CN117586379B - 一种重组纤连蛋白的制备方法及应用 - Google Patents
一种重组纤连蛋白的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组纤连蛋白的制备方法及应用。本发明公开了一种重组小片段纤连蛋白突变体的制备技术。该重组纤连蛋白分子量小但包括FN的主要功能区，可在工程菌中高效表达，制备过程简单、成本低、适用于大规模生产。在皮肤成纤维细胞或角质形成细胞促进增殖方面表现出较高的活性，并具有显著的舒缓修护、保湿、增强皮肤弹性以及抗皱功效，说明该重组蛋白具有作为药妆及美容护肤等方面原料和成品的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组纤连蛋白的制备方法及应用。
背景技术
纤连蛋白(FN)是一种广泛存在于脊椎动物中的多功能糖蛋白，它不仅参与ECM(细胞外基质)的形成，而且还调节细胞的粘附、迁移和分化，从而提供组织的发育和再生。FN分子由220kDa和250kDa大小的两个亚基组成，在两个链的C端由两个二硫键相连。该分子由三种重复的模块结构组成—Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(FNI、FNⅡ和FNⅢ)。每个亚基包括12个FNI模块(每个约40个氨基酸残基)、2个FNⅡ模块(每个约50个残基)和15-17个FNⅢ模块(每个约90-100个残基)。FN的Ⅲ8-10为中央细胞结构域，其中Ⅲ-10含有RGD序列，可与整合素受体相互作用，进而影响细胞黏附、迁移等，Ⅲ-9含有能与整合素结合的协同基序Pro-His-Ser-Arg-Asn(PHSRN)，Ⅲ-8能促进Ⅲ-9的空间定向稳定。
传统天然纤连蛋白往往从人体或动物中提取，工艺复杂且成本高，重组纤连蛋白是应用了重组DNA或重组RNA的技术结合先进的分离纯化技术从而获得高纯度、高活性的蛋白质，解决了天然纤连蛋白提取的成本和安全性问题。由于天然FN分子量大，全序列表达可行性低，因此可选取FN不同功能的结构域进行表达，以获得具有不同功能的重组FN。
FN已用于肿瘤、生物材料等方面，也开始应用于美容护肤领域。尽管专利CN111548410B、CN113717290A、CN114702571A、CN110204608B、CN113186109A和CN113527523A中有说明重组FN具有抗皱、抗衰老、促透皮及修复作用，但舒缓及保湿作用在美容护肤中非常重要，目前并无具有该作用的重组FN报道；NHDF为人皮肤成纤维细胞，更适用于美容护肤应用方面的重组FN的活性测定，但目前也并无使用NHDF测定活性的相关报道。
为了克服天然提纯FN工艺复杂、成本高；天然FN分子量大，全序列表达可行性低；现有重组蛋白可溶性低、分离纯化复杂、活性低等技术问题，本发明提供一种大肠杆菌高效表达重组纤连蛋白的制备技术及其活性、功能检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌表达重组纤连蛋白。克服了天然提纯FN工艺复杂、成本高；天然FN分子量大，全序列表达可行性低；现有重组蛋白FN可溶性低、分离纯化复杂等技术问题。
一方面，本发明提供了一种重组纤连蛋白，包括FN的功能片段和/或标签序列；所述的FN的功能片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
具体地，所述的标签序列包括但不限于：His标签、FLAG标签、c-Myc标签、HA标签、GST标签、MBP标签和/或SUMO标签。
优选地，所述的标签序列为His标签，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
具体地，所述的重组纤连蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
又一方面，本发明提供了前述的重组纤连蛋白的制备方法，该方制备法包括以下步骤：
S1、构建载体，将SEQ ID NO.3克隆到表达载体上，获得重组载体；
S2、构建工程菌，将步骤S1的重组载体转化到宿主细胞中，筛选阳性克隆，获得工程菌；
S3、工程菌的高密度发酵，采用拟指数补料进行高密度诱导培养，获得菌泥；
S4、重组纤连蛋白的纯化，将步骤S3的菌泥破碎，离心，过膜，柱子纯化，获得粗提液；将粗提液脱盐，离子交换层析纯化，获得重组纤连蛋白工作液。
具体地，所述步骤S1的表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
进一步具体地，所述真核表达载体可以选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体。
优选地所述的表达载体为pET-22b(+)载体。
具体地，所述步骤S2的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
优选地，所述的宿主细胞为原核细胞。
进一步优选地，所述的细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
具体地，所述步骤S3的拟指数补料分为第一阶段和第二阶段；所述的第一阶段是在培养液的葡萄糖浓度降至0，或pH和溶氧显著上升时，开始补料。
具体地，所述步骤S3的诱导是在OD600不低于20时加入诱导剂。
具体地，所述的第二阶段是在诱导开始时进行恒pH补料。
具体地，所述步骤S4的柱子纯化使用镍柱；所述的脱盐使用凝胶过滤层析柱；所述的离子交换层析纯化使用DEAE阴离子交换层析柱。
又一方面，本发明提供了前述的重组纤连蛋白的促细胞增殖黏附的活性检测方法，该方法包括NHDF细胞生长活性测定。
又一方面，本发明提供了前述的重组纤连蛋白在体外贴壁细胞培养中的应用。
又一方面，本发明提供了前述的重组纤连蛋白在制备皮肤损伤修护、舒缓、抗皱以及保湿产品中的应用。
本发明所取得的技术效果：本发明的重组纤连蛋白总表达水平为10％，可溶性表达水平为87％；高密度发酵OD600可达到86；利用三种纯化方法能获得纯度高达95％以上的重组纤连蛋白。本发明的重组纤连蛋白较现有技术具有更好的促细胞生长的效果。利用本发明的重组纤连蛋白制备的抗皱霜具有显著的保湿和抗皱功效。
附图说明
图1为本发明pET-22b(+)-rFN载体框架图谱。
图2为重组纤连蛋白的制备流程图。
图3为PCR扩增目的基因及线性化载体的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中1孔道为maker，图中2孔道为目的基因的琼脂糖凝胶电泳结果，3孔道为线性化载体的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4为重组纤连蛋白摇瓶发酵表达的蛋白电泳图。
图5为重组纤连蛋白镍柱纯化电泳图其中，孔道1为破碎上清；孔道2为流穿；孔道3-5为洗杂液；孔道6-9为50mM咪唑洗脱液；孔道10为100mM咪唑洗脱液。
图6为重组纤连蛋白纯化电泳图，其中，孔道1、2、3分别为凝胶过滤层析纯化目标蛋白峰前、中、后的电泳结果，孔道4为DEAE离子交换层析目标蛋白峰电泳结果。
图7为实施例1的OD450的值及拟合曲线。
图8为实施例1与对比例1-10作用于NHDF的EC50的值。
图9为对比例1的OD450的值及拟合曲线。
图10为对比例2的OD450的值及拟合曲线。
图11为对比例3的OD450的值及拟合曲线。
图12为对比例4的OD450的值及拟合曲线。
图13为对比例5的OD450的值及拟合曲线。
图14为对比例6的OD450的值及拟合曲线。
图15为对比例7的OD450的值及拟合曲线。
图16为对比例8的OD450的值及拟合曲线。
图17为对比例9的OD450的值及拟合曲线。
图18为对比例10的OD450的值及拟合曲线。
图19为受试者测试区域皮肤角质层水分含量变化趋势。
图20为受试者测试区域皮肤弹性R2变化趋势。
图21为受试者测试区域皮肤弹性R5变化趋势。
图22为受试者测试区域皱纹长度变化趋势。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文所用的术语“包括(comprises)”或“包含(comprising)”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。
本文所用的术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
本发明中所述的重组FNⅢ8-10即为重组纤连蛋白。
实施例1
基于天然纤连蛋白结构域的功能，选定天然纤连蛋白的中央细胞结构域FNⅢ8-10，所述FNⅢ8-10结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1氨基酸序列内含有Arg-Gly-Asp的三个连续氨基酸残基序列和Pro-His-Ser-Arg-Asn(PHSRN)协同序列，用于与细胞特定类型的整合素受体结合。
该重组纤连蛋白的制备方法包括以下步骤：
1.1构建重组载体
截取天然纤连蛋白的FNⅢ8-10结构域，通过全基因优化并合成，获得FNⅢ8-10的编码DNA。优化前基因序列为SEQ ID NO.4；优化后基因序列为SEQ ID NO.5：本实施例中目的基因为His-FNⅢ8-10基因，目的基因包括FN功能片段FNⅢ8-10、标签序列。
本实施例中，首先，根据His-FNⅢ8-10序列设计扩增引物。扩增引物包括正向引物与反向引物，正向引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物的核酸序列如SEQ IDNO.7所示；删除pET-22b(+)载体的第5208-5354位碱基，获得线性化载体，根据线性化载体的序列设计扩增引物，PCR扩增线性化载体，扩增引物包括正向引物与反向引物，正向引物的核酸序列如SEQ ID NO.8所示，反向引物的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。
其次，PCR扩增目的基因及线性化载体，PCR扩增目的基因及线性化载体的PCR条件为：98℃变性10s，55℃退火5s，68℃延伸30s，共30个循环，获得PCR扩增产物；分离PCR扩增产物，结果如图3所示。切下目的条带，目的条带分别为目的基因及线性化载体PCR扩增产物；回收PCR扩增产物。
在本实施例中通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，在紫外灯下快速切下目的条带，并用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因PCR扩增产物。
之后进行重组载体的构建，将所述目的基因PCR扩增回收产物、线性化载体PCR扩增回收产物及无缝克隆酶(购自翌圣生物YEASEN)按2.5μL：2.5μL：5μL混匀，50℃反应30min，获得重组载体，重组载体的图谱如图1所示。
本实施例中的无缝克隆反应体系的最适线性化载体用量及插入片段用量的计算公式如下：最适载体使用量为＝0.02×载体碱基对数]ng，最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng。
1.2构建工程菌
本实施例中重组载体通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态(感受态细胞的制备为本领域常规实验方法)。
将无缝克隆得到的重组载体全部加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，混匀，冰上静置30min后，42℃水浴锅中热休克90s，然后迅速转移至冰上静置2min。在超净台内向感受态中加入200μL无抗LB培养基，37℃、200rpm培养1h后倒入氨苄抗性的LB固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。经氨苄抗性筛选后挑取转化子进行培养，通过菌落PCR及测序鉴证转化无误的转化子，获得阳性工程菌。
1.3工程菌的诱导表达
挑取阳性工程菌单菌落接种至LB培养基中，37℃、200rpm培养8h，获得种子液，之后将种子液按1％接种于发酵培养基中，37℃、200rpm培养3h后，加入0.5mM IPTG，30℃过夜诱导。4℃、8000rpm离心10min收集菌体，按菌体量(g)：PBS(mL)为1：10的比例重悬菌体，冰浴超声破碎，12000rpm离心10min，收集全细胞裂解液及上清液，并采用SDS-PAGE分析检测重组蛋白的表达，结果如图4所示。
1.4工程菌的高密度发酵
将冷冻保存的甘油管菌株按1％接种于LB培养基中，37℃、200rpm培养8h得到种子液，将种子液按2.5％接种至3L发酵罐内，发酵罐装液量为2L。通过流加氨水控制pH为7.0，并用通气量和搅拌转速控制DO在20％以上。当发酵罐内的葡萄糖浓度降至0，或pH和溶氧显著上升时，开始补料，采用拟指数补料策略，设置比生长速率为0.2h-1。当OD600达到20时加入0.3mM IPTG进行诱导，并降低温度为20℃，诱导开始时改用恒pH的策略进行补料，诱导8h后结束发酵，此时OD600达到86。
其中，重组表达载体pET-22b(+)本身带有氨苄霉素抗性，带有T7启动子，转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株之后，菌株内带有的T7 RNA聚合酶可以启动重组蛋白基因转录，在IPTG诱导条件下，可以利用大肠杆菌本身的蛋白质翻译系统，可以表达重组蛋白pET-22b(+)-rFN，该重组蛋白带有His-tag标签，可用于金属亲和纯化。
本实施例中摇瓶发酵培养基配方为蛋白胨10g/L、酵母粉20g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾4g/L、磷酸氢二钠7g/L、硫酸铵1.2g/L、硫酸镁1g/L。
本实施例中发酵罐发酵培养基配方为蛋白胨10g/L、酵母粉20g/L、葡萄糖2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾4g/L、磷酸氢二钠7g/L、硫酸铵1.2g/L、硫酸镁1g/L、0.3mL/L泡敌；补料培养基为：C源-500g/L葡萄糖、N源-60g/L蛋白胨，20g/L酵母粉，氨水。
本实施例中PBS缓冲液的配制为：10mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、50mM氯化钠、pH7.4。
1.4重组纤连蛋白的纯化
离心收集匀浆破壁上清，用滤膜过滤用以上样；使用镍离子螯合亲和层析柱进行粗纯，获得粗纯液，再使用凝胶过滤层析去除粗纯液的氯化钠及咪唑，最后使用离子交换层析进行精纯，获得重组纤连蛋白工作液，可进一步添加甘露醇、甘露聚糖、葡聚糖、赤藓糖、海藻糖等赋型剂冻干成一定含量的纤连蛋白冻干粉。
在本实施例中离心收集破壁上清，使用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用汇研生物的Ni Focurose FF(IMAC)镍离子螯合亲和层析柱进行重组纤连蛋白的粗纯。首先用纯化水以5mL/min的流速冲洗10个CV，再用PBS以5mL/min的流速冲洗10个CV，电导率值及280nm波长吸收值都稳定后开始以2mL/min的流速上样，上样结束后再用PBS以5mL/min的流速冲洗镍柱至紫外吸收值平稳。最后用下述三种洗脱液按照咪唑浓度由低到高的顺序洗脱，收集洗脱峰对应的蛋白，得到粗纯的重组纤连蛋白，并进行洗脱样品的SDS-PAGE电泳检测，结果见图5所示。
其中，平衡液为PBS缓冲液(10mM PB,50mM NaCl,pH7.4)；
洗杂液：含有20mM咪唑的PBS缓冲液；
洗脱液1：含有50mM咪唑的PBS缓冲液；
洗脱液2：含有100mM咪唑的PBS缓冲液。
在本实施例中重组纤连蛋白在含50mM咪唑的缓冲液中被洗脱下来，为粗纯液。
在本实施例中，使用10mM PB(pH 7.4)缓冲液以8mL/min的流速冲洗凝胶过滤层析柱，直到穿过凝胶过滤层析后的溶液电导率与初始PB的相近时停止，即完成了凝胶过滤层析柱的平衡。将所述粗纯的重组纤连蛋白溶液以2mL/min的流速上样凝胶过滤层析柱，上样结束后继续用10mM PB缓冲液以8mL/min的流速冲洗凝胶过滤层析柱，根据电导率及280nm波长吸收值收集洗脱峰，得到脱盐液，并进行脱盐液的SDS-PAGE电泳检测，结果见图6所示。
在本实施例中，合并所述脱盐液，进行离子交换层析。使用汇研生物的DEAEFocurose FF阴离子交换层析柱进行重组纤连蛋白的精纯。首先用10mM PB(pH7.4)缓冲液以5mL/min的流速冲洗DEAE柱，直至流出的溶液电导率和pH与初始的10mM PB缓冲液相近时停止，即完成了离子交换层析柱的平衡。将所述脱盐液以2mL/min的流速上样，上样结束后用缓冲液以5mL/min的流速冲洗10个CV，最后用洗脱液按氯化钠浓度由低到高的顺序洗脱，收集洗脱峰对应的蛋白，得到精纯的重组纤连蛋白，并进行洗脱样品的SDS-PAGE电泳测试，测试结果见图6所示。
其中，平衡液为10mM PB(pH 7.4)；
洗脱液1：含有50mM NaCl的平衡液；
洗脱液2：含有200mM NaCl的平衡液。
大肠杆菌表达系统成本低，操作简单。本发明利用大肠杆菌表达系统，能得到的重组纤连蛋白总表达水平为10％，可溶性表达水平为87％；高密度发酵OD600可达到86；利用三种纯化方法能获得纯度高达95％以上的重组纤连蛋白。
对比例1
按照专利“具有抗皱修复功能的重组纤连蛋白及其制备方法与应用”(专利号：CN111548410B)制备得到具有RGD结构域+芋螺肽的融合蛋白。
对比例2
按照专利“一种重组人纤连蛋白Ⅲ1-C及其制备方法和应用”(专利号：CN111217903B)制备得到FNⅢ1-C。
对比例3
按照专利“一种复合透皮重组纤连蛋白及其应用”(专利号：CN113717290A)制备得到透皮短肽+FN序列+胶原蛋白的融合蛋白。
对比例4
按照专利“一种重组纤连蛋白及其应用”(专利号：CN115976031B)制备得到整联蛋白+层粘连蛋白的融合蛋白。
对比例5
按照专利“重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法”(专利号：CN113480636A)制备得到重组人纤连蛋白。
对比例6
按照专利“表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用”(专利号：CN112941081A)制备得到纤连蛋白。
对比例7
按照专利“一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法”(专利号：CN114702571A)制备得到纤连蛋白。
对比例8
按照专利“一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用”(专利号：CN110204608B)制备得到纤维蛋白+胶原蛋白+肝素结构域+整连蛋白的融合蛋白。
对比例9
按照专利“一种酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白及其在化妆品中的应用”(专利号：CN113186109A)制备得到FNⅢ1-C+HAS的融合蛋白。
对比例10
按照专利“一种重组蛋白及其构建方法和用途”(专利号：CN113527523A)制备得到透皮肽+FN序列+弹性蛋白酶的融合蛋白。
应用实施例
取实施例中以甘露聚糖作为赋型剂制备的500ppm纤连蛋白冻干粉添加到配方中，具体配方及工艺如表1：
表1：纤连蛋白抗皱霜C3配方工艺
效果实施例1
本实施例公开一种大肠杆菌表达重组纤连蛋白促细胞增殖黏附的活性检测方法。用于验证如实施例1和对比例1-10中的重组纤连蛋白促人皮肤成纤维细胞(NHDF)的活性。
试剂包括：DMEM完全培养基、DMEM无血清培养基、0.25％胰蛋白酶、PBS缓冲液、15g/L BSA溶液、CCK-8试剂盒。
具体步骤如下：
将细胞复苏，在完全细胞培养基中传代培养，待长满80％后，加胰蛋白酶消化，用无血清培养基重悬，获得细胞悬液。
将重组纤连蛋白用PBS预稀释至10μg/mL，预稀释后再进行2倍稀释，共做9个稀释度。向96孔板中加入50μL蛋白稀释液包板，每个浓度设置5个平行，并设立阴性对照(仅PBS)，37℃孵育3h。
孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μL 15％BSA封闭，置于37℃培养箱中孵育1h；孵育完成后，弃去板中液体，每孔加100μLPBS洗涤一次；再加入细胞悬液，接种密度为1×105个/mL，每孔接种100μL，即每孔含1×104个细胞，37℃孵育3h。
孵育完成后弃去板中培养基，再用无血清培养基洗涤两次。配制含10％的CCK-8溶液的无血清培养基(现配现用)，以换液形式加入96孔板，轻轻震荡96孔板后，置于37℃培养箱中孵育1h。
使用酶标仪检测450nm波长下的吸光值，并对数值进行分析，拟合曲线测定重组纤连蛋白的活性。
根据OD450的值及拟合曲线可知，重组FNⅢ8-10作用于NHDF的EC50的值为872ng/mL左右，如图7所示，而对比例1-10(图9-图18)的EC50均大于重组FNⅢ8-10，如图8所示。实验结果显示，重组FNⅢ8-10有很好的促细胞生长的效果，也就说明了该重组蛋白具有活性。
本实施例首次使用NHDF细胞测定了重组FN的活性。NHDF细胞来源于人皮肤，FN是NHDF的重要趋化因子，能促进NHDF细胞移动及生长，从而加速伤口愈合。重组FNⅢ8-10对NHDF的促增殖黏附作用证实了该重组蛋白适合作为美容护肤原料应用于人体。
效果实施例2
1、材料与仪器
1.1待测样品：应用实施例纤连蛋白抗皱霜、和将纤连蛋白冻干粉更换为甘露聚糖的空白对照抗皱霜C0。
1.2使用方法：半脸测试，受试者每天早晚各使用1次产品，左侧空白霜、右侧纤连蛋白抗皱霜，于使用产品前、使用产品4周后分别测量皮肤角质层水分含量、皮肤弹性、皱纹长度等指标。
1.3仪器：3D皮肤成像系统(爱尔兰Miravex，Antera 3D)；皮肤角质层水分含量测试仪(德国C&K，Corneometer)；皮肤弹性测试仪(德国C&K，Cutometer)。
1.4测试指标：皮肤角质层水分含量、皮肤弹性R2、皮肤弹性R5、皱纹长度。
1.5测试位置：皮肤角质层水分含量、皮肤弹性的测量位置为脸颊，皱纹长度的测量位置为外眼角直径为15mm的区域。
1.6测试流程
第0天：清洁面部并在测试环境平衡20分钟后，测量测试部位的各项测试指标。
第28(±1)天：清洁面部并在测试环境平衡20分钟后，通过问卷调查受试者对产品的评价，测量测试部位的的各项测试指标。
1.7数据分析
计算相同时间点所有受试者的某皮肤生理参数的平均值及标准差。通过各时间点皮肤生理参数的平均值计算相对使用产品前的变化值(△值)及变化率。计算公式如下：
变化值(Δ值)＝Tn-T0
式中，T0——受试区使用化妆品前，皮肤本底值
Tn——受试区使用化妆品后，皮肤参数测量值
n——回访时间
应用SPSS22.0软件进行统计学检验，分析使用样品后各个时间点的皮肤生理参数相对使用产品前的变化是否具有显著性差异。若数据呈正态分布则采用配对t检验，双尾检验，检验水准α＝0.05；若数据为非参数或不呈正态分布则采用两个相关样本的秩和检验，双尾检验，检验水准α＝0.05。
1.8测试结果
1.8.1皮肤含水量
测试期间皮肤角质层水分含量的描述性统计结果见表2：
表2皮肤角质层水分含量的描述统计结果
注：与使用产品前进行显著性分析，n.s.p≥0.05，*p<0.05，**p<0.01。
受试者测试区域皮肤角质层水分含量变化趋势见图19：
结果描述：
与使用测试样品前相比，使用产品4周后，抗皱霜C0皮肤角质层水分含量平均值增加约8.6％，差异极显著(p<0.01)，抗皱霜C3皮肤角质层水分含量平均值增加约15.2％，差异极显著(p<0.01)，且使用抗皱霜C3比使用抗皱霜C0皮肤角质层含水量增加量高，纤连蛋白能够显著提高皮肤含水量。
1.8.2皮肤弹性R2
测试期间皮肤弹性R2的描述性统计结果见表3：
表3皮肤弹性R2的描述统计结果
注：与使用产品前进行显著性分析，n.s.p≥0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，
****p<0.0001。
受试者测试区域皮肤弹性R2变化趋势见图20：
结果描述：
与使用测试样品前相比，使用产品4周后，抗皱霜C0的皮肤弹性R2平均值提高约1.16％，差异不显著(p＞0.05)；抗皱霜C3皮肤弹性R2平均的提高约6.5％，具有极显著性差异(p＜0.0001)，纤连蛋白能够显著提高皮肤弹性R2。
1.8.3皮肤弹性R5
测试期间皮肤弹性R5的描述性统计结果见表4：
表4皮肤弹性R5的描述统计结果
注：与使用产品前进行显著性分析，n.s.p≥0.05，*p<0.05，**p<0.01。
受试者测试区域皮肤弹性R5变化趋势见图21：
结果描述：
与使用测试样品前相比，使用产品4周后，抗皱霜C0的皮肤弹性R5平均值提高约1.31％，差异不显著(p＞0.05)；抗皱霜C3皮肤弹性R5平均的提高约9.8％，具有极显著性差异(p＜0.01)，纤连蛋白能够显著提高皮肤弹性R5。
1.8.4皱纹长度
测试期间皱纹长度的描述性统计结果见表5：
表5皱纹长度的描述统计结果
注：与使用产品前进行显著性分析，n.s.p≥0.05，*p<0.05，**p<0.01。
受试者测试区域皱纹长度变化趋势见图22：
结果描述：
与使用测试样品前相比，使用产品4周后，抗皱霜C0的皱纹长度平均值降低约3.8％，差异不显著(p＞0.05)，抗皱霜C3的皱纹长度平均值降低约23.4％，具有极显著性差异(p＜0.01)，说明本发明纤连蛋白具有显著缩短皱纹长度的功效。
1.9结论
纤连蛋白具有很好的保湿、抗皱功效。
Claims (13)
1.一种重组纤连蛋白，其特征在于，包括FN的功能片段和标签序列；所述的FN的功能片段的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的重组纤连蛋白，其特征在于，所述的标签序列为His标签、FLAG标签、c-Myc标签、HA标签、GST标签、MBP标签和/或SUMO标签。
3.根据权利要求2所述的重组纤连蛋白，其特征在于，所述的标签序列为His标签，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
4.权利要求1-3任一项所述的重组纤连蛋白，其特征在于，所述的重组纤连蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
5.权利要求1-4任一项所述的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建载体，将SEQ ID NO.3克隆到表达载体上，获得重组载体；
S2、构建工程菌，将步骤S1的重组载体转化到宿主细胞中，筛选阳性克隆，获得工程菌；
S3、工程菌的高密度发酵，采用拟指数补料和恒pH补料进行高密度诱导培养，获得菌泥；
S4、重组纤连蛋白的纯化，将步骤S4的菌泥破碎，离心，过膜，柱子纯化，获得粗提液；将粗提液脱盐，离子交换层析纯化，获得重组纤连蛋白工作液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的拟指数补料为在培养液的葡萄糖浓度降至0，或pH和溶氧显著上升时，开始补料。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的诱导培养是在OD600不低于20时加入诱导剂。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的恒pH补料为在诱导开始时进行。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的柱子纯化使用镍柱；所述的脱盐使用凝胶过滤层析柱；所述的离子交换层析纯化使用DEAE阴离子交换层析柱。
12.权利要求1-4任一项所述的重组纤连蛋白的促细胞增殖黏附的活性检测方法，其特征在于，包括NHDF细胞生长活性测定。
13.权利要求1-4任一项所述的重组纤连蛋白在制备抗皱以及保湿产品中的应用。
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