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CN117625480B - 一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用 - Google Patents

一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用 Download PDF

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CN117625480B CN202311630219.5A CN202311630219A CN117625480B CN 117625480 B CN117625480 B CN 117625480B CN 202311630219 A CN202311630219 A CN 202311630219A CN 117625480 B CN117625480 B CN 117625480B
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Abstract

本发明提供一株粪肠球菌，其名称为为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363，所述菌株已于2023年06月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231093。该菌株具有良好的抗猪轮状病毒的作用，能够预防猪轮状病毒性腹泻，并且能够减轻炎症和提高免疫力。

Description

一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
猪轮状病毒性腹泻(Porcine Rotaviral Diarrhea)是一种常见的猪病，由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)引起。这种病毒主要影响仔猪，尤其是新生至六周龄的仔猪，导致严重的腹泻、脱水和电解质失衡。病毒通过粪-口途径传播，比如可以通过接触病毒携带者的粪便、唾液等传播，在养猪场尤其是密集养殖环境中容易引发疫情。PoRV感染后，通常在1至3天内开始表现症状，主要包括水样腹泻、呕吐、食欲不振和体重下降，严重的可导致严重脱水和营养不良，并导致死亡。此外，PoRV还可能导致肺炎、肝炎和肠炎等疾病，引起猪的死亡率和出栏率的显著增加，严重影响养殖业的经济效益。此外，PoRV还可以引起人类的腹泻、肺炎、肝炎和肠炎等疾病，因此，猪轮状病毒的传播对养殖业也是一个巨大的威胁。
目前，针对猪轮状病毒性腹泻的治疗主要是支持性和对症治疗，包括补充水分和电解质、营养支持、控制继发性细菌感染、抗生素治疗、抗病毒治疗和免疫治疗等。此外，还可以采取预防措施，包括良好的卫生管理、定期清洁和消毒、疫苗接种、控制病毒携带者的接触、改善饲养环境和提高动物免疫力等。早期诊断和有效的管理措施对于控制疫情和减少经济损失至关重要。
发明内容
本发明提供了一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。该菌株具备良好的性能，能够很好的在动物肠道(特别是猪肠道)内定植，能够有效地减少猪轮状病毒在肠道内的病毒载量，并预防和改善猪轮状病毒性腹泻，减轻炎症，增强机体免疫力，保护肠道健康。
具体地，本发明提供了下述的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一株粪肠球菌，其名称为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363，所述菌株已于2023年06月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231093。
本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363分离自泰国蝙蝠粪便，该菌株在MRS培养基上生长有边缘整齐、表面光滑的乳白色菌落，为革兰氏阳性菌。
本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363具有良好的生长性能(2-8h为指数生长期，12h后稳定)。
本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363耐酸(在pH＝3的环境下2h存活率为29.80％)、在人工胃液中3h存活率为22％，在人工肠液中6h存活率大于100％，具有良好的耐受肠道内的消化酶，以及良好的耐热性能，60摄氏度及以上的环境下仍然可存活。
本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363具有良好的表面疏水性和自聚能力，疏水性与其在肠道中的粘附能力和定植能力有关，一般来说，疏水性强的益生菌具有较高的粘附能力和定植能力，能够更好地与肠道表面形成亲密的接触，而自聚能力可以增加菌株的活性和稳定性，使菌株可以相互保护，并阻止致病菌与肠道表面结合，从而减少感染的风险，以及增加菌株的协同效应，从而使菌株发挥更强的功能。
本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363具有良好的抑菌能力，对沙门氏菌(特别是猪霍乱沙门氏菌)抑菌性较好，菌体对沙门氏菌的抑制率可达100％，同时，菌液、菌体和上层清液均表现出良好的抑菌能力。
在本发明的第二方面，本发明提供了本发明所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363和/或其代谢物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
(1)抗猪轮状病毒；
(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；
(3)减轻炎症；
(4)增强机体免疫力；和
(5)抗菌。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了本发明所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363和/或其代谢物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
(a)提高血液中γ干扰素(IFN-γ)的含量；
(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(IFN-α)的含量；
(c)降低血液中白细胞介素1β(IL-1β)的含量；
(d)提高血液中白细胞介素6(IL-6)的含量；和
(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白A(SIgA)的含量。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品包括药品、日化用品、饲料、饲料添加剂、微生态制剂和抗菌剂。
在本发明的实施方式中，本发明以仔猪为实验对象研究了服用本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363后以猪轮状病毒对仔猪攻毒后的仔猪的一系列变化和影响。
结果表明，本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363能够在仔猪肠道内良好的定植，能够显著降低感染猪轮状病毒的仔猪肠道内(特别是小肠、空肠、回肠、盲肠、直肠)以及肠系膜淋巴结(MLN)内的病毒载量，具有良好的抗猪轮状病毒的作用。
同时，服用了本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363的仔猪虽然在攻毒后出现了少量且短暂的腹泻行为，从粪便考察的结果来看，其粪便能够很快从粘稠和不成形的状态改善为湿润和成形的粪便，并后续一直保持这种良好的状态，这表明本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363能够很好的预防和改善猪轮状病毒性腹泻。
并且，在实验中检测了免疫指标IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和SIgA的变化情况，结果表明在PoRV感染后的第三天，服用了本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363的仔猪血清中的IFN-γ水平明显增加，TNF-α的含量明显减少，IL-1β的含量明显减少以及IL-6的含量明显增加，以上表明本发明所述菌株能够通过诱导IFN-γ的分泌提高仔猪的抗病毒能力，能够有效缓解炎症，可能通过协同炎症小体拮抗PoRV的感染。以及，检测发现仔猪粪便中的SIgA的含量明显增加，SIgA抗体是粘膜证据的抗原特异性免疫的第一道防线，能够防止病原体与粘膜表面结合，从而防止细菌和病毒进入肠道。
以及，在实验中还使用流式细胞术检测了T淋巴细胞和B淋巴细胞的变化情况，结果本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363提高了PoRV感染后脾脏中CD8+IFN-γ+T细胞的比例，推测本发明所述菌株可以通过增加脾脏中CD8+IFN-γ+T细胞的比例，增强机体对PoRV感染的免疫反应，以及增加了肠道中B细胞的比例，增强了机体对PoRV感染的免疫反应。
此外，通过H&E染色观察小肠组织的病理切片，发现相较于PBS组出现的十二指肠病理变化严重，可见部分肠道绒毛断裂，肠道绒毛上皮细胞脱落，肠腔中可见脱落的组织和细胞碎片和少量炎性细胞，以及PBS攻毒组出现的十二指肠绒毛萎缩散落，断裂，分布稀疏，肠道结构被破坏的情况，使用了本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363(B363组)结果中十二指肠均未见明显病理组织学变化，肠绒毛轻度萎缩，轮廓清晰，分布较密，结构完整。以上结果表明本发明所述的所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363能够有效地保护肠道组织来自于猪轮状病毒的损伤。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物，其包括本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物具备下述中至少一项所述的用途：
(1)抗猪轮状病毒；
(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；
(3)减轻炎症；
(4)增强机体免疫力；和
(5)抗菌。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物具备下述中至少一项所述的用途：
(a)提高血液中γ干扰素(IFN-γ)的含量；
(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(IFN-α)的含量；
(c)降低血液中白细胞介素1β(IL-1β)的含量；
(d)提高血液中白细胞介素6(IL-6)的含量；和
(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白A(SIgA)的含量。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种产品，其包括本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢物，或包含本发明所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363和/或其代谢物物的组合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品包括药品、日化用品、饲料、饲料添加剂、微生态制剂、抗菌剂和试剂，并且本发明所述产品具备下述中至少一项所述的用途：
(1)抗猪轮状病毒；
(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；
(3)减轻炎症；
(4)增强机体免疫力；和
(5)抗菌。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品具备下述中至少一项所述的用途：
(a)提高血液中γ干扰素(IFN-γ)的含量；
(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(IFN-α)的含量；
(c)降低血液中白细胞介素1β(IL-1β)的含量；
(d)提高血液中白细胞介素6(IL-6)的含量；和
(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白A(SIgA)的含量。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物或产品中包含本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢物，以及，在此基础上，所述组合物或产品品中还可以包含至少一种对动物安全的辅料，或者其他治疗有效的成分。其中，合适的辅料可以是本领域已知的常规种类，比如溶剂、缓冲剂、稀释剂、冻干保护剂等等。组合物或产品可以为固体、半固体或者液体形式，其可根据本领域已知的任何常规方法进行制备。所述产品为饲料时，饲料中还可以进一步包含粮食类物质、微量元素、蛋白质等。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物可以制备成菌粉，所述菌粉中可以进一步包含冻干保护剂，所述冻干保护剂的加入量为原料重量的2-95％，优选5-85％，所述冻干保护剂可采用本领域常规的冻干保护剂，比如脱脂奶粉等。在制备其他产品时，可直接以菌粉为原料进行添加。当然，这只是一种示例，本发明所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363也可以菌液、菌体或其上清液的形式作为原料以制备产品。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种方法，其包括向受试者施用本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢物或包含本发明所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢产物的组合物或产品以实现下述至少一种功能：
(1)抗猪轮状病毒；
(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；
(3)减轻炎症；
(4)增强机体免疫力；和
(5)抗菌。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述方法还包括向受试者施用本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363和/或其代谢物或包含本发明所述粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)B363和/或其代谢产物的组合物或产品以实现下述至少一种功能：
(a)提高血液中γ干扰素(IFN-γ)的含量；
(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(IFN-α)的含量；
(c)降低血液中白细胞介素1β(IL-1β)的含量；
(d)提高血液中白细胞介素6(IL-6)的含量；和
(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白A(SIgA)的含量。
在本发明中，所述“受试者”是指已经是或将要是治疗、观察或实验对象的动物，如猪，特别是仔猪。本文描述的方法可用于兽医应用。
在本发明中，实现上述功能的所需的有效量可以由考虑到自身知识、现有技术水平和本领域技术人员常规地确定，比如通过体内、体外或离体实验确定或展示该量，然后应用该量从而更好地实施本发明所述的方法。比如，在本发明的一些实施方式中，以本发明所述菌株灌胃治疗时，其剂量为1×109CFU/mL。
相较于现有技术，本发明的优势包括：本发明提供了一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。该菌株具备良好的性能，能够很好的在动物肠道(特别是猪肠道)内定植，能够有效地减少猪轮状病毒在肠道内的病毒载量，并预防和改善猪轮状病毒性腹泻，减轻炎症，增强机体免疫力，保护肠道健康。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了1-5号菌的菌落特征。
图2示出了1-5号菌的革兰氏染色结果。
图3示出了1-5号菌的生长曲线。
图4示出了1-5号菌在0h和2h的耐酸情况。
图5示出了1-5号菌的耐酸存活率情况。
图6示出了1-5号菌在0h和2h耐胆盐情况。
图7示出了1-5号菌的胆盐存活率情况。
图8示出了1-5号菌在人工胃液和人工肠液中的存活率情况。
图9示出了1-5号菌的耐热实验结果。
图10示出了1-5号菌的表面性质实验结果。
图11示出了1-5号菌抑菌实验的结果。
图12示出了1-5号菌抑菌环的大小。
图13示出了5号菌的16s PCR扩增结果，其中，M:DL2000 marker；1:16s rRNA。
图14示出了各组粪便形态评分结果。
图15示出了各组猪肿瘤坏死因子α和仔猪γ干扰素的含量的含量。
图16示出了各组猪白细胞介素6的含量和猪白细胞介素1β的含量结果。
图17示出了各组猪分泌型免疫球蛋白A的含量结果。
图18示出了十二指肠样本中的病毒定量结果。
图19示出了空肠样本中的病毒定量结果。
图20示出了回肠样本中的病毒定量结果。
图21示出了盲肠样本中的病毒定量结果。
图22示出了结肠样本中的病毒定量结果。
图23示出了直肠样本中的病毒定量结果。
图24示出了肠系膜淋巴结样本中的病毒定量结果。
图25示出了脾脏中CD8+T细胞中IFN-γ的表达情况。
图26示出了肠道固有层中的B细胞激活水平。
图27示出了小肠组织病理切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如无特殊说明，本发明所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363在下述实施例中均简写为益生菌B363。
实施例1
1.1材料与方法
1.1.1试验材料与设备
1.1.1.1材料
由吉林农业大学微生态制剂研究中心提供的健康猪新鲜粪样、蝙蝠粪样和猪霍乱沙门氏菌。
1.1.1.2培养基
MRS液体培养基，MRS固体培养基以及LB固体培养基。
1.1.1.3试剂
革兰氏染色试剂盒、胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、二甲苯、氯仿、PBS缓冲液
1.1.1.4器材
超净无菌工作台、pH计、恒温培养振荡器、光学显微镜、恒温培养箱、微生物培养箱、水浴锅、分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、离心机
1.1.2方法
1.1.2.1样品采集和菌株培养、纯化及分离
取1g粪便样品加入到装有9mL无菌PBS的50mL离心管中，涡旋使样品充分混匀后，取上清液进行10倍梯度倍比稀释至10-8备用。取100μL稀释梯度为10-3-10-8的稀释液，用玻璃棒均匀涂在MRS固体琼脂培养基平皿上，37℃恒温箱厌氧培养48小时，观察菌落形态，选择合适稀释梯度挑取单菌落于液体培养基中活化2代，进行菌株的分离纯化，甘油保菌备用，并进行革兰氏染色与镜检。
1.1.2.2生长曲线的测定
将菌种在液体MRS中接种培养，每2h取样，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取样，利用分光光度计测定5株益生菌生长光密度值(OD600值)并绘制生长曲线。
1.1.2.3耐酸试验
取50μL活化后的菌液接种至pH为3.0的MRS液体培养基中，同时接入不加酸的MRS液体培养基作为对照，37℃恒温培养。分别于培养前(0h)和培养后(2h)分别吸取酸处理和对照组菌液1.5mL，一组用于测OD600值，另一组用PBS进行梯度稀释，稀释至适宜梯度后取50μL稀释液涂布于MRS琼脂平板上，培养24h后进行平皿菌落计数。计算酸处理过的存活率A(％)＝Xt/X0×100，式中：A为酸处理后的存活率；Xt为处理2h(0h)后每毫升的活菌数(CFU)；X0为对照组2h(0h)后每毫升的活菌数(CFU)。
1.1.2.4耐胆盐试验
在液体MRS培养基中加入0.25％(m/v)的猪胆盐，用与耐酸试验相同的方法摇匀。胆盐处理后的存活率B(％)计算为：B(％)＝Yt/Y0×100，其中B为胆盐处理后的存活率；Yt为胆盐处理2h(0h)后每毫升的活菌数(CFU)；Y0为对照组2h(0h)后每毫升的活菌数(CFU)。
1.1.2.5模拟胃肠道试验
人工胃液(AGJ)的制备方法是：将灭菌生理盐水(0.9％)的pH值调整至3.0，并加入胃蛋白酶(1:15000)，使溶液的浓度定在3g/L，最后通过0.22μm的无菌滤膜过滤，备用。
人工肠液(AIJ)的制备方法是：将灭菌生理盐水(0.9％)的pH值调整至8.0，并加入0.25％胆盐和胰蛋白酶(1:250)，使溶液的浓度定在1g/L，最后通过0.22μm的无菌滤膜过滤，备用。
取3mL菌液于离心管中，5000r/min(离心温度25℃)离心10min并弃上层清液。用无菌PBS重悬2次后，取100μL重悬液进行梯度稀释，在固体MRS上涂布计数，观察存活情况。之后用1mL重悬液和9mL人工胃液混匀，于37℃培养3h；分别于培养前(0h)和培养后(3h)吸取100μL倍比稀释，在固体MRS上涂布计数，计算存活率。(存活率＝3h菌落个数/0小时菌落个数×100％)。
3h后，取上述1mL混合液加到9mL模拟肠液中，37℃培养6h，分别于培养前(0h)和培养后(6h)吸取100μL倍比稀释，在固体MRS上涂布计数，计算存活率。(存活率＝0h菌落个数/6h菌落个数×100％)
1.1.2.6表面性质测定
疏水性：将培养液离心得到菌体后，用PBS重悬两次，并将其在600nm处的吸光度调至0.48～0.52，记为A0；分别将2mL二甲苯或氯仿加入到同等体积的菌悬液中，涡旋混匀1min；37℃静置共培养2h；待水相与有机相分层后缓慢吸取水相并测量在600nm处的吸光度值并记录为A2。菌株的疏水率(％)＝(A0-A2)/A0×100
自聚率：将培养液离心得到菌体后，用PBS重悬两次，并将其在600nm处的吸光度调至0.48～0.52，记为A0；取4mL菌悬液于37℃静置放置24h；取上层液体于600nm波长处测定吸光度，记录为A2。菌株的自聚率(％)＝(A0-A2)/A0×100
1.1.2.7耐热试验
将菌株接入MRS液体培养后，分装成5组，每组2mL，分别置于37℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴锅中加热10min，再用PBS倍比稀释，涂板计数。
1.1.2.5抑菌试验
在固体LB培养基中加入指示菌(猪霍乱沙门菌C500株由吉林农业大学微生态制剂研究中心提供)，用玻璃棒均匀涂板。再使用8mm孔径打孔器在培养皿内打3个孔，分别标记为A、B、C。分别取两组1mL活化后的受试菌MRS培养液，其中一组离心(25℃，4000×g，5min)备用；之后，A孔加入20μL菌液，B孔加入20μL离心后的上层清液，C孔加入20μL菌体。恒温培养箱中放置培养24h。游标卡尺测量透明圈直径，菌株的抑菌活性表示为抑菌圏直径的大小。
1.2结果
1.2.1菌株分离与染色特征
利用MRS培养基从粪便样品中共分离出5株益生菌，并将其标号为1、2、3、4、5。该5株益生菌在培养基上生长有边缘整齐、表面光滑的乳白色菌落，见图1。革兰氏染色看到粉色的球状的革兰氏阴性菌，见图8；蓝紫色的球状以及链球状的革兰氏阳性菌，见图2。
1.2.2菌株生长曲线的绘制
对菌株的生长情况进行测定，根据其不同时间下的A值制图。如图3所示，菌株1在接种2～8h为指数型生长，8h以后稳定；菌株2在接种2～8h为指数型生长，8h以后稳定；菌株3在接种2～8h为指数型生长，12h以后稳定；菌株4在接种2～8h为指数型生长，10h以后稳定；菌株5在接种2～8h为指数型生长，12h以后稳定。
1.2.3耐酸试验
将5株菌株置于pH值为3.0MRS液体培养基中培养2h，计算耐酸存活率。由图4和图5可知，五株益生菌酸性耐受力良好，均有不同程度的耐酸作用，4＞1＞5＞3＞2。菌株1的耐酸存活率为57％；菌株2的存活率为19％；菌株3的存活率为20.80％；菌株4的存活率为73％；菌株5的存活率为29.80％。说明这五株益生菌耐酸能力良好。
1.2.4耐胆盐试验
将5株益生菌置于胆盐浓度为0.25％的MRS液体培养基中培养2小时，计算耐胆盐存活率。由图6和图7可知，该五株益生菌均有不同程度的耐胆盐能力，且4＞3＞2＞5＞1；4的耐胆盐存活率为0.22％；3的存活率为0.19％；2的存活率为0.11％；5的存活率为0.1％；1的存活率为0.07％。
1.2.5模拟人工胃肠液
由图8可知，5株益生菌在人工胃液和人工肠液处理后，生长情况依然良好。在人工胃液中培养3小时后，五株益生菌的存活率5＞4＞2＞1＞3，其中，1号益生菌在人工胃液中存活率为3.3％；2号存活率为15.7％；3号存活率为3.2％；4号存活率为15.9％；5号存活率为22％；稍后在人工肠液中培养6小时后，由图8可知，在人工肠液中的存活率均大于100％。由此表明，5株益生菌耐肠道内消化酶能力良好。
1.2.6耐热试验
由图9可知，高温下，2号菌的耐热性略低于其他菌株，5号菌的耐热性略高于其他菌株。
1.2.7表面性质测定
如图10所示，与二甲苯等体积混合后，5号菌的表面疏水性能最好，达到60％以上；同理，等体积的氯仿混合4号菌的疏水性最好，达到45％以上；1号菌的自聚合能力最好，自聚率达到70％以上。
1.2.8抑菌试验
由图11和图12可知，C组菌体对沙门菌的抑菌性较好，5组菌菌体对沙门菌的抑菌率都达到100％。A组菌液和B组上层清液对沙门菌的抑菌率都达到60％以上。
1.2.6 16s rRNA鉴定结果
将5号菌株送基因公司测序。测序结果在NCBI Blast比对后，与GenBank数据库中粪肠球菌同源性为100％。16s PCR扩增结果如图13所示。5号菌被命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)B363，并已于2023年06月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231093，在下述实验中该菌株也被简称为益生菌B363。
表1 16S rDNA序列相似性比对
实施例2
2.1材料与方法
2.1.1材料
2.1.1.1实验动物
选取9头健康的21日龄新生猪，随机分为3组，每组3只，隔离饲养，每天7：00、13：00、21：00喂饲料以及饮水。
2.1.1.2菌株
益生菌B363。
2.1.1.3试剂
猪白细胞介素1β(IL-1β)、猪白细胞介素6(IL-6)、猪γ干扰素(IFN-γ)、猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)、猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA试剂盒购买于酶免(江苏)实业有限公司。
2.1.1.4主要仪器
CO2培养箱(HERACELL 240i)、荧光倒置显微镜(DMi8)、微孔板分光光度计(Epoch2)、
流式细胞仪(LSRFortessaTM)、4℃冷冻离心机(Centrifμge 5810R)、全自动石蜡切片机(RM2245)、-80℃冰箱(Thermo)、细胞培养箱(HERACELL 240i)、全自动高压灭菌锅(GR85DA)、低温台式高速离心机(5427R)、恒温培养箱(Heratherm IGS180)
2.1.2方法
2.1.2.1实验动物分组及免疫程序
本试验分为三个处理组，动物免疫分组组别为PBS健康组、PBS攻毒组和B363组。在第1、3、5、7、9、11和13天，对B363组中每只仔猪进行益生菌B363的灌胃，剂量为1×109CFU/mL。每天测量并记录体重增加情况，同时采集并观察每只仔猪的粪便并进行评分。在第15天进行PoRV(猪轮状病毒)的攻毒，攻毒剂量为104CID50。在所有对照组出现腹泻后，将所有仔猪屠宰并测试各项指标。
2.1.2.2生长性能指标检测
体重：仔猪以及饲料量每天称重一次，记录体重变化数据，料肉比数据并绘制柱状图。
2.1.2.3粪便评分指标检测
乳酸菌对仔猪菌群的影响可以通过对仔猪粪便形态的评分来确定，并评价益生菌B363对预防仔猪腹泻的效果。
2.1.2.4Vero细胞的复苏及传代
2.1.2.4.1复苏Vero细胞
首先从液氮中取出冻存的细胞，在水浴锅中37℃水浴加热直至解冻，接下来配置完全培养基：50mL离心管中：先加入45mL高糖DMEM不完全培养基再加入5mL血清最后加入500μL双抗，准备好后在15mL离心管中加解冻的细胞和配好的完全培养基各1mL，配平之后，4℃1000×g离心5min，期间加5mL完全培养基至25m2细胞培养瓶，待离心结束，弃掉上清液，另取1mL完全培养基悬起沉淀并加入刚刚的25m2细胞培养瓶中。复苏后将细胞培养瓶放置在37℃CO2细胞培养箱中培养。
2.1.2.4.2Vero细胞传代
首先，用移液枪吸出上一步培养的细胞；然后，加入2-3mL的PBS缓冲液，轻轻摇动培养瓶以清洗细胞；洗完后，用吸管吸出并丢弃PBS并重复这个过程一次；接下来，加入约1mL的胰蛋白酶，轻轻摇动培养瓶以渗透所有细胞。消化时间根据细胞特性而不同；在显微镜下可以看到细胞块中间的细胞，当细胞明显分离并呈圆形且若将培养瓶侧放，肉眼可以看到细胞贴壁流下则可以停止消化；加入1mL含血清的培养基停止消化。吹打细胞使之脱落并在液体里反复吹打使细胞，以获得均匀的细胞悬液，在此阶段可在显微镜下观察。尽可能多地收集悬浮液。收集细胞悬液，在4℃下1000×g离心5min。离心后，吸出并丢弃上清液。加入5mL新鲜的完全培养基，通过移动细胞数次来混合细胞，根据需要接种新的烧瓶，补足培养基，去掉盖子或用透水的盖子进行培养。
要启动细胞培养过程，必须认真按照上述步骤进行。消化时间根据细胞特性不同而不同，重要的是要在显微镜下看到均匀的细胞悬浮液。离心后，重要的是丢弃上清液并加入新鲜的完全培养基以混合细胞。
2.1.2.5病毒在Vero细胞上的毒力测定
采用TCID50微量法对PoRV进行毒力测定。
先取生长良好的Vero细胞一瓶，将细胞培养液从瓶子中倒出，用PBS清洗一次。然后用胰蛋白酶消化和分散细胞以制备细胞悬液。然后将细胞连接到96孔培养板上，每孔加入100μL的细胞悬液。将培养板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中，直到Vero细胞达到70％的细胞单层，表明其已准备好进行分析，可以进行测试。将病毒以10倍的倍数稀释在细胞维持液中，并加入到96孔板的Vero细胞单层中。每个稀释度设置8个复制孔，对照孔设置8个孔，并加入细胞维持液。将细胞放置在37℃的5％CO2细胞培养箱中培养，每天观察细胞病变情况。记录结果，直到不再发生细胞病变。最后使用Reed-Muench公式计算病毒滴度。
2.1.2.6免疫指标IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6以及SigA检测方法
在攻毒后，从每组仔猪的前腔静脉中分别抽取50mL血液，并转移至50mL离心管中将其离心，离心后用移液枪取上清液即为血清，并将血清保存在-80℃超低温冰箱中。之后用ELISA技术测定血清中IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
取新鲜粪便并称量重量，按粪便重量加入蛋白酶抑制剂并将用移液枪其吹打混匀，置于4℃冰箱，过夜。配平，最大转数离心5min，离心结束后用移液枪取上清液至新EP管中，完成粪清的制备。之后用ELISA技术测定粪清中SIgA的水平。
2.1.2.7利用Q-PCR技术对各肠段PoRV病毒载量进行检测
在这项研究中，测量了受感染仔猪体内病毒浓度的变化，以反映病毒在体内的复制速度、仔猪的感染状况以及植物乳杆菌复合菌对病毒渗透到体内的中和作用。为此，用Q-PCR法测定了仔猪感染后血清和粪便中的病毒含量。
各组织样品的处理与RNA提取：在-80℃下取出各器官的组织样本，用高压灭菌的PBS清洗，并称量约200mg。将这些样品在预冷的研磨机中彻底研磨成均匀的浆液，并将得到的均质液吸到一个无菌无酶的1.5mL EP管中。根据分离病毒RNA的说明，从匀浆中提取病毒RNA。然后测量浓度，并通过反转录获得cDNA。再次测量cDNA浓度，使用Q-PCR试剂盒按说明加样并通过分光光度计进行分析。
2.1.2.5单细胞悬液的制备
脾脏单细胞悬液制备：方法是将一部分脾脏组织细碎并通过200目过滤网。将得到的细胞悬液转移到一个15mL的离心管中，在4℃下以1650rpm离心5min。仔细丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在1mL的红细胞裂解液中。然后将细胞在冰上裂解10min，5min后进行提取，摇晃30秒。接下来，加入10mLPBS缓冲液，在4℃下以1650rpm离心5min，直到裂解完成。终止裂解，并丢弃上清液。将细胞重新悬浮在1mL的FACS缓冲液中并进行计数。
肠系膜淋巴结单细胞悬液制备：将所有的淋巴结轻轻压碎以获得单个细胞悬液，通过200目过滤网进入15mL离心管。然后在4℃下以1650rpm离心5min，丢弃上清液。将细胞重新悬浮在0.2mL的FACS缓冲液中重新悬起并进行细胞计数。
2.1.2.6流式细胞术检测
首先将上一步所述的单细胞悬液分配到试管中，保证每管1×106个细胞(外周血保证5×105)，总体积为100μL，根据滴度和抗体要求，首先将抗体稀释，然后加入适当体积的细胞表面标记物的流式抗体。然后轻轻振荡混合，在4℃下避光保存30min。当标记完成后，向试管中加入3.5mL预冷的FACS缓冲液，在4℃和1650rpm下离心5min，丢弃上清液，将细胞重新悬浮在小体积的FACS缓冲液中。这个步骤进行两次。最后一次完全洗脱，去除未结合的抗体，减少细胞表面的非特异性染色。
2.1.2.7H&E染色检测肠道病理变化
为了进一步观察仔猪肠段的病理变化，获取每组仔猪小肠段，每组肠段取相同部位，放置于4％多聚甲醛液中固定，固定时间在七天以上，再将固定后的组织切整齐，进行包埋、切片、H&E染色，步骤如下：
(1)脱水：样品先后在70％的乙醇、80％的乙醇和85％的乙醇中干燥2h，在90％的乙醇中过夜，过夜后在95％的乙醇I和95％的乙醇II中各干燥1h，在100％的乙醇I和100％的乙醇II中各干燥1h。
(2)透明：将样本先浸泡在二甲苯I中6min再浸泡在二甲苯II中7min，直至肉眼能看到发红的肉皮样即透明结束。
(3)浸蜡：将组织块按顺序依次放置在蜡I、蜡II、蜡Ⅲ，在56℃条件下分别浸蜡1h后将组织块置于包埋盒中进行包埋。
(4)切片，将每个包埋块切出厚度3.0μm的组织片，在42℃水浴中展片在洁净的载玻片上。将载玻片置于80℃的干燥箱中烤玻片1h后，进行H&E染色。
(5)H&E染色程序如下：将样品依次放在二甲苯I和二甲苯II中8min，然后在100％乙醇I、100％乙醇II、95％乙醇、80％乙醇和70％乙醇中1min，并放在超纯水中冲洗掉超过乙醇的部分。然后用苏木素染色，超纯水冲洗，之后用0.5％的盐酸分化5s，然后用水冲洗，用轻氨水清洗2min，然后用水冲洗，放至0.5％的伊红水溶液染色5min，再用水冲洗，在80％的乙醇浴中冲洗，观察伊红染色情况，将样品按顺序依次在95％、100％I、100％II的乙醇中反复提取5次，然后按顺序依次在二甲苯I和二甲苯II中1-2min，用中性树胶封片。
2.1.3数据统计学分析
使用统计学软件Graph Prism 8.0对结果进行汇总和分析，并以MED±SD表示，使用单因素方差分析确定组间差异(*为P<0.05，**为P<0.01，**为P<0.001)。
2.2结果
2.2.1粪便评分指标检测结果
试验结果表明，所有组别的仔猪在攻毒后都有少量的腹泻现象。然而，用乳酸菌喂养的仔猪表现出从粘稠和不成形的粪便逐渐改善为湿润和成形的粪便，并一直保持这种状态。结果见图14。
2.2.2免疫指标IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、SIgA检测结果
2.2.2.1免疫指标IFN-γ检测结果
众所周知，IFN-γ是一种重要的抗病毒因子，PoRV能够被肠道上皮细胞中的模式识别受体(PRRs)感知，从而激活下游的信号分子活化最终激活干扰素对抗病毒。因此用酶联免疫吸附法(ELISA)检测从仔猪采集的血清中细胞因子的分泌情况，包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6。结果显示，在PoRV感染后的第三天，B363组和对照组的IFN-γ水平有明显差异(P<0.05)，表明与对照组相比，用益生菌B363喂养的仔猪血清中的IFN-γ水平明显增加。这些结果表明，益生菌通过诱导IFN-γ的分泌较为明显地提高了仔猪的抗病毒能力。结果如图15所示。
2.2.2.2免疫指标TNF-α的检测结果
病毒没有得到有效控制在中晚期大量的炎性因子聚集导致剧烈炎症反应。结果显示在攻毒三天后，饲喂益生菌B363的仔猪血液中TNF-α的含量与对照组差异较为显著(P<0.05)，表示益生菌B363能有效缓解炎症。结果如图15所示。
2.2.2.3免疫指标IL-1β的检测结果
IL-1β同样是重要的炎性枢纽，在桥接NF-κB与炎性小体之间的转化发挥重要的功能。在感染病毒初期IL-1β的分泌能够有效的破坏病毒入侵。结果表明攻毒后三天，相比于PBS组，饲喂益生菌B363组的仔猪血液中IL-1β水平均较对照组差异显著(P<0.01)。表明宿主可能通过协同炎症小体拮抗PoRV感染。结果如图16所示
2.2.2.3免疫指标IL-6的检测结果
IL-6是身体细胞因子网络的一个重要组成部分，与自身免疫性疾病和某些癌症的发展和消退密切相关，也与身体的炎症反应和对感染的防御机制密切相关。结果表明攻毒后三天，相比于PBS组，饲喂益生菌B363组的仔猪血液中IL-6水平均较对照组差异较为显著(P<0.05)。结果如图16所示。
2.2.2.4免疫指标SIgA的检测结果
SIgA抗体是粘膜证据的抗原特异性免疫的第一道防线，它们能够防止病原体与粘膜表面结合，从而防止细菌和病毒进入肠道。结果表明攻毒后三天，相比于PBS组，饲喂益生菌B363组的仔猪粪便中SIgA较对照组差异显著(P<0.01)。结果如图17所示。
2.2.3各器官组织病毒定量结果
动物器官和组织的病毒载量是体现病毒入侵宿主机体能力和于宿主体内复制能力的一个重要指标。在靶细胞中复制释放后，PoRV通过血液传播到整个宿主的身体，影响到各种器官和组织。为了确定感染的程度，从被屠宰的猪身上解剖获得的每个的器官样本中提取病毒，并进行荧光定量PCR分析。在本实验中，从十二指肠、空肠、回肠和盲肠样本中提取病毒核酸并进行定量分析。
2.2.3.1十二指肠病毒定量结果
对十二指肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的十二指肠样本的病毒载量差异极为显著(P<0.001)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的小肠中的病毒载量，结果见图18。
2.2.3.2空肠病毒定量结果
对空肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的空肠样本的病毒载量差异极为显著(P<0.001)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的小肠中的病毒载量。结果见图19。
2.2.3.3回肠病毒定量结果
对回肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS攻毒组和益生菌B363组的回肠样本的病毒载量差异极为显著(P<0.001)，PBS健康组和益生菌B363组的回肠样本的病毒载量差异显著(P<0.01)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的小肠中的病毒载量。结果见图20。
2.2.3.4盲肠病毒定量结果
对盲肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的盲肠样本的病毒载量差异极为显著(P<0.001)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的大肠中的病毒载量。结果见图21。
2.2.3.5结肠病毒定量结果
对结肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的结肠样本的病毒载量无明显差异(P>0.05)。推测该益生菌可能不作用于结肠。结果见图22。
2.2.3.6直肠病毒定量结果
对直肠样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的直肠样本的病毒载量差异显著(P<0.01)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的大肠中的病毒载量。结果见图23。
2.2.3.7肠系膜淋巴结(MLN)病毒定量结果
对肠系膜淋巴结样本进行了病毒核酸提取和定量分析，发现PBS组和益生菌B363组的肠系膜淋巴结样本的病毒载量差异极为显著(P<0.001)。这些发现表明，益生菌B363有能力降低感染猪的肠道中的病毒载量。结果见图24。
2.2.4流式细胞术检测T淋巴细胞变化
2.2.4.1益生菌B363对T淋巴细胞的影响
PoRV感染在感染后期会触发自然免疫系统和细胞介导的抗病毒免疫力的激活。为了评估实验动物免疫力的变化，用流式细胞仪调查了脾脏中活化T细胞的比例，如图25所示。实验结果显示，益生菌B363提高了PoRV感染后脾脏中CD8+IFN-γ+T细胞的比例。益生菌B363组与对照组差异极显著(P<0.01)。综上，益生菌B363可以通过增加脾脏中CD8+IFN-γ+T细胞的比例，增强机体对PoRV感染的免疫反应。
2.2.4.2益生菌B363对B淋巴细胞的影响
B细胞是免疫系统的一个重要组成部分，特别是在肠道，它们在体液免疫和粘膜免疫中发挥着重要作用。它们产生IgA的能力对于控制病原体和塑造免疫环境至关重要。在本发明的研究中，调查了肠道固有层中的B细胞激活水平。如图26所示，研究结果表明，在PoRV感染后，益生菌B363组与对照组差异极显著(P<0.001)。综上，益生菌B363可以通过增加肠道中B细胞的比例，增强机体对PoRV感染的免疫反应。
2.2.5H&E染色
仔猪宰杀后，各组猪取盲肠和小肠中段相同部位肠段，制作石蜡切片，H&E染色后观察病理变化。
2.2.5.1小肠组织病理切片
如图27所示，PBS组十二指肠病理变化严重，可见部分肠道绒毛断裂，肠道绒毛上皮细胞脱落，肠腔中可见脱落的组织和细胞碎片，红色箭头可见少量炎性细胞；B363组十二指肠均未见明显病理组织学变化，红色箭头处肠绒毛完整。PBS攻毒组十二指肠红色箭头可见肠道绒毛脱落严重，肠腔中混有脱落的碎片；蓝色箭头为内含炎性细胞且肠腺变形，分离。结果表明，PBS健康组十二指肠绒毛结构完整；PBS攻毒组的十二指肠绒毛萎缩散落，断裂，分布稀疏，肠道结构被破坏；与PBS攻毒组相比，益生菌B363组肠绒毛轻度萎缩，轮廓清晰，分布较密，结构完整。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1. 一株粪肠球菌，其名称为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）B363，所述菌株已于2023年06月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20231093。
2.一种产品，其包括权利要求1所述的粪肠球菌。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品中还包含至少一种辅料。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于，所述产品为药品或饲料添加剂。
5.权利要求1所述的粪肠球菌在制备预防和改善猪轮状病毒性腹泻的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为药品或饲料添加剂。
CN202311630219.5A 2023-11-30 2023-11-30 一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用 Active CN117625480B (zh)

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