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CN117618671A - 胶原蛋白填充剂、制备方法及其应用 - Google Patents

胶原蛋白填充剂、制备方法及其应用 Download PDF

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CN117618671A CN202311711140.5A CN202311711140A CN117618671A CN 117618671 A CN117618671 A CN 117618671A CN 202311711140 A CN202311711140 A CN 202311711140A CN 117618671 A CN117618671 A CN 117618671A
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Abstract

本发明涉及可控孔隙结构的胶原蛋白填充剂，其中所述胶原蛋白填充剂具有平均孔径D50为50μm至500μm，孔隙率为80％‑99.5％，交联度为10％至70％，和体外酶解损失率小于40％，本发明还涉及胶原蛋白填充剂的制备方法、以及本发明胶原蛋白填充剂的用途。

Description

胶原蛋白填充剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料领域，具体地，涉及具有可控孔隙结构的胶原蛋白填充剂及其应用。本发明还涉及本发明可控孔隙结构的胶原蛋白的制备方法、本发明可控孔隙结构的胶原蛋白的用途。
背景技术
胶原蛋白是一类天然蛋白质，作为皮肤组织的主要成分，是纠正和修复软组织缺陷较为理想的材料。胶原蛋白以纤维的形式存在，是结缔组织普遍存在的成分，约占人体内总蛋白的30％，是器官和组织必不可少的基质骨架。胶原蛋白纤维作为细胞生长的依附和支架物，能诱导成纤维细胞和上皮细胞等的迁移、增殖和分化，并且部分参与了组织和器官的营养运输和新陈代谢。此外，随着胶原蛋白的提取纯化技术日益成熟，其免疫原性等风险也被降至较低水平，甚至可忽略不计。因此，相比于其他填充类材料，胶原蛋白具有其他材料无法比拟的物理性能和生物学性能等方面优势。然而，目前市场上，以胶原蛋白为主要组成的填充剂，通常在植入人体后，表现出的支撑效果不理想、易发生移位，且易在短期内降解而失去组织填充能力，又或因交联过度引发一系列的毒性风险。
针对上述胶原蛋白在填充剂领域存在的技术难题，CN113768815A中公开了一种胶原蛋白植入剂及其制备方法，该方法制备的胶原纯度高达99.82％，表现为更高的活性和安全性，经胶原分子自聚集后形成有形状分明的纤维结构，每条纤维暴露完全并相互交错形成纤维网，纤维粗细均匀，形成了更好的弹性强度。然后由于该植入剂并没有进行交联以增加维持时间，结果显示其在3个月时的降解损失率已达40％左右，尽管相比于其他未交联胶原蛋白植入剂，该产品具有一定的抗酶解性优势，但其降解损失率仍远远高于交联的胶原蛋白植入剂。
CN114288469A中公开了一种双重交联胶原蛋白的填充剂的组成和制备方法，其通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联胶原纤维，数据显示熔点在双重交联后比单级交联有所提高，但是，66.6℃的熔点在交联胶原蛋白植入剂中仍然处于中等水平。此外，该植入剂匀化工艺为冷冻球磨，在提高匀化效率的同时可能会一定程度上破坏胶原纤维搭接的网络结构，从而影响填充剂在植入组织后的支撑效果和组织代谢效率。
CN102924731B中公开了一种三重交联的胶原蛋白及制造方法和用途，对胶原蛋白悬液进行了三次逐级交联，每级使用不同类型的交联剂，突出交联后的产品具有高交联度、高熔点和低酶解率，使得产品在填充修复过程中维持的时间更久。然而，三重交联也给产品带来更多的交联剂残留的风险，且一种产品中使用多重交联剂给临床患者带来了更多致敏致畸或潜在毒性等风险。而且，其在交联后的清洗工艺中，仅用大于10倍体积的PBS清洗三次，即该产品在清洗工艺中，仅将交联剂浓度降至其原来总量的千分之一，这增加了因清洗不彻底产生较多交联剂残留的风险，从而引发其在产品应用中的毒性风险。
鉴于以上原因，亟需一种具备良好的支撑塑形能力、维持时间更长，且具有优异的生物相容性与安全性协同作用的组织填充剂，如皮肤组织填充剂。本发明的胶原蛋白填充剂，具有孔隙结构可控、机械性能良好，且维持时间更符合预期填充效果的胶原蛋白填充剂，本发明还涉及其制备方法，可为目前的胶原类填充剂产品提供性能更优且更安全的产品。
发明内容
本发明所公开的胶原蛋白填充剂克服了已知植入剂的缺点。本发明的其中一个目的是提供一种具有可控的孔隙结构，且支撑塑形效果良好、具有更高的动力粘度、维持时间符合预期用途的胶原蛋白填充剂。
本发明所公开的胶原蛋白填充剂具有的孔径较大，孔隙率较高、交联度较低、依然具有较好的抗酶解性，能够在体外和体内降解试验中维持较长时间，能维持较长的填充时间。由于产品的结构，不仅有利于细胞的长入、增殖和分化，而且也为组织中营养物质的运输和代谢提供更多便利，以协同促进胶原纤维再生；在产品的安全有效性方面，温和的交联工艺使产品保持较低的交联度和较高的生物活性，特别地，其充分彻底的交联效率也提高了胶原蛋白的抗酶解性，延长了产品的维持时间，从而在安全性和有效性方面达到了协同作用的效果。
根据本发明一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的平均孔径Ds0为50μm至500μm，优选80μm至400μm，甚至90μm至300μm，尤其地100μm至250μm，特别地120μm至200μm。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的孔隙率为80％-99.5％，甚至85％-98％，特别地90％-97％。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂在剪切速率为2Hz、温度为25±1℃条件下，动力粘度为90000mpa.s至300000mpa.s，优选95000mPa.s至280000mpa.s，甚至98000mpa.s至270000mpa.s，尤其地100000mPa.s至260000mPa.s，特别地120000mpa.s至250000mPa.s。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的熔点为55℃至85℃，优选58℃至80℃，甚至60℃至78℃，尤其地62℃至75℃，特别地大于65℃，或低于72℃。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的交联度为10％至70％，优选12％至65％，甚至15％至60％，尤其地18％至55％，特别地20％至50％。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂在一定酶解条件下，降解损失率小于40％，优选小于35％，甚至小于30％，尤其地小于25％，特别地小于20％。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的熔点为55℃至85℃，优选58℃至80℃，甚至60℃至78℃，尤其地62℃至75℃，特别地大于65℃，或低于73℃。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂包括不同孔径的组合，优选一种或多种孔径50μm至120μm与一种或多种孔径120μm至500μm的组合，甚至一种或多种孔径50μm至100μm与一种或多种孔径120μm至450μm的组合，特别一种或多种孔径50μm至90μm与一种或多种孔径130μm至420μm的组合，或者一种或多种孔径50μm至80μm与一种或多种孔径140μm至400μm的组合。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂具有平均孔径D50为50μm至500μm，孔隙率为80％-99.5％，交联度为10％至70％，和体外酶解损失率小于40％。
本发明胶原蛋白填充剂采用动态模板法进行制备，一方面通过控制以微球为模板的孔径尺寸，来控制胶原蛋白纤维束在交联过程中的相对间距，进而控制胶原蛋白纤维束形成交联骨架后的孔洞大小；另一方面，通过控制机械搅拌和微球添加方式，实现动态单模版(或多模版)的交联工艺，使每条胶原蛋白纤维束都能获得同等的交联机会，从而实现胶原蛋白植入剂更彻底、更均匀的交联效果。
根据本发明另一实施方案，本发明制备胶原蛋白填充剂的方法，在模板制孔的过程中，通过控制不同孔径的微球的加入先后次序，来调控胶原蛋白填充剂内部的分级多孔结构。如，在交联工艺开始时，首先加入大孔径的微球进行一段时间的交联反应，然后将大孔径的微球分离出，再加入较小孔径的微球作为制孔模板继续参与交联反应，根据产品所需孔径重复上述步骤，由此制备出大孔套一个或多个小孔(或含小孔)的纤维网状分级多孔结构。一般地，50～400μm的孔径是有利于细胞迁移和组织长入。其中，交联的网状纤维构成的孔壁具体更高的机械性能，利于细胞粘附；贯通的大孔套小孔(或含小孔)和网状纤维交织的微孔结构赋予胶原蛋白填充剂更高的孔隙率，利于营养物质的运输和细胞代谢产物的排出，从而为组织再生提供更多便利的空间拓扑结构。本发明制备的胶原蛋白填充剂可通过调节制孔模板的尺寸、数量、分步加入次序时间来构建与组织缺损相适宜的孔结构，从而构建与组织修复、再生更匹配的组织填充剂，便于适用不同的使用情况。
根据本发明方法制备的本发明胶原蛋白填充剂可具有多级孔径，例如孔径为50μm至500μm范围内的较大孔径与较小孔径的两种或更多种组合的多级孔径，例如，较小孔径为50μm至120μm与较大孔径120μm至400μm的两种或更多种组合的多级孔径。具有多级孔径的发明胶原蛋白填充剂使得其在力学上也表现出优异的性能，表现为较高的动力黏度，这可能得益于其孔与孔之间是通过交联的胶原网状纤维连接，使得其在剪切力的作用下仍然保持较高的粘性，这大大降低了产品植入组织后的移位风险，更适用于对中重度重力性皱纹的填充与修复。
根据本发明另一实施方案，本发明胶原蛋白填充剂的制备方法包括下述步骤：
(1)提供胶原蛋白，并溶解胶原蛋白，任选地然后过滤除菌；
(2)加入缓冲溶液，调节pH至6-8,搅拌，形成胶原悬液；
(3)加入微球，搅拌至均匀；
(4)加入交联剂，将温度调至10-40℃，恒温条件下进行交联反应；
(5)去除悬液中的微球。
根据本发明另一实施方案，在步骤(1)中，溶解后的胶原蛋白溶液的浓度为0.5-15mg/mL，优先地0.8-12mg/mL，甚至1-10mg/mL，尤其1.5-8mg/mL，特别地2-6mg/mL。
根据本发明另一实施方案，在步骤(1)中，将胶原蛋白溶解于0.001-0.1mol/L的酸溶液，例如无机酸或有机酸，特别地选自盐酸、磷酸、乙酸、柠檬酸，或其混合物。
根据本发明另一实施方案，在步骤(1)中，溶解胶原蛋白在搅拌情况下进行，例如搅拌1h至5天，甚至6h至4天，尤其12h至3天，特别地24h至2天。
根据本发明另另一实施方案，在步骤(1)中，溶解胶原蛋白的温度为0℃至25℃，甚至1℃至20℃，尤其2℃至10℃，特别地4℃至8℃。
根据本发明另一实施方案，在步骤(2)中，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，如磷酸盐/氢磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液、磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
根据本发明另一实施方案，在步骤(2)中，处理温度为20℃至37℃，甚至25℃至35℃，尤其27℃至34℃，特别地30℃至33℃。
根据本发明另一实施方案，在步骤(2)中，缓冲溶液的浓度为0.05-0.5mol/L，优选浓度为0.06-0.3mol/L，尤其0.08-0.25mol/L，特别地0.09-0.2mol/L。
根据本发明另一实施方案，在步骤(2)中，胶原蛋白溶液与缓冲溶液的体积比20∶1至5∶1，甚至15∶1至6∶1，尤其12∶1至7∶1，特别地10∶1至8∶1。
根据本发明另一实施方案，在步骤(2)中，调节pH至6.0至8.0，甚至6.5至7.5，尤其6.8至7.3，特别地6.9至7.2。
根据本发明另一实施方案，所述微球的材质为生物医用惰性材料，优选地所述微球是惰性微球，选自惰性生物陶瓷类微球、医用金属类及合金类微球、惰性高分子类材料微球，如氧化铝陶瓷微球、钛合金微球、聚四氟乙烯微球、氧化铝陶瓷微球、钛硅微球、ArteFill(聚甲基丙烯酸甲酯微球，PMMA)、Radiance(羟基磷灰石微球，CaHA)、Sculptra(聚左旋乳酸微球，PLLA)、ELLANSE(聚己内酯微球，PCL)等。
根据本发明另一实施方案，微球平均粒径为50μm至500μm，优选80μm至400μm，甚至90μm至300μm，尤其地100μm至250μm，特别地120μm至200μm。可选地，可根据需求，实施步骤(3)至步骤(5)重复多次，特别重复2-5次，甚至重复2或3次，其中微球的平均粒径不同，其中微球的粒径不同，优选一种或多种粒径50μm至120μm与一种或多种粒径120μm至500μm的组合，甚至一种或多种粒径50μm至100μm与一种或多种粒径120μm至450μm的组合，特别一种或多种粒径50μm至90μm与一种或多种粒径130μm至420μm的组合，或者一种或多种粒径50μm至80μm与一种或多种粒径140μm至400μm的组合。可选地，可根据填充需求，将一种相同或多种不同直径的微球加入胶原悬液中，通过控制微球直径的大小，进而控制胶原蛋白植入剂的孔隙形成效果，最终满足不同面部凹陷的填充需求。
根据本发明另一实施方案，相对于胶原悬液总体积，微球的堆积体积为0.1％至10％，优选0.2％至8％，甚至0.3％至6％，尤其地0.4％至5％，特别0.5％至4％，或者1-3％。微球的堆积体积值大小直接决定了胶原蛋白在交联过程中的孔隙结构的多少。即当微球在胶原悬液的堆积体积占比较大时，表明在微球直径相同的情况下，较大的微球添加量使胶原悬液内充满更多的微球，这使交联骨架中出现更多孔隙，从而形成更大的交联网络。
根据本发明另一实施方案，在步骤(3)中，处理温度为20℃至37℃，甚至25℃至35℃，尤其27℃至34℃，特别地30℃至33℃。
根据本发明另一实施方案，在步骤(4)中，交联剂为环氧化物类交联剂中的任意一种或多种，如选自山梨醇、丙三醇、1，4丁二醇二缩水甘油醚。
根据本发明另一实施方案，在步骤(4)中，交联剂浓度为0.005％-3.0％，甚至0.01％-2.0％，尤其0.015％-1.5％，特别地0.02％-1.0％，或者0.025％-0.5％。
根据本发明另一实施方案，在步骤(4)中，调节pH为8至12，甚8.5至11.5，尤其9.0至11.0，特别地9.5至10.5。
根据本发明另一实施方案，在步骤(4)中，反应温度为20-40℃，甚至25℃至37℃，尤其28℃至36℃，特别地30℃至35℃。
根据本发明另一实施方案，在步骤(4)中，反应时间为6h至8天，甚至12h至6天，尤其36h至5天，特别地2天至4天。
根据本发明另一实施方案，在步骤(5)中，过筛去除微球，例如其具体操作可以为在反应罐体出口设置筛网，边搅拌边过筛，防止微球堵塞筛网，筛网孔径依据具体微球尺寸调整。
根据本发明另一实施方案，在纯化步骤中，以＞5000rpm转速离心收集产物，然后用5-50体积的磷酸盐缓冲液反复清洗5次以上(含5次)，以去除交联剂，其中例如磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.3mol/L，优选浓度为0.08-0.20mol/L，尤其0.09-0.15mol/L，特别地0.10-0.12mol/L。
根据本发明另一实施方案，在纯化步骤中，每次添加磷酸盐缓冲液的量为离心沉淀的6-10倍，清洗大于或等于5次，以去除交联胶原蛋白悬液中的交联剂。
根据本发明另一实施方案，本发明方法还包括匀化步骤，将产物倒入匀化机中，匀化至均匀，例如循环匀化大于或等于2次，甚至大于或等于3次。
根据本发明另一实施方案，本发明所述胶原蛋白填充剂的制备方法还包括灌装步骤，将匀化后的样品灌装于注射器中，经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
根据本发明另一实施方案，本发明所述胶原蛋白填充剂的制备方法依次按照以下步骤进行：
(1)将组织提取的胶原蛋白溶解于0.001mol/L至0.1mol/L的酸溶液，然后过滤除菌；
(2)加入磷酸盐缓冲溶液，调节pH至6-8，在一定温度下搅拌至胶原蛋白析出，形成白色混悬液；
(3)加入0.1％-10％(v/v)微球，继续在一定温度下搅拌至均匀；
(4)加入交联剂，将温度调至20-40℃，恒温条件下反应3-10天；
(5)将悬液边搅拌边过筛，其中筛网孔径依据微球尺寸进行调换(筛网孔径<微球直径)，以去除悬液中的全部微球；
(6)离心收集产物，用磷酸盐缓冲液反复清洗，以去除交联剂；
(7)匀化：将产物倒入匀化机中，匀化至均匀；
(8)任选地，灌装：将匀化后的样品灌装于注射器中，经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
根据本发明另一实施方案，步骤(2)和步骤(3)的温度为20-40℃，
例如25-37℃。
本发明所述的胶原蛋白为动物如动物组织中提取，可用于注射至真皮中层至深层，以填充由软组织缺损引起的皮肤缺陷。
根据本发明另一实施方案，制备本发明胶原蛋白填充剂的胶原蛋白为动物组织提取的胶原蛋白，包含牛源、马源、羊源、猪源、鱼源去端肽胶原蛋白I型、II型或III型、富含胶原蛋白的脱细胞人类皮肤组织、脱细胞猪皮组织或牛皮组织中的一种或多种；更优选为猪源去端肽胶原蛋白I型或III型。
根据本发明另一实施方案，制备本发明胶原蛋白填充剂的胶原蛋白是经化学交联法处理得到的改性胶原蛋白，其体外酶解试验，如在37℃，1mg/ml的胶原酶浓度下，酶解一定时间后，酶解程度不大于40％。
根据本发明另一实施方案，制备本发明胶原蛋白填充剂的胶原蛋白是经化学交联法处理得到的改性胶原蛋白，交联工艺结束后会对其进行清洗，以去除未参与反应的交联剂，确保胶原蛋白填充剂的安全性。本发明制备的胶原蛋白填充剂的交联剂残留量通过气相色谱法检测，结果未检出。且远低于其他面部填充剂对于该指标的控制量(≤2.0μg/g)。
为了实现本发明目的，本发明采用了动态模板法制备胶原蛋白填充剂，一方面通过控制以微球为模板的孔径尺寸，来控制胶原蛋白纤维束在交联过程中的相对间距，进而控制胶原蛋白纤维束形成交联骨架后的孔洞大小；另一方面，通过控制一定的搅拌转速，实现动态下每条胶原蛋白纤维束都能获得同等的交联机会，从而实现胶原蛋白植入剂更彻底、更均匀的交联效果。
本发明提供的胶原蛋白填充剂具有大孔纤维网状结构，由于更充分的交联反应，使纤维构成的“骨架”具有更高的动力黏度，表现出更强韧的机械性能。
本发明胶原蛋白填充剂通过采用动态模板法获得孔径可控的纤维网状结构，再通过降低交联剂浓度、延长交联时间，获得交联反应更充分的胶原纤维，进而提高了填充剂的抗酶解性。鉴于获得孔径可控的纤维网状结构，一方面，不同直径的微球模板可制备具有不同孔径的植入剂样品，不同孔径的植入剂可适配不同凹陷程度的皮肤填充；另一方面，反应充分的交联位点也获得了更久的维持时间，有利于产品在植入后获得更持久稳定的填充效果。
此外，本发明提供的胶原蛋白填充剂，由于在交联胶原纤维的过程中采用了模板法搭建胶原纤维网络，因此植入剂保留了更多的纤维网状结构，保障了植入体内后营养物质和代谢产物的运输，并诱导细胞向植入剂内部迁移、增殖和分化，从而使局部成纤维细胞增生，合成并分泌更多的I型胶原蛋白纤维。
本发明提供的胶原蛋白填充剂保留了部分胶原完整的三螺旋结构，从而保留了胶原蛋白的活性成分，大大降低了交联反应潜在的致敏、致毒风险。
本发明还涉及胶原蛋白组合物，包含本发明所述胶原蛋白填充剂，任选地包含添加剂，如助悬剂、抗氧化剂、治疗活性剂如药物活性剂；包含营养剂，蛋白类的如重组胶原蛋白、多肽、各类氨基酸，多糖类的如透明质酸钠、壳聚糖；或其组合。
本发明还涉及本发明所述胶原蛋白填充剂在制备医疗整形美容例如细纹的治疗、面部雕塑、矫正、外科手术或外科治疗填充剂的产品中的应用。
本发明还涉及医疗整形美容例如细纹的治疗、面部雕塑、矫正、外科手术或外科治疗的方法，其包括使用如本发明所述胶原蛋白填充剂的步骤。
附图说明
图1示出了本申请实施例1胶原蛋白填充剂的冻干品扫描电镜图，本发明胶原蛋白填充剂具有分级多孔结构。
图2示出了本申请对比例1胶原蛋白填充剂的冻干品扫描电镜图。
图3示出了本申请实施例4胶原蛋白填充剂的交联剂残留量气相色谱图(未检出)。
图4示出了本申请实施例6胶原蛋白填充剂的冻干品扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚、下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部实施方式。因此，以下提供的本发明的实施方式的详细描述并非限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1-6和对比例1-3：制备胶原蛋白填充剂
实施例1：
本发明实施例1实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为采购的I型胶原蛋白(广东胜驰，GVB-atelo-03)，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，4℃下搅拌48h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜对胶原蛋白溶液过滤，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
(2)胶原蛋白纤维析出：加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至6，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3)模板制孔：分别加入直径为50μm、100μm的氧化铝陶瓷微球，其堆积体积占比分别为0.5％和1％，继续在25℃下搅拌至均匀。
(4)交联：加入含有4g山梨醇的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至11，将温度调至30℃，搅拌反应3天。
(5)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为320目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以5000rpm的转速，离心收集产物，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入匀化机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例2：
本发明实施例2实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为采购的I型胶原蛋白，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，10℃下搅拌30h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜过滤胶原蛋白溶液，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
(2)胶原蛋白纤维析出：向加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至6，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3)模板制孔：加入直径为100μm的氧化铝陶瓷微球，其堆积体积占比为1％，继续在25℃下搅拌至均匀。
(4)交联：加入含有6g山梨醇的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至11，将温度调至35℃，搅拌反应6天。
(5)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为160目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以5000rpm的转速，离心收集产物，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入匀化机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例3：
本发明实施例3实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为本公司采购的I型胶原蛋白，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，10℃下搅拌30h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜过滤胶原蛋白溶液，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
(2)胶原蛋白析出：向步骤(2)得到的无菌胶原蛋白滤液中加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至7，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3)模板制孔：加入直径为100μm的聚四氟乙烯微球，其堆积体积占比为2％，继续在25℃下搅拌至均匀。
(4)交联：加入含有6g山梨醇的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至11，将温度调至35℃，搅拌反应6天。
(5)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为160目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以6000rpm的转速，离心收集产物，使用8倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作6次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入均质机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例4：
本发明实施例4实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为本公司采购的I型胶原蛋白，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液4000mL，10℃下搅拌18h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.2Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜过滤胶原蛋白溶液，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
(2)胶原蛋白析出：向步骤(2)得到的无菌胶原蛋白滤液中，加入0.1mol/L碱性(0.1mol/LNaOH)磷酸盐缓冲溶液，调节pH至7，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3)模板制孔：加入直径为200μm的聚四氟乙烯微球，其堆积体积占比为2％，继续在,25℃下搅拌至均匀。
(4)交联：加入含有6g 1，4丁二醇缩水甘油醚(纯度≥95％)的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至9，将温度调至30℃，搅拌反应3天。
(5)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为90目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以10000rpm的转速，离心收集产物，使用8倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作6次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入均质机中，循环匀化3次至均匀。
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例5：
本发明实施例5实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为本公司采购的I型胶原蛋白，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液3000mL，10℃下搅拌16h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜过滤胶原蛋白溶液，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
(2)胶原蛋白析出：向步骤(2)得到的无菌胶原蛋白滤液中加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至8，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3)模板制孔：加入直径为200μm的聚四氟乙烯微球，其堆积体积占比为1％，继续在常温下搅拌至均匀。
(4)交联：加入含有6g 1，4丁二醇缩水甘油醚(纯度≥95％)的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至9，将温度调至30℃，搅拌反应3天。
(5)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为90目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以10000rpm的转速，离心收集产物，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入均质机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例6：
本发明实施例6实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为本公司采购的I型胶原蛋白，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液3000mL，10℃下搅拌16h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜过滤胶原蛋白溶液。
(2)先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液。
胶原蛋白析出：向步骤(2)得到的无菌胶原蛋白滤液中加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至8，室温下搅拌至胶原纤维析出。
(3.1)第一模板制孔：加入直径为200μm的聚四氟乙烯微球，其堆积体积占比为0.5％，继续在常温下搅拌至均匀；
(4.1)交联：加入含有6g 1，4丁二醇缩水甘油醚(纯度≥95％)的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至9，将温度调至35℃，搅拌反应2天。
(5.1)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为90目，以去除悬液中的全部微球；
(3.2)第二模板制孔：加入直径为50μm的聚四氟乙烯微球，其堆积体积占比为0.5％，继续在常温下搅拌至均匀；
(4.2)交联：将交联温度调至35℃，搅拌反应2天。
(5.2)过筛：将悬液边搅拌边过筛，其中筛网目数为320目，以去除悬液中的全部微球；
(6)纯化：以10000rpm的转速，离心收集产物，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入均质机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
对比例1：步骤如实施例1，区别仅在于采用三重交联法且不使用模板微球的方法制备，实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为采购的I型胶原蛋白(广东胜驰，GVB-atelo-03)，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，4℃下搅拌48h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜对胶原蛋白溶液过滤，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液，
(2)胶原蛋白纤维析出：加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至6，室温下搅拌至胶原纤维析出，
(3)第一次交联：加入含有0.3g戊二醛的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至7，将温度调至30℃，搅拌反应16h，
(4)离心收集沉淀，即得第一次交联后的交联胶原纤维，并分散于磷酸盐缓冲溶液中，
(5)第二次交联：在获得的交联胶原纤维中加入含有5g 1，4丁二醇二缩水甘油醚的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至11，将温度调至40℃，搅拌反应16h，
(6)离心收集沉淀，即得第二次交联后的交联胶原纤维，并分散于磷酸盐缓冲溶液中，
(7)第三次交联：在获得的交联胶原纤维中加入含有5g碳化二亚胺的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至5，将温度调至35℃，搅拌反应16h，
(8)离心收集沉淀，即得第三次交联后的交联胶原纤维，
(9)纯化：以5000rpm的转速，离心收集产物，即得第三次交联后的交联胶原纤维，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(10)匀化：将纯化收集的产物倒入匀化机中，循环匀化3次至均匀；
(11)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
根据图1本发明胶原蛋白填充剂经冻干处理去除水分后，呈现出50-300μm的分级多孔结构，孔壁为交联胶原纤维形成的纤维网状孔壁。
实施例1中的胶原蛋白填充剂与对比例1中的胶原蛋白填充剂(如图2所示)相比，具有更大更丰富的孔径，这种分级多孔结构在材料植入人体后，有利于成纤维细胞的长入和营养物质、代谢产物的输送，以促进胶原纤维网再生和重塑。根据附图3，本发明胶原蛋白填充剂未检出交联剂残留，显示残留量为0，表明本发明涉及的制备工艺对交联剂的去除较彻底，进一步证实了本发明胶原蛋白填充剂具有较高的安全性。
对比例2：步骤如实施例1，区别在于对比例2采用双重交联法且不使用模板微球的方法制备，实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为采购的I型胶原蛋白(广东胜驰，GVB-atelo-03)，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，4℃下搅拌48h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜对胶原蛋白溶液过滤，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液，
(2)胶原蛋白纤维析出：加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至6，室温下搅拌至胶原纤维析出，
(3)第一次交联：加入含有20g葡萄糖的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至7，将温度调至30℃，搅拌反应7天，
(4)离心收集沉淀，即得第一次交联后的交联胶原纤维，并分散于磷酸盐缓冲溶液中，
(5)第二次交联：在获得的交联胶原纤维中加入含有10g碳化二亚胺和2g和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/L NaOH)缓冲溶液，调节pH至5.5，温度调至室温，搅拌反应16h，
(6)纯化：以5000rpm的转速，离心收集产物，即得第二次交联后的交联胶原纤维，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素。
(7)匀化：将纯化收集的产物倒入匀化机中，循环匀化3次至均匀；
(8)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
对比例3：步骤如实施例1，区别在于对比例3采用不使用模板微球的方法制备，实施以下步骤：
(1)胶原蛋白配液溶解：称取胶原蛋白10g，所述胶原蛋白原料为采购的I型胶原蛋白(广东胜驰，GVB-atelo-03)，猪源。加0.01mol/L的盐酸溶液2000mL，4℃下搅拌48h至溶解完全，得到均一的胶原蛋白溶液；
过滤除菌：在0.25Mpa的压力下，使用0.2μm的过滤膜对胶原蛋白溶液过滤，先后过滤两次，以达到除菌目的，得到无菌胶原蛋白滤液，
(2)胶原蛋白纤维析出：加入0.1mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至6，室温下搅拌至胶原纤维析出，
(3)交联：加入含有4g山梨醇的0.01mol/L磷酸盐碱性(0.1mol/LNaOH)缓冲溶液，调节pH至11，将温度调至30℃，搅拌反应3天，
(4)纯化：以5000rpm的转速，离心收集产物，使用10倍体积的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液反复清洗胶原悬液，重复上述操作5次，以去除胶原蛋白中的交联剂残留和细菌内毒素；
(5)匀化：将纯化收集的产物倒入匀化机中，循环匀化3次至均匀；
(6)灌装：将匀化后的样品灌装于1mL注射器中，然后经内包和外包后，得到胶原蛋白填充剂。
实施例7-10：胶原蛋白填充剂的特性结果
实施例7：胶原蛋白填充剂的动力粘度
本实施例对胶原蛋白填充剂的动力黏度进行检测。
检测方法：本实验是按《中华人民共和国药典(二部)》(2020年版)第三法进行，具体测试参数参照《YY 0954-2015无源外科植入物I型胶原蛋白植入剂》进行。检测样品为实施例1-6和对比例1-3。
表1胶原蛋白填充剂的动力黏度检测结果
从上表1动力黏度检测数据，本发明实施例1-6胶原蛋白填充剂的动力黏度显著高于对比例1-3。不希望被理论束缚，其原因可能包含以下两点：其一，动态模板法制得的胶原蛋白填充剂具有更大的孔径，表现为更大的应变范围。其二，经过充分的交联反应后，其交联位点提高了网状纤维整体的稳定性。上述两点的共同作用使本发明中的胶原蛋白填充剂在对抗持续剪切力时，表现出更高的动力黏度，表明其具有更优异的塑性能力。
实施例8：胶原蛋白填充剂的交联度
本实施例对胶原蛋白填充剂的交联度(氨基取代度)进行检测。
检测方法：本实验例是以茚三酮检测蛋白含量进行胶原蛋白填充剂的交联度分析。
<实验组1>
分别称取1.0g实施例1-6中制备的样品，先后加入3mL纯化水和2mL茚三酮反应液，混匀，100℃加热30min，置冰水浴冷却至室温，再加入50％的异丙醇稀释定容至25mL,在570nm处测定吸光度值。
<实验组2>
实验组2的步骤同实验1的步骤，差别仅在于实验组2所使用的样品为未交联样品制得的浓度相同的胶原蛋白植入剂。
<对照组>
对照组步骤同实验组1，差别仅在于以等量的纯化水替代试样。
<标准曲线绘制>
以L-谷氨酸作为标准溶液，绘制标准曲线。具体地，分别吸取10mmol/L L-谷氨酸标准液L-谷氨酸标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25mL的具塞比色管中(对应的L-谷氨酸分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mmol)，再依次加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0mL纯化水，接下来的操作自上述实验组1中“先后加入3mL纯化水”起操作至检测完成。
交联度计算公式：
其中，a为实验组1的吸光度值扣除对照组吸光度值对应的氨基量，b为实验组2的吸光度值扣除对照组吸光度值对应的氨基量。
表2胶原蛋白填充剂的交联度检测结果
交联度
实施例1 20.04％
实施例2 43.76％
实施例3 49.22％
实施例4 24.70％
实施例5 30.26％
实施例6 21.36％
对比例1 75.62％
对比例2 62.30％
对比例3 54.16％
根据上表2交联度检测数据，本发明实施例1-6的方法制得的胶原蛋白填充剂的交联度明显低于对比例，其原因可能是本发明方法制得的胶原纤维的交联反应大多发生在胶原纤维束的表面，其内部还保留有部分天然的胶原纤维，这对胶原蛋白活性的保持至关重要。
实施例9：胶原蛋白填充剂酶解程度
本实施例对胶原蛋白填充剂酶解程度进行检测。
检测方法：本实验例通过检测供试品酶解上清液中的羟脯氨酸的含量，与未经酶解的供试品中羟脯氨酸含量的比值，反应供试品在一定时间的酶解程度。
供试品酶解上清液中羟脯氨酸的含量与未经酶解的供试品中羟脯氨酸含量检测依据YY/T 1151-2017胶原蛋白海绵附录B进行检测。
样品的酶解处理如下：
<实验组1>
分别称取1.0g实施例1-6制备的样品和对比例，加入9mL胶原酶溶液(pH 7.4，内含0.1mmol/L CaCl2的磷酸盐缓冲溶液，胶原酶的浓度为1mg/mL)，混匀，放入37℃水浴孵育2h。离心后取1mL上清进行羟脯氨酸含量检测。
<实验组2>
分别对应称取1.0g实施例1-6制备的样品，依据YY/T 1151-2017胶原蛋白海绵附录B进行检测。
<对照组>
对照组步骤同实验组1，差别仅在于以等量的纯化水替代试样。
交联度计算公式：
其中，A为实验组1的吸光度值扣除对照组吸光度值对应的羟脯氨酸含量，B为实验组2的吸光度值扣除对照组吸光度值对应的羟脯氨酸含量。
表3胶原蛋白填充剂的酶解程度检测结果
酶解程度
实施例1 39.25％
实施例2 18.00％
实施例3 36.10％
实施例4 38.45％
实施例5 32.66％
实施例6 20.67％
对比例1 46.49％
对比例2 48.67％
对比例3 54.18％
根据上表3酶解程度检测数据，本发明实施例1-6的方法制得的胶原蛋白填充剂的酶解程度明显低于对比例测得的结果。其原因主要是本发明中交联反应采用环氧化物，其与胶原蛋白交联反应的速度比戊二醛慢，这给胶原蛋白纤维表面的活性基团提供了更充分的反应条件，使整个胶原蛋白纤维中的交联反应分布均匀且完全。此外，一方面通过调整反应温度、交联剂浓度和反应pH，可提高胶原蛋白交联反应的充分程度，使样品在低交联度下仍保持较低的酶解程度；另一方面通过调节动态模板的直径大小和堆积体积占比，来调节交联网络结构，以获得不同空隙结构的胶原蛋白填充剂，从而使样品具备更多应用场景。
实施例10：胶原蛋白填充剂的平均孔径和孔隙率
在相同的条件，将各供试品注射入相同的圆柱模具中，冷冻干燥。
(1)平均孔径：取供试样中线截面，将其截面水平贴于断面样品台一侧，使用扫描电镜进行观察，统计孔径尺寸，并计算平均值。
(2)孔隙率：采用比重瓶法测定供试品(已干燥处理)，具体地，如下：
在恒温条件下，将精确称量的供试品(Ws)浸入装满乙醇的比重瓶中，该瓶预先称重为W1。施加真空以对供试品进行脱气处理，直到供试品完全被乙醇浸透，然后向比重瓶中重新装满乙醇，并将该系统的总重量记录为W2。然后取出保有乙醇的供试品，将比重瓶的重量和比重瓶中剩余的乙醇的总重量记录为W3。因此，被测供试品的孔隙率(ε)计算如下：
ε＝VP/(Vp+Vs)＝(W2-W3-Ws)/(W1-W3)
其中Vs是供试品的体积(除去内部孔隙)，而Vp是供试品内部的孔体积。
(3)细胞增殖实验：采用CCK-8检测细胞增殖过程中的相对数目。
具体步骤如下：
a)将0.1g供试品注射入48孔板中，取细胞悬液以5×103/孔密度接种rBMSCs于供试品表面，以TCPS组作为对照组，把培养板转入培养箱，待细胞贴附2h后，继续补加500μLα-MEM培养基于每孔，放入培养箱内继续培养；隔天换液，接种细胞的当天记为细胞生长的第0天。
b)CCK-8溶液配制：将CCK-8液体和培养基以体积比1：9配制得到CCK-8溶液；
c)在细胞以接触培养的方式分别培养至第1、3、5、7天后将培养基吸出，将200μLCCK-8溶液加入每孔，放入培养箱孵育2h；
d)将孵育完成的培养板取出，吸取100μL溶液并置于酶标板上，选取450nm的波长进行吸光度的定量检测，记录数值，并计算细胞增殖率。
表4平均孔径、孔隙率和促细胞增长率的结果
根据上表4平均孔径和孔隙率的结果显示，实施例1-6方法制得的样品均显示出较高的平均孔径和较高的孔隙率。实施例6获得了分级多孔结构和更高的孔隙率。在实施例6中，制备的胶原蛋白填充剂通过控制大(200μm)、小(50μm)孔径的微球先后加入，加之温和彻底的交联工艺，最终制备的胶原蛋白填充剂具有较高的动力黏度、孔隙率、适宜的多孔结构，以及较低的交联度和酶解程度，更适用于对中重度重力性皱纹的填充与修复。如表4所示，实施例6本发明的胶原蛋白填充剂更高的促细胞增长率。而且实施例1-6方法制得的胶原蛋白填充剂的细胞存活率明显高于对比例1、对比例2、对比例3和阴性对照例，表明该发明制得的样品无细胞毒性，且其表现出更优的细胞相容性。
实施例11：胶原蛋白体外细胞毒性
本实施例对胶原蛋白填充剂体外细胞毒性进行检测。
检测方法：本实验依据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价：第5部分：体外细胞毒性试验》中的试验方法进行。
表6胶原蛋白填充剂的体外细胞毒性实验检测结果
体外细胞毒性实验结果(细胞存活率)
实施例1 114.49±4.29％
实施例2 110.86±6.57％
实施例3 108.79±4.13％
实施例4 118.36±10.65％
实施例5 111.86±9.78％
实施例6 115.63±4.26％
对比例1 97.31±3.65％
对比例2 96.32±1.49％
对比例3 98.45±3.67％
空白对照例 100％
阳性对照例 7.31±2.46％
阴性对照例 98.61±1.68％
根据上表6体外细胞毒性实验检测结果显示，上述方法制得的样品均显示出较高的细胞存活率。其中，实施例1-6方法制得的胶原蛋白填充剂的细胞存活率明显高于对比例1、2、3和阴性对照例，表明该发明制得的样品无细胞毒性，且其表现出更优的细胞相容性。
综上所述，本发明制得的胶原蛋白填充剂，在结构上具有可模拟天然细胞外基质的纤维多孔支架，且部分保留了胶原蛋白分子最具特性的三螺旋结构。通过充分且完全的交联反应，获得了机械性能显著提高、酶解程度大大降低的胶原蛋白填充剂，这有利于延长填充剂在组织内的作用时间，可减少胶原蛋白填充剂的注射频次，有效降低该类制剂的使用成本。根据本发明方法制备的胶原蛋白填充剂可具有多级孔径，例如孔径为50μm至500μm范围内的较大孔径与较小孔径的两种或更多种组合的多级孔径，例如，较小孔径为50μm至120μm与较大孔径120μm至400μm的两种或更多种组合的多级孔径。具有多级孔径的发明胶原蛋白填充剂使得其在力学上也表现出优异的性能，表现为较高的动力黏度，这可能得益于其孔与孔之间是通过交联的胶原网状纤维连接，使得其在剪切力的作用下仍然保持较高的粘性，这大大降低了产品植入组织后的移位风险，更适用于对中重度重力性皱纹的填充与修复。在生物学性能方面，除了保证无菌和内毒素检验合格以外，其细胞毒性试验结果显示，本发明的胶原蛋白填充剂具有至少110％至120％的促细胞增长率，表明该填充剂具有良好的生物相容性，进一步证实了本发明的胶原蛋白填充剂的生物安全性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.胶原蛋白填充剂，其中所述胶原蛋白填充剂具有平均孔径D50为50μm至500μm，孔隙率为80％-99.5％，交联度为10％至70％，和体外酶解损失率小于40％。
2.根据权利要求1所述胶原蛋白填充剂，其中所述胶原蛋白填充剂具有下述至少之一：
-平均孔径D50为80μm至400μm，甚至90μm至300μm，尤其地100μm至250μm，特别地120μm至200μm；
-孔隙率为80％-99％，甚至85％-98％，特别地90％-96％；
-交联度为12％至65％，甚至15％至60％，尤其地18％至55％，特别地20％至50％；
-体外酶解损失率小于40％，优选小于35％，甚至小于30％，尤其地小于25％，特别地小于20％；
-在剪切速率为2Hz、温度为25±1℃条件下，动力粘度为90000mPa.s至300000mPa.s，优选95000mPa.s至280000mPa.s，甚至98000mPa.s至270000mPa.s，尤其地100000mPa.s至260000mPa.s，特别地120000mPa.s至250000mPa.s；
-熔点为55℃至85℃，优选58℃至80℃，甚至60℃至78℃，尤其地62℃至75℃，特别地大于65℃，或低于73℃。
3.根据前述权利要求任一项所述胶原蛋白填充剂，其中所述胶原蛋白填充剂包括不同孔径的组合，优选一种或多种孔径50μm至120μm与一种或多种孔径120μm至500μm的组合，更优选一种或多种孔径50μm至120μm与一种或多种孔径120μm至500μm的组合，特别一种或多种孔径50μm至100μm与一种或多种孔径120μm至450μm的组合，甚至一种或多种孔径50μm至90μm与一种或多种孔径130μm至420μm的组合，或者一种或多种孔径50μm至80μm与一种或多种孔径140μm至400μm的组合。
4.根据前述权利要求1-3任一项所述胶原蛋白填充剂的制备方法，其包括下述步骤：
(1)提供胶原蛋白，并溶解胶原蛋白，任选地过滤除菌；
(2)加入缓冲溶液，调节pH至6-8，搅拌，形成胶原混悬液；
(3)加入微球，搅拌至均匀；
(4)加入交联剂，将温度调至20-40℃，恒温条件下进行交联反应；
(5)去除胶原混悬液中的微球；
(6)任选地中和、纯化和匀化。
5.根据权利要求8或9所述方法，其中在步骤(1)中，处理温度为1℃至15℃。
6.根据权利要求8或9所述方法，其中在步骤(2)中，胶原蛋白溶液与缓冲溶液的体积比20:1至5:1，或10:1至8:1。
7.根据权利要求8或9所述方法，其中在步骤(2)中，处理温度为25℃至37℃。
8.根据权利要求8或9所述方法，其中实施步骤(3)至步骤(5)重复2-5次，其中各次实施步骤(3)至步骤(5)使用的微球的粒径不同，选自一种或多种粒径50μm至120μm与一种或多种粒径120μm至500μm的组合，尤其一种或多种粒径50μm至100μm与一种或多种粒径120μm至400μm的组合，甚至一种或多种粒径50μm至90μm与一种或多种粒径150μm至300μm的组合。
9.根据权利要求8或9所述方法，其中相对于胶原混悬液总体积，微球的堆积体积为0.1％至10％。
10.根据前述权利要求1-3任一项所述胶原蛋白填充剂和根据前述权利要求4-9任一项所述方法获得的胶原蛋白填充剂在制备医疗整形美容的填充剂产品中的应用。
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