V296I和S215P的组合；

(6)S466C、S443C、S190F和T54H的组合；

(7)S466C、S443C、S190F和D486S的组合；

(8)S466C、S443C、S190F、T54H和D486S的组合；

(9)S466C、S443C、S190F、D486S和V296I的组合；

(10)S466C、S443C、S190F、V296I和T54H的组合；

(11)S466C、S443C、S190F、V296I、T54H和D486S的组合；

(12)S466C、S443C、S190F、V207L和V296I的组合；

(13)S466C、S443C、S190F、V207L和T54H的组合；

(14)S466C、S443C、S190F、V207L和D486S的组合；

(15)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和T54H的组合；

(16)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I和D486S的组合；

(17)S466C、S443C、S190F、V207L、T54H和D486S的组合；

(18)S466C、S443C、S190F、V207L、V296I、T54H和D486S的组合；和

(19)S466C、S443C、S190F和S215P的组合。
一种核酸分子，其编码权利要求1-8中任一项所述的突变体。
一种表达载体或细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子。
一种针对病毒感染对人受试者进行免疫接种的试剂盒，其包含权利要求1-8中任一项所述的突变体。
根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述病毒感染是RSV感染。
一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的突变体或权利要求9所述的核酸分子或者权利要求10所述的表达载体或细胞和药学上可接受的载体。
根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。
权利要求13或14所述的药物组合物用于诱导对抗RSV感染的免疫应答中的用途。
一种预防或治疗RSV感染的方法，包括给药受试者有效量的权利要求1-8中任一项所述的突变体或权利要求13或14的药物组合物。
权利要求1-8中任一项所述的突变体或权利要求13或14的药物组合物在制备预防或治疗RSV感染的药物或疫苗中的用途。