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CN117562049A - 基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用 - Google Patents

基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用 Download PDF

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CN117562049A CN202311572873.5A CN202311572873A CN117562049A CN 117562049 A CN117562049 A CN 117562049A CN 202311572873 A CN202311572873 A CN 202311572873A CN 117562049 A CN117562049 A CN 117562049A
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Abstract

本发明提供了一种基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用，所述基于γδT细胞培养的血液保存液包括：肝素钠5～50mg/100mL、D‑葡萄糖1～10g/100mL、转铁蛋白0.1～10mg/100mL、胰岛素0.01～1mg/100mL、胰岛素样生长因子0.1～10μg/100mL、腺嘌呤0.01～0.1g/100mL、维生素C 0.1～10mg/100mL、丙酮酸钠2～20mg/100mL、L‑谷氨酰胺1～10mM、胆固醇0.01～1mg/100mL、唑来膦酸1～15μg/100mL以及DMEM基础培养基。该血液保存液能够较长时间地维持血液中某些免疫细胞的活性，经此血液保存液在4℃条件下保存5天后的血液样本，分离的PBMC仍能培养扩增出具有杀伤和调节活性的γδT细胞，γδT细胞的比例可达75％以上，并具有较高的杀伤相关标志CD107α的表达。

Description

基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用
技术领域
本发明涉及γδT细胞培养技术领域，尤其涉及一种基于γδT细胞培养的血液保存液及其应用。
背景技术
γδT细胞是人体具有重要免疫功能的T细胞，发挥着抗肿瘤、抗病毒和抗细菌以及机体组织再生等作用。γδT细胞已被用于治疗肿瘤和病毒感染性疾病，在体外已经能够大量培养扩增。
以往血液保存液主要为了使供输血用的血液(红细胞)能保存一定时间，从而加入适当的抗凝剂、磷酸、葡萄糖和腺嘌呤等成分，防止在保存期红细胞破坏导致血红蛋白逸出到血浆中。
用现在血库使用的ACD保存液在2～8℃条件下保存的外周血样本，在24-36小时后分离的PBMC，用γδT细胞专用培养基培养过程中发现，培养的γδT细胞没有明显的细胞增殖现象，培养15天后γδT细胞比率较低(＜10％)且数量和质量上都达不到临床应用标准。
因此，用现有的血液保存液保存一定时间(24-36小时)的PBMC是无法培养出供临床使用γδT细胞。
发明内容
本发明提供了一种基于γδT细胞培养的血液保存液，旨在解决目前常用的ACD保存液较长时间保存的血液样本，无法培养出供临床使用的γδT细胞的问题。
本发明的内容如下：
本发明第一方面提供了一种基于γδT细胞培养的血液保存液。在所述血液保存液中，肝素钠5～50mg/100mL、D-葡萄糖1～10g/100mL、转铁蛋白0.1～10mg/100mL、胰岛素0.01～1mg/100mL、胰岛素样生长因子0.1～10μg/100mL、腺嘌呤0.01～0.1g/100mL、维生素C0.1～10mg/100mL、丙酮酸钠2～20mg/100mL、L-谷氨酰胺1～10mM、胆固醇0.01～1mg/100mL、唑来膦酸1～15μg/100mL，以及DMEM基础培养基。
在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述血液保存液中，肝素钠30mg/100mL、D-葡萄糖3g/100mL、转铁蛋白5mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、胰岛素样生长因子2μg/100mL、腺嘌呤0.03g/100mL、维生素C 2.5mg/100mL、丙酮酸钠10mg/100mL、L-谷氨酰胺2mM、胆固醇0.5mg/100mL、唑来膦酸5μg/100mL。
在本发明第一方面一种可选的实施方式中，所述血液保存液的pH值为7.0～7.5。
在本发明第一方面一种可选的实施方式中，所述血液保存液的pH值优选为7.35～7.45。
本发明第二方面，提供了基于γδT细胞培养的血液保存液的使用的方法，包括将待处理血液与上述任一所述的血液保存液混合并在预设温度下保存，其中所述血液保存液与待处理血液体积比为14：100。
在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述预设温度为2～10℃，优选4℃。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述方案中任意一项所述的基于γδT细胞培养的血液保存液，所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、γδT细胞扩增、γδT细胞培养、γδT细胞上清液外泌体制备的任意一种或多种。
本发明第四方面提供了一种基于上述任一项所述的基于γδT细胞培养的血液保存液在血液保存试剂盒、免疫细胞保存试剂盒中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种基于γδT细胞培养的血液保存液及其相关的应用。其中，基于γδT细胞培养的血液保存液包括：肝素钠、D-葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子、腺嘌呤、维生素C、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、胆固醇、唑来膦酸及DMEM基础培养基。该血液保存液能够较长时间地维持血液中某些免疫细胞的活性，经此血液保存液在4℃条件下保存5天后的血液样本，分离的PBMC仍能培养扩增出具有杀伤和调节活性的γδT细胞，γδT细胞比例可达75％以上并具有较高的杀伤相关标志CD107α的表达。因此，本发明的血液保存液可实现高质量地保存血液，提高血液的使用率，确保血液经较长时间(72-120小时)运输后，仍具备可扩增培养出供需求者使用的γδT细胞，满足临床需求。
此外本发明还提供其使用方法及应用，基于γδT细胞培养的血液保存液能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、γδT细胞扩增、γδT细胞培养、γδT细胞上清液外泌体等试剂盒中，通过提高γδT细胞的质量和活性，提高试剂盒的效能。
附图说明
图1为本发明实施例和对比例经保存不同时间后分离得到的PBMC扩增培养的γδT细胞形态；
图2为培养第15天实施例的γδT细胞流式检测图；
图3为培养第15天γδT细胞CD107α的表达图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的第一方面提供了一种基于γδT细胞培养的血液保存液，所述基于γδT细胞培养的血液保存液包括：肝素钠、D-葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子、腺嘌呤、维生素C、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、胆固醇、唑来膦酸、DMEM基础培养基。
其中，在所述血液保存液中，其中，肝素钠为抗凝剂，所加入的浓度为5～50mg/100mL，如可以为5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL 40mg/mL、50mg/mL。
D-葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子、腺嘌呤、维生素C、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、胆固醇、唑来膦酸及DMEM基础培养基均为营养剂。所加入的D-葡萄糖的浓度为1～10g/100mL，如可以为1g/100mL、3g/100mL、5g/100mL、6g/100mL、8g/100mL、10g/100mL；所加入的转铁蛋白的浓度为0.1～10mg/100mL，如可以为0.1mg/100mL、1mg/100mL、3mg/100mL、5mg/100mL、6mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL；所加入的胰岛素，其浓度为0.01～1mg/100mL，如可以为0.01mg/100mL、1mg/100mL、2mg/100mL、4mg/100mL、6mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL；所加入的胰岛素样生长因子浓度为0.1～10μg/100mL，如可以为0.1μg/100mL、1μg/100mL、2μg/100mL、4μg/100mL、6μg/100mL、8μg/100mL、10μg/100mL；所加入的腺嘌呤的浓度为0.01～0.1g/100mL，如可以为0.01g/100mL、0.03g/100mL、0.05g/100mL、0.06g/100mL、0.08g/100mL、0.1g/100mL；所加入的维生素C的浓度为0.1～10mg/100mL，如可以为0.1mg/100mL、1mg/100mL、2.5mg/100mL、5mg/100mL、7mg/100mL、8.5mg/100mL、10mg/100mL；所加入的丙酮酸钠的浓度为2～20mg/100mL，如可以为2mg/100mL、6mg/100mL、10mg/100mL、12.5mg/100mL、15mg/100mL、17.5mg/100mL、20mg/100mL；所加入的L-谷氨酰胺的浓度为1～10mM，如可以为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM；所加入的胆固醇的浓度为0.01～1mg/100mL，如可以为0.01mg/100mL、0.1mg/100mL、0.3mg/100mL、0.5mg/100mL、0.8mg/100mL、1mg/100mL；所加入的唑来膦酸的浓度为1～15μg/100mL，如可以为1μg/100mL、3μg/100mL、5μg/100mL、8μg/100mL、10μg/100mL、12μg/100mL、15μg/100mL。
在一个优选的方案中，所述血液保存液中，肝素钠30mg/100mL、D-葡萄糖3g/100mL、转铁蛋白5mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、胰岛素样生长因子2μg/100mL、腺嘌呤0.03g/100mL、维生素C2.5mg/100mL、丙酮酸钠10mg/100mL、L-谷氨酰胺2mM、胆固醇0.5mg/100mL、唑来膦酸5μg/100mL及DMEM基础培养基。
其中，所述的血液保存液，其pH值范围为7.0～7.5，采用弱碱性环境，优选pH值为7.35～7.45。此pH值范围相当于人体血液pH值。
通过上述的血液保存液，为PBMC提供必要的营养及环境，保证了长时间保存的PBMC仍具有扩增培养γδT细胞的活力，可确保外周血经一定时间(72-120小时)运输后，具备可扩增培养出供需求者使用的γδT细胞，以此适用于较长时间运输或者大批量无法及时处理情形，以扩大其应用场景。
进一步的，在提取血液样本至上述的血液保存液中，其中，上述血液保存液与血液样本体积比为14：100，所述血液保存液对应保存血液样品时的温度为2～10℃，优选4℃。
为了更好的说明本发明技术方案的技术效果，本发明构造了如下实施例和对比例进行测试。
实施例1
实施例1的基于γδT细胞培养的血液保存液，包括：肝素钠30mg/100mL、D-葡萄糖3g/100mL、转铁蛋白5mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、胰岛素样生长因子2μg/100mL、腺嘌呤0.03g/100mL、维生素C 2.5mg/100mL、丙酮酸钠10mg/100mL、L-谷氨酰胺2mM、胆固醇0.5mg/100mL、唑来膦酸5μg/100mL，其余为DMEM基础培养基，其中，血液保存液的pH 7.4。
血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
实施例2
实施例2的基于γδT细胞培养的血液保存液，包括：肝素钠30mg/100mL、D-葡萄糖3g/100mL、转铁蛋白5mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、胰岛素样生长因子2μg/100mL、腺嘌呤0.03g/100mL、维生素C 2.5mg/100mL、丙酮酸钠10mg/100mL、L-谷氨酰胺2mM、胆固醇0.5mg/100mL、唑来膦酸5μg/100mL，其余为DMEM基础培养基，其中，血液保存液的pH 7.0。
血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
实施例3
实施例3的基于γδT细胞培养的血液保存液，包括：肝素钠30mg/100mL、D-葡萄糖3g/100mL、转铁蛋白5mg/100mL、胰岛素2mg/100mL、胰岛素样生长因子2μg/100mL、腺嘌呤0.03g/100mL、维生素C 2.5mg/100mL、丙酮酸钠10mg/100mL、L-谷氨酰胺2mM、胆固醇0.5mg/100mL、唑来膦酸5μg/100mL，其余为DMEM基础培养基，其中，血液保存液的pH 7.4。
血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为10℃。
其中，实施例1与实施例2在于pH值的不同，实施例1与实施例3在于保存温度的不同。为验证上述实施例1-3的血液保存液的效用，本发明还提供对比例1及对比例2进行对比。
对比例1
对比例1的血液保存液包括：抗凝剂肝素钠30mg/100mL，营养剂包括D-葡萄糖3g/100mL、L-谷氨酰胺2mM、其余为DMEM基础培养基，pH 7.4。其中，对比例1的血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
对比例2
对比例2的血液保存液为血库使用的血液保存液(ACD)。ACD与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
本发明中，通过以下实验进行测试。
实验1
使用Ficoll法(密度梯度离心法)从本发明的血液保存液保存0天、5天的外周血中提取单个核细胞(PBMC)，并检测PBMC存活率。其中PBMC存活率结果如表1所示、
表1.PBMC存活率对比表(％)
组别 保存0天 保存5天
实施例1 98.69±0.58 94.30±0.68
实施例2 98.82±0.77 93.16±1.01
实施例3 98.90±0.39 92.59±1.04
对比例1 98.70±0.75 67.28±0.35
对比例2 98.94±0.28 57.02±1.57
其中，从上表数据可明显看出，采用本发明的实施例1-实施例3对应的血液保存液，保存至第5天时，实施例1-3的存活率仍在90％以上，明显高于对比例1-2。故本发明提供的血液保存液，能够在不同pH和温度条件下，实现对血液样本的长时间高效保存，提高PBMC存活率。
实验2对所提取的PBMC进行γδT细胞培养，培养15天后检测PBMC总细胞存活率、形态、γδT细胞比例和γδT细胞杀伤活性相关标志CD107α的表达。
其中：PBMC培养15天后细胞存活率检测方法为：将收集到的PBMC培养15天后，进行AO/PI染色，采用细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞存活率。PBMC细胞存活率结果如表2所示。
表2.培养15天后PBMC细胞存活率对比表(％)
组别 保存0天 保存5天
实施例1 94.23±1.06 87.57±1.16
实施例2 93.95±1.57 84.80±2.15
实施例3 93.98±0.29 81.24±0.96
对比例1 93.82±1.21 46.07±1.79
对比例2 93.64±0.62 23.34±1.75
从表2可以得出，经实施例1-3血液保存液的PBMC，其在培养15天后，其PBMC总细胞存活率高于80％，相比对比例1及对比例2，其细胞存活率大大提高。故本发明提供的血液保存液，能够在不同pH和温度条件下，实现对血液样本的长时间高效保存，保持PBMC活力。
其中，γδT细胞形态如图1所示，图1中a为新鲜血液提取PBMC和经该PBMC培养15天得到的γδT细胞；b:经各实施例和对比例血液保存液保存5天后培养15天得到的γδT细胞。由于对比例1及2活细胞数量较少，不足以达到流式分析的数量要求，故检测结果不包含对照组。
γδT细胞比例检测方法如下：
PBMC培养15天后，收集细胞进行γδT细胞的比例检测。采用流式细胞检测方法对收集的细胞中γδT细胞(APC anti-Human TCRγδantibody阳性细胞)的比例进行检测，检测结果如图2所示。
γδT细胞杀伤活性相关标志CD107α的表达检测方法如下：
采用流式细胞检测方法对收集的γδT细胞(APC anti-Human TCRγδantibody阳性细胞)CD107α的表达(PE anti-h uman CD107aantibody阳性细胞)进行检测，如图3所示。
从图1-3可以得出在实施例1-3所保存的γδT细胞仍具有较强的活力，经本发明实施例的血液保存液保存120小时的外周血分离的PBMC所培养得到的γδT细胞比例＞75％，并依然具有较高的杀伤相关标志CD107α的表达。
基于上述，采用本发明的基于γδT细胞培养的血液保存液突破了现有的技术难点，可确保血液经一定时间(72-120小时)运输后，仍具备可扩增培养出供需求者使用的γδT细胞。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的血液保存液，该试剂盒能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、γδT细胞扩增、γδT细胞培养、γδT细胞上清液外泌体制备等方面，通过其对血液中γδT细胞质量和数量的有效保存，提高PBMC细胞提取、γδT细胞扩增和培养、外泌体提取等目的的高效实现，实现临床对γδT细胞需求。
本发明还保护一种基于上述方案的基于γδT细胞培养的血液保存液在免疫细胞保存试剂盒、血液保存试剂盒的应用。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种基于γδT细胞培养的血液保存液，其特征在于，包括：
肝素钠5～50mg/100mL、D-葡萄糖1～10g/100mL、转铁蛋白0.1～10mg/100mL、胰岛素0.01～1mg/100mL、胰岛素样生长因子0.1～10μg/100mL、腺嘌呤0.01～0.1g/100mL、维生素C0.1～10mg/100mL、丙酮酸钠2～20mg/100mL、L-谷氨酰胺1～10mM、胆固醇0.01～1mg/100mL、唑来膦酸1～15μg/100mL以及DMEM基础培养基。
2.根据权利要求1所述的基于γδT细胞培养的血液保存液，其特征在于，在所述血液保存液中，肝素钠为30mg/100mL、D-葡萄糖为3g/100mL、转铁蛋白为5mg/100mL、胰岛素为2mg/100mL、胰岛素样生长因子为2μg/100mL、腺嘌呤为0.03g/100mL、维生素C为2.5mg/100mL、丙酮酸钠为10mg/100mL、L-谷氨酰胺为2mM、胆固醇为0.5mg/100mL、唑来膦酸为5μg/100mL。
3.根据权利要求1或2所述的基于γδT细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述血液保存液的pH值为7.0～7.5。
4.根据权利要求3所述的基于γδT细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述血液保存液的pH值为7.35～7.45。
5.一种血液保存液的使用方法，其特征在于，包括将待处理血液与权利要求1-4任一所述的血液保存液混合并在预设温度下保存，其中所述血液保存液与待处理血液体积比为14：100。
6.根据权利要求5所述的血液保存液的使用方法，其特征在于，所述预设温度为2～10℃。
7.根据权利要求6所述的血液保存液的使用方法，其特征在于，所述预设温度为4℃。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～4中任意一项所述的基于γδT细胞培养的血液保存液，所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、γδT细胞扩增、γδT细胞培养、γδT细胞上清液外泌体制备的任意一种或多种。
9.一种基于权利要求1-4任一项所述的基于γδT细胞培养的血液保存液在免疫细胞保存试剂盒、血液保存试剂盒的应用。
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