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CN117538533B - 一种定量检测免疫血浆及免疫球蛋白制品破伤风效价的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种定量检测免疫血浆及免疫球蛋白制品破伤风效价的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒及其应用。试剂盒，其特征在于，包括稀释液、工作液及标准品；所述稀释液是由缓冲液、表面活性剂、促浊剂、防腐剂组成；所述工作液是由缓冲液、包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒、无关蛋白、防腐剂组成。本发明提供的试剂盒适用于全自动生化分析仪，可快速定量检测破伤风免疫血浆中的破伤风抗体的含量，也可用于破伤风免疫球蛋白制品效价的测定。该试剂以破伤风疫苗类毒素原液为反应底物，具有线性广、灵敏度高、稳定性好、操作方便等优点。

Description

一种定量检测免疫血浆及免疫球蛋白制品破伤风效价的试剂 盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒及其应用。
背景技术
检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品中的破伤风抗体效价，现行采用的是小鼠中和试验法和快速荧光灶抑制试验法。其中，小鼠中和试验法是将样品和标准品各梯度稀释成两组不同浓度度的供试品与标准品溶液加入等量的用病毒，置37℃中和1小时后注射小鼠/感染BSR细胞，再用样品与标准品的ED50比较计算出产品中抗体效价。
但是，现有技术中的小鼠中和试验法的检测方法存在大量的缺点：1）此类方法实验受动物体质/细胞活力、病毒滴度、结果判断等多种因素影响，因有结果重现和精确度较差；2）实验周期特别长：小鼠中和试验法需耗时至少15天；3）小鼠中和试验法每次小鼠用量达120只，实验消耗较大；4）检测成本高，小鼠中合法1500元/测试。而快速荧光灶抑制试验法也存在大量的缺陷：1）快速荧光灶抑制试验法需要根据荧光情况判定结果，主观因素影响较大；2）耗时较长，快速荧光灶抑制试验法至少3天；3）检测成本高，快速荧光法800元/测试。因此，亟需开发一种新型的可定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒及检测方法，以提升检测准确程度、降低检测成本和缩短检测时间。
发明内容
针对现有技术中存在的破伤风抗体效价检测方法的检测准确程度不理想、检测成本高和检测时间长等技术问题，本发明提供了一种新型的可定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒。本发明采用一种稳定有效的乳胶微球包被方法，该试剂适用于全自动生化分析仪，可快速定量检测破伤风免疫血浆中的破伤风抗体的含量，也可用于破伤风免疫球蛋白制品效价的测定。该试剂以破伤风疫苗类毒素原液为反应底物，具有线性广、灵敏度高、稳定性好、操作方便等优点。
本发明还提供了上述试剂盒的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒，包括稀释液、工作液及标准品；
所述稀释液是由缓冲液、表面活性剂、促浊剂、防腐剂组成；
所述工作液是由缓冲液、包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒、无关蛋白、防腐剂组成。
本发明提供的稀释液或工作液中，所述缓冲液为浓度为0.01～0.1mol/L， pH6～9的MOPS缓冲液或CB缓冲液；所述表面活性剂为S9和油酸钠组成；所述表面活性剂在稀释液中的浓度为0.1～5％；所述S9和油酸钠的质量比为1:0.08；所述促浊剂为吐温20，浓度为0.1～5％；所述防腐剂为硫柳汞钠，浓度为0.01-0.05%。
本发明提供的工作液中，所述无关蛋白为Casein或脱脂奶粉；所述无关蛋白在工作液中的浓度为0.1～1％。
本发明提供的包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒通过以下方法制备而成：
（1）活化：将羧基乳胶微球首先置于丁二酸酐溶液中，搅拌处理，过滤后水洗，然后加水制备成羧基乳胶微球悬浊液，将EDC和NHS配成交联溶液，加入到微球悬浊液中，避光旋转反应，得反应液；
（2）包被BSA：将反应液中加BSA水溶液, 混合，避光反应；离心，弃上清，PBS复溶,超声后加入戊二醛溶液，旋转反应；
（3）标记破伤风疫苗类毒素原液：将旋转反应后的反应液中加入破伤风疫苗类毒素原液, 避光反应；然后加入PEG进行封闭，避光旋转反应；离心清洗后弃上清， PBS复溶,超声，重复两次；再次离心，弃上清，加入CASEIN-GLY溶液复溶，超声即可。
进一步的，步骤（1）中，所述丁二酸酐溶液的浓度为8-10%；所述羧基乳胶微球和丁二酸酐溶液的质量比为1:5；所述丁二酸酐溶液搅拌处理的时间为20min；所述羧基乳胶微球悬浊液的固含量为10%；所述交联溶液的浓度为50mg/ml；所述羧基乳胶微球悬浊液、EDC和NHS的比例为1mL：5mg：5mg；所述交联活化剂避光旋转反应的时间为40min。
进一步的，步骤（2）中，所述羧基乳胶微球悬浊液和BSA水溶液的体积比为1:2.5；所述BSA水溶液的质量浓度为2%；所述避光反应的时间为18-24h；所述戊二醛溶液的浓度为10%；所述PBS和戊二醛溶液的体积比为2:1；所述旋转反应的时间为6h。
进一步的，步骤（3）中，所述破伤风疫苗类毒素原液的浓度为1mg/ml；所述羧基乳胶微球和破伤风疫苗类毒素的比例为1：0.05；所述避光反应的时间为18-24h；所述破伤风疫苗类毒素和PEG的质量比为1:5；所述避光旋转反应的时间为2h；所述CASEIN-GLY的浓度为5%；所述Gly的浓度为0.1M，pH为8.0。
进一步的，所述包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒的粒径为100nm-200nm。
本发明所提供的标准品为以人破伤风抗体血浆为母液，使用1%caein-氯化钠溶液（0.9%氯化钠）作为稀释液，进行稀释；
所述标准品的浓度为： 0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL， 20IU/mL，40IU/ml。
本发明还提供了一种上述试剂盒在检测血浆样本和血液制品稀释后破伤风效价中的应用，其特征在于，检测范围在0-40IU/mL.相关系数r＞0.99。
试剂盒测定使用全自动生化分析仪检测，检测方法：免疫比浊法。主波长：570nm，副波长：700nm，定标方法：四参数。反应方向：正向。R1试剂150μl；R2试剂50μl。 测定方法(两点终点法)：150μl稀释液加入2μl样本，于37℃反应5分钟，读点测得吸光度A1，然后加入50μl工作液，于37℃反应5分钟之后再次读点测得吸光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，并根据破伤风标准曲线计算定测试结果。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的试剂盒适用于全自动生化分析仪，可快速定量检测破伤风免疫血浆中的破伤风抗体的含量，也可用于破伤风免疫球蛋白制品效价的测定。该试剂以破伤风疫苗类毒素原液为反应底物，具有线性广、灵敏度高、稳定性好、操作方便等优点。
（2）本发明提供的制备方法，能够提高交联效率，减少随机性，从而提高检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明提供的试剂盒的工艺流程图；
图2为实施例1的标准曲线图；
图3为对比例1的标准曲线图；
图4为对比例2的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明提供的试剂盒的具体工艺流程图如图1所示。
实施例1
（1）检测试剂盒组成为：
稀释液（50mL*1瓶）；
工作液（15mL*1瓶）；
标准品0.2ml/支（0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL，20IU/mL，40IU/mL。）；
（2）所述稀释液成分为：缓冲液（0.05M CB缓冲液pH7.5）、表面活性剂（2.5％的S9和油酸钠，S9:油酸钠=1:0.08）、促浊剂（5% 吐温20）、防腐剂（0.04％的硫柳汞钠）；
（3）所述试剂工作液为：缓冲液（0.05M CB缓冲液pH7.5）、包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒、无关蛋白（1%Casein）、防腐剂（0.04％的硫柳汞钠）；
（4）所述标准品：以人破伤风抗体血浆为母液，使用1%caein-氯化钠溶液（0.9%氯化钠）作为稀释液，
制备标准品： 0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL， 20IU/mL，40IU/ml。
（5）所述包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒，具体制备方法为：
5.1将羧基乳胶微球首先置于丁二酸酐溶液中，搅拌处理，过滤后水洗，然后加水制备成羧基乳胶微球悬浊液。取羧基微球（固含量10%）悬浊液1ml，将5mg 的EDC和5mg 的NHS分别配成浓度为50mg/ml的溶液，加入到微球悬浊液中，避光旋转反应40min，即得反应液。
5.2包被BSA: 加2% BSA 水溶液2.5ml, 混合，避光过夜（18-24h）；
离心8000rpm×5min，弃上清， 5mL PBS复溶, 超声60s ，功率100%
5.3加入戊二醛溶液（10%）2.5ml，旋转反应6h,
5.4标记破伤风疫苗类毒素：加1mg/ml破伤风类毒素 5.0ml, 避光反应过夜（18-24h）；
5.5加入50mg/ml PEG（水溶液） 0.5ML，避光旋转反应2h。
5.6离心清洗，8000rpm×30min，弃上清， 5ml 10mMPBS（PH7.4）复溶, 超声30min。重复两次;
5.7离心8000rpm×30min，弃上清， 5ml CASEIN-GLY溶液（0.1M Gly PH8.0）复溶,超声60min。
（6）所述所述破伤风类毒素原液是通过戊二醛交联蛋白原理。
（7）所述乳胶颗粒为100-200nm；
（8）破伤风抗体效价检测方法，具体包括以下步骤：
试剂盒测定使用全自动生化分析仪检测，检测方法：免疫比浊法。主波长：570nm，副波长：700nm，定标方法：四参数。反应方向：正向。R1试剂150μl；R2试剂50μl。 测定方法(两点终点法)：150μl R1试剂加入2μl样本，于37℃反应5分钟，读点测得吸光度A1，然后加入50μlR2试剂，于37℃反应5分钟之后再次读点测得吸 光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，并根据破伤风标准曲线计算定测试结果。
对比例1
（1）检测试剂盒组成为：
稀释液（50mL*1瓶）；
工作液（15mL*1瓶）；
标准品0.2ml/支（0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL，20IU/mL，40IU/mL。）；
（2）所述稀释液成分为：缓冲液（0.05M CB缓冲液pH7.5）、表面活性剂（2.5％S9）、促浊剂（5% 吐温20）、防腐剂（0.04％的硫柳汞钠）；
其他步骤同实施例1。
对比例2
（1）检测试剂盒组成为：
稀释液（50mL*1瓶）；
工作液（15mL*1瓶）；
标准品0.2ml/支（0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL，20IU/mL，40IU/mL。）；
（2）所述稀释液成分为：缓冲液（0.05M CB缓冲液pH7.5）、表面活性剂（2.5％的S9和油酸钠，S9:油酸钠=1:0.08）、促浊剂（5% 吐温20）、防腐剂（0.04％的硫柳汞钠）；
（3）所述试剂工作液为：缓冲液（0.05M CB缓冲液pH7.5）、包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒、无关蛋白（1%Casein）、防腐剂（0.04％的硫柳汞钠）；
（4）所述标准品：以人破伤风抗体血浆为母液，使用1%caein-氯化钠溶液（0.9%氯化钠）作为稀释液，
制备标准品： 0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL， 20IU/mL，40IU/ml。
（5）所述包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒，具体制备方法为：
5.1将羧基乳胶微球加水制备成羧基乳胶微球悬浊液。取羧基微球（固含量10%）悬浊液1ml，将5mg 的EDC和NHS配成浓度为50mg/ml的溶液，加入到微球悬浊液中，避光旋转反应40min，即得反应液。
其他步骤同实施例1。
效果实施例1
将实施例1制备得到的试剂盒进行质量标准检测，检测标准依据破伤风免疫血浆效价测试试剂质量标准，具体结果如表1所示。
表1
效果实施例2
采用实施例1和对比例1、2，测试标准品（0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL，20IU/mL，40IU/ml）及质控血浆(QC11.6IU/mL)，具体检测结果参见表1（ΔA）。并使用标准品中抗体效价浓度为横坐标，以ΔA为纵坐标作图并进行拟合:具体结果见表2，如图2-4所示。
表2
效果实施例3
采用实施例1和对比例2，以及ELISA法检测试剂盒，测试国标18IU/mL、国标9IU/mL、国标4.5IU/mL、制品01（120IU/mL）、制品02（130IU/mL）、制品03（120IU/mL），具体检测结果见表3。
表3

Claims (8)

1.一种定量检测破伤风免疫血浆及免疫球蛋白制品效价的试剂盒，其特征在于，包括稀释液、工作液及标准品；
所述稀释液是由缓冲液、表面活性剂、促浊剂、防腐剂组成；
所述工作液是由缓冲液、包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒、无关蛋白、防腐剂组成，
稀释液或工作液中，所述缓冲液为浓度0.01～0.1mol/L，pH6～9的MOPS缓冲液或CB缓冲液；所述表面活性剂为S9和油酸钠组成；所述表面活性剂在稀释液中的浓度为0.1～5％；所述S9和油酸钠的质量比为1:0.08；所述促浊剂为吐温20，浓度为0.1～5％；所述防腐剂为硫柳汞钠，浓度为0.01-0.05%；
所述包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒通过以下方法制备而成：
（1）活化：将羧基乳胶微球首先置于丁二酸酐溶液中，搅拌处理，过滤后水洗，然后加水制备成羧基乳胶微球悬浊液，将EDC和NHS配成交联溶液，加入到微球悬浊液中，避光旋转反应，得反应液；
（2）包被BSA：将反应液中加BSA水溶液, 混合，避光反应；离心，弃上清，PBS复溶, 超声后加入戊二醛溶液，旋转反应；
（3）标记破伤风疫苗类毒素原液：将旋转反应后的反应液中加入破伤风疫苗类毒素原液, 避光反应；然后加入PEG进行封闭，避光旋转反应；离心清洗后弃上清，PBS复溶, 超声，重复两次；再次离心，弃上清，加入CASEIN-GLY溶液复溶，超声即可。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，工作液中，所述无关蛋白为Casein或脱脂奶粉；所述无关蛋白在工作液中的浓度为0.1～1％。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1）中，所述丁二酸酐溶液的浓度为8-10%；所述羧基乳胶微球和丁二酸酐溶液的质量比为1:5；所述丁二酸酐溶液搅拌处理的时间为20min；所述羧基乳胶微球悬浊液的固含量为10%；所述交联溶液的浓度为50mg/ml；所述羧基乳胶微球悬浊液和交联溶液的比例为1mL：5mg；所述交联溶液的浓度为50mg/mL；所述交联活化剂避光旋转反应的时间为40min。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2）中，所述羧基乳胶微球悬浊液和BSA水溶液的体积比为1:2.5；所述BSA水溶液的质量浓度为2%；所述避光反应的时间为18-24h；所述戊二醛溶液的浓度为10%；所述PBS和戊二醛溶液的体积比为2:1；所述旋转反应的时间为6h。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤（3）中，所述破伤风疫苗类毒素原液的浓度为1mg/ml；所述羧基乳胶微球和破伤风疫苗类毒素的比例为1：0.05；所述避光反应的时间为18-24h；所述破伤风疫苗类毒素和PEG的质量比为1:5；所述避光旋转反应的时间为2h；所述CASEIN-GLY的浓度为5%；所述GLY的浓度为0.1M，pH为8.0。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被破伤风疫苗类毒素原液的乳胶颗粒的粒径为100nm-200nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为以人破伤风抗体血浆为母液，使用1%caein-0.9%氯化钠溶液作为稀释液，进行稀释；
所述标准品的浓度为： 0IU/mL， 2.5IU/mL， 5IU/mL， 10IU/mL， 20IU/mL，40IU/ml。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的试剂盒在检测血浆样本和血液制品稀释后破伤风效价中的应用，其特征在于，检测范围在0-40IU/mL，相关系数r＞0.99。
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