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CN117625585A - 双功能酶NagEA及其应用 - Google Patents

双功能酶NagEA及其应用 Download PDF

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CN117625585A
CN117625585A CN202311612803.8A CN202311612803A CN117625585A CN 117625585 A CN117625585 A CN 117625585A CN 202311612803 A CN202311612803 A CN 202311612803A CN 117625585 A CN117625585 A CN 117625585A
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cmpneusyn
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赵弘
邓彭花
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Zhuhai Ruidelin Biology Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及双功能酶NagEA及其应用。本发明利用多个酶的组合应用有效的转化乙酰基葡萄糖胺至3’‑唾液酸乳糖，具有简便易控、转化率高、副产物少的特定。融合表达异构酶和裂解酶，降低了添加酶的用量。使用固定化混合酶，由于固定化后的酶可以被重复再利用，可以进一步降低酶的用量并优化生产工艺。因此该方法制备3’‑唾液酸乳糖具有绿色环保、成本低以及易规模化生产等多方面优势。

Description

双功能酶NagEA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及双功能酶NagEA及其应用。
背景技术
3'-唾液乳糖(3'-Sialyllactose，3'-SL)是一种天然三糖，它存在于人体母乳中，是母乳低聚糖(HMOs)的重要成分；结构上它由两种糖，N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)和β-D-乳糖(Lac)通过β-1，3-糖苷键连接而成。3'-SL的具体功效包括降低有害细菌及其蛋白质的黏附风险，且被认为在婴儿免疫系统和肠道菌群的发育中起着重要作用；由于唾液酸是神经元的重要组成部分，3'-SL和6'-SL通过提供唾液酸特别支持婴儿大脑发育，因此3'-SL在婴幼儿配方奶粉产业展现出很大应用潜在，并具有广阔的市场前景。然而，迄今为止，目前市面上仍然缺少有效廉价的合成方法。
现今市面上报道3'-唾液乳糖制备方法主要是单菌株发酵及多菌株耦合发酵的方法，譬如南开大学于2016年利用重组大肠发酵生产3'-SL的方法，后来，2021年，江南大学又开发了一种3菌株耦合发酵生产3'-唾液乳糖的方法。与此同时，市面上还有其它单位及个人也采用了类似的技术生产3'-唾液乳糖，如南通励成生物工程有限公司，游星等人报道了“基于混菌耦合发酵策略合成3'-唾液酸乳糖”。
现报道的3'-唾液乳糖方案是利用改造的单菌或复合菌进行发酵制备，未见到酶法相关技术进行该产物的生产。利用菌株发酵虽然便捷，但是由于发酵时间很长，而细胞内含有大量的杂酶，因此不可避免的会导致副产物增多，从而影响后续纯化工艺及产品品质。与此同时，菌株发酵放大工艺复杂且不稳定，规模化生产难度很大。
因此，提供一种在规模化生产以及产品品质上都具有明显优势的制备3'-唾液乳糖方法具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了双功能酶NagEA及其应用。
本发明提供了双功能酶NagEA及其应用。本发明利用多个酶的组合应用有效的转化乙酰基葡萄糖胺至3’-唾液酸乳糖，具有简便易控、转化率高、副产物少的特定。融合表达异构酶和裂解酶，降低了添加酶的用量。使用固定化混合酶，由于固定化后的酶可以被重复再利用，可以进一步降低酶的用量并优化生产工艺。因此该方法制备3’-唾液酸乳糖具有绿色环保、成本低以及易规模化生产等多方面优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了融合酶，包括异构酶、裂解酶和连接片段；
所述异构酶来源于点状念珠藻(Nostoc punctiforme)；
所述裂解酶来源于苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)；
所述连接片段包括柔性连接片段。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柔性连接片段具有：
(1)如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
(2)在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)与如(1)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述融合酶具有：
(4)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
(5)在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(6)与如(4)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
本发明还提供了编码所述融合酶的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.7所示核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少70％序列同源性的核苷酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了酶组合物，包括所述融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PPK来源于戴尔福特菌(Delftiasp.)；
所述CMPNeuSyn来源于脑膜炎球菌(Neisseria meningitides)；
所述3'-SialTrans来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans依次具有：
(A)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
(B)在如(A)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(C)与如(A)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶组合物包括固定化酶。
在本发明的一些具体实施方案中，所述固定化酶中融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的酶活比为1：(1～2)：(1～2)：(2～3)。
本发明还提供了基因元件，包括：
(D)、所述核酸分子；和
(E)、编码PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans依次具有：
(Ⅴ)、如SEQ ID No.6、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示核苷酸序列；或
(Ⅵ)、与(Ⅴ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅴ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅶ)、与(Ⅴ)或(Ⅵ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅴ)或(Ⅵ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅷ)、与(Ⅴ)～(Ⅶ)任一项所述核苷酸序列具有至少70％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了表达载体，包括所述基因元件以及可接受的载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述可接受的载体包括pET-28a。
本发明还提供了宿主，包括
1)、所述核酸分子；和/或
2)、所述基因元件；和/或
3)、所述表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括大肠杆菌BL21。
本发明还提供了如下任意项在合成3'-唾液乳糖中的应用：
1)、所述融合酶；和/或
2)、所述核酸分子；和/或
3)、所述酶组合物；和/或
4)、所述基因元件；和/或
5)、所述表达载体；和/或
6)、所述宿主。
本发明还提供了3'-唾液乳糖的制备方法，基于N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述酶组合物催化，制得所述3'-唾液乳糖。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶组合物的添加方式包括分步添加和同时添加；
所述酶组合物包括固定化酶。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法，具体步骤包括：
步骤1：在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺和丙酮酸钠于经所述NagEA-a催化制得NeuAc；
步骤2：在Tris-HCl溶液中，所述NeuAc、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述CMPNeuSyn、所述3'-SiaTrans和所述PPK催化，制得所述3'-唾液乳糖。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述Tris-HCl的浓度为50mM，pH为7.5。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述催化的温度35℃，pH为6.0～8.5，时间为3小时。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述NagEA-a的酶活为4000U。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述催化后还包括离心、去含磷酸副产物、除盐和浓缩的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述去含磷酸副产物采用D201阴离子交换树脂进行；所述除盐采用反渗透膜进行。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述Tris-HCl的浓度为100mM，pH为7.5。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述催化的温度30℃，pH为7.0～9.0，时间为4小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CMPNeuSyn的酶活为4000U；所述3'-SiaTrans的酶活为5000U；所述PPK的酶活为8000U。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2后还包括去含磷酸副产物，除盐、浓缩和结晶的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述去含磷酸副产物采用D201阴离子交换树脂进行；所述除盐采用反渗透膜进行；所述结晶的条件为乙醇：水＝2：1(v：v)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法：在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述NagEA-a、所述CMPNeuSyn、所述3'-SiaTrans和所述PPK催化，制得所述3'-唾液乳糖。
在本发明的一些具体实施方案中，所述Tris-HCl溶液的浓度为100mM，pH为8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述催化的温度30℃，pH为7.5～8.5，时间为5小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述NagEA-a的酶活为2000U；所述CMPNeuSyn的酶活为3000U；所述3'-SiaTrans的酶活为3000U；所述PPK的酶活为5000U。
本发明的一些具体实施方案中，所述催化后还包括离心、去含磷酸副产物、除盐、浓缩和结晶的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述去含磷酸副产物采用D201阴离子交换树脂进行；所述除盐采用反渗透膜进行；所述结晶的条件为乙醇：水＝2：1(v：v)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法：在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述酶组合物进行催化，制得所述3'-唾液乳糖。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶组合物包括固定化酶；
所述固定化酶中融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的酶活比为1：(1～2)：(1～2)：(2～3)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述Tris.HCl的浓度为50mM，pH为8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述催化的温度为35℃，pH为7.5～9.0，时间为8小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述固定化酶的酶活为20,000U。
在本发明的一些具体实施方案中，所述催化后还包括过滤、去含磷酸副产物、除盐、浓缩和结晶的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中，所述去含磷酸副产物采用D201阴离子交换树脂进行；所述除盐采用反渗透膜进行；所述结晶的条件为乙醇：水＝2：1(v：v)。
本发明提供了双功能酶NagEA及其应用。本发明制备路线利用廉价的乙酰基葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine)、丙酮酸(Pyruvate)以及乳糖(lactose)作为主要原料，三磷酸胞苷(cytidine triphosphate，CTP)、多聚磷酸(Pi)n作为少量辅料，在四个酶NagEA、CMPNeuSyn、3'-SiaTrans以及PPK的连续催化下高收率的转化成目标产物3'-唾液乳糖，该制备路线比较直接，路线精简、收率高、产品品质好，无杂质生成，绿色指数高且易规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1中反应0小时的液相检测谱图；
图2示实施例1中反应3小时的液相结果谱图；
图3示实施例2中反应5小时的液相检测谱图；
图4示产物唾液酸NeuAc质谱图；
图5示实施例3中反应0小时液相检测图谱；
图6示实施例3中反应4小时液相结果图谱；
图7示本发明中3’-唾液乳糖质谱图；
图8示实施例4中反应0小时的液相检测；
图9示实施例4中反应5小时的液相结果图谱；
图10示实施例5中用NagEA-b进行多酶反应5小时制备3’-唾液乳糖；
图11实施例6中反应8小时的液相结果图谱；
图12示PPK I、NagEA-a、NagEA-b、CMPNeuSyn和3'-SialTrans电泳图；其中，最左侧泳道为Marker。
具体实施方式
本发明公开了双功能酶NagEA及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明拟采用酶高效生产3'-唾液乳糖，通过酶融合及催化空间整合等方式实现多个酶的高效连续催化，最终高收率生产3'-唾液乳糖。
本发明3'-唾液乳糖酶制备方案：
该路线利用廉价的乙酰基葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine)、丙酮酸(Pyruvate)以及乳糖(lactose)作为主要原料，三磷酸胞苷(cytidine triphosphate，CTP)、多聚磷酸(Pi)n作为少量辅料，在四个酶NagEA、CMPNeuSyn、3'-SiaTrans以及PPK的连续催化下高收率的转化成目标产物3'-唾液乳糖，该制备路线比较直接，路线精简、收率高、产品品质好，无杂质生成，绿色指数高且易规模化生产。
本发明利用多酶复合体连续转化乙酰基葡萄糖胺至3'-唾液乳糖，该反应可以分步完成或同一反应体内系内完成，原料及酶可一次性加入，无需反应中间体纯化。为减少酶的用量采用了融合方案实现一步发酵生产双功能酶，如NagEA能进行异构化及缩合两步反应；同时也采用循环体系再生昂贵的三磷酸胞苷(CTP)；该反应体系可以是液体酶或固定化酶催化。
本发明所用酶相关信息：
多聚磷酸激酶(PPK):来源于戴尔福特菌(Delftia sp.，Uniprot ID:
F6B1D3)，实验测试它不仅能利用多聚磷酸(Pi)n再生AMP到ATP，同时也能再生CMP到CTP；
双功能酶NagEA：是异构酶(EC 5.1.3.8:N-acylglucosamine 2-epimerase)与裂解酶(EC 4.1.3.3:N-acetylneuraminic acid lyase)的融合，这两个酶分别来源于点状念珠藻(Nostoc punctiforme，Uniprot ID:B2IWM7)以及苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti，Uniprot ID:Q92WP0)，通过多肽片段进行连接分别得到NagEA-a(GGGGSGGGGSGGGGS柔性片段连接SEQ ID No.11)，NagEA-b(AEAAAKEAAAKEAAAKA刚性片段连接SEQ ID No.12)；
唾液酸CMP活化酶CMPNeuSyn:来源于脑膜炎球菌(Neisseria meningitides，Uniprot ID:P0A0Z8)；
唾液酸基转移酶3'-SialTrans:来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi，Uniprot ID:Q7VPL1)
酶表达及活力数据如表1所示：
表1
本发明涉及的序列如表2和表3所示：
表2
表3
酶的发酵生产和酶的固定化方法：
酶的发酵生产：
本发明所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得；其具体包含以下步骤：将以上酶所对应的基因进行序列优化后在通用生物公司合成(安徽滁州)，通过引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(生工生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD～20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞30-60g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验，具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)在低温混合均匀(以～10克湿细胞:200ml缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在500～2500U/ml，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。
LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
酶的固定化：
往上述收集的粗酶清液中缓慢加入硫酸铵固体至蛋白固体析出(30-60％w/v硫酸铵:缓冲液)，该蛋白固体通过高速离心(10000rpm，10分钟)收集后缓慢溶解到25mMpH 8.0的Tris缓冲液中(缓冲液A)，然后在50倍体积的缓冲液A中透析(两次，每次间隔4小时)除去酶溶液里的含硫酸铵，最后透析液上样DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱(NaCl在缓冲液梯度洗脱:0-1NNaCl)得到初纯化的NagEA-a、CMPNeuSyn、3'-SiaTrans、PPK酶液；以上酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按活性单位1:(1～2)：(1～2)：(2～3)以下面的方法一次性混合固定：10，000U纯化混合酶溶解在10L 50mMpH 8.0的磷酸钾(缓冲液B)溶液中，随后加入30-50mM苯氧乙酸以及5公斤LX-1000EP环氧树脂至，25℃搅拌12小时后过滤出固定化酶，最后用清水及缓冲液B各洗两次后低温保存待用，固定化酶初始活力具有76-91％的液体酶活力。
本发明采用的D201阴离子交换树脂，购于天津波鸿树脂科技有限公司，货号为天津波鸿D201。
本发明提供的双功能酶NagEA及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1利用N-乙酰基葡萄糖胺为原料，NagEA-a酶制备唾液酸NeuAc
在1L 50mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入44.2克N-乙酰基葡萄糖胺(200mM)，66克丙酮酸钠(600mM)；然后将反应体系pH值调回7.5后加入酶NagEA-a 4000U启动反应。反应维持在35℃轻微搅拌并维持反应pH在6.0-8.5之间，3小时后反应达到平衡，HPLC检测无更多唾液酸NeuAc生成，见液相检测结果图1、2。反应结束后加入HCl水溶液调节pH值1.0终止反应并沉淀酶，随后pH值调回7.0，并离心除去固体杂质，上清液通过D201阴离子交换树脂纯化后，最后利用分子量300Da的膜除剩余的丙酮酸，反渗透膜除盐并浓缩备用，液相转化率64％。
实施例2利用N-乙酰基葡萄糖胺为原料，NagEA-b酶制备唾液酸NeuAc
与上述NeuAc制备方法类似，同样在1L 50mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入44.2克N-乙酰基葡萄糖胺(100mM)，66克丙酮酸钠(300mM)；然后将反应体系pH值调回7.5后加入酶NagEA-b 5000U启动反应。反应维持在35℃轻微搅拌并维持反应pH在6.0-8.5之间，5小时后产物唾液酸NeuAc停止增加，见液相检测结果图3。同样在反应结束后加入HCl水溶液调节pH值1.0终止反应并沉淀酶，随后pH值调回7.0，并离心除去固体杂质，上清液通过D201阴离子交换树脂纯化后，最后利用分子量300Da的膜除剩余的丙酮酸，反渗透膜除盐并浓缩备用，液相转化率46％。
实施例3利用唾液酸NeuAc做原料制备3'-SL
以上述实施例1得到的唾液酸NeuAc做为原料，在1L 50mMpH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入61.8克唾液酸NeuAc(200mM)、4.8克三磷酸胞苷CTP(10mM)、82.1克乳糖(240mM)以及97.8克六偏磷酸钠(160mM)。在酶加入前将反应体系pH值调回8.0，然后加入4000U CMPNeuSyn、3'-SiaTrans 5000U以及PPK 8000U启动反应。反应维持在30℃轻微搅拌并维持反应pH在7.0-9.0之间，4小时后HPLC检测原料唾液酸NeuAc反应完全，见液相检测结果图5、6。反应结束后加入HCl水溶液调节pH值2.0沉淀酶，离心后去除固体，随后pH值调回7.0并利用D201阴离子交换树脂除去含磷酸副产物，最后利用反渗透膜除盐并浓缩、结晶(结晶条件乙醇:水＝2:1v:v)得到116.4克白色固体产物3'-唾液乳糖(最终收率92％)。经质谱(图7)确认产物结构正确。
实施例4利用N-乙酰基葡萄糖胺为原料，多个液体酶一锅法制备3'-SL:含NagEA-a酶
在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中连续加入22.1克N-乙酰基葡萄糖胺(100mM)，12.1克丙酮酸钠(110mM)，2.4克三磷酸胞苷CTP(5mM)、41克乳糖(120mM)以及48.9克六偏磷酸钠(80mM)。随后将反应体系pH值调回8.0，最后加入2000UNagEA-a，3000U CMPNeuSyn，3'-SiaTrans 3000U以及PPK 5000U启动反应。维持反应在30℃轻微搅拌且pH在7.5-8.5之间，5小时后HPLC检测原料N-乙酰基葡萄糖胺消耗完毕，见液相检测结果图8、9。如同实施例3，反应结束后加入HCl水溶液调节pH值2.0沉淀酶并离心除去固体，随后上清液pH值调回7.0并利用D201阴离子交换树脂除去含磷酸副产物，最后利用反渗透膜除盐并浓缩、结晶(结晶条件乙醇:水＝2:1v:v)得到54.4克白色固体产物(最终收率约为86％)。经质谱确认(比对图7)，结构正确。
实施例5利用N-乙酰基葡萄糖胺为原料，多个液体酶一锅法制备3'-SL:含NagEA-b酶
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中连续加入22.1克N-乙酰基葡萄糖胺(100mM)，12.1克丙酮酸钠(110mM)，2.4克三磷酸胞苷CTP(5mM)、41克乳糖(120mM)以及48.9克六偏磷酸钠(80mM)。随后将反应体系pH值调回8.0，最后加入2000UNagEA-b，3000UCMPNeuSyn，3'-SiaTrans 3000U以及PPK 5000U启动反应。维持反应在30℃轻微搅拌且pH在7.5-8.5之间，5小时后HPLC检测原料N-乙酰基葡萄糖胺没有消耗完毕，还有30％左右的葡萄糖胺没有消耗，预估产物3'-唾液乳糖收率为60％。液相检测反应结果见图10。
实施例6利用N-乙酰基葡萄糖胺为原料，固定化MixEnzymes一锅法制备3'-SL
与实施例4类似，在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中连续加入22.1克N-乙酰基葡萄糖胺(100mM)，12.1克丙酮酸钠(110mM)，2.4克三磷酸胞苷CTP(5mM)、41克乳糖(120mM)以及48.9克六偏磷酸钠(80mM)。随后将反应体系pH值调回8.0，最后加入固定化混合酶(含NagEA-a，CMPNeuSyn，3'-SiaTrans以及PPK混合固定的酶，具体混合比例见具体实施方式中酶的发酵生产和酶的固定化方法部分)总计20，000U活力启动反应。维持反应在35℃轻微搅拌且pH在7.5-9.0之间，反应8小时后HPLC检测原料N-乙酰基葡萄糖胺消耗完毕，液相检测反应结果见图11；反应结束后直接过滤回收固定化酶，上清液pH值调至7.0并利用D201阴离子交换树脂除去含磷酸副产物，最后利用反渗透膜除盐并浓缩、结晶(结晶条件乙醇:水＝2:1v:v)得到51.9克白色固体产物3'-唾液酸乳糖(最终收率约为82％)，固定化酶使用5次后还保留原有64％的活力。
效果例
不同酶法之间的对比，请见表4：
表4多组合酶法比较说明
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (21)

1.融合酶，其特征在于，包括异构酶、裂解酶和连接片段；
所述异构酶来源于点状念珠藻(Nostoc punctiforme)；
所述裂解酶来源于苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)；
所述连接片段包括柔性连接片段。
2.如权利要求1所述的融合酶，其特征在于，所述柔性连接片段具有：
(1)如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；或
(2)在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)与如(1)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的融合酶，其特征在于，具有：
(4)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
(5)在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(6)与如(4)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
4.编码如权利要求1至3任一项所述的融合酶的核酸分子。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.7所示核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少70％序列同源性的核苷酸序列。
6.酶组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述的融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans。
7.如权利要求6所述的酶组合物，其特征在于，所述PPK来源于戴尔福特菌(Delftiasp.)；
所述CMPNeuSyn来源于脑膜炎球菌(Neisseria meningitides)；
所述3'-SialTrans来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)。
8.如权利要求6或7所述的酶组合物，其特征在于，所述PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans依次具有：
(A)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
(B)在如(A)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(C)与如(A)所示的氨基酸序列具有至少70％序列同源性的氨基酸序列。
9.如权利要求6至8任一项所述的酶组合物，其特征在于，包括固定化酶。
10.如权利要求9所述的酶组合物，其特征在于，所述固定化酶中融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的酶活比为1：(1～2)：(1～2)：(2～3)。
11.基因元件，其特征在于，包括：
(D)、如权利要求4或5所述的核酸分子；和
(E)、编码PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的核酸分子。
12.如权利要求11所述的基因元件，其特征在于，所述PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans依次具有：
(Ⅴ)、如SEQ ID No.6、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示核苷酸序列；或
(Ⅵ)、与(Ⅴ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅴ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅶ)、与(Ⅴ)或(Ⅵ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅴ)或(Ⅵ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅷ)、与(Ⅴ)～(Ⅶ)任一项所述核苷酸序列具有至少70％序列同源性的核苷酸序列。
13.表达载体，其特征在于，包括如权利要求11或12所述的基因元件以及可接受的载体。
14.宿主，其特征在于，包括
1)、如权利要求4或5所述的核酸分子；和/或
2)、如权利要求11或12所述基因元件；和/或
3)、如权利要求13所述的表达载体。
15.如下任意项在合成3'-唾液乳糖中的应用：
1)、如权利要求1至3任一项所述的融合酶；和/或
2)、如权利要求4或5所述的核酸分子；和/或
3)、如权利要求6至10任一项所述的酶组合物；和/或
4)、如权利要求11或12所述的基因元件；和/或
5)、如权利要求13所述的表达载体；和/或
6)、如权利要求14所述的宿主。
16.3'-唾液乳糖的制备方法，其特征在于，基于N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经如权利要求6至10任一项所述的酶组合物催化，制得所述3'-唾液乳糖。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述酶组合物的添加方式包括分步添加和同时添加；
所述酶组合物包括固定化酶。
18.如权利要求16或17所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺和丙酮酸钠于经所述NagEA-a催化制得NeuAc；
步骤2：在Tris-HCl溶液中，所述NeuAc、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述CMPNeuSyn、所述3'-SiaTrans和所述PPK催化，制得所述3'-唾液乳糖。
19.如权利要求16或17所述的制备方法，其特征在于，在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经所述NagEA-a、所述CMPNeuSyn、所述3'-SiaTrans和所述PPK催化，制得所述3'-唾液乳糖。
20.如权利要求16或17所述的制备方法，其特征在于，在Tris-HCl溶液中，N-乙酰基葡萄糖胺、丙酮酸钠、三磷酸胞苷CTP、乳糖和六偏磷酸钠经如权利要求6至10任一项所述的酶组合物进行催化，制得所述3'-唾液乳糖。
21.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述酶组合物包括固定化酶；
所述固定化酶中融合酶、PPK、CMPNeuSyn和3'-SialTrans的酶活比为1：(1～2)：(1～2)：(2～3)。
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