CN117603865B

CN117603865B - 一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用

Info

Publication number: CN117603865B
Application number: CN202311575094.0A
Authority: CN
Inventors: 李光玉; 赵梦迪; 张媛媛; 李悦垚; 刘可园
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2023-11-23
Filing date: 2023-11-23
Publication date: 2024-09-17
Anticipated expiration: 2043-11-23
Also published as: CN117603865A

Abstract

本发明公开了一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用，涉及微生物领域。本发明提供了一种嗜酸乳杆菌GLA09，保藏号为CCTCC NO:M 2023982。相对于其他益生菌而言，菌株GLA09的高温耐受能力较好，在喷涂制备宠物食品的过程中具有较高的存活率；其次，菌株GLA09还具有较高的人工胃肠液耐受性和自凝聚性，在胃肠道中具有更好的定植能力；再有，菌株GLA09对多种病原体有较好的抑制效果，可应用于防治由病原体引发的相关疾病；此外，菌株GLA09还具有很高的自由基清除能力，可用于抗氧化和抗衰老。

Description

一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用。

背景技术

近年来，宠物犬养殖数量逐渐增加，其社会地位也逐渐被拟人化。当代的宠物主人自称是“宠物父母”，宠物是家庭成员之间情感交流的纽带和桥梁。随着宠物数量的增加，宠物主人开始关注饲养宠物的科学性，功能性宠物产品受到广泛关注。一系列有机、天然、含有益健康成分的功能性宠物食品应运而生。益生菌作为一种无毒无残留且具有有益作用的添加剂在宠物食品中的应用越来越广泛。比如乳酸杆菌、双歧杆菌、屎肠球菌等在宠物食品中的应用。

但是，目前市场销售大多数的宠物益生菌产品并非宿主源，使用效果也良莠不齐。考虑宿主物种具有特异性，使用来自宿主物种肠道的益生菌才能更好的适应胃肠道环境，发挥其益生功能。但目前犬源嗜酸乳杆菌报道较少，市场上相应产品更少。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌及其相关制剂和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种嗜酸乳杆菌，其名称为Lactobacillusacidophilus GLA09，保藏号为CCTCC NO:M 2023982。

第二方面，本发明实施例提供了一种微生物制剂，其含有前述实施例所述的嗜酸乳杆菌。

第三方面，本发明实施例提供了一种产品，其包括前述实施例所述的嗜酸乳杆菌和/或前述实施例所述的微生物制剂。

第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂在制备用于具有延缓衰老和/或抗氧化功能的产品中的应用。

第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品或制备防治由所述病原体引发的相关疾病的产品中的应用。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂在制备用于防治胃肠道疾病的产品中的应用。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂在制备宠物饲料中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种嗜酸乳杆菌GLA09，具有以下优势：

菌株GLA09的高温耐受能力好，70℃耐高温存活率超过50％，在喷涂制备宠物食品的过程中具有较高的存活率，降低了加工成本；

菌株GLA09具有较高的人工胃肠液耐受性和自凝聚性，相对于其他益生菌而言，菌株GLA09在胃肠道中具有更好的定植能力；

菌株GLA09对多种病原体具有优异的抑制效果，可应用于防治由病原体引发的相关疾病；

菌株GLA09具有很高的自由基清除能力，可用于抗氧化、抗衰老产品的制备，例如，应用于宠物的抗衰老，延长宠物寿命。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为嗜酸乳杆菌GLA09菌落形态(A)及细胞形态(B)；

图2为嗜酸乳杆菌GLA09进化树；

图3为嗜酸乳杆菌GLA09生长及产酸速率曲线；

图4为嗜酸乳杆菌GLA09对酸度的耐受性；

图5为嗜酸乳杆菌GLA09抑菌图片；其中，A：大肠杆菌，B：金黄色葡萄球菌，C：沙门氏菌，D：铜绿假单胞菌，E：单核细胞增生李斯特菌；a：菌悬液，b：无细胞上清液，c：细菌沉淀，d：MRS液体培养基；

图6为嗜酸乳杆菌GLA09溶血试验结果；其中，A为血平板正面，B为血平板反面，a为金黄色葡萄球菌(阳性对照)，b为嗜酸乳杆菌GLA09；

图7为饲喂GLA09小鼠生长及采食情况；其中，A为体重的情况，B为采食量的情况，C为日增重的情况，D为平均日采食量的情况；

图8为饲喂GLA09小鼠回肠和空肠绒毛高度和隐窝深度HE染色图；其中，A、B、C、D分别为CK组、LA组、MA组和HA组小鼠回肠HE染色图片；E、F、G、H分别为CK组、LA组、MA和HA组小鼠空肠HE染色图片；

图9为基因组circos图；

图10为COG结果分类图；

图11为GO注释结果分类图；

图12为KEGG pathway结果分类图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一方面，本发明实施例提供了一种嗜酸乳杆菌，其名称为Lactobacillusacidophilus GLA09，保藏号为CCTCC NO:M 2023982。

具体地，嗜酸乳杆菌GLA09，于2023年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO:M 2023982。

嗜酸乳杆菌GLA09的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明实施例还提供了一种微生物制剂，其含有前述实施例所述的嗜酸乳杆菌。

在一些实施例中，所述微生物制剂的制备方法包括：培养所述嗜酸乳杆菌。

对用于培养嗜酸乳杆菌GLA09的培养基和培养条件没有特殊限制，可采用现有应用于嗜酸乳杆菌培养的培养基和培养条件。培养基具体可以为MRS培养基。培养温度可以为20～40℃，具体可以为20、22、24、26、28、30、32、34、36、37、38、40℃中的任意一种或多种。培养时间可以为1～50h，具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50h中的任意一种或任意两种之间的范围。

另一方面，本发明实施例还提供了一种产品，其包括前述实施例所述的嗜酸乳杆菌和/或前述任意实施例所述的微生物制剂；

在一些实施例中，所述产品为药品或饲料。

在一些实施例中，所述饲料包括宠物饲料。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂在制备用于具有延缓衰老和/或抗氧化功能的产品中的应用。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品或制备防治由所述病原体引发的相关疾病的产品中的应用。

在一些实施例中，所述病原体包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌中的任意一种或多种。

在一些实施例中，所述防治包括：预防、治疗或辅助治疗中的任意一种或多种。

本文中的“治疗”包括减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。

对于癌症来说，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说，“治疗”包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂在制备用于防治胃肠道疾病的产品中的应用。

在一些实施例中，所述胃肠道疾病包括：腹泻、胃炎、肠炎、结肠炎、阑尾炎、克罗恩病、消化性溃疡、胃癌和肠癌中的任意一种或多种。

在一些实施例中，所述消化性溃疡包括：食管溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡中的任意一种。

在一些实施例中，前述任意实施例所述产品包括：药物和饲料中的任意一种。

在一些实施例中，所述饲料包括宠物饲料。此外，另一方面，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的嗜酸乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂在制备宠物饲料中的应用。

具体地，所述宠物饲料的类型包括动物性饲料、植物性饲料和饲料添加剂。动物性饲料来自动物及其屠宰后的副产品，包括畜禽的肉、内脏、血粉、肉骨粉、鱼粉、乳汁等。动物性饲料适口性好，易于消化，蛋白质和维生素含量较高。常见的犬动物性饲料有鱼、肉、蛋、奶等。植物性饲料种类繁多，价格低廉，是肉用犬或大型犬的补充饲料。其中，植物性饲料包括农作物成熟的籽实，如玉米、大米、大豆等；根茎类植物的根茎，如甘薯、马铃薯、木薯、胡萝卜菜等；瓜果类，如南瓜、西葫芦等；农副业加工产品，如米糠、糖渣、豆腐渣等；青菜类等。这些饲料富含淀粉和糖类。饲料添加剂又称“辅加料”，给宠物喂食“辅加料”是为了给宠物补充某种微量成分。饲料添加剂的种类很多作用各异，最常见的是用于促进狗生长发育、防治疾病等。在一些实施例中，所述制备宠物饲料的步骤包括：在宠物基础饲料上喷涂嗜酸乳杆菌或微生物制剂。以喷涂的方式在宠物饲料中添加益生菌，能够使得饲料的内里和/或表面均匀分布高活性的益生菌，提高益生菌的存活率，降低运输过程益生菌脱离的损失率。

对喷涂的具体工艺无特殊限制，可基于现有工艺进行实施。在一些实施例中，所述喷涂包括：高温喷涂或真空喷涂。所述高温可以为60～80℃，具体可以为60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80℃中的任意一种或任意两种之间的范围。

菌株GLA09具有优异的高温耐受能力，其在50℃的存活率超过70％，60℃的存活率超过60％，70℃耐高温存活率超过50％，相对于其他菌株而言，其更能适用于以喷涂的方式添加于宠物食品中(较高的存活率)，在降低了宠物饲料的加工成本的情况下，提高了宠物饲料的功效。

在一些实施例中，所述宠物包括：犬科动物，包括但不限于狗(宠物犬)。

相对于其他来源的嗜酸乳杆菌，菌株GLA09能更好的适用于狗的胃肠道环境，发挥其益生功能。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1.犬源嗜酸乳杆菌分离鉴定

1.1分离用培养基

MRS培养基，具体成分如表1所示：

表1.MRS培养基成分表

成分	重量	成分	重量
				蛋白胨	10.0·g/L	磷酸氢二钾	2.0·g/L
牛肉浸粉	8.0·g/L	柠檬酸氢二铵	2.0·g/L
				酵母浸粉	4.0·g/L	NaAc	5.0·g/L
葡萄糖	20.0·g/L	MgSO₄	0.2·g/L
				琼脂	14.0·g/L	MnSO₄	0.04·g/L
吐温80	1.0·mL	蒸馏水	1000·mL

pH 6.5±0.2，121℃高压灭菌15min。

1.2分离方法

(1)样品的采集与微生物分离：选择中国青岛即墨畜牧实验场的3只成年健康的雌性比格犬。通过无菌拭子采集直肠粪便，迅速放入含有生理盐水的50mL灭菌螺口具盖试管中。低温冷藏条件运输至青岛农业大学特种经济动物营养实验室，立即进行梯度稀释，每梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。

(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取不同菌落形态的乳酸菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。

(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。

(4)按照北京索莱宝科技有限公司细菌基因组提取试剂盒(D1600)说明书提取细菌DNA，利用细菌通用引物：27F，1492R对所获得乳酸菌保守序列进行扩增并测序，引物合成及测序送检北京擎科生物科技有限公司完成，对16S rRNA序列进行同源性比对。16S rDNA的扩增体系如表2所示，扩增体系的总体积为50μl。

表2扩增体系

ddH₂O	19·μl
		DNA·plate	2·μl
Primer·F	2·μl
		Primer·R	2·μl
2×Es·Taq·MasterMix(含染料)	25·μl

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

1.3嗜酸乳杆菌的分离鉴定筛选

经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rRNA测序比对，鉴定为嗜酸乳杆菌，命名为GLA09，16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。

菌株培养24h后，菌落中间凸起，边缘整齐，表面光滑；兼性厌氧，革兰氏阳性，呈杆状。GLA09的菌落形态如图1中A所示，显微镜检形态如图1中B所示。

对GLA09的16S rRNA基因进行系统发育分析，确定它们与嗜酸乳杆菌的亲缘关系密切。系统发育树如图2所示。

2.生长特性

2.1生理生化特性

取活化培养18h后的分离菌菌液，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行乳酸菌生理生化特性鉴定，糖发酵试验、V-P试验、甲基红(MR)试验、明胶试验等生化特性进行鉴定。

2.2生长性能及产酸性能测定

取活化培养18h后的分离菌菌液以3.0％的接种量接种于MRS培养基中，37℃恒温培养24h，对照组为未接菌种液的液体培养基。分别于0、1、2、3、6、9、12、18、24、30、36、48h取样测定培养液OD600nm吸光度值，分别于0、1、2、3、6、9、12、18、24、30、36、48h取样测定pH。以时间为横坐标，以培养液的pH和OD600nm吸光度值为纵坐标，绘制其生长曲线和产酸曲线。

2.3耐酸特性试验

取活化培养18h后的分离菌菌液以3.0％的接种量接种于初始pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的MRS液体培养基中，37℃恒温培养。分别于0、3、6、9、12、18、24、30、36、42h测定其OD600nm吸光度值，每组3个平行。测定完成后取3组平行试验结果计算平均值，根据计算结果绘制曲线。

2.4耐高温特性试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，分别于50℃、60℃和70℃的水浴锅中处理5min，处理后立即放在冰盒中。取100μL培养液梯度稀释后涂布，用平板计数法计算活菌数，以0h的活菌数为对照计算存活率。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。

其中，T_initial1和T_treatment1分别是0min和5min存活细菌的数量(l

g CFU/mL)。

2.5胃肠道定植能力

2.5.1耐酸试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，弃去上清液后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，然后在无菌PBS缓冲液(pH 2.5)中重新悬浮。在37℃培养0和3h后，将10×连续稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上，然后在37℃下孵育24h，通过活菌落来评估分离菌株对酸的耐受性，重复3次试验。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。

其中，T_initial2和T_treatment2分别是在温育前(0h)以及在温育后(3h)存活细菌的数量(lg CFU/mL)。

2.5.2耐胆盐试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，弃去上清液后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，重新悬浮在含有0.1％和0.3％(w/v)猪胆汁盐(Solarbio，China)的PBS缓冲液中。在37℃培养0和4h后，将10×连续稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上，然后在37℃下孵育24h，通过活菌菌落来评估分离菌株对胆盐的耐受性，重复3次试验。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。

其中，T_initial3和T_treatment3分别是在温育前(0h)以及在温育后(4h)存活细菌的数量(lg CFU/mL)。

2.5.3人工胃肠液耐受性试验

人工胃液和人工肠液的配置参考2010年版《中国药典》。

取活化培养18h后的分离菌菌液，4℃，10000rpm离心10min，弃上清，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，重悬于人工胃液中，于37℃，200rpm孵育1.5h。孵育后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤细菌沉淀两次，4℃，10000rpm离心10min，然后重悬于人工肠液中，并在37℃，200rpm孵育2h。在人工胃液和肠液中孵育前后，通过平板计数稀释法计算细菌沉淀活力，重复3次试验。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。

其中，T_initial4和T_treatment4分别是在人工胃液或肠液中孵育之前以及在人工胃液或肠液中孵育后存活细菌的数量(lg CFU/mL)。

2.5.4表面疏水性试验

采用细菌碳烃化合物黏着法(bacterium adhesion to hydrocarbons，BATH)，通过乳酸菌对碳烃化合物的亲和力来反应菌株表面的疏水性能。取活化培养18h后的分离菌的菌液4℃，10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤3次后，调节菌液OD₆₃₀吸光度值为0.25±0.05(A1)备用。然后，以1∶1的比例加入二甲苯和氯仿，涡旋振荡3min，于37℃孵育8h。最后，小心地吸取水相，测量OD₆₃₀吸光度值(A2)，重复3次试验。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。疏水率计算公式如下：

疏水率CSH(％)＝(1-A2/A1)×100％(5)；

其中，A1和A2分别是孵育8小时之前和之后的OD₆₃₀吸光度值。

2.5.5自凝聚力试验

取培养过夜18h的分离菌菌液，4℃，10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤2次，然后重新悬浮于等体积的无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)中，测量OD₆₃₀吸光度值(A3)，然后涡旋振荡10s，置于37℃，孵育8h，避免搅拌，仔细吸收上部，测量OD₆₃₀吸光度值(A4)，以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照，重复3次试验。自凝聚率计算公式如下：

Autoaggregation ability(％)＝(1-A4/A3)×100％ (6)；

其中，A3和A4分别是孵育8h之前和之后的OD₆₃₀吸光度值。

2.6抑菌试验

菌株的抑菌性能采用牛津杯琼脂扩散法进行测定，取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，去除无细胞上清液(CFS)，将细菌沉淀(BP)重悬于等体积无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)中。将无菌牛津杯放置在TSA琼脂平板上，TSA平板含有胰蛋白胨(15.0g/L)、大豆胨(5.0g/L)、氯化钠(5.0g/L)和琼脂(15.0g/L)，取200μL浓度为1×107CFU/mL的致病菌(大肠杆菌ATCC25922；沙门氏菌ATCC14028；金黄色葡萄球菌ATCC25923；铜绿假单胞菌ATCC27853；单核细胞增生李斯特菌ATCC19115)涂布于TSA琼脂平板上，待菌液吸收完全后，每个孔接种200uL分离菌株的BS，CFS，BP和MRS液体培养基，TSA平板于37℃恒温培养箱正置放置培养，24h后观察是否有抑菌圈形成，并精确量取抑菌圈直径。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。

2.7抗生素敏感性试验

菌株的抗生素敏感性采用纸片扩散法进行测定。根据评价益生菌安全性的建议并结合市场上常见的抗生素，选择27种抗生素以6mm纸片(BIO-KONT，China)的形式进行测试：青霉素、苯唑西林、氨苄西林、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、四环素、米诺环素、红霉素、阿奇霉素、诺氟沙星、林可霉素、万古霉素、多粘菌素B、复方新诺明、氯霉素、强力霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星。

取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤2次后，然后在无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)中重悬以获得对数生长期的细菌溶液(0.5McFarland悬浮液)。取100uL分离菌株的菌悬液涂布于MRS琼脂平板上。最后，将抗生素纸片在15min内贴于MRS琼脂平板表面，将平板在37℃恒温培养24h，观察是否有抑菌圈形成，并用游标卡尺测定抑菌圈直径。

2.8自由基清除试验

2.8.1DPPH自由基清除试验

用索莱宝DPPH检测试剂盒来测定分离菌株的DPPH清除能力，按照说明书操作，简而言之，吸取100μL培养18h后的分离菌菌液加入900μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000rpm离心10min，取25μL上清液加入到975μL DPPH工作溶液中，涡旋混匀，室温避光静止30min。用酶标仪于515nm处记录吸光度。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

其中：A_assay ¹为待测样品的吸光度；A_control ¹为分离菌株处理上清液和无水乙醇混合液的吸光度；A_blank ¹为提取液和工作液混合的吸光度。

2.8.2ABTS自由基清除试验

用索莱宝DPPH检测试剂盒来测定分离菌株的DPPH清除能力，按照说明书操作，简而言之，吸取100μL培养18h后的分离菌菌液加入900μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000rpm离心10min，取上清，置冰上待测。取50μL上清液加入到850μL ABTS工作液中，再加入100μL试剂四工作液，充分混匀，室温避光静置6min。用酶标仪测定405nm处的吸光度，同时做空白和对照。以犬源乳酸片球菌GLP06作为阳性对照。ABTS自由基清除率的计算公式如下：

其中：A_assay ²为待测样品的吸光度；A_control ²为空白管吸光度；A_blank ²对照管的吸光度。

2.8.3超氧阴离子自由基清除试验

用索莱宝超氧阴离子自由基清除检测试剂盒来测定分离菌株的超氧阴离子清除能力，按照说明书操作。在530nm处测定空白管和测定管的吸光值，分别记为A_空白和A_测定。计算公式如下：

超氧阴离子清除率(％)＝(A空白-A测定)/A空白×100％(9)。

2.9安全性试验

2.9.1溶血试验

取活化培养18h后的分离菌菌液在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上划线，其中含有5.0％(w/v)的羊血(Oxoid,Germany)，将平板在37℃下培养48h，并检查血琼脂平板是否存在β-溶血(菌落周围的清晰区域)、α-溶血(菌落周围的绿色区域)或γ-溶血(菌落周围无区域)迹象。用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌株作为阳性对照。

2.9.2小鼠安全性试验

为了进行体内安全性评价，将生长健康，体重接近的昆明系小白鼠80只随机分为4组，每组20只动物。对照组(CK)小鼠灌服0.2mL无菌生理盐水，而其他三组的小鼠分别灌服0.2mL分离菌株2×10⁹(LA09)，2×10¹⁰(MA09)和2×10¹¹(HA09)CFU/mL。每3天测量一次体重和采食量，并记录小鼠的健康状况。持续28天后，将小鼠禁食12小时，然后用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉。腹主动脉采血收集血液，并通过离心(4000rpm，4℃，10min)收集血清以进行进一步分析。处死小鼠后，解剖观察各组小鼠的内脏中毒情况，并收集肝脏、肾脏、脾脏和胸腺等器官并称重，器官系数计算为器官重量/体重×100。

采集小鼠空肠中段和回肠中段约1cm，用生理盐水轻轻漂洗肠道内容物后迅速将样本浸泡至4％多聚甲醛中进行组织固定24h。然后进行组织的修整和洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，然后在光学显微镜下观察染色切片，并使用Image J测量绒毛高度和隐窝深度。

2.10菌株全基因组测序

使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行联合测序，使用Unicycler(版本：0.5.0，https://github.com/rrwick/Unicycler)进行基因组组装。组装后的基因组由Prokka(版本：1.14.6，https://github.com/tseemann/prokka)软件进行编码基因预测。使用MinCED(Version：0.4.2)对基因组进行成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)进行预测。用COG、KEGG、UniProt和RefSeq BLAST+(版本：2.11.0+)对预测的基因序列进行分析，将预测的基因序列与这些功能数据库进行比较，得到基因功能注释结果。使用软件Hmmer(版本：3.3.2)基于Pfam和TIGERFAMs数据库进行功能注释，并使用R包，绘制基因组圈图。

3.结果与分析

3.1生长特性

3.1.1生理生化特性

嗜酸乳杆菌GLA09部分生理生化特性如表3所示。嗜酸乳杆菌GLA09可利用半乳糖等单糖，纤维二糖、麦芽糖、蔗糖等二塘，棉子糖等寡糖，菊糖等多糖。

表3.嗜酸乳杆菌GLA09生理生化特性

项目	结果	项目	结果
				七叶苷	-	阿拉伯糖	-
纤维二糖	+	果糖	-
				麦芽糖	+	葡萄糖	-
甘露醇	-	鼠李糖	-
				水杨苷	-	L-鼠李糖	-
山梨醇	-	木糖	-
				蔗糖	+	MR试验	-
棉子糖	+	V-P试验	-
				菊糖	+	硝酸盐产气	-
半乳糖	+	硫化氢试验	-

+：阳性反应；-：阴性反应。

3.1.2生长性能及产酸性能测定

如图3所示，嗜酸乳杆菌GLA09在0～2h生长缓慢，处于生长迟缓期，3～18hOD₆₀₀nm吸光度值迅速上升，处于生长对数期，18h后菌液吸光度趋于平稳，进入生长稳定期。菌液产酸pH曲线变化与生长曲线相一致，2h内pH下降缓慢；3hpH下降速率加快，18h后菌液pH变化趋于平缓，稳定在4.0左右。

3.1.3菌株耐酸性能

由图4可知，菌株GLA09在pH≤3.0时生长完全被抑制，随培养时间延长，OD₆₀₀nm吸光度值未见变化。在pH＝4.0时，菌株能缓慢生长，但OD₆₀₀nm吸光度值明显低于pH＝5.0、6.0、7.0时。在pH≥5.0时，菌株GLA09均能正常生长，但在到达稳定期时OD₆₀₀nm吸光度值存在一定差别，其中OD值pH＝7.0>pH＝6.0>pH＝5.0，活菌数与OD₆₀₀nm吸光度值变化趋势相一致。

3.1.4菌株对高温耐受性

由表4可知，菌株GLA09在50℃的存活率超过70％，60℃的存活率超过60％，70℃存活率超过50％，且在70℃时菌株GLA09存活率显著高于菌株GLP06，说明嗜酸乳杆菌GLA09具有较好的耐高温能力。

表4.嗜酸乳杆菌GLA09高温耐受性

3.2菌株在胃肠道内的定植能力

3.2.1菌株对酸和胆盐耐受性

由表5可知，菌株GLA09对酸和胆盐具有较强的耐受性。接种于pH＝2.5的MRS液体培养基中3h后菌株的存活率为75.86％，活菌数约为2.53×10⁶CFU/mL。接种于胆盐浓度为0.1％的MRS液体培养基中4h后菌株的存活率为82.51％，活菌数约为4.43×10⁶CFU/mL；接种于胆盐浓度为0.3％的MRS液体培养基中4h后菌株的存活率为59.19％，活菌数约为6.30×10⁴CFU/mL。

表5.嗜酸乳杆菌GLA09在酸和不同胆盐浓度中的存活率

3.2.2菌株对人工胃肠液耐受性

由表6可知，嗜酸乳杆菌GLA09在人工胃肠液的存活率菌显著高于菌株GLP06。接种于人工胃液1.5h后菌株的存活率为94.33％，活菌数约为1.12×10⁸CFU/mL；接种于人工肠液2h后菌株的存活率为98.83％，活菌数约为5.74×10⁹CFU/mL，人工肠胃液共同消化3.5h后，存活率为69.62％，活菌数约为4.03×10⁶CFU/mL。

表6.嗜酸乳杆菌GLA09在人工胃肠液中的存活率％

菌株	人工胃液	人工肠液	人工胃肠液
				GLP06	61.94±0.66^a	90.44±0.31^a	54.83±0.26^a
GLA09	94.33±2.09^b	98.83±1.01^b	69.62±0.39^b

3.3菌株表面疏水性及自凝聚性能

细菌根据表面疏水性定义标准，一般设定CSH％>50％为高度疏水，CSH％介于20％和50％为中度疏水，CSH％<20％为非疏水。自凝聚能力一般分为：低(16％-35％)，中等(35％-50％)和高(50％以上)三类。由表7可知，嗜酸乳杆菌GLA09的疏水性低于菌株GLP06但是其自凝聚性显著高于菌株GLP06。

表7嗜酸乳杆菌GLA09表面疏水率及自凝聚率

3.4菌株的抑菌性能

由图5可知，嗜酸乳杆菌GLA09的菌悬液和无细胞上清液能够有效抑制5种致病菌的生长增殖，菌体沉淀和MRS培养基无抑菌作用。表8结果显示，该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径大于20mm，对单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈直径大于19mm，对金黄色葡萄球菌的直径大于18mm。菌株GLA09菌悬液和上清液的抑菌效果均显著优于菌株GLP06。

表8.嗜酸乳杆菌GLA09抑菌试验结果

注：同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

3.5菌株的抗生素敏感性

药敏片直径为6mm，故设抑菌圈直径大于7mm的为具有抑菌性，小于等于7mm视为无抑菌性。由表9可知，菌株GLA09对各种常见抗生素的敏感性不同。对青霉素、哌拉西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢呋辛、四环素、米诺环素、氯霉素、强力霉素、头孢哌酮、氟苯尼考的敏感性强，抑菌圈直径大于23mm，对氨苄西林、万古霉素中度敏感，抑菌圈直径大于15mm，对苯唑西林、阿米卡星、庆大霉素、红霉素、左氧氟沙星抑菌圈直径在7-14mm之间，对头孢他啶、卡那霉素、链霉素、阿奇霉素、诺氟沙星、林可霉素、多粘菌素B、复方新诺明、环丙沙星则不敏感。

表9.嗜酸乳杆菌GLA09抗生素敏感性

注：抑菌圈直径(mm)：+++：23-30mm；++：15-22mm；+：7-14mm；-：没有抑菌圈。

3.6菌株自由基清除能力

由表10可知，嗜酸乳杆菌GLA09对DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基清除率分别是64.34％、98.19％和86.36％。菌株GLA09的DPPH自由基清除率显著高于菌株GLP06。

表10嗜酸乳杆菌GLA09自由基清除率

3.7安全性试验结果

3.7.1溶血试验结果

以金黄色葡萄球菌作阳性对照(图6中a)，可见明显β-溶血(菌落周围的清晰区域)，但GLA09为γ-溶血(菌落周围无区域)，可初步判断菌种GLA09安全无致病性。

3.7.2小鼠试验结果

临床观察所有小鼠精神状况良好，均能正常采食及饮水，粪便未见异常，试验期间未有试验小鼠死亡。试验结束后剖检观察其内脏均未见异常病理组织学变化及细菌易位，说明菌株针对小鼠临床应用无毒副作用。

体重、食物摄入量和器官系数是评价动物健康状况的常用指标，用其评估分离菌株的安全性。首先，观察了补充GLA09对小鼠体重和食物摄入量的影响。补充不同剂量GLA09的小鼠体重、采食量、平均日增重(ADG)和平均每日食物摄入量(ADFI)与CK组之间均没有显著差异(图7)。以上结果表明，添加GLA09对小鼠的体重和摄食量均无不良影响。

表11.饲喂GLA09小鼠器官指数的影响

备注：CK:对照组(灌服0.2mL无菌生理盐水)；LA、MA、HA分别:灌服2×10⁹、2×10¹⁰和2×10¹¹CFU/mL嗜酸乳杆菌GLA09。

还研究了GLA09如何影响小鼠的器官系数。表11展示了添加GLA09的小鼠的器官重量数据。CK组与试验组小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏、胸腺脏器重均无显著性差异。这表明菌株GLA09对动物生长发育无不良影响，是安全的，无毒副作用。

表12.饲喂GLA09小鼠回肠和空肠绒毛长度与隐窝深度及比值

还研究了饲喂GLA09对小鼠肠道形态的影响。图8(A-D)展示了小鼠回肠绒毛高度与隐窝深度的的HE染色图片，图8(E-H)为空肠HE染色结果。有图8与表12知，各组小鼠回肠与空肠的绒毛长度、隐窝深度及其比值均无显著差异。由此可以说明，饲喂GLA09对小鼠肠道发育与肠道健康无不良影响。

3.8菌株全基因组测序结果

为了了解益生菌的特性并探索GLA09的益生潜力，进行了全基因组测序。图9中显示了GLA09的完整环状基因组图谱的结果。GLA09的完整基因组由一条2.103M的环状染色体和一个环状质粒组成，(G+C)含量分别为34.94％和33.38％，基因组大小为2,042,740bp，属于中等大小的基因组，这些细菌通常具有很强的代谢性、耐受性和适应性。菌株GLA09基因组的COG、GO和KEGG结果如图10、图11和图12所示。

COG注释结果显示，GLA09主要富集的有核糖体结构和生物合成、碳水化合物转运和代谢、主要功能预测有转录和氨基酸转运代谢。GO注释结果显示，生物过程

(biological process)富集前三的分别是翻译、介导DNA转位和DNA整合；细胞成分(cellular component)富集前三的分别是膜整体成分、细胞质和细胞质膜；分子功能(molecular function)富集前三的分别是ATP结合、DNA结合和转移酶活性。KEGG注释到前五条信号通路有：全局和总览图(Global and overview maps，329)、碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism，128)、跨膜运输(Membrane transport，124)、翻译(Translation，79)和氨基酸代谢(Amino acid metabolism，76)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种嗜酸乳杆菌，其特征在于，其名称为Lactobacillus acidophilus GLA09，其保藏编号为CCTCC NO:M 2023982。

2.一种微生物制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的嗜酸乳杆菌。

3.一种产品，其特征在于，其包括权利要求1所述的嗜酸乳杆菌和/或权利要求2所述的微生物制剂；

所述产品为药品或饲料。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述饲料包括宠物饲料。

5.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品中的应用；所述病原体包括：铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌中的任意一种或多种；所述产品为药品或饲料。

6.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂在制备宠物饲料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制备宠物饲料的步骤包括：在宠物基础饲料上喷涂所述嗜酸乳杆菌或所述微生物制剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述宠物包括：犬科动物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述犬科动物包括：狗。