CN117660493B - 一种调控羊肚菌风味的基因及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种调控羊肚菌风味的基因及其筛选方法，所述调控羊肚菌风味的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过不同培养温度筛选羊肚菌风味相关基因，可用于开发羊肚菌鲜味剂来发挥羊肚菌提鲜作用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和食用菌技术领域，涉及到一种调控羊肚菌风味的基因及其筛选方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella spp.)是一种珍稀食药用菌，香脆可口、别具风味，富含蛋白质，维生素等、多糖和许多生物活性成分。羊肚菌人工栽培已有百余年历史，但仍面临着品质难以保证、产量不稳定等问题。近年来，我国逐渐形成羊肚菌大田生态栽培模式，开始规范化栽培羊肚菌。大田栽培时环境温度不能准确调节，温度胁迫对羊肚菌生长有显着影响。
羊肚菌是一种低温菇，温度是其生长发育的关键因子之一。羊肚菌在成长的过程当中，所需的气温更低，温差更大，便于激发菌丝体分化。已有研究表明，低温胁迫会对食用菌造成氧化损伤，低温胁迫过程中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性前期上升后期下降，过氧化氢酶(catalase，CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(aseorbateperoxidase，APX)活性总体上升，谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)含量增加；热胁迫则会促使植物生产抗氧化剂，累积并调节相容溶质的含量，诱导有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和钙依赖性蛋白激酶(CDPK)级联等。这些调控是通过不同基因家族成员之间复杂的相互作用实现的，如参与细胞信号转导通路等。在已有的研究中，通常采用转录组的方法研究温度等对食用菌生长的影响。
转录组是指在细胞内某一发育阶段或者某一生理条件时所形成的完整转录本和转录数，主要由核糖体RNA(80％-90％，rRNA)，转运RNA(5％-15％，tRNA)，信使RNA(2％-4％，mRNA)以及基因内或者基因间的非编码RNA(1％，ncRNA)组成。组学技术灵敏度高，应用范围广，受到研究者的青睐。组学技术在食用菌研究中的应用是食用菌研究的重大突破，使食用菌研究从人工栽培转向基础研究。在食用菌的不同组织类型中，这些转录组成分具有各自独特的生物学功能。对不同类型食用菌的转录组学研究可以帮助人们更好地揭示功能基因的作用方式和调控过程，从而改进食用菌育种选择和栽培实践。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控羊肚菌风味的基因及其筛选方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种调控羊肚菌风味的基因，所述调控羊肚菌风味的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种调控羊肚菌风味的基因的筛选方法，包括下列步骤：
步骤1：取统一直径活化后的羊肚菌菌块，转接到培养基中心，置于不同温度下培养相同时间；
步骤2：根据菌丝向平板伸展的程度标志菌落的直径，计算菌丝生长速度；
步骤3：使用倒置显微镜观察菌丝的微观形态；
步骤4：收集不同温度时的羊肚菌菌丝，抽提RNA进行转录组测序；
步骤5：将测序序列与指定的羊肚菌参考基因组比对分析，统计基因的表达水平及注释信息，获得不同培养温度间菌丝体的差异表达基因；
步骤6：利用加权基因共表达网络分析构建差异表达基因的分层聚类树，探索聚类树中不同基因模块与菌丝体培养温度的关联关系；
步骤7：基于各模块中基因之间相互关系构建共线网络图，挖掘参与温度调控的羊肚菌风味相关基因。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
羊肚菌作为珍贵的食用菌资源，香脆可口，味道鲜美，别具风味，富有营养，富含蛋白质，维生素等、多糖和许多生物活性成分，越来越受到消费者青睐。风味是由各种不同呈味的游离氨基酸的平衡及相互影响共同决定的。氨基酸是羊肚菌特征风味化合物之一，而羊肚菌菌丝体中富含氨基酸。羊肚菌是一种低温菇，温度是其生长发育的关键因子之一。目前，培养温度对羊肚菌风味调控的报道较少。本发明通过不同培养温度筛选羊肚菌风味相关基因，可用于开发羊肚菌鲜味剂来发挥羊肚菌提鲜作用。
附图说明
图1不同温度时供试菌株的菌丝生长速度比较。
图2不同温度时供试菌株的微观菌丝形态。从上到时依次为H1、H5、H6、H8、H18、M4、M15、M24、MZ-14、MZ-20、MZ-22、T6、T7；从左到右以此为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃。
图3培养温度对羊肚菌菌丝体负调控的基因共线网络图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种调控羊肚菌风味的基因及其筛选方法
1、筛选羊肚菌菌丝体生长的最适温度范围
(1)选取六妹(M.sextelata)、七妹(M.septimelata)和梯棱(M.importuna)三个品种共13株供试羊肚菌菌株，在超净工作台上用无菌接种针将各菌株从试管转接到PDA培养基上活化。
(2)取5mm×5mm活化后的羊肚菌菌块，置于直径90mm的PDA培养基中心，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃的黑暗恒温培养箱中培养。
(3)记录各培养温度下生长24h和48h菌丝体向培养基伸展的程度，用于计算各处理组中菌丝生长速度，即菌丝生长速率＝(48h测量直径-24h测量直径)/d，每个处理5个重复。
(4)将六个温度处理组的培养基平板置于倒置显微镜(蔡司LSM 880)下，40×放大倍数观察菌丝的分叉情况，每个处理组5个重复。
(5)采用SPSS(version 26.0)软件对数据进行显著性差异分析，通过生长速度和菌丝分叉情况确定13株供试羊肚菌菌株的菌丝生长最佳培养温度均在15-20℃。
2、筛选羊肚菌菌丝体中受温度调控的风味基因
(1)以供试菌株H6六妹(M.sextelata)为代表性羊肚菌菌株，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃温度下培养5天；
(2)用无菌刮刀收集各温度处理组培养基中的菌丝体置于无菌袋中，放入烘箱中烘干，每个处理组3个重复。
(3)将烘干后的菌丝体放入液氮中充分研磨成粉末，取100mg粉末装入无RNA酶的1.5mL离心管中。加入1mL Trizol，剧烈震荡30s后于冰上静置3min使菌丝体细胞充分裂解。
(4)加入200μL的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15s后，在冰上静置5min，置于离心机12000rpm，4℃离心15min使其分相。
(5)转移500μL上层水相于新的离心管中，加入500μL异丙醇，充分混匀后，在冰上静置10min，置于离心机10000rpm，4℃离心10min沉淀RNA。
(6)加入1mL75％乙醇漂洗3次，置于离心机7000rpm，4℃离心5min洗涤RNA并去上清。
(7)在超净台中室温干燥RNA沉淀，随后加入50μL DEPC水充分溶解，获得各处理组的菌丝体RNA。
(8)利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent5300测定RIN值，并放入-80℃保存。
(9)利用带有Oligo dT的磁珠从各处理组总RNA中分离出mRNA。加入fragmentation buffer，将mRNA随机断裂成300bp左右的小片段。
(10)以mRNA为模板在逆转录酶作用下反转合成cDNA。随后加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端，并在3’末端加上A碱基，连接Y字形接头。利用IlluminaNovaSeq Reagent Kit(Illumina,San Diego,CA,USA)对连接adapter后的产物进行富集，再使用2％琼脂糖回收目的条带进行Qubit 4.0定量，得到最终的文库，随后在IlluminaNovaSeq6000平台测序。
(11)利用Trimmomatic(version0.36)软件对原始序列进行数据质控，包括去除没有插入片段或含N率超过10％的reads，剔除质量值小于10或长度小于20bp的序列，从而获得优化后的高质量数据clean data。
(12)将质控后的clean data与羊肚菌参考基因组(GCF_020137385.1_ASM2013738v1)比对分析，统计基因的表达水平及功能的注释信息。
(13)以20℃温度培养的菌丝体为对照组，获得各培养温度间菌丝体的差异表达基因。
(14)利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建差异表达基因的分层聚类树，根据聚类树的不同分支寻找协同表达的基因模块，并探索各基因模块与菌丝体培养温度的关联关系。
(15)基于各模块中基因之间相互关系构建共线网络图，展示模块内基因的调控关系，挖掘参与温度调控的羊肚菌风味相关基因。
3、结果分析
(1)供试菌株
表1供试菌株来源
(2)不同温度处理对菌丝生长速度的影响
表2供试菌株在不同温度时的菌丝生长速度
注：数据以平均值±方差表示(n＝10)；不同小写字母表示同一菌株不同温度间差异显著(P<0.5)
图1为不同羊肚菌菌株在相同温度时的生长速度柱形图，由图可以看出，在20℃以下各品种生长速度差异明显，而当温度在20℃以上时，各品种的生长速度差异变小。20℃时，9个菌株的生长速度达到14.00mm/d。
(3)不同温度处理对羊肚菌菌丝微观形态的影响
整体来看，羊肚菌菌丝尖端分叉随着温度升高而增多(图2)。温度低时，菌丝较为疏松笔直，而随着温度升高，菌丝出现弯曲扭结现象，菌丝密度增加。以H8为例，5℃时菌丝笔直，前端分枝较短，分叉数少；10℃时菌丝前端分枝延长，分叉数少；15℃也是如此。推测温度低时，菌丝为保持生命力，集中生长减少分支。20℃时菌丝分叉数增多，菌丝密度增加；25℃菌丝分叉数最多，菌丝最浓密，此时温度较高，菌丝快速分叉，增加菌丝对环境的适应性。30℃时菌丝弯曲现象明显。
(4)不同温度处理组中菌丝体的差异表达基因
以20℃组为对照组，10℃组共有2334个，其中上调表达669个，时调表达1665个；15℃组共有1950个，其中上调表达752个，时调表达1198个；25℃组共有1655个，其中上调表达1129个，时调表达526个；30℃组共有1861个，其中上调表达1299个，时调表达562个。
表3不同温度处理组的差异表达基因
(5)WGCNA分析
通过WGCNA共获得739个与培养温度呈显著负相关的基因(r＝-0.896,p<0.001)。对这些负调控基因构建共线网络图，如图3所示。共线网络图由122个节点和4,710个连线组成，所有的节点被分成了三个主要模块，即module I、module II和module III。三个模块分别含有70个、38个和14个基因(表4)。通过基因功能注释，在module III中发现了与羊肚菌风味相关的基因H6S33_001094(flavo protein WrbA)，基因H6S33_001094的序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。这一结果说明，羊肚菌的风味随着菌丝体培养温度的增加而下降。
表4各模块基因功能的详细信息
4、羊肚菌作为珍贵的食用菌资源，香脆可口，味道鲜美，别具风味，富有营养，富含蛋白质，维生素等、多糖和许多生物活性成分，越来越受到消费者青睐。风味是由各种不同呈味的游离氨基酸的平衡及相互影响共同决定的。氨基酸是羊肚菌特征风味化合物之一，而羊肚菌菌丝体中富含氨基酸。羊肚菌是一种低温菇，温度是其生长发育的关键因子之一。目前，培养温度对羊肚菌风味调控的报道较少。本实施例通过不同培养温度筛选羊肚菌风味相关基因，可用于开发羊肚菌鲜味剂来发挥羊肚菌提鲜作用。
SEQ ID No.1：
Atggctccccgcgtcgctatcattatctactccatgtacgggcacattactcagcttgctgaggccgagaaggctggtatcgaggctgctggtggttctgctaccatcctccagtgagttatgctcaattcctactattgaagcattgcttgcaagctgcttcaaaagtcgattgatctcctaatacttacaatcttttctttcttcagggttcctgagactcttcctgaggaggttcttggaaagatgcacgctgcccccaagcctaactaccccatcattaccgccccggaactgaagaactacgatgccttcctcttcggtatccccactcgttacggaaacttccccggccagtggaaggccttcatcgacaccactggtggcctctggggtgagggtgctctctccggaaagtacgccggtctctttatctctaccggcacccagggcggtggacaggagattactgccttaaacgccatgtccaccctcgcccaccacggaataatctacgttcccttcggatacaagcacgctttccccatccttgcctccaacgaggaggtccgcggtggatccccatggggtgctggtacctttgctgtaagttttctctttgtttgtgaggtttaagttttccccttcagattactgattgcgtctgttacagggtgccgatggttcccgccagccctcagcgaaggagctcgagattgctcagatccatggcaagtccttctacgagactgtcgctcgtgtcaacttcgcctga。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (2)
1.一种调控羊肚菌风味的基因，其特征在于：所述调控羊肚菌风味的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种调控羊肚菌风味的基因的筛选方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：取统一直径活化后的羊肚菌菌块，转接到培养基中心，置于不同温度下培养相同时间；
步骤2：根据菌丝向平板伸展的程度标志菌落的直径，计算菌丝生长速度；
步骤3：使用倒置显微镜观察菌丝的微观形态；
步骤4：收集不同温度时的羊肚菌菌丝，抽提RNA进行转录组测序；
步骤5：将测序序列与指定的羊肚菌参考基因组比对分析，统计基因的表达水平及注释信息，获得不同培养温度间菌丝体的差异表达基因；
步骤6：利用加权基因共表达网络分析构建差异表达基因的分层聚类树，探索聚类树中不同基因模块与菌丝体培养温度的关联关系；
步骤7：基于各模块中基因之间相互关系构建共线网络图，挖掘参与温度调控的羊肚菌风味相关基因；
获得调控羊肚菌风味的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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