CN117701658A - 一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法 - Google Patents
一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117701658A CN117701658A CN202311683814.5A CN202311683814A CN117701658A CN 117701658 A CN117701658 A CN 117701658A CN 202311683814 A CN202311683814 A CN 202311683814A CN 117701658 A CN117701658 A CN 117701658A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligonucleotide chain
- synthesis
- dntp
- oligonucleotide
- base extension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims abstract 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 4
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims 2
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 claims 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 claims 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 claims 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 claims 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法，包括(1)采用基于生物酶促方法在固相载体上以dNTP‑3’‑R为原料实现寡核苷酸链的碱基延伸；(2)采用TdT在未发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的‑OH偶合ddNTP用以实现加帽封闭反应；(3)然后进行脱保护以将发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的‑R脱保护形成活化的‑OH；(4)重复步骤(1)至(3)直至实现所需的寡核苷酸链的合成。本发明可实现在寡核苷酸链酶促合成过程中对每一轮未发生延伸反应的羟基基团进行高效封闭反应，以此提升酶促合成终产物的纯度和产率。
Description
技术领域
本发明属于DNA合成技术领域，具体涉及一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法。
背景技术
DNA是生命信息的主要载体，RNA则是遗传信息传递的中间载体，它们在生命过程中起到至关重要的作用。自上个世纪以来，人类对DNA、RNA有着愈加成熟、全面的了解，包括DNA的组成、结构、性质、功能等。这也为科研人员将DNA、RNA作为研究生命科学的“利器”奠定了坚实的基础。
寡核苷酸(oligonucleotide)一般是指在实验室条件下合成并制造的DNA短链或RNA短链。在过去将近70年的时间里，从头合成寡核苷酸技术广泛地应用于绝大多数生物学研究，显著提升了人类理解和改造生命的能力。
时至今日，在上个世纪八十年代所提出的亚磷酰胺固相寡核苷酸合成方法(简称亚磷酰胺法)仍然占据着主导地位。亚磷酰胺法是以二甲氧三苯甲基(DMT)为保护基的亚磷酰胺单体，通过5’→3’磷酸二酯键的合成实现相邻核苷酸的连接，通常包括以下四个步骤：
(1)脱保护(deprotection)：通过使用三氯乙酸去除固相载体上亚磷酰胺的5’-DMT保护基，获得游离的5’-羟基；
(2)偶合(coupling)：引入新一轮5-DMT保护的亚磷酰胺单体，其3’端在活化剂四氮唑的作用下得到中间体，可与游离的5’-羟基偶合形成亚磷酸三酯；
(3)加帽(capping)：在偶合步骤中会有少部分5’-羟基未发生反应(＜2％)，可加入乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化未反应的5’-羟基，终止其后续反应，留下的较短片段寡核苷酸链可在纯化时分离；
(4)氧化(oxidation)：使用碘氧化亚磷酸三酯生成更稳定的磷酸三酯，产生氰乙基保护的磷酸骨架；接着从5’→3’依次添加目标的核苷亚磷酰胺单体，循环上述四个合成步骤，最后用浓氨水一次性去除完整的产物上所有的保护基(包括单体上的DMT以及骨架上的氰乙基)，并依次从固相载体上去除、脱盐、纯化，就可得到寡核苷酸链；
然而，经历此后数十年的技术优化与性能提升后，这种传统的化学合成方法始终存在合成长度不足(上限约为200nt)的瓶颈问题，同时偶合效率较低、错误率较高、成本较高、合成试剂有毒有害、生物相容性差等不足也限制了其进一步的应用。化学合成的技术困难也促使科研人员转向自然界生物酶法合成的技术路线之上。
与化学合成法相比，酶促合成法具有几个潜在优势(NAT.METHODS,2014，11(5)：499-507)：(1)酶促合成具有远超亚磷酰胺合成技术的合成长度、速度以及效率，预计至少可实现400nt长度的寡核苷酸合成，效率可达到99.5％，同时错误率小于0.5％；(2)酶可以在温和作用下实现高效酶促合成，相较于化学合成所使用的多种有毒有害的有机试剂，酶促合成不仅可以减少对寡核苷酸的损害以及副产物的产生，适配更多需高生物相容性的应用，还可以极大减少危险废物的产生，对环境友好；(3)酶促合成方法步骤简单，将极大降低单碱基合成的时间与成本。目前，已有报道实现基于末端脱氧核苷酸转移酶的无模板寡核苷酸从头(de novo)合成(NAT.BIOTECH.，2018，36：645-650；ACS CATAL.，2022，12(5)：2988-2997)，均采用两步法实现酶促DNA单碱基延伸，即“延伸-脱保护”。
虽然两步法使得酶促合成操作简便、合成高效，但是缺少加帽步骤使得酶促合成过程所产生的错误类型仍以缺失(Deletion，约3～10％)居多(NAT.BIOTECH.，2018，36：645-650；ACS CATAL.，2022，12(5)：2988-2997)。这在很大程度上影响了酶促DNA合成的终产物纯度和产率，削弱了得酶促合成在寡核苷酸合成方面的高效率、高保真、长度长、效率高等优势。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法。
本发明中关键技术词语的定义如下：
DNA(Deoxyribonucleic acid)：脱氧核糖核酸；
RNA(Ribonucleic acid)：核糖核酸；
dNTP(Deoxynucleotide triphosphates)：脱氧核糖核苷三磷酸；
ddNTP(Dideoxynucleotide triphosphates)：2′，3′-双脱氧核苷三磷酸，脱氧核糖核苷三磷酸3’号位羟基(-OH)被氢基(-H)取代，偶合后续无法延伸；
dNTP-3’-R：脱氧核糖核苷三磷酸3’号位羟基(-OH)被保护基团R取代以防止不受控的dNTP延伸，其中在酶促DNA合成反应中一种典型的保护基团为氨基氧基(-OHN2)、氧基叠氮甲基(-OCN3)和2-氨乙基-3-丙酰基(-Aep)；
TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)：末端脱氧核苷酸转移酶，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，催化dNTP或ddNTP结合到DNA分子的3’羟基端；
E-ZaTdT(Engineered Zonotrichia albicollis TdT)：工程化改造的ZaTdT酶，野生型TdT催化腔体无法适配可逆终止核苷酸，通过酶工程方法筛选出一种催化活性远高于普通TdT的ZaTdT，并重塑其催化腔以更好适配3’-ONH2修饰的核苷酸的可逆终止延伸，实现了酶促寡核苷酸链的从头合成。
本发明的技术方案如下：一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法，包括如在步骤：
(1)采用基于生物酶促方法在固相载体上以dNTP-3’-R为原料实现寡核苷酸链的碱基延伸；
(2)采用TdT在未发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的-OH偶合ddNTP用以实现加帽封闭反应；
(3)然后进行脱保护以将发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的-R脱保护形成活化的-OH；
(4)重复步骤(1)至(3)直至实现所需的寡核苷酸链的合成。
上述加帽封闭反应的原理是：TdT是一种不需要模板即可催化dNTP或ddNTP添加到寡核苷酸链的3’-OH末端，而相比于dNTP，由于ddNTP的空间位置更小，TdT对其在羟基末端的催化偶合效率更高，因此可以更高效地与在延伸步骤中未发生反应的羟基基团进行反应，同时由于其3’末端为氢(-H)，因此在下一轮的延伸反应中无法进一步发生TdT催化偶合，达到加帽反应的封闭作用，后续可通过纯化步骤将未达到目标片段长度的寡核苷酸链进行分离并去除，使寡核苷酸链酶促合成产物具有更高的纯度与产率。
在本发明的一个优选实施方案中，所述ddNTP包括ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddUTP。
在本发明的一个优选实施方案中，所述dNTP-3’-R包括dNTP-3’-ONH2(氧基氨基)、dNTP-3’-OCN3(氧基叠氮甲基)和dNTP-3’-Aep(2-氨乙基-3-丙酰基)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的TdT选自野生型TdT或E-ZaTdT。
在本发明的一个优选实施方案中，所述寡核苷酸链为单链DNA、双链DNA或单链RNA。
进一步优选的，所述寡核苷酸链为单链DNA。
更进一步优选的，所述步骤(1)中的碱基延伸为基于E-ZaTdT的DNA单碱基延伸。其原理为：通过酶工程方法筛选并改造后的E-ZaTdT具有可以催化偶合3’修饰氨氧基(-ONH2)的核苷酸的可逆终止延伸，在单链DNA末端加入E-ZaTdT和特定3’-ONH2修饰的核苷酸，在二价阳离子(钴离子Co2+)的存在下，即可在DNA链末端进行单碱基延伸反应。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的脱保护是在酸性的亚硝酸钠溶液中进行。其原理为：由于脱保护的目的在于将带有氨氧基(-ONH2)保护基团的3’端通过反应生成羟基，以便后续在下一轮反应中继续延伸，因此可以通过酸性条件下亚硝酸钠表现的氧化性，反应氨氧基生成羟基，以实现脱保护反应。
进一步优选的，所述亚硝酸钠溶液含有非离子型表面活性剂。
更进一步优选的，所述非离子型表面活性剂为Triton X-100或吐温。
本发明的有益效果是：
1、本发明可实现在寡核苷酸链酶促合成过程中对每一轮未发生延伸反应的羟基基团进行高效封闭反应，以此提升酶促合成终产物的纯度和产率。
2、本发明使用TdT进行加帽反应，仍使用的是生物酶反应体系，不影响原有的酶促合成体系，适用于寡核苷酸链的酶促合成反应体系。
3、本发明使用TdT偶合ddNTP进行加帽反应，其反应效率高于TdT偶合或延伸dNTP，所需底物浓度低、所需反应时间短，具有高效封闭的优点。
4、相比于传统的化学加帽反应，本发明基于TdT偶合ddNTP的加帽反应不仅可高效适配于酶促合成体系，同时与现有酶促合成体系完全契合，所有试剂无毒无害，具有低消耗、低污染的优点。
附图说明
图1为本发明实施例1的反应原理图。
图2为本发明实施例1的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
如图1所示，本实施例进行寡核苷酸链合成，具体包括如下步骤：
(1)链霉亲和素磁珠与生物素-引发链偶联：
本实施例中采用以链霉亲和素磁珠为固相载体的基于E-ZaTdT实现DNA的单碱基生物酶促合成，具体包括：
a、链霉亲和素磁珠清洗：在1个离心管中，取20μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素(SA)修饰磁珠，与180μL磁珠清洗结合缓冲液混匀，将离心管置于磁力架上，静置3min，弃去上清液，该步骤重复3次。
b、引发链偶联：在上述离心管中，加入197μL磁珠清洗结合缓冲液重悬，然后再加入3μL浓度为100μM的Biotin-Initiator生物素-引发链溶液(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，进行生物素与链霉亲和素的结合反应，置于旋转孵育仪上，孵育30min。
c、引发链磁珠清洗：将孵育完成的磁珠用200μL的超纯水清洗3次，清洗完成后，加入20μL超纯水重悬。
至此，完成寡核苷酸链合成的固相载体准备。
(2)寡核苷酸链合成——延伸a、配制延伸预混液：取1个离心管，加入0.5mg/mL E-ZaTdT(参见Enzymatic DNA Synthesis by Engineering Terminal DeoxynucleotidylTransferase，ACS Catal.2022，12，5，2988-2997)、0.25mM 3’-ONH2-dNTPs(该轮所需延伸的碱基)、0.25mM CoCl2、100mM NaCl、0.01％v/v Triton X-100以及50mM PBS缓冲液(pH6.8)；
b、预孵育：将离心管放置于40℃中，预孵育5min；
c、延伸：取20μg引发链磁珠，加入上述延伸预混液10μL，放置于恒温震荡仪中，温度设置为40℃，转速设置为1400rpm，反应10min，完成延伸。
(3)寡核苷酸链合成一一加帽(Capping)
a、配制加帽预混液：取1个离心管，加入1U/μL TdT、0.1mM ddNTP(N可为A、T、C、G等任意碱基)、0.25mM CoCl2、100mM NaCl、0.01％v/v Triton X-100以及50mM PBS缓冲液(pH6.8)；
b、预孵育：将离心管放置于40℃中，预孵育5min；
c、加帽：将上述延伸后的磁珠进行磁分离去除上清后，加入上述加帽预混液10μL，放置于恒温震荡仪中，温度设置为40℃，转速设置为1400rpm，反应1min，完成延伸。
(4)寡核苷酸链合成——脱保护
a、配制脱保护预制液：取1个离心管，加入0.7M的亚硝酸钠，并使用亚硝酸(通过向亚硝酸钠中添加乙酸制得)将溶液pH调整至5.0，并加入0.01％Triton X-100，放于冰中备用；
b、脱保护：将上述加帽后的磁珠进行磁分离去除上清后，加入上述脱保护预制液10μL，振荡孵育1min，完成脱保护；
(5)寡核苷酸链合成一一清洗
a、配制清洗预制液：取1个离心管，加入0.01％v/v Triton X-100以及50mM PBS缓冲液(pH 6.8)；
b、清洗：将上述脱保护后的磁珠进行磁分离去除上清后，加入上述清洗预制液10μL，振荡孵育0.5min，重复2次。
至此，完成寡核苷酸链的单轮合成，依次按照指定的寡核苷酸链序列，重复上述步骤(1)至(5)，即可完成寡核苷酸链的合成。
本实施例的具体效果如图2所示，该图2表现的是分别酶促合成4轮、10轮以及18轮DNA间使用加帽与不加帽对逐步产率的影响，由图可知，本实施例的合成方法，尤其是其中步骤(3)的加帽可以显著提升DNA酶促合成的逐步产率，尤其是在当合成链长增加的情况下。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法，其特征在于：包括如在步骤：
(1)采用基于生物酶促方法在固相载体上以dNTP-3’-R为原料实现寡核苷酸链的碱基延伸；
(2)采用TdT在未发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的-OH偶合ddNTP用以实现加帽封闭反应；
(3)然后进行脱保护以将发生碱基延伸的寡核苷酸链的3’末端的-R脱保护形成活化的-OH；
(4)重复步骤(1)至(3)直至实现所需的寡核苷酸链的合成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ddNTP包括ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddUTP。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述dNTP-3’-R包括dNTP-3’ONH2、dNTP-3’-OCN3和dNTP-3’-Aep。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的TdT选自野生型TdT或E-ZaTdT。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸链为单链DNA、双链DNA或单链RNA。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸链为单链DNA。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的碱基延伸为基于E-ZaTdT的DNA单碱基延伸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的脱保护是在酸性的亚硝酸钠溶液中进行。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述亚硝酸钠溶液含有非离子型表面活性剂。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述非离子型表面活性剂为Triton X-100或吐温。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2023116438087 | 2023-12-01 | ||
| CN202311643808 | 2023-12-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117701658A true CN117701658A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90154551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311683814.5A Pending CN117701658A (zh) | 2023-12-01 | 2023-12-08 | 一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117701658A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118389626A (zh) * | 2024-06-28 | 2024-07-26 | 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 | 一种特异性多聚核苷酸的制备方法 |
| CN119410752A (zh) * | 2025-01-07 | 2025-02-11 | 天津中合基因科技有限公司 | 一种oligo pool的生物合成方法及应用 |
-
2023
- 2023-12-08 CN CN202311683814.5A patent/CN117701658A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118389626A (zh) * | 2024-06-28 | 2024-07-26 | 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 | 一种特异性多聚核苷酸的制备方法 |
| CN119410752A (zh) * | 2025-01-07 | 2025-02-11 | 天津中合基因科技有限公司 | 一种oligo pool的生物合成方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN117701658A (zh) | 一种用于提升寡核苷酸链酶促合成纯度与产率的方法 | |
| JP6783145B2 (ja) | 核酸、特に長い核酸の合成方法、その方法の使用、および、その方法を実施するためのキット | |
| CN109642255B (zh) | 使用栓系的核苷三磷酸的核酸合成和测序 | |
| CN104114702B (zh) | 模板转换用于dna合成的用途 | |
| Gibson | Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments | |
| CN107567501B (zh) | 涉及核酸合成的组合物和方法 | |
| JP7438259B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの産生のための新規プロセス | |
| EP2610352B1 (en) | Template-independent ligation of single-stranded DNA | |
| JP6219944B2 (ja) | ５’保護に依存した増幅 | |
| WO2011056866A2 (en) | Methods and kits for 3'-end-tagging of rna | |
| EP3469078B1 (en) | Methods and compositions for nucleic acid amplification | |
| US8586303B1 (en) | In vitro selection with expanded genetic alphabets | |
| CN101067133A (zh) | 基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法 | |
| US20030152984A1 (en) | Method for the manufacture of DNA | |
| CN111542532B (zh) | 酶法合成寡核苷酸的方法和体系 | |
| CN115667511A (zh) | 多核苷酸序列的按需合成 | |
| CN108350492A (zh) | 连接酶辅助的核酸环化和扩增 | |
| CN117757787A (zh) | 用于合成核苷酸链的组合物以及核苷酸链的合成方法 | |
| Pichon et al. | Controlled enzymatic synthesis of oligonucleotides | |
| CN115491399B (zh) | 一种制备腺苷酸化核酸产物的方法 | |
| JP2024531716A (ja) | リパーゼ変異体及びその使用 | |
| JPH04506002A (ja) | 改良されたプライマー伸長反応 | |
| Hatahet et al. | A novel method for site specific introduction of single model oxidative DNA lesions into oligodeoxyribonucleotides | |
| JP6069314B2 (ja) | 長鎖核酸分子の大規模合成方法 | |
| CA2327286A1 (en) | 5'-modified nucleotides and their use in molecular biology and medicine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |