CN117547526A - γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了γ‑氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用，本发明发现γ‑氨基丁酸GABA可抑制皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症，从而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗；另发现GABA可通过改善脂肪增生和异位沉积来防治奥氮平诱导的脂代谢异常这一不良反应。本发明为GABA用于防治奥氮平诱发的不良反应提供了重要的理论依据，为制备防治奥氮平诱发的不良反应药物提供了新的思路。

Description

γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中 的应用

技术领域

本发明涉及防治奥氮平诱发的不良反应药物技术领域，具体涉及γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用。

背景技术

奥氮平(olanzapine，OLZ)是第二代抗精神分裂症药物，目前已成为临床的一线用药，相比于第一代抗精神分裂症药物，其锥体外系不良反应较少，但是可导致较为严重的内分泌代谢异常，可表现为高血糖、高血脂、高胆固醇、体重增加等，其共同的病理基础是胰岛素抵抗的发生。精神分裂症患者往往需要长期用药，而奥氮平的这一不良反应不仅会降低精神分裂症患者用药的依从性，还会显著增加患者2型糖尿病和心血管疾病风险，成为限制奥氮平临床应用的重要因素之一。因此，解决奥氮平诱发的胰岛素抵抗不良反应这一临床问题具有重要意义。

机体胰岛素抵抗的发生发展与脂肪组织的炎症反应密切相关。脂肪组织除了作为一种重要的分泌器官，还是扮演重要免疫调节作用的器官，组织中包含多种免疫细胞，其中巨噬细胞是除了脂肪细胞外丰度最高的细胞类型，在调节脂肪组织代谢和炎症反应中具有重要作用，与肥胖相关的慢性炎症、胰岛素抵抗密切相关。巨噬细胞主要以两种亚群存在于脂肪组织中，是由两种不同激活途径激活，表现出不同的免疫状态。其中经典激活的M1型巨噬细胞主要表现为促炎状态，分泌促炎因子；而选择性激活的M2巨噬细胞则表现出抗炎状态，分泌抗炎因子。在肥胖机体的脂肪组织中，巨噬细胞极化成M1型是造成脂肪组织炎症的重要原因，也是进一步诱导胰岛素抵抗发生的重要病理因素。

作为一种生物小分子代谢产物，γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)最为人熟知的生理功能是作为一种主要的抑制性神经递质，调节神经元间的通讯，但是其在中枢神经系统外的功能和作用机制研究较少。近年来发现，GABA也存在于脑组织外包括肠道、肝脏和胰腺等多种组织和器官中，并且具有作为神经递质以外的重要生理作用，其中重要的功能之一便是参与免疫调控，而免疫调控在糖脂代谢中具有重要作用。那么，GABA是否会通过参与免疫调控进而影响机体糖脂代谢？最新研究显示，在肥胖机体的脂肪组织中，与内脏脂肪相比，皮下脂肪组织不易发生炎症反应的原因是巨噬细胞的浸润和M1极化被抑制，而使皮下脂肪组织保持这一免疫特征的机制便是GABA信号的激活。这一研究揭示了GABA在脂肪组织中通过调控巨噬细胞免疫功能进而维持脂肪组织代谢稳态的重要生理作用。

脑组织中GABA水平与包括精神分裂症、双相情感障碍、重度抑郁症在内的严重精神疾病相关，其作用在于调控神经元的兴奋程度。精神分裂症中的GABA假说表明GABA不止对于精神分裂症的阳性症状有效，对于阴性症状和前额叶皮质功能异常导致的认知障碍均具有改善作用。然而，目前对于外周GABA的作用研究较少。在探究奥氮平对神经递质的影响的相关研究中，我们意外发现，奥氮平可降低外周血GABA水平(RSC Advances.2020,10(31):18305-18314)，这一发现引起我们的关注，并对奥氮平降低外周GABA水平与其诱导代谢紊乱相关副作用的因果关系和分子机制进行了深入探究。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用，本发明发现γ-氨基丁酸GABA可抑制皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症，从而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗。通过改善脂肪增生和异位沉积来防治改善奥氮平诱导的脂代谢异常这一不良反应。本发明为GABA用于防治奥氮平诱发的不良反应提供了重要的理论依据，为制备防治奥氮平诱发的不良反应药物提供了新的思路。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用。

优选的是，其中，奥氮平诱发的不良反应为胰岛素抵抗和脂代谢紊乱。

优选的是，其中，γ-氨基丁酸GABA作为单一组分药物或组合药物中的有效成分。

优选的是，其中，胰岛素抵抗包括奥氮平不良反应导致的血清胰岛素水平升高、糖耐量受损、胰岛素敏感性降低。

优选的是，其中，脂代谢紊乱包括脂肪增生肥大和内脏、棕色脂肪、肝脏部位的脂肪异位沉积。

优选的是，其中，γ-氨基丁酸GABA的有效剂量为50mg/kg/d。

优选的是，其中，GABA是指氨基酸生物小分子代谢产物。

优选的是，其中，γ-氨基丁酸GABA通过抑制皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症来防治奥氮平诱发的胰岛素抵抗。

优选的是，其中，γ-氨基丁酸GABA通过改善脂肪增生和异位沉积来防治奥氮平诱发的脂代谢紊乱。

本发明至少包括以下有益效果：

γ-氨基丁酸GABA可抑制皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症，从而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗。γ-氨基丁酸GABA可改善脂肪增生和异位沉积来防治奥氮平诱导的脂代谢异常这一不良反应。这为GABA用于防治奥氮平诱发的不良反应提供了重要的理论依据，为制备防治奥氮平诱发的不良反应药物提供了新的思路。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中GABA改善奥氮平长期暴露小鼠模型中奥氮平诱导的体重增加和胰岛素抵抗图，其中(A)小鼠体重，***P<0.001；(B)腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)*P<0.05；(C)胰岛素耐受试验(ITT)，**P<0.01，***P<0.001；(D)小鼠血清胰岛素水平，*P<0.05；(E)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；**P<0.01，***P<0.001。

图2为本发明实施例中GABA抑制奥氮平长期暴露小鼠模型的皮下脂肪组织(sWAT)中巨噬细胞的浸润图，其中(A)流式细胞术图示，CD11b⁺F4/80⁺细胞为巨噬细胞，其中CD11c⁺细胞为M1巨噬细胞，CD301⁺细胞为M2巨噬细胞；(B)皮下脂肪组织中的巨噬细胞总数，***P<0.001；(C)皮下脂肪组织中的M1巨噬细胞数，***P<0.001；(D-E)皮下脂肪组织中的M1和M2巨噬细胞比例，**P<0.01。

图3为本发明实施例中GABA对奥氮平长期暴露小鼠模型的内脏脂肪组织(pWAT)中巨噬细胞的浸润未显示出明显抑制作用图，其中(A)流式细胞术图示，CD11b⁺F4/80⁺细胞为巨噬细胞，其中CD11c⁺细胞为M1巨噬细胞，CD301⁺细胞为M2巨噬细胞；(B)内脏脂肪组织中的巨噬细胞总数，***P<0.001，^nsP>0.05；(C)皮下脂肪组织中的M1巨噬细胞数，*P<0.05，^nsP>0.05；(D-E)皮下脂肪组织中的M1和M2巨噬细胞比例，^nsP>0.05。

图4为本发明实施例中GABA抑制奥氮平长期暴露小鼠模型的脂肪组织来源条件培养基中单核细胞THP-1的迁移图，其中(A)小鼠皮下脂肪组织来源的条件培养基中THP-1的迁移，*P<0.05，**P<0.01；(B)小鼠内脏脂肪组织来源的条件培养基中THP-1的迁移，*P<0.05，^nsP>0.05。

图5为本发明实施例中GABA改善奥氮平长期暴露小鼠模型的皮下脂肪增生和脂肪的异位沉积图，其中(A)小鼠皮下脂肪组织和内脏脂肪组织的外观图；(B-C)小鼠皮下脂肪和内脏脂肪重量，**P<0.01，***P<0.001，^nsP>0.05；(D)小鼠皮下脂肪组织、内脏脂肪组织、棕色脂肪组织(BAT)和肝脏(liver)的HE染色。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

GABA是一种氨基酸代谢物，在体内由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化脱羧合成，可进一步代谢为琥珀酸降解。GABA作为一种抑制性神经递质被人熟知，但是其在外周的其他功能未被阐明。GABA在制备防治奥氮平诱导胰岛素抵抗和脂代谢紊乱的药物中的应用未见报道。我们意外发现，奥氮平可降低外周血GABA水平(RSC Advances.2020,10(31):18305-18314)，这一发现引起我们的关注，并对奥氮平降低外周GABA水平与其诱导代谢紊乱相关副作用的因果关系和分子机制进行了深入探究。

<实施例1>

补充外源性GABA可以降低奥氮平长期暴露引起的体重增加和胰岛功能损伤：

实验方法：

利用4周龄C57BL/6J雌性小鼠，分别按照随机数字表将其随机分为3组，每组10只。适应性饲养2周后，生理盐水对照组(Control)、奥氮平组(OLZ)和GABA治疗组(OLZ+GABA)分别给予定制饲料(31kcal％脂肪,55kcal％碳水化合物,14kcal％蛋白质，MolDiets)，其中对照组小鼠在第0-10周进行生理盐水灌胃，第5-10周同步进行生理盐水腹腔注射；奥氮平组小鼠第0-10周进行OLZ灌胃(3mg/kg/d)，第5-10周同步进行腹腔注射生理盐水；GABA治疗组小鼠第0-10周灌胃OLZ(3mg/kg/d)，第5-10周同步进行腹腔注射GABA(50mg/kg/d)。期间每周测量一次小鼠体重，每4周测量1次小鼠血糖。于第11周进行葡萄糖耐量(GTT)、胰岛素耐受(ITT)试验。

(1)体重、血糖监测：实验期间，每天观察记录小鼠生活状态，包括毛色、精神状态、活动量、进食进水状况。每周称量体重1次，每4周测量随机血糖和空腹血糖1次。

(2)GTT试验：小鼠禁食6h后腹腔注射葡萄糖(1.5g/kg)，分别在给予葡萄糖后0、15、30、60、90和120min采尾尖血测定血糖水平，绘制糖耐量曲线。实验结束后补充饲料。

(3)ITT试验：小鼠禁食2h后颈背部皮下注射胰岛素(1.0U/kg)，分别在给予胰岛素后0、15、30、60、90和120min采尾尖血测定血糖水平。绘制胰岛素耐受曲线。

(4)血清胰岛素水平检测：于第11周小鼠禁食6h，麻醉后处死，摘除眼球后取血，离心后取小鼠血清，使用ELISA方法进行胰岛素水平检测(Mercodia mouse insulin ELISAkit)。

(5)胰岛素抵抗指数HOMA-IR的计算：根据上述空腹胰岛素水平和空腹血糖结果，按照公式HOMA-IR＝空腹血糖x空腹胰岛素/22.5计算胰岛素抵抗指数。

实验结果：

分析小鼠体重发现，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠体重明显增加，GABA治疗组小鼠相较于奥氮平组小鼠，体重显著降低(图1A)。葡萄糖耐量试验(GTT)发现，与对照组小鼠比较，奥氮平小鼠GTT曲线下面积增加，即糖耐量发生损伤，而GABA治疗组小鼠GTT曲线下面积降低，表明糖耐量受损得到改善(图1B)。进一步进行胰岛素耐受试验(ITT)发现，与对照组小鼠比较，奥氮平小鼠ITT曲线下面积增加，即胰岛素敏感性发生损伤，而GABA治疗组小鼠ITT曲线下面积降低，表明胰岛素敏感性受损得到改善(图1C)。同时检测小鼠空腹血清胰岛素水平并计算胰岛素抵抗指数，我们发现，与对照组相比，奥氮平组小鼠血清呈现高胰岛素水平(图1D)，其胰岛素抵抗指数亦明显增大；而相较于奥氮平组小鼠，GABA治疗组小鼠的胰岛素水平显著降低，胰岛素抵抗指数随之减小(图1E)。以上结果表明，进行奥氮平长期暴露的小鼠且同时给予外源性GABA补充，可改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗。

<实施例2>

GABA可抑制皮下脂肪组织中巨噬细胞的浸润和M1极化进而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗：

实验方法：

使用流式细胞术方法检测实施例1中小鼠脂肪组织中的巨噬细胞数及M1细胞比例。具体方法如下所示：将小鼠脂肪组织样本称重，放入EP管中，用剪刀剪碎，加入500μL胶原蛋白酶II、500μL胶原蛋白酶IV、2mL DNA酶及2mL1640无血清培养基消化35min。通过250目尼龙筛网过滤后，离心10min(4℃，500g)。离心后去除上层漂浮的成熟脂肪细胞，留取底部沉淀，用Stainingbuffer重悬细胞，计数为1×10⁶/μL。取细胞悬液100μL，加1μL封闭剂，避光孵育5min。按推荐用量分别加入CD45、F4/80、CD11b、CD11c、CD301抗体，避光孵育15min。加1mL1X不含固定剂溶血素，涡旋混匀，避光放置10min。离心5min(4℃，1500g)，弃上清，得到细胞沉淀，加入200μL Stainingbuffer，加入1μL DAPI(1×)，涡旋混匀，上机检测。

实验结果：

流式细胞术实验结果显示，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠的皮下脂肪组织中的巨噬细胞数量明显增加，而GABA治疗组小鼠相较于奥氮平组小鼠，巨噬细胞数量显著降低(图2A和B)。进一步分析M1巨噬细胞发现，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠的皮下脂肪组织中的促炎细胞M1巨噬细胞数绝对值显著增加，所占比例也明显增加；而GABA治疗组小鼠相较于奥氮平组小鼠，M1巨噬细胞数量显著降低，所占比例降低(图2A和C、D)，而抗炎细胞M2巨噬细胞所占比例显著上升(图2A和E)。上述结果表明，GABA可抑制皮下脂肪组织中巨噬细胞的浸润和M1极化。而如图3所示，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠的内脏脂肪组织中的巨噬细胞数量明显增加(图3A和B)，而GABA治疗组小鼠相较于奥氮平组小鼠，巨噬细胞数和M1细胞数均未显示出显著差异(图3A和C、D、E)。

<实施例3>

GABA可抑制奥氮平组小鼠皮下脂肪组织离体培养基中单核细胞THP-1的迁移：

实验方法：

分离实施例1中小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪组织0.5g，眼科剪剪碎后至于含有10％FBS和1％双抗的1640培养基中，于37℃、5％CO₂中进行孵育，48小时后收集条件培养基，4℃保存备用。收集对数期THP-1细胞，使用Calcein AM(碧云天，C2012)进行活细胞荧光标记，收集荧光标记的THP-1细胞，接种在Tanswell的上层小室中(8μm，24孔板)，每孔3×10^5个细胞，下层小室中加入上述条件培养基，培养24h。每孔加入500μL Hoechst 33342工作液，孵育15min后置于荧光显微镜下观察并拍照。

实验结果：

如图4所示，与对照组小鼠皮下组织来源的条件培养基相比，奥氮平组小鼠皮下脂肪组织来源的条件培养基可显著增加THP-1从上室向下室的迁移，而GABA治疗组小鼠皮下脂肪组织来源的条件培养基则可抑制THP-1从上室向下室的迁移(图4A)。而小鼠内脏脂肪来源的条件培养基培养THP-1细胞后未观察到类似结果(图4B)。以上结果表明，GABA可抑制奥氮平组小鼠皮下脂肪组织离体培养基诱导的单核细胞THP-1的迁移，进一步表明，GABA可通过抑制皮下脂肪组织中巨噬细胞的浸润进而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗。

<实施例4>

补充外源性GABA可以改善奥氮平长期暴露引起的脂代谢紊乱：

实验方法：

利用实施例1中小鼠，于第11周时进行上述实验后使用戊巴比妥麻醉，取血后处死，取材后进行后续HE染色：小鼠处死后取腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪、肩胛间棕色脂肪、肝脏，分别于脂肪专用固定液和4％多聚甲醛中固定，脱水后石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色后观察脂肪细胞大小、脂滴聚集相关病理变化。

实验结果：

小鼠皮下脂肪组织HE染色结果显示(图5)，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠皮下脂肪组织明显增生(图5A)，组织重量明显增加(图5B)，单个脂肪细胞较大(图5D)，内脏脂肪也出现类似结果(图5C和D)；同时，奥氮平组小鼠出现脂肪异位沉积，在棕色脂肪组织和肝脏中出现较多脂滴(图5D)。而GABA治疗组小鼠相较于奥氮平组小鼠，皮下脂肪组织重量明显降低，增生情况亦被改善(图5A和B)，小鼠棕色脂肪和肝脏中的脂肪异位沉积也得到明显缓解(图5D)。由此说明，补充外源性GABA可以改善奥氮平长期暴露引起的脂代谢紊乱。

综上，本发明中发明人利用小鼠模型确证了奥氮平长期暴露对小鼠体重、胰岛功能的影响以及GABA对其的改善作用。利用4周龄C57BL/6J雌性小鼠，分别给予生理盐水、奥氮平和GABA干预后发现，与奥氮平组小鼠相比，GABA治疗组小鼠体重显著降低，糖耐量、胰岛素敏感性受损得到改善(图1)。发明人进一步分析小鼠脂肪组织中巨噬细胞的浸润和M1极化，揭示GABA是如何缓解奥氮平诱导的胰岛素抵抗。利用流式细胞术技术检测小鼠脂肪组织中的巨噬细胞数及促炎细胞M1巨噬细胞的比例，结果显示，与对照组小鼠相比，奥氮平组小鼠的皮下脂肪组织中巨噬细胞浸润显著增加，并且M1巨噬细胞的比例显著增加，而GABA治疗组小鼠的皮下脂肪组织中巨噬细胞浸润明显改善，M1巨噬细胞的比例亦显著降低(图2)。进一步地，发明人进行小鼠皮下脂肪组织的离体培养，并收集条件培养基进行单核细胞迁移实验，结果发现，与对照组小鼠比较，奥氮平组的条件培养基可促进单核细胞的迁移，而GABA治疗组小鼠的皮下脂肪来源的条件培养基可明显改善单核细胞的迁移(图4)。以上结果表明，GABA可抑制小鼠皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症，从而改善奥氮平诱导的胰岛素抵抗。因此，GABA具有在制备防治奥氮平诱导胰岛素抵抗的药物中的用途，可用于制备改善奥氮平诱导胰岛素抵抗的药物。另外，本发明中发明人进一步确证了GABA对改善奥氮平诱导的脂代谢紊乱的作用。利用4周龄C57BL/6J雌性小鼠，分别给予生理盐水、奥氮平和GABA干预后发现，，奥氮平组小鼠的皮下脂肪出现明显增生，且在棕色脂肪和肝脏中出现明显的脂肪异位沉积；而GABA干预后上述情况均得到改善(图5)。以上结果表明，补充外源性GABA可以明显改善奥氮平诱导的脂代谢异常这一不良反应。因此，GABA具有在制备防治奥氮平诱导脂代谢异常的药物中的用途，可用于制备改善奥氮平诱导脂代谢异常的药物。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.γ-氨基丁酸GABA在制备防治奥氮平诱发的不良反应药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中，奥氮平诱发的不良反应为胰岛素抵抗和脂代谢紊乱。

3.如权利要求1所述的应用，其中，γ-氨基丁酸GABA作为单一组分药物或组合药物中的有效成分。

4.如权利要求1所述的应用，其中，胰岛素抵抗包括奥氮平不良反应导致的血清胰岛素水平升高、糖耐量受损、胰岛素敏感性降低。

5.如权利要求1所述的应用，其中，脂代谢紊乱包括脂肪增生肥大和内脏、棕色脂肪、肝脏部位的脂肪异位沉积。

6.如权利要求2所述的应用，其中，γ-氨基丁酸GABA的有效剂量为50mg/kg/day。

7.如权利要求1所述的应用，其中，GABA是指氨基酸生物小分子代谢产物。

8.如权利要求2所述的应用，其中，γ-氨基丁酸GABA通过抑制皮下脂肪中的巨噬细胞浸润，抑制促炎细胞M1巨噬细胞的极化，进而抑制脂肪组织中的炎症来防治奥氮平诱发的胰岛素抵抗。

9.如权利要求2所述的应用，其中，γ-氨基丁酸GABA通过改善脂肪增生和异位沉积来防治奥氮平诱发的脂代谢紊乱。