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CN117535152A - 一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法 - Google Patents

一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，具体包括以下步骤：(1)禁食；(2)麻醉、剃毛；(3)保定、消毒；(4)切开皮肤；(5)挑取盲肠；(6)注射子孢子；(7)术部缝合；(8)术后护理。本发明将分离纯化后的柔嫩艾美耳球虫子孢子经开腹手术后精准注射于盲肠内，注射接种感染成功率达100％，球虫卵囊产量较传统泄殖腔和十二指肠注射接种产量大幅提升。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法。
背景技术
鸡球虫病(Avian coccidiosis)是由艾美耳属球虫(Eimeria)寄生在鸡肠道所引起的家禽传染性疾病，鸡球虫属于顶复门、孢子虫纲、真球虫目、艾美耳科、艾美耳属。引起鸡球虫病的艾美耳球虫有7种，以肠道损伤、下痢或血便为特征。鸡艾美耳球虫具有严格的宿主特异性，不同种的鸡球虫寄生部位和致病力存在较大差异，其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)致病力强且分布广泛，对养禽业危害最严重。
基因编辑技术是解析鸡球虫抗球虫药物作用靶点和毒力基因之间关系，研究基因缺失疫苗的关键技术之一。在球虫基因编辑过程中，需要将外源基因经电转染转入球虫子孢子，但电转势必会对子孢子细胞膜造成损伤从而影响虫体正常入侵及发育。转染后的子孢子在体内发育至卵囊，进行高效扩繁是子孢子转染体系所需要解决的技术瓶颈。
扩繁子孢子常见的方式，一种是子孢子经口接种，但这种接种方式胃酸会对子孢子造成损伤，尽管可以使用NaHCO3改善胃部酸性环境，但最终仅产生少量卵囊；另一种方式经泄殖腔接种，但经泄殖腔接种由外排造成的损耗会直接影响接种效率。也有报道经十二指肠接种子孢子进行柔嫩艾美耳球虫扩繁，但其繁殖率和卵囊产量仍偏低。
因此，如何提高柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种产量和接种效率是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，以解决现有技术中鸡球虫子孢子的接种产量少和效率低等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，具体包括以下步骤：
(1)禁食
术前对鸡只进行禁食；
(2)麻醉、剃毛
先对鸡只进行第一次肌肉注射麻醉，待鸡只反应迟钝时进行第二次肌肉注射麻醉，并将鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处羽毛剃干净；
(3)保定、消毒
将鸡只仰卧保定，术部选择鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处，先使用医用酒精脱脂，再使用碘伏溶液消毒，最后使用医用酒精脱碘，均以手术切口为中心向四周涂擦；
(4)切开皮肤
使用无菌布覆盖鸡只，创巾钳固定，于鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处纵向切开腹部皮肤；
(5)挑取盲肠
暴露肌肉，钝性分离腹壁肌肉，提起腹膜，剪一小口，暴露腹腔，挑取盲肠；
(6)注射子孢子
将柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液缓慢注入盲肠体；
(7)术部缝合
腹壁肌肉采用单纯连续缝合法进行缝合，腹部皮肤采用结节缝合法进行缝合，手术完成；
(8)术后护理
术后喂食喂水，查看鸡只状态，消毒术部。
进一步，上述步骤(1)中，术前12h对鸡只进行禁食。
进一步，上述步骤(2)中，第一次肌肉注射麻醉采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂，用量为0.25mL/kg；第二次肌肉注射麻醉采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂，用量为0.1mL/kg；速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂由速眠新Ⅱ与氯胺酮以1:1的体积比混合制得。
进一步，上述步骤(3)中，将鸡只仰卧保定在手术床上；医用酒精的体积分数为75％。
进一步，上述步骤(4)中，执笔式持手术刀于鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处纵向切开腹部皮肤2-3cm。
进一步，上述步骤(5)中，使用止血钳或手术刀柄钝性分离腹壁肌肉；使用镊子提起腹膜；使用剪刀剪一小口；使用弯头止血钳挑取盲肠。
进一步，上述步骤(6)中，柔嫩艾美耳球虫子孢子的浓度为80000个/mL，注射剂量为0.5mL/鸡。
进一步，上述步骤(8)中，术后4h喂食喂水；每天查看鸡只状态至少一次；术后五天内每天用碘伏消毒术部两次。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明探索了一种新的柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，将柔嫩艾美耳球虫子孢子直接接种至其靶器官，避免经口接种胃酸和胰酶消化液对柔嫩艾美耳球虫子孢子活力的影响以及经泄殖腔接种产生的外排造成的损耗。本发明较泄殖腔接种柔嫩艾美耳球虫子孢子产量提升了2.16倍，较小肠中段注射柔嫩艾美耳球虫子孢子产量提升了4.8倍，且潜隐期和排卵高峰较十二指肠注射子孢子均提前了11h，应用本发明可最大限度提升柔嫩艾美耳球虫子孢子接种的卵囊产量并缩短卵囊繁殖时间，为获得基因编辑虫株提供了技术支持。
2、本发明将分离纯化后的柔嫩艾美耳球虫子孢子经开腹手术后精准注射于盲肠内，注射接种感染成功率达100％，球虫卵囊产量较传统泄殖腔和小肠注射接种产量大幅提升。
附图说明
图1为柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法的实拍图；
图2为盲肠接种与泄殖腔接种柔嫩艾美耳球虫子孢子后的卵囊产量。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，本发明对柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液的获取方法和接种剂量没有特殊限定，采用常规方法即可。
实施例
柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)禁食
术前12h对鸡只进行禁食；
(2)麻醉、剃毛
先采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂以0.25mL/kg的用量对鸡只进行第一次肌肉注射麻醉，待鸡只反应迟钝时采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂以0.1mL/kg的用量进行第二次肌肉注射麻醉，并将鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处羽毛剃干净；
其中，速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂由速眠新Ⅱ与氯胺酮以1:1的体积比混合制得；
(3)保定、消毒
将鸡只仰卧保定在手术床上，术部选择鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处，先使用体积分数为75％的医用酒精脱脂，再使用碘伏溶液消毒，最后使用体积分数为75％的医用酒精脱碘，均以手术切口为中心向四周涂擦；
(4)切开皮肤
使用无菌布覆盖鸡只，创巾钳固定，执笔式持手术刀于鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处纵向切开腹部皮肤2-3cm；
(5)挑取盲肠
暴露肌肉，使用止血钳或手术刀柄钝性分离腹壁肌肉，使用镊子提起腹膜，使用剪刀剪一小口，暴露腹腔，使用弯头止血钳挑取盲肠；
(6)注射子孢子
将0.5mL、浓度为80000个/mL的柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液缓慢注入盲肠体；
(7)术部缝合
腹壁肌肉采用单纯连续缝合法进行缝合，腹部皮肤采用结节缝合法进行缝合，手术完成；
(8)术后护理
术后4h喂食喂水，每天查看鸡只状态至少一次，术后五天内每天用碘伏消毒术部两次。
对比例
柔嫩艾美耳球虫子孢子的泄殖腔接种方法，具体包括以下步骤：
术前12h对鸡只进行禁食，用镊子翻开泄殖腔，使用1mL注射器(甘油润滑)抵住泄殖腔深部，伴随泄殖腔开合缓慢注射0.5mL、浓度为80000个/mL的柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液，每天查看鸡只状态至少一次。
性能测试
1、子孢子的分离纯化
(1)孢子囊的释放
取适量E.tenella新鲜孢子化卵囊，以2300r/min的转速离心7min，去除重铬酸钾，在沉淀中加入去离子水反复洗涤离心4次，然后将沉淀用饱和食盐水漂浮，以1500r/min的转速离心5min，保留上清，弃去沉淀。将上清用去离子水7倍稀释，以2500r/min的转速离心7min，保留沉淀，弃去上清。用PBS将沉淀悬浮，将PBS悬浮的卵囊置于研磨管中研磨，边研磨边在显微镜下检测，直到85％左右的孢子囊释放，停止研磨，并取出20μL孢子囊悬浮液稀释，在显微镜下用血球计数板分别计孢子囊数，将研磨得到的孢子囊以2200r/min的转速离心7min，离心洗涤3次，弃上清，得到E.tenella孢子囊沉淀；
(2)孢子囊的消化
将E.tenella孢子囊沉淀用41℃预热的联合消化液(0.75％胰酶消化液5mL+10％鸡胆汁5mL)进行悬浮，置于青霉素小瓶中，在41℃振荡培养箱中消化1h。同时在显微镜下观察，直至80％左右的子孢子从孢子囊溢出时，加入消化所用胰酶用量的10倍PBS停止消化，得到E.tenella子孢子；
(3)子孢子的纯化
将E.tenella子孢子以2800r/min的转速离心10min，去掉胆汁和胰酶，然后用PBS悬浮，悬液先经800目筛(22μm)过滤，滤液再经1400目筛(12μm孔径)过滤，每次过滤时用PBS反复冲洗3次。将过滤得到的子孢子悬液再以2800r/min的转速离心10min，离心2次，得到纯化的子孢子沉淀，将纯化的子孢子用PBS悬浮，然后在显微镜下用血球计数板计数过滤后的子孢子数量。
2、子孢子接种
选取12只36日龄鸡，随机分为6组，每组2只，分别命名为M1组、M2组、M3组、X1组、X2组和X3组，对泄殖腔部位吹气刺激10次，等候3-5min，排除肠道残留粪便，然后将M1组、M2组和M3组按照实施例方法进行柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种，将X1组、X2组和X3组按照对比例方法进行柔嫩艾美耳球虫子孢子的泄殖腔接种。
3、柔嫩艾美耳球虫潜隐期和卵囊产量测定
于接种后130h开始检测鸡粪便卵囊，测定潜隐期。从发现第一个卵囊开始，连续检测2天粪便卵囊，测定每克粪便中的卵囊数(OPG)，称量每组每日的总粪重，计算每羽鸡每日的卵囊产量、统计排卵高峰及单个子孢子的产量。
取全部粪样称重后，用5倍体积分离液(含0.5％洗洁精+2.5％乙酸+0.017mg/mL胃蛋白酶的凉开水)稀释，研碎混匀，静置30min后再加入10mL分离液，混匀粪液。摇匀粪液后用吸管吸取混悬液，滴于血球计数板盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。多余培养液可用滤纸吸去。静置5min，待球虫全部沉降到计数室底部后，将4个方格中的卵囊数相加后乘以2.5×104(A×2500×20÷2)，即得每克粪便卵囊数，每个样品重复计数3次，取3次平均数。
结果如表1和图2所示。
表1各处理组的球虫卵囊产量
由表1和图2可知，盲肠(实施例)和泄殖腔(对比例)接种柔嫩艾美耳球虫子孢子的排卵囊高峰均为133-157h，潜隐期均为133h。盲肠(实施例)接种柔嫩艾美耳球虫子孢子后卵囊产量为4.16×106个卵囊/羽，单个子孢子产量为103.96个卵囊/羽。泄殖腔(对比例)接种柔嫩艾美耳球虫子孢子后卵囊产量为1.93×106个卵囊/羽，单个子孢子产量为48.13个卵囊/羽。盲肠(实施例)接种卵囊产量显著高于(p＜0.05)泄殖腔(对比例)接种卵囊产量(2.16倍)。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)禁食
术前对鸡只进行禁食；
(2)麻醉、剃毛
先对鸡只进行第一次肌肉注射麻醉，待鸡只反应迟钝时进行第二次肌肉注射麻醉，并将鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处羽毛剃干净；
(3)保定、消毒
将鸡只仰卧保定，术部选择鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处，先使用医用酒精脱脂，再使用碘伏溶液消毒，最后使用医用酒精脱碘，均以手术切口为中心向四周涂擦；
(4)切开皮肤
使用无菌布覆盖鸡只，创巾钳固定，于鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处纵向切开腹部皮肤；
(5)挑取盲肠
暴露肌肉，钝性分离腹壁肌肉，提起腹膜，剪一小口，暴露腹腔，挑取盲肠；
(6)注射子孢子
将柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液缓慢注入盲肠体；
(7)术部缝合
腹壁肌肉采用单纯连续缝合法进行缝合，腹部皮肤采用结节缝合法进行缝合，手术完成；
(8)术后护理
术后喂食喂水，查看鸡只状态，消毒术部。
2.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(1)中，术前12h对鸡只进行禁食。
3.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一次肌肉注射麻醉采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂，用量为0.25mL/kg；所述第二次肌肉注射麻醉采用速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂，用量为0.1mL/kg；所述速眠新Ⅱ复合氯胺酮麻醉剂由速眠新Ⅱ与氯胺酮以1:1的体积比混合制得。
4.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(3)中，将鸡只仰卧保定在手术床上；所述医用酒精的体积分数为75％。
5.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(4)中，执笔式持手术刀于鸡只右侧肋骨后下缘至耻骨处纵向切开腹部皮肤2-3cm。
6.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(5)中，使用止血钳或手术刀柄钝性分离腹壁肌肉；使用镊子提起腹膜；使用剪刀剪一小口；使用弯头止血钳挑取盲肠。
7.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(6)中，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的浓度为80000个/mL，注射剂量为0.5mL/鸡。
8.根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的盲肠接种方法，其特征在于，步骤(8)中，术后4h喂食喂水；每天查看鸡只状态至少一次；术后五天内每天用碘伏消毒术部两次。
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