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CN117597141A - 工程改造的SIRPα变体及其使用方法 - Google Patents

工程改造的SIRPα变体及其使用方法 Download PDF

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CN117597141A
CN117597141A CN202280041663.0A CN202280041663A CN117597141A CN 117597141 A CN117597141 A CN 117597141A CN 202280041663 A CN202280041663 A CN 202280041663A CN 117597141 A CN117597141 A CN 117597141A
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CN
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seq
amino acid
acid corresponding
polypeptide
engineered
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CN202280041663.0A
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王锦堂
邓涵方
郭邦贤
曾琪铃
卓宗显
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Fbd Biological Products Co ltd
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Abstract

信号调节蛋白a(SIRPa)是SIRP家族的调节膜糖蛋白。它主要由骨髓细胞表达，也由干细胞或神经元表达。SIRPa作为抑制性受体并与广泛表达的跨膜蛋白CD47相互作用。本公开涉及工程化的SIRPa变体及其使用方法。

Description

工程改造的SIRPα变体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本公开要求2021年12月21日提交的美国临时专利申请序列号63/292,267的优先权和利益，该申请通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经作为名为52246-0004WO1_SL_ST26.xml的XML文件以电子形式提交。创建于2022年12月5日的该XML文件的大小为65,094字节。XML文件中的材料据此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开涉及工程改造的SIRPα变体及其使用方法。
背景技术
信号调节蛋白α(SIRPα)是来自SIRP家族的调节性膜糖蛋白。它主要由髓系细胞表达，并且也由干细胞或神经元表达。SIRPα充当抑制性受体并且与广泛表达的跨膜蛋白CD47相互作用。这种相互作用负面控制先天免疫细胞的效应子功能，如宿主细胞吞噬作用。SIRPα在巨噬细胞膜上横向扩散，并且在吞噬细胞突触处积聚以结合CD47，CD47抑制通过巨噬细胞的吞噬作用的细胞骨架密集型过程。
CD47通过与信号调节蛋白α(SIRPα)的N-末端结合提供“不要吃”信号。已经发现其在许多不同的肿瘤细胞中过表达。靶向CD47和/或SIRPα可用于癌症免疫疗法。然而，CD47和SIRPα之间的相互作用是保护红细胞、血小板和淋巴细胞不被脾巨噬细胞快速清除所必需的。需要开发具有有限毒性的靶向CD47/SIRPα通路的癌症疗法。
发明内容
本公开涉及工程改造的SIRPα变体及其使用方法。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括在BC环、C'D环和/或DE环的一个或多个氨基酸突变。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A、H、N、I、R、G、S、D或L；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W、F、Q、L、D、K、R、A或P；和(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P、I、T、N、V、R、L、S、G或Q。
在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I、T、N、V、L、S、G或Q。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A、N或T。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A或N。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q或N；和(b)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是N或T；(b)对应于SEQID NO:1的T26的氨基酸是I。
在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G、F、R、A、L或T；(b)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R或Y；和(c)对应于SEQ ID NO:1的D73的氨基酸是I。
在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的K53的氨基酸是R。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的K53的氨基酸不是R。
在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的位置27的氨基酸是V或L；(b)对应于SEQ ID NO:1的位置63的氨基酸是V；和(c)对应于SEQ ID NO:1的位置68的氨基酸是K。
在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种:(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W；和(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(d)对应于SEQ IDNO:1的G55的氨基酸是F；(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I；和(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:3至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是N；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是H；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q；和(f)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:5至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是N；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是L；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I；和(d)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:6至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的T26的氨基酸是I；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是I；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是L；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；和(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是Y。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:7至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是K；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；和(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:8至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是G；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是N；和(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是F。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:9至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；和(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是F。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:10至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是L；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是V；和(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:11至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是G；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是R；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；和(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是A。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:12至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是L；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是D；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是F；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是L；和(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:13至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是A；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是L；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是S；和(e)对应于SEQ ID NO:1的N71的氨基酸是S。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:14至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是T；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q；和(f)对应于SEQ ID NO:1的D73的氨基酸是I。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:14至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:33至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是A；和(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:33至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:34至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是P；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；和(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是L。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:34至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:35至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；和(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:34至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:36至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是A；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是G；和(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是T。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:36至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:37至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的S29的氨基酸是Q；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是H；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是R；(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；和(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是N。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:37至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:38至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是P；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；和(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是L。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:38至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:39至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是L；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；和(d)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:39至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:40至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是L；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是T；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；和(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:40至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:41至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；和(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:41至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:42至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是N；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；和(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:42至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:43至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；和(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:43至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:44至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是N；(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；和(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:44至少90％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQID NO:45至少80％相同的氨基酸序列，在一些实施例中，该多肽包括以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；和(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。在一些实施例中，本文所述的工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:45至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽进一步包括CH2结构域和CH3结构域。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽进一步包括铰链区。在一些实施例中，CH2结构域是IgGCH2结构域，并且CH3结构域是IgG CH3结构域。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:15-28和46-58中任一个至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本公开涉及一种蛋白质构建体，其包括本文所述的工程改造的SIRPα多肽。在一些实施例中，本文所述的蛋白质构建体包括两种或更多种工程改造的SIRPα多肽。在一些实施例中，至少两种工程改造的SIRPα多肽是相同的。在一些实施例中，至少两种工程改造的SIRPα多肽是不同的。在一些实施例中，本文所述的蛋白质构建体进一步包括Fc区。在一些实施例中，Fc区是IgG4 Fc区。在一些实施例中，Fc区是IgG1Fc区(例如，具有LALA突变或LALA-PG突变)。
在一个方面，本公开涉及一种蛋白质构建体，其包括第一融合多肽，该第一融合多肽包括如本文所述的工程改造的SIRPα多肽、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和第二融合多肽，该第二融合多肽包括第二CH2结构域和第二CH3结构域。在一些实施例中，第一融合多肽和第二融合多肽彼此缔合，形成二聚体。在一些实施例中，第二融合多肽进一步包括第二工程改造的SIRPα多肽。
在一个方面，本公开涉及一种药物组合物，其包括如本文所述的工程改造的SIRPα多肽或本文所述的蛋白质构建体；和药学上可接受的载剂。
在一个方面，本公开涉及一种核酸，其编码如本文所述的工程改造的SIRPα多肽或如本文所述的蛋白质构建体。在一个方面，本公开涉及一种载体，其包括如本文所述的核酸。在一个方面，本公开涉及一种细胞，其包括如本文所述的核酸。在一些实施例中，细胞是CHO细胞。
在一个方面，本公开涉及一种产生工程改造的SIRPα多肽或包括工程改造的SIRPα多肽的蛋白质构建体的方法，该方法包括(a)在足以使细胞产生工程改造的SIRPα多肽或蛋白质构建体的条件下培养如本文所述的细胞；和(b)收集由细胞产生的工程改造的SIRPα多肽或蛋白质构建体。
在一个方面，本公开涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括如本文所述的工程改造的SIRPα多肽或如本文所述的蛋白质构建体。在一些实施例中，受试者患有实体瘤或血液癌症。在一些实施例中，癌症是急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌或小细胞肺癌肿瘤。
在一个方面，本公开涉及一种降低肿瘤生长速率的方法，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，该组合物包括如本文所述的工程改造的SIRPα多肽或如本文所述的蛋白质构建体。
在一个方面，本公开涉及一种杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，该组合物包括如本文所述的工程改造的SIRPα多肽或如本文所述的蛋白质构建体。
如本文所用，术语“工程改造的SIRPα多肽”是指衍生自具有一个或多个突变(例如，插入、缺失或取代)的野生型SIRPα多肽或其部分(例如，SIRPα的胞外区，或SIRPα的IgV结构域)的多肽。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括SIRPα的胞外区或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括SIRPα的IgV结构域或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽是经修饰的IgV结构域。
如本文所用，术语“蛋白质构建体”是指具有一种或多种多肽的复合物。在一些实施例中，蛋白质构建体具有两种或更多种多肽，其中多肽可以彼此缔合，形成二聚体或多聚体。
如本文所用，术语“癌症”是指具有不受控制的自主生长的能力的细胞。此类细胞的实例包含具有以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语意指包含癌性生长，例如肿瘤；致癌过程、转移组织和恶性转化的细胞、组织或器官，与组织病理学类型或侵袭阶段无关。还包含各种器官系统的恶性肿瘤，如呼吸系统、心血管系统、肾脏系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝脏系统、胃肠系统和内分泌系统；以及腺癌，其包含恶性肿瘤如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌和小肠癌。“自然发生的”癌症包含任何不是通过将癌细胞植入到受试者体内实验诱导的癌症，并且包含例如自发发生的癌症、由患者暴露于致癌物引起的癌症、由转基因癌基因的插入或肿瘤抑制基因的敲除引起的癌症以及由感染例如病毒感染引起的癌症。术语“癌”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。该术语还包含癌肉瘤，其包含由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质来源的恶性肿瘤。术语“造血肿瘤病症”包含涉及造血来源的增生性/肿瘤性细胞的疾病。造血肿瘤病症可以由髓系、淋巴系或红细胞系或其前体细胞引起。血液学癌症是一种始于造血组织(如骨髓)或免疫系统的细胞的癌症。血液学癌症的实例包含例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述根据本发明的方法向其提供治疗的动物、人类或非人类。在本公开中考虑了兽医应用和非兽医应用。人类患者可以是成年人或青少年(例如，18岁以下的人)。除了人类，患者包含但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、犬和灵长类动物。包含例如非人灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔形目动物、豕(例如，猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物和其他家养动物、农场动物和动物园动物。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指至少两个氨基酸的任何长度的氨基酸的聚合物。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互换使用，是指至少两个核苷酸的任何长度的核苷酸的聚合物，并且包含但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体及其修饰。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用以其整体并入。如有冲突，以本说明书(包含定义)为准。
从下面的详细描述和附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得清楚。
附图说明
图1示出了人SIRPα的IgV结构域的3D蛋白质结构。九条β链(A-B-C-C'-D-E-F-G-G2)和五个环区(BC环、CC'环、C'D环、DE环和FG环)被标记。
图2示出了人SIRPα的IgV结构域的氨基酸残基。该序列(SEQ ID NO:1)与GenBank登录号：CAA71403.1(SEQ ID NO:30)的氨基酸31-148相同。BC环、C'D环和DE环中的残基被加下划线。
图3A-3D示出了K53、G55、E54和H56的残基扫描结果。
图4A-4B是示出了56个选择的克隆的表达水平(在450nm处的吸光度，或OD450)、hCD47/hSIRPα阻断(在450nm处的吸光度，或OD450)、hCD47/hSIRPα阻断能力、人CD47结合(在450nm处的吸光度，或OD450)、人CD47结合能力(B)/表达(E)比率和小鼠CD47结合(在450nm处的吸光度，或OD450)数据的表格。
图5示出了hSIRPα-Fc蛋白的示意性结构。两个SIRPαIgV结构域连接至人IgG4铰链区和Fc区的N-末端。
图6示出了野生型SIRPαIgV结构域的BC环区、C'D环区和DE环区内的特定氨基酸突变和13个选择的克隆(mt3-mt15)。
图7示出了通过HPLC-SEC的hSIRPα-Fc突变体蛋白的纯化结果。
图8示出了通过系统的hSIRPα-Fc突变体蛋白与CD47-ECD-His的结合亲和力结果。
图9A-9C分别示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白与CD47转染的CHO-S细胞、Jurkat细胞和Raji细胞的全细胞结合结果。
图9D-9E分别示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白与CD47 tf CHO-S和Raji细胞的全细胞结合结果。
图10A-10D示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白的RBC结合结果。从两个供体收集人类红细胞。
图11A-11D示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白的血小板结合结果。从两个供体收集人类血小板。
图12A-12C示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白与cynoCD47 tf CHO-S细胞或LLC-MK2细胞的全细胞结合结果。
图13A示出了hSIRPα-Fc突变体蛋白与EMT-6细胞的全细胞结合结果。
图13B是图13A在低MFI范围中的放大图。
图14A-14C示出了使用hSIRPα-Fc突变体蛋白的RBC血细胞凝集测定结果。从三个供体收集人类RBC细胞。Hu5F9-G4用作阳性对照以诱导血细胞凝集。
图15A-15C分别示出了使用CD47 tf CHO-S细胞、FaDu细胞和Raji细胞的hSIRPα-Fc突变体蛋白的hCD47/hSIRPα阻断能力。
图15D-15E示出了使用CD47 tf CHO-S细胞的hSIRPα-Fc突变体蛋白的hCD47/hSIRPα阻断能力。
图16A-16C分别示出了由Raw264.7小鼠巨噬细胞针对Jurkat、FaDu和Raji细胞的诱导的hSIRPα-Fc突变体蛋白的吞噬作用能力。
图16D-16E分别示出了由Raw264.7小鼠巨噬细胞针对DLD1和Raji细胞的诱导的hSIRPα-Fc突变体蛋白的吞噬作用能力。
图17A示出了由Raw264.7小鼠巨噬细胞针对人RBC细胞的诱导的hSIRPα-Fc突变体蛋白的吞噬作用能力。
图17B示出了由Raw264.7小鼠巨噬细胞针对人血小板的诱导的hSIRPα-Fc突变体蛋白的吞噬作用能力。
图18A-18C分别示出了由人单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)针对Raji、DLD1和Jurkat细胞的hSIRPα-Fc突变体蛋白的诱导的吞噬作用能力。
图18D示出了由人单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)针对DLD1细胞的hSIRPα-Fc突变体蛋白的诱导的吞噬作用能力。
图19A-19C示出了由人单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)针对RBC细胞的hSIRPα-Fc突变体蛋白的诱导的吞噬作用能力。从两个供体收集人RBC细胞。
图20A示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)或Hu5F9-IgG4处理的携带Raji异种移植物的NOD/SCID小鼠中的肿瘤生长曲线。对照组小鼠被施用安慰剂。
图20B示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)、Hu5F9-IgG4或安慰剂处理的携带Raji异种移植物的NOD/SCID小鼠在接种后第18天的个体肿瘤体积。
图20C示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)、Hu5F9-IgG4或安慰剂处理的携带Raji异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线。
图21A示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)或Hu5F9-IgG4处理的携带NCI_H82异种移植物的NOD/SCID小鼠中的肿瘤生长曲线。对照组小鼠被施用安慰剂。
图21B示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)、Hu5F9-IgG4或安慰剂处理的携带NCI_H82异种移植物的NOD/SCID小鼠在接种后第25天的个体肿瘤体积。
图21C示出了用hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-wt(延龄草TTI-622)、Hu5F9-IgG4或安慰剂处理的携带NCI_H82异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线。
图22列出了人SIRPα的野生型IgV结构域或IgV结构域突变体的氨基酸序列。
图23列出了本公开中讨论的蛋白质序列。
具体实施方式
信号调节蛋白α(SIRPα、SIRPa或CD172A)是一种跨膜蛋白。它具有包括三个Ig样结构域的胞外区和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序的胞质区，这些基序介导蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2的结合。SIRPα的酪氨酸磷酸化受多种生长因子和细胞因子以及整合素介导的细胞与细胞外基质蛋白粘附的调节。SIRPα在髓系细胞如巨噬细胞和树突细胞中特别丰富，而在T、B、NK和NKT细胞中仅以低水平表达。
SIRPα的胞外区可以与其配体CD47相互作用。巨噬细胞上的SIRPα与红细胞上的CD47的相互作用在体外和体内阻止了通过巨噬细胞对Ig调理的红细胞的吞噬作用。SIRPα被在相邻细胞上表达的CD47连接到吞噬细胞上导致SIRPα细胞质的基于免疫受体酪氨酸的抑制(ITIM)基序的磷酸化，导致SHP-1和SHP-2磷酸酶的募集。一个由此产生的下游效应是阻止了肌球蛋白-IIA在吞噬细胞突触上的积聚，从而抑制了吞噬作用。因此，CD47-SIRPα相互作用作为负性免疫检查点发送“不要吃我”信号，以确保健康的自体细胞不被不适当地吞噬。然而，在几乎所有类型的肿瘤中也发现了CD47的过表达，其中一些肿瘤包含急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌。可以通过阻断CD47与SIRPα的结合来最小化巨噬细胞的此类负调节。
阻断CD47/SIRPα相互作用可以促进细胞吞噬作用，从而可以用于治疗各种癌症。它通过先天免疫触发癌细胞的识别和消除。靶向CD47或SIRPα的药剂可以用于治疗各种肿瘤和癌症，例如，实体瘤、血液恶性肿瘤(例如，复发性或难治性血液恶性肿瘤)、急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和小细胞肺癌肿瘤。
SIRPα及其功能的详细描述可以在例如Yanagita等人的“抗SIRPα抗体作为癌症免疫疗法的潜在的新工具(Anti-SIRPαantibodies as a potential new tool for cancerimmunotherapy)”，《JCI洞察(JCI insight)》2.1(2017)；Seiffert等人，“信号调节蛋白α(SIRPα)而不是SIRPβ参与T细胞活化，以高亲和力与CD47结合，并在未成熟的CD34+CD38造血细胞上表达(Signal-regulatory proteinα(SIRPα)but not SIRPβis involved in T-cell activation,binds to CD47 with high affinity and is expressed on immatureCD34+CD38-hematopoietic cells)”，《血液(Blood)》，97.9(2001):2741-2749中找到；它们通过引用整体并入本文。
此外，SIRPα还用于抑制通过巨噬细胞对表达CD47的宿主细胞(包含红细胞和血小板)的体内清除。CD47-SIRPα相互作用似乎也是造血干细胞移植的必要条件。阻断CD47/SIRPα相互作用可能会导致正常红细胞的意外杀伤，潜在地导致贫血，并引发炎症。因此，调节SIRPα靶向剂与CD47的相互作用是重要的，例如，对红细胞具有有限或受控的作用。
本公开提供了工程改造的SIRPα变体。这些工程改造的SIRPα变体可以用于靶向CD47/SIRPα通路，而工程改造的SIRPα变体和CD47的相互作用被仔细调节。
工程改造的SIRPα变体
人SIRPα是信号调节蛋白(SIRP)的成员。信号调节蛋白是细胞表面Ig超家族蛋白，其介导必需的细胞表面蛋白相互作用和信号转导。SIRP都含有N-末端胞外区，单一的跨膜结构域和C-末端胞内区。
人SIRPα(UniProt标识符：P78324)的胞外区具有IgV结构域、Ig样C1 1型结构域和Ig样C1 2型结构域。它们对应于人SIRPα蛋白(SEQ ID NO:31；NP_542970.1)的氨基酸32-137、氨基酸148-247和氨基酸254-348。氨基酸1-30是信号肽。人SIRPα也具有长的胞内结构域，其包括两个推定的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。SIRPαITIM的激活递送抑制信号，该抑制信号负调节细胞响应。
SIRPα与CD47的结合是通过SIRPα的胞外IgV结构域介导的。hSIRPa的IgV结构域属于免疫球蛋白超家族，其含有9个β链，包含A-B-C-C'-D-E-F-G-G2。螺旋位于E链和F链之间(图1)。
基于人CD47(hCD47)与hSIRPα复合物的结构，确定了与CD47相互作用的残基。分析结果显示多种相互作用的残基位于hSIRPαIgV结构域的BC环(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸24-36)、C'D环(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸53-56)和DE环(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸61-78)内，是高度保守的。在图1B中，这些环区内的氨基酸残基被加下划线。这些区是突变的靶标。因此，在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括在BC环、C'D环和/或DE环处的一个或多个氨基酸突变或者由其组成。
进一步分析表明hSIRPα中的Leu30、Gly34、Gln52、Lys53、Glu54、His56、Ser66、Thr67、Arg69、Lys93、Lys96、Gly97和Asp100参与了与CD47的相互作用。因此，在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以包括在Leu30、Gly34、Gln52、Lys53、Glu54、His56、Ser66、Thr67、Arg69、Lys93、Lys96、Gly97和/或Asp100处的一个或多个氨基酸突变。
此外，已经确定Lys53和Ser66对于增加hSIRPa与CD47的结合亲和力可能是重要的。Lys53位于C'D环上，并且S66位于DE环上。在位置53位中的Lys处的突变对于增加hSIRPa与CD47的结合亲和力可能是重要的。因此，在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的K53的氨基酸是R。此外，由于结构变化导致的位置54的空间位阻的消除也表明改变C'D环的结构也可以增加hSIRPa与CD47结合亲和力增加的机会。在C'D环处的突变提供了更灵活的方法来筛选独特的突变，这些突变可以提供增加的与CD47的结合亲和力。
根据来自残基扫描的结果，当Lys53被具有长侧链或具有芳环的侧链的氨基酸如精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸取代时，Lys53可以增加稳定性。因此，在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的K53的氨基酸是精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的K53的氨基酸不是R。
同时，指导在Glu54、Gly55和His56处的突变可能更灵活，并且可能更有利。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以具有以下突变中的一个或多个：(a)对应于SEQ IDNO:1的E54的氨基酸是A、H、N、I、R、G、S、D或L；(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W、F、Q、L、D、K、R、A或P；(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P、I、T、N、V、R、L、S、G或Q。
Thr67是直接参与相互作用的残基，减小Thr67与CD47的距离可能会增加hSIRPa与CD47的结合亲和力。残基Ser66和Thr67的替换可以使DE环更接近CD47。因此，在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以具有以下中的一种或多种：(a)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q或N；(b)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G。
在本公开中还观察到CD47/hSIRPa复合物的一些其他界面。残基Ile31、Val33和Arg69可以形成正电荷袋。由于两个区的电荷和形状互补，CD47的FG环完全被包埋在正电荷袋中。因此，在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A、N或T。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A或N。
此外，本公开中的分析显示，Val27、Val63和Lys68对于维持hSIRPa的结构可能是重要的。因此，在一些实施例中，这些氨基酸残基被保留。总之，Ile31、Glu54、Gly55、His56、Ser66和Thr67被确定为hSIRPa突变筛选的候选氨基酸。
因此，在一个方面，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:9至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:14至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:41至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:42至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:43至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:44至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:45至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任何一个相比，工程改造的SIRPα变体可以具有至少或约1个(例如，至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40个)氨基酸插入、缺失或取代。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽具有以下突变中的一个或多个：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A、H、N、I、R、G、S、D或L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W、F、Q、L、D、K、R、A或P；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P、I、T、N、V、R、L、S、G或Q。
在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I、T、N、V、L、S、G或Q。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A、N、I或T。在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A、N或I。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q或N；
(b)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R、N或T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的T26的氨基酸是I。
在一些实施例中，对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是N或T。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G、F、R、A、L或T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R或Y；和
(c)对应于SEQ ID NO:1的D73的氨基酸是I。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的位置27的氨基酸是V或L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的位置63的氨基酸是V；和
(c)对应于SEQ ID NO:1的位置68的氨基酸是K。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R、N或T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的T26的氨基酸是I；
(c)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是L；
(d)对应于SEQ ID NO:1的S29的氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W、K、Y、L、A或N；
(f)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A、H、N、I、R、G、S、D或L；
(g)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W、F、Q、L、D、K、R、A或P；
(h)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P、I、T、N、V、R、L、S、G或Q。
(i)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q或N；
(j)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G；
(k)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G、F、R、A、L或T；
(l)对应于SEQ ID NO:1的N71的氨基酸是S；
(m)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R或Y；和
(n)对应于SEQ ID NO:1的D73的氨基酸是I。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是I或L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是F、S或T；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是Q；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P或R；
(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是T或G；
(f)对应于SEQ ID NO:1的K68的氨基酸是K或R；和
(g)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是N。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是W；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是F；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I；
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是N；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是H；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；
(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是Q；
(f)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是N；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是L；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是I；
(d)对应于SEQ ID NO:1的T67的氨基酸是G。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的T26的氨基酸是I；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是I；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是L；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是Y
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是K；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是G；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是N；
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是F。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是F。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是V；
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是G；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是A。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是D；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是F；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是L；
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:12)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是A；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是L；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是S；
(e)对应于SEQ ID NO:1的N71的氨基酸是S。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是T；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q；
(f)对应于SEQ ID NO:1的D73的氨基酸是I。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:33)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是P；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是L。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:34)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:35)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是W；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是G；
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是T。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:36)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的S29的氨基酸是Q；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是H；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T；
(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的氨基酸是N。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:37)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是S；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是P；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是L。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:38)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是D；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的M72的氨基酸是R。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:39)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是T；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是P；
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的氨基酸是G。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是N；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是T。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:42)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的氨基酸是N；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:44)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括以下突变中的一个或多个或由以下突变中的一个或多个组成：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的氨基酸是A；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的氨基酸是K；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的氨基酸是Q。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:45)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与具有如图6所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个突变的SEQ ID NOs:1-14和33-45中的任一个(例如，SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:44)至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列或由其组成。
工程改造的SIRPα多肽可以具有额外的修饰。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以具有Fc的CH2结构域和/或CH3结构域。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以连接到CH2结构域的N-末端(例如，通过任选的铰链区或GS接头)。在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽可以连接到CH3结构域的C-末端(例如，通过任选的GS接头)。在一些实施例中，铰链区是IgG铰链区(例如，IgG4铰链区)。在一些实施例中，CH2结构域是IgG CH2结构域(例如，IgG4 CH2结构域)。在一些实施例中，CH3结构域是IgG CH3结构域(例如，IgG4 CH3结构域)。在一些实施例中，铰链区、CH2结构域、CH3结构域具有与SEQ ID NO:29至少80％、85％、90％、95％、100％相同的序列。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由其组成。
SIRPα蛋白质构建体
本公开提供了可以特异性地结合至CD47的工程改造的SIRPα蛋白质构建体。在一些实施例中，这些蛋白质构建体可以阻断CD47/SIRPα信号通路，从而增强免疫应答。在一些实施例中，这些蛋白质构建体可以启动吞噬作用。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα蛋白质构建体可以包括如本文所述的任何工程改造的SIRPα变体。在一些实施例中，工程改造的SIRPα蛋白质构建体可以具有与SEQ IDNOs:1-14和33-45的任何序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，工程改造的SIRPα蛋白质构建体可以包括与SEQ ID NOs:15-28和46-58的任何序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列或由其组成。
本公开还提供了包括编码多肽的多核苷酸的核酸，该多肽包括与SEQ ID NOs:1-14和33-45或SEQ ID NOs:15-28和46-58的任何序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的考虑了空位的数量以及每个空位的长度的函数，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。例如，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用Blossum 62评分矩阵来完成，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。
工程改造的SIRPα蛋白质构建体可以进一步包括抗体的Fc区。这些抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE1、IgE2)。在一些实施例中，Fc区源自人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施例中，Fc区是IgG4 Fc区(例如，人IgG4 Fc区)。
在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体通过抗体铰链区(例如，IgG、IgE铰链区)连接到Fc区。此外，Fc区可以被修饰以提供期望的效应子功能或血清半衰期。
本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以阻断CD47和在免疫细胞上表达的内源性SIRPα之间的结合。在一些实施例中，通过结合至CD47，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以抑制CD47(例如，在肿瘤细胞上表达的CD47)与在免疫细胞(例如，髓系细胞、巨噬细胞和树突细胞)上表达的内源性SIRPα的结合，从而阻断CD47/SIRPα通路，上调免疫应答，并促进吞噬作用。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以将免疫细胞(例如，髓系细胞、巨噬细胞、树突细胞、抗原呈递细胞)的免疫应答、活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方式中，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以以小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1或小于0.00001s-1的解离速率(koff)结合至SIRPα(例如，人SIRPα、猴SIRPα(例如，食蟹猴(食蟹猕猴)、小鼠SIRPα)。在一些实施例中，解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。
在一些实施例中，动力学缔合速率(kon)大于1x 102/Ms、大于1x 103/Ms、大于1x104/Ms、大于1x 105/Ms或大于1x 106/Ms。在一些实施例中，动力学缔合速率(kon)小于1x105/Ms、小于1x 106/Ms或小于1x 107/Ms。
亲和力可以从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导出来。在一些实施例中，KD小于1x 10-6M、小于1x 10-7M、小于1x 10-8M、小于1x 10-9M或小于1x 10-10M。在一些实施例中，KD小于300nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。在一些实施例中，KD大于1x 10-7M、大于1x 10- 8M、大于1x 10-9M、大于1x 10-10M、大于1x 10-11M或大于1x 10-12M。
用于测量亲和力的一般技术包含，例如，ELISA、RIA和表面等离子体共振(SPR)。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以结合至猴SIRPα和/或小鼠SIRPα。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体不能结合至猴SIRPα和/或小鼠SIRPα。
在一些实施例中，确定热稳定性。如本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以具有大于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃的Tm。在一些实施例中，Tm小于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体具有大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体具有小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的肿瘤生长抑制百分比。TGI％可以在例如治疗开始后第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月确定。如本文所用，肿瘤生长抑制百分比(TGI％)使用以下公式计算：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是第i天时治疗组中的平均肿瘤体积。T0是在第零天时治疗组中的平均肿瘤体积。Vi是第i天时对照组中的平均肿瘤体积。V0是第零天时对照组中的平均肿瘤体积。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的肿瘤抑制效果与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)或抗SIRPa抗体(例如CC-95251)相当。Hu5F9-G4描述于例如Sikic等人，“在患有晚期癌症的患者中抗CD47抗体Hu5F9-G4的人类首次、首个同类I期试验(First-in-human,first-in-class phase I trial of the anti-CD47antibody Hu5F9-G4 in patients with advanced cancers)”，《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)》，37.12(2019):946，其通过引用以其整体并入本文。CC-95251。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的肿瘤抑制效果比抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)或抗SIRPa抗体(例如CC-95251)高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍或5倍。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的肿瘤抑制效果比延龄草高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍或5倍。也被称为TTI-622的hSIRPα-Fc-wt(延龄草)的细节。hSIRPα-Fc-wt(延龄草)的氨基酸序列在SEQ ID NO:15中示出。
在一些实施例中，如本文所述的蛋白质构建体具有功能性Fc区。在一些实施例中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施例中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施例中，如本文所述的蛋白质构建体具有无效应子功能的Fc区。在一些实施例中，Fc是人IgG4 Fc。在一些实施例中，Fc不具有功能性Fc区。例如，Fc区具有LALA突变(EU编号中的L234A和L235A突变)，或LALA-PG突变(EU编号中的L234A、L235A、P329G突变)。
可以对Fc区进行一些其他修饰。例如，可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中，从而允许该区中的链间二硫键形成。如此产生的同二聚体融合蛋白在体外和/或体内可以具有任何增加的半衰期。
在一些实施例中，IgG4具有S228P突变(EU编号)。S228P突变阻止体内和体外IgG4Fab臂交换。
在一些实施例中，提供Fc区，其具有缺乏岩藻糖连接(直接或间接)到Fc区的碳水化合物结构。例如，此类Fc区组合物中岩藻糖的量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中所述，通过计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量，相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的连接到Asn 297的所有糖结构(例如，复合物、杂合物和高甘露糖结构)的总和，来确定岩藻糖的量。Asn297是指位于Fc区大约位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号；或者Kabat编号中的位置314)；然而，由于Fc区序列中微小的序列变异，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294和位置300之间。此类岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。在一些实施例中，为了减少聚糖异质性，Fc区可以被进一步工程改造以用丙氨酸(N297A)取代位置297处的天冬酰胺。
在一些实施例中，与CD47和野生型SIRPα或其蛋白质构建体之间的结合亲和力相比，CD47(例如，人CD47、猴CD47、小鼠CD47或其胞外结构域)与如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体之间的结合亲和力为至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体具有1至1.25、1.25至1.5、1.5至1.75、1.75至2或大于2的B/E比率(CD47结合OD450超过表达OD450)。在一些情况下，B/E比率大于0.4。
在一些实施例中，在通过蛋白A柱纯化后，HPLC-SEC的主峰占如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
在一些实施例中，与野生型SIRPα或其蛋白质构建体相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以以至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍的亲和力结合至表达人CD47的肿瘤细胞(例如，人CD47 tf CHO-S细胞、Jurkat细胞或Raji细胞)。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体结合至表达人CD47的肿瘤细胞(例如，人CD47 tf CHO-S细胞)的EC50值小于5nM、小于4nM、小于3.5nM、小于3nM、小于2.5nM、小于2nM、小于1.5nM或小于1nM。在一些实施例中，与野生型SIRPα或其蛋白质构建体相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以以至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍的亲和力结合至表达猴CD47的细胞(例如，cynoCD47 tf CHO-S细胞或LLC-MK2细胞)。在一些实施例中，与野生型SIRPα或其蛋白质构建体相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以以至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍的亲和力结合至表达小鼠CD47的细胞(例如EMT-6细胞)。
在一些实施例中，与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％或至少150％的亲和力结合至表达CD47的肿瘤细胞(例如，CD47 tf CHO-S细胞、Jurkat细胞或Raji细胞)。
在一些实施例中，与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以以小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％或小于1％的亲和力结合至RBC细胞或血小板(例如来自人类供体)。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体结合至RBC细胞的EC50值小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2.5nM、小于2nM、小于1.5nM、小于1nM或小于0.5nM。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体结合至血小板的EC50值小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体不诱导血细胞凝集。在一些实施例中，与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体在大于500倍、2000倍、5000倍、20000倍或50000倍的最小浓度下诱导血细胞凝集。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以阻断人CD47和人SIRPα之间的相互作用。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以阻断表达人CD47的细胞(例如，CD47 tf CHO-S细胞、FaDu细胞或Raji细胞)和人SIRPα之间的相互作用。在一些实施例中，与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体的阻断能力为至少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％或至少150％。在一些实施例中，与野生型SIRPα或其蛋白质构建体的阻断能力相比，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体的阻断能力为至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体阻断CD47/SIRPα相互作用的IC50值小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于0.1nM。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以诱导通过小鼠巨噬细胞(例如Raw264.7细胞)对表达CD47的肿瘤细胞(例如，Jurkat细胞、FaDu细胞或Raji细胞)的吞噬作用。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体诱导表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的EC50值小于30nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM。在一些实施例中，工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体诱导表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的EC50值与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)的EC50值相当(例如，至少80％、85％、90％或95％)。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体比抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)具有更弱的诱导通过小鼠巨噬细胞(例如Raw264.7细胞)对RBC细胞的吞噬作用的能力。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体比抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)具有更弱的诱导通过小鼠巨噬细胞(例如Raw264.7细胞)对血小板的吞噬作用的能力。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以诱导通过人巨噬细胞(例如MDM细胞)对表达CD47的肿瘤细胞(例如Raji细胞、DLD1细胞或Jurkat细胞)的吞噬作用。在一些实施例中，诱导工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体的吞噬作用的能力与抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)相当(至少80％、85％、90％或95％)。在一些实施例中，与野生型SIRPα或其蛋白质构建体相比，诱导工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体的吞噬作用的能力为至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体比抗CD47参考抗体(例如Hu5F9-G4)具有更弱的诱导通过人巨噬细胞(例如MDM细胞)对RBC细胞的吞噬作用的能力。
在一些实施例中，如本文所述的工程改造的SIRPα变体和/或其蛋白质构建体可以抑制肿瘤生长。在一些实施例中，将Raji细胞或NCI-H82细胞注射到免疫缺陷小鼠(例如NOD/SCID小鼠)中以产生异种移植物模型。
制备工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的方法
本文所述SIRPα的变体可以通过将适当的核苷酸改变引入到编码SIRPα肽或其部分的DNA中或通过肽合成来制备。此类变体包含，例如，氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。
可以进行筛选。在此类变体的群体中，一些工程改造的SIRPα变体将具有增加的对CD47的亲和力。可以进行缺失、插入和/或组合的任何组合，以获得具有增加的对靶的结合亲和力的变体。引入到变体中的氨基酸改变也可以改变或引入新的翻译后修饰到多肽中，如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量，改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列，使得不同的糖被细胞中存在的酶附着)，或引入新的糖基化位点。
工程改造的SIRPα变体可以来源于任何动物物种，包含哺乳动物。SIRPα变体的非限制性实例包含来源于人类、灵长类(例如猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科动物(例如骆驼和骆马)、鸡、山羊和啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠和兔)的SIRPα变体。
本公开还提供了重组载体(例如表达载体)，其包含本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，重组载体引入到其中的宿主细胞(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包括多核苷酸的载体)，以及通过重组技术生产重组多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入到宿主细胞时，能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已经引入到表达载体中的宿主细胞中递送和表达一种或多种感兴趣的多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，感兴趣的多核苷酸通过与调控元件如启动子、增强子和/或poly-A尾可操作地连接而被定位用于载体中的表达，该调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中，在感兴趣的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，使得感兴趣的多核苷酸将在引入到表达载体内的宿主细胞中被翻译。
可以通过本领域已知的方法将载体引入到宿主细胞中，该已知的方法例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染和感染和/或转导(例如用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包含病毒载体(其可以用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体和与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如，痘苗病毒或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可以涉及使用非致病性(缺陷型)、复制型病毒，或者可以使用复制缺陷型病毒。用于将DNA并入到此类表达系统中的技术是本领域普通技术人员熟知的。DNA也可以是“裸露的”。可以通过将DNA包被到可生物降解的珠上来增加裸DNA的摄取，该珠被有效地转运到细胞中。
为了表达，包括本文公开的编码多肽的多核苷酸的DNA插入物可以可操作地连接到合适的启动子(例如，异源启动子)，如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子，仅举几例。其他合适的启动子是技术人员已知的。在一些实施例中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。表达构建体可以进一步含有用于转录起始、终止的位点，并且在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包含起始于开始处的翻译和适当定位于待翻译的多肽的末端处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可以包含至少一个可选择性标志物。此类标志物包含用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实例包含但不限于细菌细胞，如大肠杆菌细胞、链霉菌细胞和鼠伤寒沙门菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HK 293细胞；和植物细胞。本文所述的宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包含pQE70、pQE60和pQE-9，可从Qiagen获得；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可从Stratagene获得；以及可从Pharmacia获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性真核载体包含可从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对技术人员来说将是显而易见的。
适合用于使用的非限制性细菌启动子包含大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。适合的真核启动子包括CMV即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子(如劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)的启动子)，和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多含有组成型启动子或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。
可以通过磷酸钙转染、经过DEAE-葡聚糖介导的转染、经过阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现将构建体引入到宿主细胞中。此类方法在许多标准实验室手册中进行描述了，如Davis等人，《分子生物学基础方法(Basic Methods InMolecular Biology)》(1986)，其通过引用以其整体并入本文。
高等真核生物对编码本公开的多肽的DNA的转录可以通过将增强子序列插入到载体中而增加。增强子是DNA的，通常为约10到300bp的起到增加给定宿主细胞类型中的启动子的转录活性的作用的顺式作用元件。增强子的实例包含位于碱基对100到270处的复制起点的后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。
为了使经过翻译的蛋白质分泌到内质网的腔、周质空间或细胞外环境中，可以将适当的分泌信号并入到所表达多肽中。该信号对多肽可以是内源性的，或者其也可以是异源信号。
多肽(例如，SIRPα变体)可以以修饰的形式表达，如融合蛋白(例如，GST融合蛋白)或与组氨酸标签一起表达，并且不仅可以包括分泌信号，而且还可以包括额外的异源功能区。例如，可以将额外的氨基酸，特别是带电荷的氨基酸的区添加到多肽的N-末端，以改进在纯化期间或在随后的处理和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加到多肽中以促进纯化。可以在最终制备多肽之前将此类区去除。将肽部分添加到多肽以引起分泌或排泄、改进稳定性并促进纯化(除其他外)是本领域的熟知和常规技术。
治疗方法
本公开的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以用于各种治疗目的。
在一方面，本公开提供了用于治疗受试者中的癌症的方法、降低受试者中的肿瘤的体积随着时间的推移增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法或降低受试者中发生额外的转移的风险的方法。在一些实施例中，治疗可以停止、减缓、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施例中，治疗可以使受试者中的一种或多种癌症症状的数量、严重性和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于这样的方法，该方法包含将治疗有效量的本文公开的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体施用于有此需要的受试者(例如，患有或被鉴定或诊断为患有癌症的受试者)，例如，乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液恶性肿瘤。在一些实施例中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施例中，受试者患有实体瘤。在一些实施例中，癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤、血液恶性肿瘤，尤其是非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病或晚期实体瘤。
在一些实施例中，本文所公开的组合物和方法可以用于治疗有患癌症的风险的患者。患有癌症的患者可以用本领域已知的各种方法来标识。
如本文所用，“有效量”意指足以产生有益或所期望结果的量或剂量，该有益或所期望结果包含停止、减慢、延缓或抑制疾病，例如癌症的进展。
有效量将根据例如施用工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体、包括编码工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的多核苷酸的载体和/或其组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径而变化，因此可以在个体基础上确定施用。
可以以一次或多次施用来施用有效量。举例来说，工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者中癌症的进展的量，或者是足以改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如活检细胞、本文所述的任何癌细胞或细胞系(例如癌细胞系))体外增殖的量。如本领域所理解的，有效量可以变化，这尤其取决于患者病史以及其他因素，如所用的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的类型(和/或剂量)。
施用本文公开的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体、编码工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的多核苷酸和/或组合物的有效量和时间表可以根据经验确定，并且进行此类确定在本领域的技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如将接受工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的哺乳动物、本文公开的多核苷酸和/或组合物、施用途径、本文公开的多核苷酸和/或组合物的具体类型以及施用给哺乳动物的其他药物而变化。
有效量的工程改造的SIRPα变体和/或蛋白质构建体的典型日剂量为0.1mg/kg至100mg/kg(mg/kg患者体重)。在一些实施例中，剂量可以小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施例中，剂量可以大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施例中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg或1mg/kg。在一些实施例中，剂量为约1至10mg/kg、约1至5mg/kg或约2至5mg/kg。
在本文所述的任何方法中，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用于受试者。
在一些实施例中，一种或多种额外的治疗剂可以在施用工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体之前或之后施用于受试者。在一些实施例中，向受试者施用一种或多种额外的治疗剂，使得在受试者中，一种或多种额外的治疗剂和工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的生物活性期存在重叠。
在一些实施例中，可以向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。额外的治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的抑制剂：B-Raf的抑制剂、EGFR的抑制剂、MEK的抑制剂、ERK的抑制剂、K-Ras的抑制剂、c-Met的抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)的抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂、Akt的抑制剂、mTOR的抑制剂、双重PI3K/mTOR的抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂和异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)的抑制剂和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)的抑制剂。在一些实施例中，额外的治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1)(IDO1)(例如，艾卡哚司他)的抑制剂。
在一些实施例中，额外的治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的抑制剂：HER3的抑制剂、LSD1的抑制剂、MDM2的抑制剂、BCL2的抑制剂、CHK1的抑制剂、活化的hedgehog信号通路的抑制剂和选择性降解雌激素受体的药剂。
在一些实施例中，额外的治疗剂可以包括选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、纳布紫杉醇(nab-paclitaxel)、特伯纳尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、IFL、瑞格拉非尼(regorafenib)、溶血素(Reolysin)、爱宁达(Alimta)、立克癌(Zykadia)、索坦(Sutent)、替西罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依维莫司、索拉非尼(sorafenib)、帕唑帕尼(Votrient)、帕唑帕尼(Pazopanib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春花碱、沙利度胺(Thalomid)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺、来那度胺(lenalidomide)、阿扎胞苷(azacytidine)、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎滔林(enzastaurin)。
在一些实施例中，额外的治疗剂可以包括选自由以下组成的组的一种或多种治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、治疗靶向CX3CL1、治疗靶向CXCL9、治疗靶向CXCL10、治疗靶向CCL5、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。
在一些实施例中，向受试者施用卡铂、纳布紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI。
在一些实施例中，额外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗SIRPα抗体、抗CD47抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。在一些实施例中，额外的治疗剂是抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)或抗EGF受体抗体(例如，西妥昔单抗)。
药物组合物和施用途径
本文还提供了含有本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的药物组合物。药物组合物可以以本领域已知的任何方式配制。
药物组合物被配制成与其预期的施用途径(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)相容。组合物可以包含无菌稀释剂(例如无菌水或盐水)、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂或抗真菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂，如乙二胺四乙酸，缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及等渗剂，如糖(例如葡萄糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)或盐(例如氯化钠)，或它们的任意组合。还可以使用脂质体悬浮液作为药学上可接受的载剂。组合物的制剂可以被配制并封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果需要(例如，如在可注射配方中)，可以通过例如使用包衣(如卵磷脂)或表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长药剂的吸收。可替代地，可以通过植入物和微囊化递送系统来实现受控释放，该递送系统可以包含可生物降解的、生物相容的聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸)。
含有本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的组合物可被配制成用于以剂量单位形式(即，含有预定量的活性化合物的物理离散单位，以便于施用和剂量均匀)的肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)施用。
用于胃肠外施用的药物组合物优选地是无菌的和基本上等渗的，并在良好生产规范(GMP)条件下生产。医药组合物可以以单位剂型(即用于单次施用的剂量)提供。可使用一种或多种生理学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂配制医药组合物。调配物取决于所选择的施用途径。对于注射，可以将工程改造的SIRPα变体和蛋白构建体配制在水溶液中，优选地配制在生理相容的缓冲液中，以减少注射部位的不适。溶液可含有调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体可以是冻干形式，用于在使用前与合适的载体(例如无菌无热原水)一起构建。
组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物(例如猴子)中的标准制药程序来确定。例如，可以确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(50％的群体中治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。优选表现出高治疗指数的药剂。在药剂表现出不期望的副作用的情况下，应注意最小化潜在损害(即减少不想要的副作用)。毒性和治疗功效可以通过其他标准制药程序来确定。
示例性的剂量包含每千克受试者体重毫克或微克量的本文所述的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体中的任何一种(例如，约1μg/kg至约500mg/kg、约100μg/kg至约500mg/kg、约100μg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约0.5mg/kg、约1μg/kg至约50μg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约5mg/kg)。虽然这些剂量覆盖了广泛的范围，但是本领域普通技术人员将理解治疗剂的效力可以变化，并且有效量可以通过本领域已知的方法来确定。通常，首先施用相对低的剂量，并且主治卫生保健专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(当仍在研发阶段工作时)可以随后并逐渐增加剂量，直到获得适当的响应。此外，应当理解，任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包含所用的特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率以及工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的体内半衰期。
医药组合物可以与用于施用的说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开还提供了制造用于如本文所述的各种用途的工程改造的SIRPα变体和蛋白质构建体的方法。
实例
本发明在以下实例中进行了进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实例1.人SIRPα的基因改造的IgV结构域的设计
人SIRPα(hSIRPα)的IgV结构域属于免疫球蛋白超家族，其含有九条β链，包含A-B-C-C'-D-E-F-G-G2。螺旋位于E链和F链之间。hSIRPαIgV结构域的3D结构在图1中示出。
对CD47/hSIRPa复合物结构进行了详细分析。根据结构，确定hSIRPα中的Leu30、Gly34、Gln52、Lys53、Glu54、His56、Ser66、Thr67、Arg69、Lys93、Lys96、Gly97和Asp100参与与CD47的相互作用。这些相互作用的残基主要位于hSIRPa的环结构上，包含BC环、C'D环、DE环和FG环。结果表明hSIRPa主要通过其环区与CD47相互作用(图2)。
此外，hSIRPa-FD6的结构已被解决(Weiskopf,Kipp等人，《科学(Science)》，2013年7月5日；341(6141))。基于CD47/hSIRPa-FD6复合物结构(PDB ID:4KJY)确定hSIRPa-FD6与CD47的相互作用的残基包含Leu30、Gly34、Gln52、Arg53、Glu54、His56、Thr66、Thr67、Arg69、Lys93、Lys96、Gly97和Asp100。这些残基与CD47/hSIRPa复合物中显示的残基相同。在野生型中仅有的两个相互作用的残基Lys53和Ser66在hSIRPa-FD6中分别突变为Arg53和Thr66，并且导致对CD47的结合亲和力显著增加。从hSIRPa到hSIRPa-FD6的其他改变的残基不参与CD47相互作用。这一发现意味着Lys53和Ser66对于增加hSIRPa与CD47的结合亲和力可能是重要的。
为了找出哪些残基对于结合亲和力是良好的并且在C'D环中是稳定的，通过MOE试验版本进行位置53、54、55和56的残基扫描。根据来自残基扫描的结果，当Lys53被具有长侧链或具有芳环的侧链的氨基酸如精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸取代时，Lys53可以增加稳定性(图3A)。然而，这种替换不能改善hSIRPa的亲和力。另一方面，Glu54、Gly55和His56的替换显示出更大的灵活性(图3B、3C和3D)，hSIRPa的亲和力和稳定性可以通过将Glu54、Gly55和His56改变为一些其他氨基酸来改善。因此，突变被引入到Glu54、Gly55和His56用于筛选。
此外，Ile31、Glu54、Gly55、His56、Ser66和Thr67被鉴定为经由结构分析进行hSIRPa突变筛选的候选氨基酸。Val27、Val63和Lys68参与维持hSIRPa本身的结构。为了不对hSIRPa的结构产生负面影响，不建议改变这些残基。基于人CD47(hCD47)与hSIRPα(PDBID:2JJT)复合物的结构，分析了相互作用的残基。分析结果显示hSIRPαIgV结构域的BC环、C'D环和DE环中的多个相互作用的残基是高度保守的。如图2所示，这些环区内的氨基酸残基被加下划线。
为了筛选与野生型hSIRPα对hCD47相比具有更高阻断活性(例如，对hCD47具有不同结合亲和力)且与抗CD47参考抗体Hu5F9-G4相比具有更低RBC结合的hSIRPαIgV结构域突变体，对hSIRPαIgV结构域的BC环、C'D环和DE环内的选择的残基进行了突变。这些残基包含BC环内的His24-Val33的10个氨基酸(例如Ile31)、C'D环内的Glu54-His56的3个氨基酸和DE环内的Ser66-Asp73的8个氨基酸(例如Ser66和Thr67)。氨基酸位置基于hSIRPa的IgV结构域(SEQ ID NO:1)。
实例2.筛选和重新确认
噬菌粒表达系统用于通过噬菌体展示进行筛选。具体地，CD47抗原或表达CD47的细胞系用于淘选。将获得的噬菌体用于再感染TG1电穿孔感受态大肠杆菌细胞，然后将其铺展到LB琼脂板上并温育16小时。挑取单个菌落接种于补充有10％缓冲磷酸盐的700μl 2×YT培养基中。当OD600接近1时，加入1mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)以在30℃下诱导蛋白质表达。在16小时后，以3200g离心细菌培养物，并且收集上清液用于后续实验。
表达水平的确定
为了确定hSIRPαIgV结构域突变体的表达水平，制备包被有2μg/ml抗His抗体(R&D，目录号：MAB050-500)的ELISA板。将30μl的收集的上清液加入到ELISA板中，并在25℃下温育1小时。温育后，将稀释比为1:10000的山羊抗c-Myc HRP(Bethy，目录号：A190-104P)加入板中，并加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(SURMODICS，目录号：TMBW-0100-01)用于进行显色。使用VarioskanTMLUX板读取器(Thermo)测量在450nm处的吸光度值(OD450)。
人CD47结合能力的确定
为了确定hSIRPαIgV结构域突变体的人CD47结合能力，制备包被有与Fc区(hCD47ECD Fc)连接的1μg/ml人CD47胞外结构域(ECD)的ELISA板。将30μl的收集的上清液加入到ELISA板中，并在25℃下温育1小时。在温育后，将稀释比为1:10000的山羊抗c-Myc HRP加入板中，并加入TMB用于进行显色。使用VarioskanTMLUX板读取器测量在450nm处的吸光度值。
小鼠CD47结合能力的确定
为了确定hSIRPαIgV结构域突变体的小鼠CD47结合能力，制备包被有1μg/ml小鼠CD47 ECD Fc(Sino Bio，目录号：57231-M31H)的ELISA板。将100μl的收集的上清液加入到ELISA板中，并在25℃下温育1小时。在温育后，将稀释比为1:10000的山羊抗c-Myc HRP加入板中，并加入TMB用于进行显色。使用VarioskanTMLUX板读取器测量在450nm处的吸光度值。
hCD47/hSIRPα阻断能力的确定
为了确定hSIRPαIgV结构域突变体的hCD47/hSIRPα阻断能力，制备包被有1μg/ml人CD47 ECD Fc的ELISA板。将150μl的收集的上清液和20μl生物素标记的SIRPαECD His蛋白(终浓度：2.5μg/ml)加入到ELISA板中，并在25℃下温育1小时。在温育后，将稀释比为1:1000的抗生物素蛋白HRP(BioLegend，目录号：79004)加入板中，并加入TMB用于进行显色。使用VarioskanTMLUX板读取器测量在450nm处的吸光度值。
蛋白质热稳定性的确定
将100μl的收集的上清液转移到PCR管中，其在PCR机中以65℃或70℃加热90分钟。同时使用加热的上清液和未加热的上清液进行人CD47结合测定。具体地，制备包被有1μg/ml人CD47 ECD Fc的ELISA板。将30μl的加热的上清液或未加热的上清液加入到ELISA板中，并在25℃下温育1小时。在温育后，将稀释比为1:10000的山羊抗c-Myc HRP加入到板中，并加入TMB用于进行显色。使用VarioskanTMLUX板取数器测量在450nm处的吸光度值。
全细胞与CD47-TF-CHO-S、红细胞和血小板结合能力的确定
将3×104个CD47 tf CHO-S细胞(表达人CD47的转染的CHO-S细胞)、1×105个人红细胞(RBC)或3×105个人血小板与收集的上清液在4℃下温育30分钟。然后加入稀释比为1:100的抗His PE(Abcam，目录号：ab72467)，并且流式细胞术(Beckman Coulter，目录号：CytoFlex)用于检测MFI(平均荧光强度)值。
具有比野生型hSIRPα更高的hCD47/hSIRPα阻断能力的克隆被分离，并且基于它们的人CD47结合OD450(B)/表达OD450(E)比率进行分组。具体地，12个克隆具有超过2的hCD47结合B/E比率；5个克隆具有在1.75和2之间的该比率；5个克隆具有在1.5和1.75之间的该比率；7个克隆具有在1.25和1.5之间的该比率；并且2个克隆具有在1和1.25之间的该比率。还选择了B/E比率小于野生型hSIRPαIgV结构域的7个克隆。因为人SIRPα对小鼠CD47没有交叉反应性，所以通过该筛选还筛选出18个克隆，其小鼠CD47结合能力超过高于0.4的表达比率。因此，总共选择了56个候选克隆，其中详细表达、hCD47/hSIRPα阻断和CD47结合结果在图4A-4B中示出。
接下来，通过确定全细胞与CD47 tf CHO-S、RBC和血小板的结合能力，以及蛋白质在高温(例如65℃和70℃)下的热稳定性，进一步筛选所选择的克隆。基于全细胞结合测定的结果，选择血小板和RBC结合能力低于野生型hSIRPαIgV结构域的血小板和RBC结合能力的克隆，以及可以以不同结合能力结合至CD47 tf CHO-S的克隆。验证了所选择的克隆的蛋白质热稳定性，并且与野生型SIRPαIgV结构域相比没有观察到显著差异。最后，选择21个克隆，包含mt3-mt15(SEQ ID NOs:2-14)和mt16-mt23(SEQ ID NOs:33-40)。还产生了5个额外的克隆，包含mt31-mt35(SEQ ID NOs:41-45)。构建质粒以表达野生型SIRPαIgV结构域或与人IgG4铰链区和Fc区连接的工程改造的SIRPαIgV结构域突变体(SEQ ID NO:29)。表达的蛋白质的示意性结构在图5中示出。野生型SIRPαIgV结构域的BC环区、C'D环区和DE环区内的特定氨基酸突变和26个克隆在图6中示出。
实例3.hSIRPα-Fc的纯化以及通过Octet的hSIRPα-Fc与CD47-ECD-His的结合亲和力确定
表达的蛋白质通过蛋白质A柱纯化，随后通过HPLC-SEC(高效液相色谱法结合尺寸排阻色谱法；安捷伦)纯化，并且测量高分子量峰的百分比(HMW％)、主峰的百分比(主峰％)和低分子量峰的百分比(LMW％)。如图7所示，hSIRPα-Fc突变体蛋白可以使用上述方法以高纯度收获。使用去免疫化工具(免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Databaseand Analysis Resource)；Dhanda等人，“选择具有降低的HLA结合和免疫原性的候选蛋白类似物的策略和计算应用的开发(Development of a strategy and computationalapplication to select candidate protein analogues with reduced HLA bindingand immunogenicity)”，《免疫学(Immunology)》，153.1(2018):118-132)来分析hSIRPα-Fc-wt和13个hSIRPα-Fc突变体蛋白(mt3-mt15)的氨基酸序列以鉴定免疫原性区。未鉴定免疫原性。
hSIRPα-Fc蛋白与CD47-ECD-His的结合亲和力也由系统确定。如图8所示，进行了两组实验，其中hSIRPα-Fc-wt作为阴性对照，并且抗CD47参考抗体Hu5F9-G4作为阳性对照。与hSIRPα-Fc-wt的KD值相比，每种蛋白质的相对结合亲和力也从相应的KD值推导出来。结果表明，与野生型SIRPαIgV结构域相比，大多数工程改造的SIRPαIgV结构域突变体表现出更强的与CD47的结合。
实例4.CD47 tf CHO-S和表达CD47的肿瘤细胞的全细胞结合测定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白与CD47的全细胞结合能力，通过蛋白A色谱法来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并从500nM至100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0.064nM连续稀释(5倍)。PD1-Fc-wt(连接到人IgG4的N-末端的两个人PD1胞外结构域，其示意性结构在图5中示出)用作阴性对照。Hu5F9-G4用作阳性对照。将稀释的蛋白质与5×104个CD47tf CHO-S细胞、Jurkat细胞或Raji细胞一起温育。在温育后，加入抗-hFcr-PE(1:100，Invitrogen，目录号：109-115-098)，并且通过流式细胞术测量MFI值。
如图9A-9C所示，与抗CD47抗体Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt4、hSIRPα-Fc-mt8、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt11、hSIRPα-Fc-mt12、hSIRPα-Fc-mt13和hSIRPα-Fc-15表现出相似的抗CD47 tf CHO-S细胞、Jurkat细胞和Raji细胞的全细胞结合能力。
如图9D所示，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt19和hSIRPα-Fc-mt22表现出比hSIRPα-Fc-mt17、hSIRPα-Fc-mt18、hSIRPα-Fc-mt19和Hu5F9-G4更高的CD47 tf CHO-S细胞结合能力。此外，所有测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白显示出比hSIRPα-Fc-wt显著更高的CD47 tf CHO-S细胞结合能力。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的EC50值。
表1.CD47 tf CHO-S细胞结合的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 ～2.387
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 3.351
hSIRPα-Fc-mt10 1.458
hSIRPα-Fc-mt15 1.556
hSIRPα-Fc-mt16 1.918
hSIRPα-Fc-mt17 2.111
hSIRPα-Fc-mt18 2.374
hSIRPα-Fc-mt19 1.679
hSIRPα-Fc-mt21 2.078
hSIRPα-Fc-mt22 1.914
如图9E所示，hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15表现出比hSIRPα-Fc-mt21、hSIRPα-Fc-mt16和hSIRPα-Fc-mt23更高的Raji细胞结合能力。与Hu5F9-G4相比，所有测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白都表现出相似的Raji细胞结合能力，并且与hSIRPα-Fc-wt相比，表现出显著更高的Raji细胞结合能力。
实例5.红细胞结合测定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白的RBC结合能力，通过蛋白A色谱法来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并且从500nM至100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0.064nM连续稀释(5倍)。PD1-Fc-wt用作阴性对照。Hu5F9-G4用作阳性对照。将稀释的蛋白质与来自两个供体的1×105个人RBC细胞一起温育。在温育后，加入抗hFcr-PE(1:100，Invitrogen)，并且通过流式细胞术测量MFI值。
如图10A-10B所示，与抗CD47抗体Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt12、hSIRPα-Fc-mt13、hSIRPα-Fc-mt8、hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15表现出较弱的RBC结合能力。特别是，hSIRPα-Fc-mt6、hSIRPα-Fc-mt14和hSIRPα-Fc-wt不显示任何与RBC的结合。
如图10C所示，hSIRPα-Fc-mt18和hSIRPα-Fc-mt19显示出比Hu5F9-G4更高的RBC(来自供体1)结合能力，而hSIRPα-Fc-mt22、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt17、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt15和hSIRPα-Fc-mt21表现出比Hu5F9-G4更低的RBC结合能力。通过hSIRPα-Fc-wt未检测到RBC细胞结合。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的EC50值。
表2.RBC结合的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 0.6414
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) -
hSIRPα-Fc-mt10 0.4939
hSIRPα-Fc-mt15 2.908
hSIRPα-Fc-mt16 2.556
hSIRPα-Fc-mt17 0.5624
hSIRPα-Fc-mt18 0.1107
hSIRPα-Fc-mt19 0.125
hSIRPα-Fc-mt21 2.074
hSIRPα-Fc-mt22 0.4952
如图10D所示，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21、hSIRPα-Fc-mt23表现出比Hu5F9-G4显著更低的RBC(来自供体2)结合能力。通过hSIRPα-Fc-wt未检测到RBC细胞结合。
实例6.血小板结合测定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白的血小板结合能力，通过蛋白A珠来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并从500nM至100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0.064nM连续稀释(5倍)。PD1-Fc-wt用作阴性对照。Hu5F9-G4用作阳性对照。将稀释的蛋白质与来自两个供体的5×105个人血小板一起温育。在温育后，加入抗hFcr-PE(1:100；Invitrogen)，并且通过流式细胞术测量MFI值。
如图11A-11B所示，与抗CD47抗体Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt4、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt8、hSIRPα-Fc-mt11、hSIRPα-Fc-mt12、hSIRPα-Fc-mt13和hSIRPα-Fc-mt15表现出更强的血小板结合能力，而hSIRPα-Fc-mt14、hSIRPα-Fc-wt和hSIRPα-Fc-mt6表现出显著低的血小板结合能力。
如图11C所示，与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt19、hSIRPα-Fc-mt18、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt21、hSIRPα-Fc-mt20、hSIRPα-Fc-mt17和hSIRPα-Fc-mt22表现出更强或相似的血小板(来自供体1)结合能力。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的EC50值。
表3.血小板结合的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 0.3334
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 95.95
hSIRPα-Fc-mt10 0.1572
hSIRPα-Fc-mt15 0.2297
hSIRPα-Fc-mt16 0.3098
hSIRPα-Fc-mt17 0.2429
hSIRPα-Fc-mt18 0.1593
hSIRPα-Fc-mt19 0.1505
hSIRPα-Fc-mt20 0.2472
hSIRPα-Fc-mt21 0.2469
hSIRPα-Fc-mt22 0.3996
如图11D所示，与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt21、hSIRPα-Fc-mt23和hSIRPα-Fc-mt16表现出更强或相似的血小板结合能力。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的EC50值。
表4.血小板结合的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 0.5207
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 1.939
hSIRPα-Fc-mt10 ～0.4110
hSIRPα-Fc-mt15 ～0.4341
hSIRPα-Fc-mt16 0.5317
hSIRPα-Fc-mt21 ～0.4287
hSIRPα-Fc-mt23 ～0.4343
实例7.表达猴CD47的细胞的全细胞结合测定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白与猴CD47的全细胞结合能力，通过蛋白A珠来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并从500nM至100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0.064nM连续稀释(5倍)。PD1-Fc-wt用作阴性对照。Hu5F9-G4用作阳性对照。将稀释的蛋白质与1×105个转染的表达食蟹猴CD47的CHO-S细胞(cynoCD47tf CHO-S)或1×105个恒河猴肾上皮细胞系LLC-MK2一起温育。在温育后，加入抗hFcr-PE(1:100；Invitrogen)，并通过流式细胞术测量MFI值。如图12A-12B所示，所有hSIRPα-Fc突变体蛋白都可以与猴CD47结合。
如图12C所示，Hu5F9-G4表现出比hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23更强的LLC-MK2结合能力。
实例8.表达小鼠CD47的细胞的全细胞结合测定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白与小鼠CD47的全细胞结合能力，通过蛋白A珠来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并从1000nM至200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM和0.0128nM连续稀释(5倍)。PD1-Fc-wt用作阴性对照。MIAP410(一种抗人小鼠CD47抗体)用作阳性对照。将稀释的蛋白质与3×104个EMT-6细胞一起温育。在温育后，加入抗hFcr-PE(1:100；Invitrogen)，并且通过流式细胞术测量MFI值。对于MIAP410，使用了抗小鼠(H+L)-FITC(1:100)。如图13A-13B所示，hSIRPα-Fc-mt13、hSIRPα-Fc-mt11、hSIRPα-Fc-mt4、hSIRPα-Fc-mt12、hSIRPα-Fc-mt8和hSIRPα-Fc-mt10可以与表达小鼠CD47的细胞结合。然而，hSIRPα-Fc-wt、hSIRPα-Fc-mt6、hSIRPα-Fc-mt14和hSIRPα-Fc-mt15不与EMT-6细胞结合。
实例9.血细胞凝聚(HA)活性的确定
为了确定由hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导的HA活性，通过用0.9％氯化钠缓冲液洗涤两次，从两名健康供体的全血中制备10％RBC溶液，然后在0.9％氯化钠缓冲液中稀释10倍。将hSIRPα-Fc突变体蛋白连续稀释(3倍)至500nM、166.7nM、55.6nM、18.5nM、6.2nM、2.1nM、685.8pM、228.6pM、76.2pM、25.4pM或8.4pM的最终浓度，并在室温(RT)下与12μl的10％RBC溶液一起在圆底96孔板中温育过夜。在温育后，凝集的RBC均匀地包覆孔，而未凝集的细胞在孔的底部形成明显的红点。Hu5F9-G4用作阳性对照。hSIRPα-Fc-wt和PD1-Fc-wt用作阴性对照。如图14A-14C所示，没有一种测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导血细胞凝集。
实例10.对CD47 tf CHO-S细胞、FaDu细胞和Raji细胞的阻断能力的确定
为了确定hSIRPα-Fc突变体蛋白对人CD47的阻断能力，通过蛋白A珠来纯化hSIRPα-Fc突变体蛋白，并从1000nM至125nM、15.63nM、1.95nM、0.24nM、0.03nM、0.0038nM和0.0004nM连续稀释(8倍)。PD1-Fc-wt用作阴性对照。Hu5F9-G4用作阳性对照。将稀释的蛋白质与3×104个CD47 tf CHO-S细胞(表达人CD47的转染的CHO-S细胞)、FaDu细胞或Raji细胞以及1μg/ml生物素标记的hSIRPα-Fc-wt一起温育。在温育后，加入链霉亲和素-PE(每孔0.3μl，eBioscience，目录号：EBS12-4317-87)，并且通过流式细胞术测量MFI值。
如图15A-15C所示，所有测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白可以阻断hSIRPα和CD47 tfCHO-S细胞或表达CD47的肿瘤细胞(FaDu和Raji)之间的相互作用。特别是，hSIRPα-Fc-mt4、hSIRPα-Fc-mt8、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt11、hSIRPα-Fc-mt12、hSIRPα-Fc-mt13、hSIRPα-Fc-mt15和hSIRPα-Fc-wt表现出与Hu5F9-G4相当的阻断能力。
如图15D所示，与Hu5F9-G4相比，所有测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白都表现出相似的全细胞阻断能力。hSIRPα-Fc-wt表现出最低的CD47/SIRPα阻断能力。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的IC50值。
表5.全细胞阻断的IC50值
蛋白质 IC50(nM)
Hu5F9-G4 0.6765
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 6.122
hSIRPα-Fc-mt10 0.3282
hSIRPα-Fc-mt15 0.3758
hSIRPα-Fc-mt16 0.5815
hSIRPα-Fc-m17 0.4449
hSIRPα-Fc-mt18 0.1529
hSIRPα-Fc-mt19 0.2129
hSIRPα-Fc-mt21 0.1975
hSIRPα-Fc-mt22 0.2757
如图15E所示，hSIRPα-Fc-mt21表现出最强的全细胞阻断能力。与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16和hSIRPα-Fc-mt23表现出相似的全细胞阻断能力。hSIRPα-Fc-wt表现出最低的CD47/SIRPα阻断能力。在下表中列出了测试的hSIRPα-Fc蛋白的IC50值。
表6.全细胞阻断的IC50值
实例11.通过小鼠巨噬细胞对表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的诱导
表达人CD47的肿瘤细胞(Jurkat、FaDu或Raji)的吞噬作用通过在hSIRPα-Fc突变体蛋白的存在下将肿瘤细胞与Raw264.7小鼠巨噬细胞一起温育来确定。实验进行如下。Jurkat、FaDu或Raji细胞在37℃下用5nM CellTraceTMCFSE(Thermo，目录号：C34554)标记10分钟，然后用含有10％FBS(胎牛血清)的完全DMEM培养基洗涤。然后将hSIRPα-Fc突变体蛋白连续稀释(10倍)至1μM、100nM、10nM、1nM、100pM和10pM的最终浓度。Hu5F9-G4和hSIRPα-Fc-wt(延龄草)用作阳性对照。PD1-Fc-wt用作阴性对照。1×105个细胞/孔CFSE标记的Jurkat细胞、FaDu细胞或Raji细胞(靶细胞)与稀释的hSIRPα-Fc突变体蛋白在低结合96孔U形板中在37℃下温育30分钟。之后，将5×104个Raw264.7细胞添加到每个孔中，并将板在37℃下温育2小时。用PE-花青7缀合的F4/80抗体(eBioscience，目录号：25-4801-82)对Raw264.7细胞进行染色。通过流式细胞术计算来自巨噬细胞的CFSE+F4/80+(表明巨噬细胞吞噬了CFSE标记的Jurkat、FaDu或Raji细胞)占来自巨噬细胞的总F4/80信号的百分比来评估hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导吞噬作用的能力。
如图16A-16C所示，与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt4、hSIRPα-Fc-mt8、hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt13和hSIRPα-Fc-mt15表现出相当或甚至更高的诱导表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的能力。还计算了每个肿瘤细胞的EC50值，如下表所示。
表7.Jurkat细胞的吞噬作用的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 0.17
SIRPα-Fc(延龄草，G4) 23.28
hSIRPα-Fc-mt4 0.28
hSIRPα-Fc-mt6 18.69
hSIRPα-Fc-mt8 0.43
hSIRPα-Fc-mt11 0.24
hSIRPα-Fc-mt12 0.48
hSIRPα-Fc-mt13 0.61
hSIRPα-Fc-mt14 22.06
hSIRPα-Fc-mt15 1.22
表8.FaDu细胞的吞噬作用的EC50值
表9.Raji细胞的吞噬作用的EC50值
蛋白质 EC50(nM)
Hu5F9-G4 0.05
SIRPα-Fc(延龄草，G4) 23.06
hSIRPα-Fc-mt4 0.06
hSIRPα-Fc-mt6 15.87
hSIRPα-Fc-mt8 0.08
hSIRPα-Fc-mt10 0.07
hSIRPα-Fc-mt13 0.09
hSIRPα-Fc-mt15 0.13
如图16D所示，与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23表现出相当的诱导DLD1细胞的吞噬作用的能力。如图16E所示，与Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt20、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23表现出相当的诱导DLD1细胞的吞噬作用的能力。
实例12.通过小鼠巨噬细胞对RBC吞噬作用的诱导
通过在hSIRPα-Fc突变体蛋白的存在下，将RBC与Raw264.7小鼠巨噬细胞一起温育来确定人RBC的吞噬作用。实验进行如下。在37℃下用5nM CellTraceTMCFSE(Thermo)标记RBC持续10分钟，然后用含有10％FBS的完全DMEM培养基洗涤。然后将hSIRPα-Fc突变体蛋白连续稀释(10倍)至1μM、100nM、10nM、1nM、100pM和10pM的最终浓度。Hu5F9-G4和hSIRPα-Fc-wt(延龄草)用作阳性对照。PD1-Fc-wt用作阴性对照。1×106个细胞/孔CFSE标记的RBC(靶细胞)与稀释的hSIRPα-Fc突变体蛋白在低结合96孔U形板中在37℃下温育30分钟。之后，将5×104个Raw264.7细胞添加到每个孔中，并将板在37℃下温育2小时。Raw264.7细胞用PE-花青7缀合的F4/80抗体(eBioscience)染色。通过流式细胞术计算来自巨噬细胞的CFSE+F4/80+(表明巨噬细胞吞噬了CFSE标记的红细胞)与来自巨噬细胞的总F4/80信号的百分比来评估hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导RBC吞噬作用的能力。
如图17A所示，所有测试的hSIRPα-Fc突变体蛋白都表现出较弱的诱导巨噬细胞(Raw264.7)吞噬RBC的能力。
实例13.通过小鼠巨噬细胞对血小板吞噬作用的诱导
通过在hSIRPα-Fc突变体蛋白的存在下，将血小板与Raw264.7小鼠巨噬细胞一起温育来确定人血小板的吞噬作用。实验进行如下。血小板在37℃下用5nM CellTraceCFSE(Thermo)标记10分钟，然后用含有10％FBS的完全DMEM培养基洗涤。然后将hSIRPα-Fc突变体蛋白连续稀释(10倍)至500nM、50nM、5nM、0.5nM、50pM、5pM和0.5pM的最终浓度。Hu5F9-G4和hSIRPα-Fc-wt(延龄草)用作阳性对照。PD1-Fc-wt用作阴性对照。5×105个细胞/孔CFSE标记的血小板(靶细胞)与稀释的hSIRPα-Fc突变体蛋白在低结合96孔U形板中在37℃下温育30分钟。之后，将5×104个Raw264.7细胞添加到每个孔中，并将板在37℃下温育2小时。Raw264.7细胞用PE-花青7缀合的F4/80抗体(eBioscience)染色。通过流式细胞术计算来自巨噬细胞的CFSE+F4/80+(表明巨噬细胞吞噬了CFSE标记的RBC细胞)与来自巨噬细胞的总F4/80信号的百分比来评估hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导血小板吞噬作用的能力。
如图17B所示，hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23表现出较弱的诱导巨噬细胞(Raw264.7)吞噬血小板的能力。
实例14.通过人巨噬细胞对表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的诱导
通过人巨噬细胞对表达CD47的肿瘤细胞(Raji、DLD1或Jurkat)的吞噬作用确定如下。从人血液中分离PBMC，并通过在含有10％FBS、1×链霉素/青霉素和200U/ml GM-CSF(BioLegend，目录号：576304)的完全RPMI培养基中温育单核细胞10-14天，将单核细胞分化为巨噬细胞。单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)变成贴壁的，并且未附着的细胞被洗掉。通过与(eBioscience，目录号：EBS00-4555-56)一起温育并刮擦，从板上分离MDM。表达人CD47的肿瘤细胞(Raji、DLD1或Jurkat)在37℃下用5nM CellTraceCFSE(Thermo)标记10分钟，然后用含有10％FBS的完全RPMI培养基洗涤。然后将候选克隆连续稀释(10倍)至200nM、20nM、2nM、200pM、20pM和2pM的最终浓度。Hu5F9-G4和hSIRPα-Fc-wt(延龄草)用作阳性对照。PD1-Fc-wt用作阴性对照。2.4×104-6×104个细胞/孔CFSE标记的Raji细胞、DLD1细胞或Jurkat细胞(靶细胞)与稀释的hSIRPα-Fc突变体蛋白在低结合96孔U形板中在37℃下温育30分钟。之后，在每个孔中加入1.2×104-3×104个细胞/孔MDM细胞(靶细胞数量的一半)，并且将板在37℃下温育2小时。MDM细胞用PE-花青7缀合的CD14抗体(eBioscience，目录号：25-0149-42)染色。通过流式细胞术计算来自巨噬细胞的CFSE+CD14+(表明巨噬细胞吞噬了CFSE标记的RBC细胞)占来自巨噬细胞的总CD14信号的百分比来评估hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导吞噬作用的能力。
如图18A-18C所示，与hSIRPα-Fc-wt(hSIRPα-Fc)相比，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt15和Hu5F9-G4表现出更好的诱导通过MDM细胞对表达CD47的肿瘤细胞的吞噬作用的能力。
如图18D所示，与hSIRPα-Fc-wt相比，hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23表现出更好的诱导通过MDM细胞对DLD1细胞的吞噬作用的能力。Hu5F9表现出诱导通过MDM细胞的吞噬作用的最高能力。
实例15.通过人巨噬细胞对RBC吞噬作用的诱导
通过人巨噬细胞对RBC的吞噬作用确定如下。从人血液中分离PBMC，并且通过在含有10％FBS、1×链霉素/青霉素和200U/ml GM-CSF(Biolegend)的完全RPMI培养基中温育单核细胞10-14天，将单核细胞分化为巨噬细胞。MDM变成贴壁的，并且未附着的细胞被洗去。通过与(eBioscience)一起温育并刮擦，从板上分离MDM。在37℃下用5nMCellTraceTMCFSE(Thermo)标记RBC持续10分钟，用含有10％FBS的完全RPMI培养基洗涤。然后将候选克隆连续稀释(10倍)至200nM、20nM、2nM、200pM、20pM和2pM的最终浓度。Hu5F9-G4和hSIRPα-Fc-wt(延龄草)用作阳性对照。PD1-Fc-wt用作阴性对照。4×105个细胞/孔CFSE标记的RBC(靶细胞)与稀释的hSIRPα-Fc突变体蛋白在低结合96孔U形板中在37℃下温育30分钟。之后，向每个孔中加入4×104个MDM细胞，并将板在37℃下温育2小时。MDM细胞用PE-花青7缀合的CD14抗体(eBioscience)染色。通过计算来自巨噬细胞的CFSE+CD14+(表明巨噬细胞吞噬了CFSE标记的RBC细胞)占来自巨噬细胞流式细胞术的总CD14信号的百分比来评估hSIRPα-Fc突变体蛋白诱导吞噬作用的能力。
如图19A-19B所示，hSIRPα-Fc-mt10、hSIRPα-Fc-mt13和hSIRPα-Fc-mt15不诱导人MDM吞噬RBC。如图19C所示，hSIRPα-Fc-mt15、hSIRPα-Fc-mt16、hSIRPα-Fc-mt21和hSIRPα-Fc-mt23不诱导人MDM吞噬RBC。
实例16.体内抗肿瘤功效的确定
使用Raji细胞确定hSIRPα-Fc突变体蛋白的体内抗肿瘤功效。具体地，在第0天用Raji细胞接种NOD/SCID小鼠。在第4天，将小鼠置于对照组和四个治疗组中。对于治疗组小鼠，hSIRPα-Fc-mt10(G1)、hSIRPα-Fc-mt15(G2)、hSIRPα-Fc-wt(延龄草；G3)或Hu5F9-G4(G4)在接种后第7天和第14天通过腹膜内注射施用。对照组小鼠被施用等体积的安慰剂。在接种后第4天、第7天、第11天、第14天和第18天测量每组中小鼠的肿瘤体积。每组中小鼠的平均肿瘤体积在下表中示出。还确定了肿瘤生长抑制(TGI)和p值。
表10.
接种后第18天 剂量水平 平均值±SEM TGI(％) P值
hSIRPα-Fc-mt10 3.2mg/kg 289±147 81 0.0002(***)
hSIRPα-Fc-mt15 3.2mg/kg 288±110 80 <0.0001(****)
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 3.2mg/kg 772±181 42 0.0295(*)
Hu5F9-G4 6mg/kg 243±86 82 <0.0001(****)
安慰剂 - 1303±116 - -
注释：*:p<0.05、**:p<0.01、***:p<0.001、****:p<0.0001
如图20A-20B所示，与抗CD47抗体Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15表现出相当的抗肿瘤功效。此外，hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15两者在抑制肿瘤生长方面比hSIRPα-Fc-wt更有效。还确定了每组中小鼠的存活曲线，如图20C所示，这表明与安慰剂对照相比，施用hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15可以显著延长存活小鼠的百分比。
在不同的实验中，使用NCI-H82细胞确定了hSIRPα-Fc突变体蛋白的体内抗肿瘤功效。具体地，在第0天用NCI-H82细胞接种NOD/SCID小鼠。在第4天，将小鼠置于对照组和四个治疗组中。对于治疗组小鼠，hSIRPα-Fc-mt10(G1)、hSIRPα-Fc-mt15(G2)、hSIRPα-Fc-wt(延龄草；G3)或Hu5F9-G4(G4)在接种后的第4天、第7天、第14天、第11天、第14天、第18天、第21天、第25天和第28天通过腹膜内注射施用。对照组小鼠被施用等体积的安慰剂。在接种后第4天、第7天、第14天、第11天、第14天、第18天、第21天、第25天、第28天和第32天测量每组中小鼠的肿瘤体积。每组中小鼠的平均肿瘤体积在下表中示出。还确定了肿瘤生长抑制(TGI)和p值。
表11.
接种后第25天 剂量水平 平均值±SEM TGI(％) P值
hSIRPα-Fc-mt10 2.7mg/kg 95.36±4.912 105 <0.0001(***)
hSIRPα-Fc-mt15 2.7mg/kg 90.73±3.312 105 <0.0001(****)
hSIRPα-Fc-wt(延龄草) 2.7mg/kg 1002±189.9 23 0.30
Hu5F9-G4 5mg/kg 144.3±28.14 101 <0.0001(****)
安慰剂 - 1262±42.6 - -
注释：*:p<0.05、**:p<0.01、***:p<0.001、****:p<0.0001
如图21A-21B所示，与抗CD47抗体Hu5F9-G4相比，hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15表现出相当的抗肿瘤功效。此外，hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15两者在抑制肿瘤生长方面比hSIRPα-Fc-wt更有效。还确定了每组中小鼠的存活曲线，如图21C所示，这表明与安慰剂对照相比，施用hSIRPα-Fc-mt10和hSIRPα-Fc-mt15可以显著延长存活小鼠的百分比。
其他实施例
应该了解，虽然本发明已经结合其上述详细说明进行了描述，但是上述描述是打算说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改都在以下权利要求的范围内。

Claims (88)

1.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列，其中所述工程改造的SIRPα多肽包括在BC环、C'D环和/或DE环处的一个或多个氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A、H、N、I、R、G、S、D或L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是W、F、Q、L、D、K、R、A或P；和
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P、I、T、N、V、R、L、S、G或Q。
3.根据权利要求1或2所述的工程改造的SIRPα多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是I、T、N、V、L、S、G或Q。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W、K、Y、L、A、N或T。
5.根据权利要求4所述的工程改造的SIRPα多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W、K、Y、L、A或N。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的S66的所述氨基酸是Q或N；和
(b)对应于SEQ ID NO:1的T67的所述氨基酸是G。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是N或T；和
(b)对应于SEQ ID NO:1的T26的所述氨基酸是I。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是G、F、R、A、L或T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是R或Y；和
(c)对应于SEQ ID NO:1的D73的所述氨基酸是I。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的K53的所述氨基酸是R。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的K53的所述氨基酸不是R。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的位置27的所述氨基酸是V或L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的位置63的所述氨基酸是V；和
(c)对应于SEQ ID NO:1的位置68位的所述氨基酸是K。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45至少85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
13.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是W；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P。
14.根据权利要求13所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。
15.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是F；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是I；和
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是G。
16.根据权利要求15所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:3至少90％相同的氨基酸序列。
17.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是N；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是H；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是Q；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T；
(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的所述氨基酸是Q；和
(f)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是R。
18.根据权利要求17所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。
19.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是N；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是L；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是I；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的T67的所述氨基酸是G。
20.根据权利要求19所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的氨基酸序列。
21.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的T26的所述氨基酸是I；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是I；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是L；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是Y。
22.根据权利要求21所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的氨基酸序列。
23.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是K；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是D；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是R。
24.根据权利要求23所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列。
25.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是G；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是N；和
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是F。
26.根据权利要求25所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列。
27.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是Q；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T；和
(f)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是F。
28.根据权利要求27所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列。
29.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是S；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是K；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是V；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是R。
30.根据权利要求29所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列。
31.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是Y；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是G；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是R；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是A。
32.根据权利要求31所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列。
33.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是D；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是F；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是L；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是R。
34.根据权利要求33所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列。
35.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是A；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是L；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是D；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是S；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的N71的所述氨基酸是S。
36.根据权利要求35所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列。
37.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是T；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是K；
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是Q；和
(f)对应于SEQ ID NO:1的D73的所述氨基酸是I。
38.根据权利要求37所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:14至少90％相同的氨基酸序列。
39.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:33至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是A；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P。
40.根据权利要求39所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:33至少90％相同的氨基酸序列。
41.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:34至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是S；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是P；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是L。
42.根据权利要求41所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:34至少90％相同的氨基酸序列。
43.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:35至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是S；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是R。
44.根据权利要求43所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:34至少90％相同的氨基酸序列。
45.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:36至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是W；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是G；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是T。
46.根据权利要求45所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:36至少90％相同的氨基酸序列。
47.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:37至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的S29的所述氨基酸是Q；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是H；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的S66的所述氨基酸是N。
48.根据权利要求47所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:37至少90％相同的氨基酸序列。
49.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:38至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是S；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是P；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是R；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是L。
50.根据权利要求49所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:38至少90％相同的氨基酸序列。
51.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:39至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的所述氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是D；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是R；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的M72的所述氨基酸是R。
52.根据权利要求51所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:39至少90％相同的氨基酸序列。
53.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的V27的所述氨基酸是L；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是T；
(c)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是P；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的E70的所述氨基酸是G。
54.根据权利要求53所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:40至少90％相同的氨基酸序列。
55.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是Q；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T。
56.根据权利要求55所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:41至少90％相同的氨基酸序列。
57.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:42至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是T；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是N；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是R；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是Q；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是T。
58.根据权利要求57所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:42至少90％相同的氨基酸序列。
59.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是Y；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是K；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是Q。
60.根据权利要求59所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:43至少90％相同的氨基酸序列。
61.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:44至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的I31的所述氨基酸是N；
(c)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(d)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是K；和
(e)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是Q。
62.根据权利要求61所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:44至少90％相同的氨基酸序列。
63.一种工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:45至少80％相同的氨基酸序列，其中所述多肽包括以下中的一种或多种：
(a)对应于SEQ ID NO:1的H24的所述氨基酸是R；
(b)对应于SEQ ID NO:1的E54的所述氨基酸是A；
(c)对应于SEQ ID NO:1的G55的所述氨基酸是K；和
(d)对应于SEQ ID NO:1的H56的所述氨基酸是Q。
64.根据权利要求63所述的工程改造的SIRPα多肽，其包括与SEQ ID NO:45至少90％相同的氨基酸序列。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽，其中所述工程改造的SIRPα多肽进一步包括CH2结构域和CH3结构域。
66.根据权利要求65所述的工程改造的SIRPα多肽，其中所述工程改造的SIRPα多肽进一步包括铰链区。
67.根据权利要求65所述的工程改造的SIRPα多肽，其中所述CH2结构域是IgG CH2结构域，并且所述CH3结构域是IgG CH3结构域。
68.根据权利要求65所述的工程改造的SIRPα多肽，其中所述工程改造的SIRPα多肽包括与SEQ ID NOs:15-28和46-58中的任何一个至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。
69.一种蛋白质构建体，其包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽。
70.根据权利要求69所述的蛋白质构建体，其包括两种或更多种工程改造的SIRPα多肽。
71.根据权利要求70所述的蛋白质构建体，其中至少两种工程改造的SIRPα多肽是相同的。
72.根据权利要求70所述的蛋白质构建体，其中至少两种工程改造的SIRPα多肽是不同的。
73.根据权利要求69所述的蛋白质构建体，其进一步包括Fc区。
74.根据权利要求73所述的蛋白质构建体，其中所述Fc区是IgG4 Fc区。
75.根据权利要求73所述的蛋白质构建体，其中所述Fc区是IgG1 Fc区(例如，具有LALA突变或LALA-PG突变)。
76.一种蛋白质构建体，其包括：
第一融合多肽，所述第一融合多肽包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽、第一CH2结构域和第一CH3结构域；和
第二融合多肽，所述第二融合多肽包括第二CH2结构域和第二CH3结构域；
其中所述第一融合多肽和所述第二融合多肽彼此缔合，形成二聚体。
77.根据权利要求76所述的蛋白质构建体，其中所述第二融合多肽进一步包括第二工程改造的SIRPα多肽。
78.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽或根据权利要求69至77中任一项所述的蛋白质构建体；和
药学上可接受的载剂。
79.一种核酸，其编码根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽或根据权利要求69至77中任一项所述的蛋白质构建体。
80.一种载体，其包括根据权利要求79所述的核酸。
81.一种细胞，其包括根据权利要求79所述的核酸。
82.根据权利要求81所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
83.一种产生工程改造的SIRPα多肽或包括所述工程改造的SIRPα多肽的蛋白质构建体的方法，所述方法包括：
(a)在足以使细胞产生所述工程改造的SIRPα多肽或所述蛋白质构建体的条件下培养根据权利要求81或82所述的细胞；和
(b)收集由所述细胞产生的所述工程改造的SIRPα多肽或所述蛋白质构建体。
84.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽或根据权利要求69至77中任一项所述的蛋白质构建体。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述受试者患有实体瘤或血液癌症。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症是急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌或小细胞肺癌肿瘤。
87.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽或根据权利要求69至77中任一项所述的蛋白质构建体。
88.一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包括根据权利要求1至68中任一项所述的工程改造的SIRPα多肽或根据权利要求69至77中任一项所述的蛋白质构建体。
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