CN117529496A

CN117529496A - 小分子调控的细胞信号传导表达系统

Info

Publication number: CN117529496A
Application number: CN202280021322.7A
Authority: CN
Inventors: G·福伊特; S·博伊肯; M·拉乔伊
Original assignee: Otpez Biotech
Current assignee: Otpez Biotech
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2022-01-31
Publication date: 2024-02-06
Also published as: TW202246312A; WO2022165378A1; CA3209126A1; JP2024505248A; AU2022214455A1; EP4284822A1

Abstract

本公开提供了包括嵌合多肽(例如，嵌合抗原受体)和二聚化结构域的第一融合蛋白以及包括信号传导结构域和二聚化结构域的第二融合蛋白，其中所述二聚化结构域能够形成二聚体，并且其中小分子调控因子(例如，诱导物和抑制剂)能够改变所述二聚体的状态以改变CAR的活性。提供了小分子调控因子、表达本公开的融合蛋白的细胞以及包括本公开的蛋白质、小分子和细胞的组合物。描述了通过提供本公开的组合物来治疗或预防受试者的疾病或病症的方法。

Description

小分子调控的细胞信号传导表达系统

相关申请交叉引用

本申请要求于2021年1月29日提交的美国临时申请第63/143,725号的优先权。此临时申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表的并入

本申请含有已经以ASCII格式通过EFS-Web递交的序列表并且所述序列表特此通过引用整体并入本文。创建于2022年1月31日的所述ASCII副本命名为016-TNP024PCT_SeqList.txt，并且大小为约54千字节。

技术领域

本公开涉及小分子化学、分子生物学、基因疗法、细胞疗法、免疫学和免疫细胞信号传导领域中的小分子调节的细胞信号传导表达系统。本公开的表达系统使用模块化设计和可变结构域来靶向细胞表面抗原，并且在受体-配体相互作用时引导信号传导级联，由此驱动细胞功能。

背景技术

控制二聚化或蛋白酶活性的小分子药物可以用于控制细胞和基因疗法的活性，以提高功效和安全性。为了开发有效且安全的下一代细胞和基因疗法，包含针对癌症的免疫治疗方法，对利用模块化设计和CAR的可变结构域的技术的需要日益增加，所述CAR可以靶向一系列细胞表面抗原，并且在受体-配体相互作用时引导信号传导级联。

发明内容

本公开提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括与二聚化结构域可操作地连接的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括包含抗原感测结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中所述嵌合多肽在细胞内与所述二聚化结构域可操作地连接。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述嵌合多肽包括T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或嵌合受体。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述抗原感测结构域包括以下中的一种或多种：(a)重链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合(CDR)；(b)重链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合和轻链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合；(c)基于纤连蛋白的支架；其中抗原感测区与靶抗原特异性结合。在一些实施例中，所述基于纤连蛋白的支架包括Centyrin。在一些实施例中，所述基于纤连蛋白的支架包括III型纤连蛋白(FN3)结构域。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述抗原感测区包括从哺乳动物序列分离的或源自其的一个或多个序列。在一些实施例中，抗原感测区包括从人序列分离的或源自其的一个或多个序列。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述抗原感测区包括人源化或全人抗体。在一些实施例中，所述抗原感测区包括单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，所述抗原感测区包括抗体模拟物。在一些实施例中，所述抗原感测区包括单体。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述细胞外结构域进一步包括铰链区、间隔子序列或安全开关中的一个或多个。在一些实施例中，所述铰链区包括从CD4(分化簇4)多肽、CD8(分化簇8)多肽或CD28(分化簇28)多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述铰链区包括从人序列分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述铰链区和所述间隔子序列是相同的结构域。在一些实施例中，所述铰链区和所述间隔子序列是不同的结构域。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述细胞外结构域进一步包括铰链区、间隔子序列或安全开关中的一个或多个。在一些实施例中，所述间隔子序列包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述间隔子序列包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述细胞外结构域进一步包括铰链区、间隔子序列或安全开关中的一个或多个。在一些实施例中，所述安全开关包括从表皮生长因子受体(EGFR)多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述安全开关包括截短的EGFR(EGFRt)多肽。在一些实施例中，当EGFRt与利妥昔单抗(rituximab)结合时，组合导致细胞死亡。在一些实施例中，所述EGFRt包括序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGE。在一些实施例中，所述安全开关包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述跨膜结构域包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述跨膜结构域包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述细胞内结构域包括一个或多个共刺激结构域。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激结构域包括从CD3ζ(分化簇3ζ)多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激结构域包括从以下分离的或源自其的序列：CD28多肽、4-1BB(分化簇137)多肽、ICOS(诱导型T细胞共刺激分子)多肽、OX40多肽或CD27(分化簇27)多肽。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激结构域包括(a)第一共刺激结构域，所述第一共刺激结构域包括从CD28多肽、4-1BB多肽或ICOS多肽分离的或源自其的序列；以及(b)第二共刺激结构域，所述第二共刺激结构域包括从4-1BB多肽、OX40多肽或CD27多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述嵌合多肽包括进一步包括诱导型细胞因子结构域的细胞内结构域。在一些实施例中，所述诱导型细胞因子结构域包括能够诱导IL-12细胞因子的表达的经激活的T细胞的核因子(NFAT)多肽。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述嵌合多肽包括进一步包括细胞因子受体的细胞内结构域的细胞内结构域。在一些实施例中，细胞因子受体的所述细胞内结构域包括IL-2受体β(IL-2Rβ)链片段。在一些实施例中，所述嵌合多肽包括进一步包括信号转导子和转录激活子(STAT3/5)结合基序的细胞内结构域。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述嵌合多肽包括进一步包括至少一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)序列的细胞内结构域。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，所述融合蛋白从氨基到羧基末端包括所述嵌合多肽、接头和所述二聚化结构域。在一些实施例中，所述接头包括以下中的一种或多种：DNA序列、RNA序列、氨基酸序列和聚合物。在一些实施例中，所述接头包括序列GGGGS；或所述接头包括介于2个与20个氨基酸之间的长度；或所述接头包括包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的序列。在一些实施例中，所述接头包括寡聚化结构域。在一些实施例中，所述寡聚化结构域包括以下序列：

SEYEIRKALEELKASTAELKRATASLRASTEELKKNPSEDALVENNRLIVEHNAIIVENNRIIAAVLELIVRAIK(三聚体)；

TRTEIIRELERSLREQEELAKRLKELLRELERLQREGSSDEDVRELLREIKELVEEIEKLAREQKYLVEELKRQD(二聚体)；

TRRKQEMKRLKKEMEKIREETEEVKKEIEESKKRPQSESAKNLILIMQLLINQIRLLALQIRMLALQLQE(五聚体)；或

TEDEIRKLRKLLEEAEKKLKKLEDKTRRSEEISKTDDDPKAQSLQLIAESLMLIAESLLIIAISLLLSSRNG(六聚体)。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述二聚化结构域包括NS3a多肽。在一些实施例中，所述NS3a多肽包括序列(a)MAKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLLGCIITSATGRDKNQVDGEVQVLSTATQSFLATCVNGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPVSYLKGSAGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVESMETTMRSP；或(b)MKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP；或(c)KKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP.。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述二聚化结构域包括DNCR多肽。在一些实施例中，所述DNCR多肽包括序列

SSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEE

VKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLA

VEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARE

LVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH.。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述二聚化结构域包括GNCR多肽。在一些实施例中，所述GNCR多肽包括序列

DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLT

ACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIK

LASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHP

DSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKS.。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述二聚化结构域包括apo NS3a阅读子(ANR)多肽。在一些实施例中，所述ANR多肽包括序列

GELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNF.。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包括杀伤结构域。在一些实施例中，所述杀伤结构域包括从以下分离的或源自其的序列：胱天蛋白酶-9(Cas9)多肽、胱天蛋白酶-1(Cas1多肽)、胱天蛋白酶-4(Cas4)多肽、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1(RIPK1)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3(RIPK3)多肽或其催化结构域。

在本公开的融合蛋白的一些实施例中，包含那些包括嵌合多肽的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包括可切割肽。在一些实施例中，所述可切割肽包括P2A序列或T2A序列。在一些实施例中，所述P2A序列包括序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。在一些实施例中，所述T2A序列包括序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPG.。

本公开提供了第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括与二聚化结构域可操作地连接的信号传导结构域，其中(a)在存在小分子诱导物的情况下，所述二聚化结构域能够与本公开的第一融合蛋白的所述二聚化结构域形成二聚体，或(b)在存在抑制剂的情况下，包括所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域和所述第一融合蛋白的所述二聚化结构域的二聚体可以被破坏。

在本公开的一些实施例中，所述第二融合蛋白进一步包括衔接子序列、跨膜结构域和共刺激结构域中的一个或多个。在一些实施例中，所述衔接子序列包括从DAP10多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述DAP10多肽包括序列MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，所述衔接子序列包括从表皮生长因子受体(EGFR)多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述安全开关包括截短的EGFR(EGFRt)多肽。在一些实施例中，当EGFRt与利妥昔单抗结合时，组合导致细胞死亡。在一些实施例中，所述EGFRt包括序列MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGE。在一些实施例中，所述衔接子序列包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的一些实施例中，所述第二融合蛋白进一步包括衔接子序列、跨膜结构域和共刺激结构域中的一个或多个。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的一些实施例中，所述第二融合蛋白进一步包括衔接子序列、跨膜结构域和共刺激结构域中的一个或多个。在一些实施例中，所述共刺激结构域包括从CD3ζ(分化簇3ζ)多肽分离的或源自其的序列。在一些实施例中，所述共刺激结构域包括从以下分离的或源自其的序列：CD28多肽、4-1BB多肽、ICOS多肽、OX40多肽或CD27多肽。在一些实施例中，所述共刺激结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

在本公开的一些实施例中，所述第二融合蛋白从氨基到羧基末端包括所述二聚化结构域、接头和调控结构域。在一些实施例中，所述接头包括以下中的一种或多种：DNA序列、RNA序列、氨基酸序列和聚合物。在一些实施例中，所述接头包括序列GGGGS；或所述接头包括介于2个与20个氨基酸之间的长度；或所述接头包括包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的序列。在一些实施例中，所述接头包括寡聚化结构域。在一些实施例中，所述寡聚化结构域包括以下序列：

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述二聚化结构域包括NS3a多肽。在一些实施例中，所述NS3a多肽包括序列(a)MAKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLLGCIITSATGRDKNQVDGEVQVLSTATQSFLATCVNGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPVSYLKGSAGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVESMETTMRSP；或(b)MKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP；或(c)KKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP。在一些实施例中，所述第一融合蛋白包括包含DNCR多肽、GNCR多肽或ANR多肽的二聚化结构域。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述二聚化结构域包括DNCR多肽。在一些实施例中，所述DNCR多肽包括序列SSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述二聚化结构域包括GNCR多肽。在一些实施例中，所述GNCR多肽包括序列DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKS。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述二聚化结构域包括apo NS3a阅读子(ANR)多肽。在一些实施例中，所述ANR多肽包括序列GELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNF。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，包含其中所述二聚化结构域包括DNCR多肽、GNCR多肽或ANR多肽的那些第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述第二融合蛋白质进一步包括杀伤结构域。在一些实施例中，所述杀伤结构域包括从以下分离的或源自其的序列：Cas9多肽、Cas1多肽、Cas4多肽、RIPK1多肽、RIPK3多肽或其催化结构域。

在本公开的第二融合蛋白的一些实施例中，所述第二融合蛋白进一步包括可切割肽。在一些实施例中，所述可切割肽包括P2A序列或T2A序列。在一些实施例中，所述P2A序列包括序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。在一些实施例中，所述T2A序列包括序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPG。

本公开提供了一种编码本公开的融合蛋白的核酸。在一些实施例中，核酸编码本公开的第一融合蛋白。在一些实施例中，核酸编码本公开的第二融合蛋白。在一些实施例中，核酸编码本公开的第一融合蛋白和第二融合蛋白。

在本公开的核酸的一些实施例中，所述核酸进一步包括内部核糖体进入序列(IRES)。在一些实施例中，所述IRES包括序列CCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCC.。

在本公开的核酸的一些实施例中，所述核酸进一步包括以下中的一种或多种：启动子、增强子、内含子、外显子、非翻译区(UTR)和翻译后调控元件(PRE)。在一些实施例中，所述启动子包括诱导型启动子。在一些实施例中，所述诱导型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：YB_TATA启动子、人β珠蛋白启动子(huBG)、minIL2启动子、最小CMV(minCMV)启动子和TRE3G启动子。在一些实施例中，所述启动子包括组成型启动子。在一些实施例中，所述组成型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：MND启动子、hPGK启动子、CMV启动子、CAG启动子、SFFV启动子、EF1α启动子、UBC启动子和CD43启动子。

本公开提供了一种载体，其包括本公开的核酸。在一些实施例中，所述核酸编码本公开的融合蛋白。在一些实施例中，所述核酸编码本公开的第一融合蛋白和第二融合蛋白。在一些实施例中，所述载体包括编码本公开的第一融合蛋白的第一核酸和编码本公开的第二核酸的第二核酸。在一些实施例中，第一载体包括编码本公开的第一融合蛋白的核酸，并且第二载体包括本公开的第二融合蛋白。

在本公开的载体的一些实施例中，所述载体包括能够驱动哺乳动物细胞中核酸的表达的表达载体。在一些实施例中，所述表达载体包括质粒。在一些实施例中，所述表达载体是克隆载体。

在本公开的载体的一些实施例中，所述载体包括能够将核酸引入哺乳动物细胞的递送载体。在一些实施例中，所述递送载体包括以下中的一种或多种：病毒载体、非病毒载体、脂质体、胶束、聚合物囊泡和纳米颗粒。在一些实施例中，所述病毒载体包括从病毒基因组分离的或源自其的一个或多个序列。

本公开提供了包括本公开的融合蛋白、本公开的核酸或本公开的载体的细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞是体细胞。在一些实施例中，所述细胞是干细胞。在一些实施例中，所述细胞不是人类胚胎干细胞。在一些实施例中，所述细胞是离体或体外的。在一些实施例中，所述细胞是体内的。在一些实施例中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞或其前体。在一些实施例中，所述前体是造血干细胞(HSC)。

在本公开的细胞的一些实施例中，包含表达本公开的第一融合蛋白和本公开的第二融合蛋白的那些细胞，所述细胞进一步包括小分子诱导物。在一些实施例中，所述小分子诱导物包括达诺瑞韦(danoprevir)。在一些实施例中，包含其中所述小分子诱导物包括达诺瑞韦的那些实施例，所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括DNCR多肽。在一些实施例中，所述小分子诱导物包括格佐匹韦(grazoprevir)。在一些实施例中，包含其中所述小分子诱导物包括格佐匹韦的那些实施例，所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

在本公开的细胞的一些实施例中，包含表达本公开的第一融合蛋白和本公开的第二融合蛋白的那些细胞，所述细胞进一步包括抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂包括NS3a抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂包括小分子。在一些实施例中，(a)所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域；或(b)所述第一融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域；并且所述抑制剂包括达诺瑞韦或格佐匹韦。

本公开提供包括本公开的融合蛋白、本公开的核酸、本公开的载体或本公开的细胞的组合物。

在本公开的组合物的一些实施例中，包含包括本公开的第一融合蛋白和本公开的第二融合蛋白的那些组合物，所述组合物进一步包括小分子诱导物。在一些实施例中，所述小分子诱导物包括达诺瑞韦。在一些实施例中，包含其中所述小分子诱导物包括达诺瑞韦的那些实施例，所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括DNCR多肽。在一些实施例中，所述小分子诱导物包括格佐匹韦。在一些实施例中，包含其中所述小分子诱导物包括格佐匹韦的那些实施例，所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

在本公开的组合物的一些实施例中，包含表达本公开的第一融合蛋白和本公开的第二融合蛋白的那些组合物，所述组合物进一步包括抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂包括NS3a抑制剂。在一些实施例中，所述抑制剂包括小分子。在一些实施例中，(a)所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域；或(b)所述第一融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域；并且所述抑制剂包括达诺瑞韦或格佐匹韦。

本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本公开的组合物和药学上可接受的载体。

本公开提供了本公开的融合蛋白、本公开的核酸、本公开的载体、本公开的细胞、本公开的组合物或本公开的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。在一些实施例中，所述疾病或病症包括以下中的一种或多种：自身免疫性疾病或病症；炎性疾病或病症；免疫缺陷疾病或病症；以及增殖性疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病或病症包括癌症。在一些实施例中，所述疾病或病症包括由传染病引起的感染或疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病或病症包括遗传性疾病或病症。

本公开提供了本公开的融合蛋白、本公开的核酸、本公开的载体、本公开的细胞、本公开的组合物或本公开的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。

在本公开的用途的一些实施例中，所述疾病或病症包括以下中的一种或多种：自身免疫性疾病或病症；炎性疾病或病症；免疫缺陷疾病或病症；缺血性疾病或病症；血液疾病或病症；骨病或病症；神经系统疾病或病症；心脏病或病症；血管疾病或病症；代谢疾病或病症；皮肤疾病或病症；消化系统疾病或病症；线粒体疾病或病症；肌肉疾病或病症；肝病或病症；肾病或病症；听力疾病或病症；眼科疾病或病症；以及增殖性疾病或病症。

在本公开的用途的一些实施例中，所述疾病或病症包括癌症。在一些实施例中，所述癌症包括以下中的一种或多种：成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人急性髓细胞性白血病(AML)、肾上腺癌、肛门癌、基底和鳞状细胞皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人脑和脊髓肿瘤、儿童脑和脊髓肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、青少年癌症、儿童癌症、年轻成人癌症、不明原发性癌症、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤文氏肿瘤家族(EwingFamily of Tumors)、眼癌(眼黑色素瘤)、胆囊癌、胃肠道神经内分泌(类癌)肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、卡波西肉瘤(KaposiSarcoma)、肾癌、喉和下咽癌、白血病、儿童白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、黑色素瘤皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌(Merkel Cell Skin Cancer)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、口腔(口)和口咽(喉)癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(NET)、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)和维尔姆斯瘤(Wilms Tumor)。

在本公开的用途的一些实施例中，所述疾病或病症包括由传染病引起的感染或疾病或病症。

在本公开的用途的一些实施例中，所述疾病或病症包括遗传性疾病或病症。

本公开提供了一种治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的融合蛋白、本公开的核酸、本公开的载体、本公开的细胞、本公开的组合物或本公开的药物组合物，其中所述疾病或病症的体征或症状的严重程度降低，由此治疗所述疾病或病症。

本公开提供了一种预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的融合蛋白、本公开的核酸、本公开的载体、本公开的细胞、本公开的组合物或本公开的药物组合物或本公开的药物组合物，其中所述疾病或病症的体征或症状的发作或复发被延迟或被抑制，由此预防所述疾病或病症。

在本公开的方法的一些实施例中，所述疾病或病症包括以下中的一种或多种：自身免疫性疾病或病症；炎性疾病或病症；免疫缺陷疾病或病症；缺血性疾病或病症；血液疾病或病症；骨病或病症；神经系统疾病或病症；心脏病或病症；血管疾病或病症；代谢疾病或病症；皮肤疾病或病症；消化系统疾病或病症；线粒体疾病或病症；肌肉疾病或病症；肝病或病症；肾病或病症；听力疾病或病症；眼科疾病或病症；以及增殖性疾病或病症。

在本公开的方法的一些实施例中，所述疾病或病症包括癌症。在一些实施例中，所述癌症包括以下中的一种或多种：成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人急性髓细胞性白血病(AML)、肾上腺癌、肛门癌、基底和鳞状细胞皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人脑和脊髓肿瘤、儿童脑和脊髓肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、青少年癌症、儿童癌症、年轻成人癌症、不明原发性癌症、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤文氏肿瘤家族、眼癌(眼黑色素瘤)、胆囊癌、胃肠道神经内分泌(类癌)肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、儿童白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、黑色素瘤皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、口腔(口)和口咽(喉)癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(NET)、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。

在本公开的方法的一些实施例中，所述疾病或病症包括由传染病引起的感染或疾病或病症。

在本公开的方法的一些实施例中，所述疾病或病症包括遗传性疾病或病症。

本公开提供了一种包括一种或多种载体的多核苷酸集合，所述一种或多种载体包括：(a)编码包括与第一二聚化多肽连接的第一信号传导结构域的第一融合蛋白的第一多核苷酸；以及(b)编码包括与第二二聚化多肽连接的第二信号传导结构域或寡聚化结构域的第二融合蛋白的第二多核苷酸；并且其中所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽被选择为使得所述第一二聚化多肽与所述第二二聚化多肽的相互作用由小分子的存在介导。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，细胞中的信号传导功能相对于向所述细胞施用所述小分子是诱导型的。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述小分子介导第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的结合。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述小分子破坏第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的结合。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述小分子选自由达诺瑞韦和格佐匹韦组成的组。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)第一小分子介导所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合；(b)第二小分子破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合；(c)所述第二小分子可以介导第三二聚化多肽与所述第一二聚化多肽的结合，并且(d)所述第三二聚化多肽与信号传导结构域连接。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述第二小分子通过竞争胜过所述第一小分子而破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)所述第一小分子是格佐匹韦或其类似物或衍生物；并且(b)所述第二小分子是达诺瑞韦或其类似物或衍生物。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中的一个或两个是细胞质蛋白。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中的一个或两个是跨膜蛋白。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中的一个或两个包括跨膜结构域。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中的一个是跨膜蛋白；并且(b)所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中的一个是细胞质蛋白。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述多核苷酸集合包括与所述第一二聚化多肽或所述第二二聚化多肽连接的多个信号传导结构域。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述多核苷酸集合包括具有与所述第一二聚化多肽或所述第二二聚化多肽连接的一个或多个蛋白质结构域的跨膜受体。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，与所述第一二聚化多肽连接的信号传导结构域和与所述第二二聚化多肽连接的信号传导结构域相同或基本上相同。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，与所述第一二聚化多肽连接的信号传导结构域和与所述第二二聚化多肽连接的信号传导结构域不同或基本上不同。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述多核苷酸集合包括至少两种载体，所述载体包括：(a)包括编码所述第一融合蛋白的多核苷酸的第一载体；以及(b)包括编码所述第二融合蛋白的多核苷酸的第二载体。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，载体主链包括所述多核苷酸集合。在一些实施例中，所述载体主链选自由以下的主链组成的组：腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦·巴尔病毒载体(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和转座子载体。在一些实施例中，所述载体主链包括同源性定向修复载体。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，染色体包括所述多核苷酸集合。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，编码第一融合蛋白的多核苷酸和编码所述第二融合蛋白的多核苷酸通过分离元件分离，所述分离元件包括阻止所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白的融合的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述分离元件包括包含核糖体跳跃序列的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述分离元件包括包含至少两个核糖体跳跃序列的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述分离元件包括包含P2a和/或T2a的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述分离元件包括选自由以下组成的组的多核苷酸序列：P2a、T2a、T2a-RFP-P2a、P2a-T2a、T2a-P2a和IRES。在一些实施例中，所述分离元件包括包含组成型启动子的多核苷酸序列。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)与所述二聚化多肽连接的所述信号传导结构域是嵌合抗原受体(CAR)的一部分；并且(b)所述小分子的施用调节T细胞信号传导功能。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)所述第一融合蛋白包括与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a，(b)所述第二融合蛋白包括与CD3ζ结构域连接的ANR肽；并且其中所述小分子下调CAR T细胞信号传导。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)所述第一融合蛋白包括与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a；(b)所述第二融合蛋白包括与CD3ζ结构域连接的DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其设计的变体，包含但不局限于GNCR1-3rep、G33和G38)，并且其中所述小分子的施用激活CART细胞信号传导。在一些实施例中，所述融合蛋白进一步包括跨膜结构域和/或共刺激结构域。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，(a)第一信号传导结构域和第二信号传导结构域包括杀伤结构域；并且(b)所述小分子的施用诱导细胞死亡。

在本公开的多核苷酸集合的一些实施例中，所述第一信号传导结构域和所述第二信号传导结构域中的任一个或两个选自由以下组成的组：胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-4、RIPK1或RIPK3、其突变的变体，以及前述任一种的组合。在一些实施例中，所述第一信号传导结构域和所述第二信号传导结构域中的任一个或两个包括胱天蛋白酶-9或其变体的催化结构域。在一些实施例中，(a)所述第一信号传导结构域包括胱天蛋白酶-9或其变体的催化结构域；并且(b)所述第二信号传导结构域包括胱天蛋白酶-9或其变体的催化结构域。在一些实施例中，(a)所述第一信号传导结构域包括胱天蛋白酶-9或其变体的催化结构域；并且(b)所述第二二聚化多肽与同源寡聚化结构域连接。在一些实施例中，(a)所述第一二聚化多肽选自以下组：与杀伤结构域连接的DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其变体，包含但不限于GNCR1-3rep、G33和G38)，并且(b)所述第二二聚化多肽是NS3a，并且与选自由以下组成的组的同源寡聚化结构域连接：二聚体-NS3aH1、三聚体-N3aH1、五聚体-NS3aH1、六聚体-NS3a或其变体。在一些实施例中，(a)所述第一二聚化多肽选自由以下组成的组：DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其变体，包含但不限于GNCR1-3rep、G33和G38)；并且(b)所述第二二聚化多肽是与CAR或其它同源寡聚体受体连接的NS3a。

本公开提供了一种包括本公开的多核苷酸集合的细胞。在一些实施例中，所述细胞是原核细胞。在一些实施例中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞是体内的人细胞。在一些实施例中，所述细胞是离体的人细胞。在一些实施例中，所述细胞是干细胞。在一些实施例中，所述细胞是多能干细胞。在一些实施例中，所述细胞是诱导的多能干细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血干细胞。

本公开提供了一种影响干细胞分化的方法，所述方法包括使用本公开的多核苷酸集合的多肽集合修饰干细胞。在一些实施例中，所述细胞是癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是来自被诊断患有癌症的人受试者的非癌细胞。在一些实施例中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述细胞选自由以下组成的组：白细胞、淋巴细胞、T细胞、调控T细胞、效应子T细胞、CD4+效应子T细胞，CD8+效应子T细胞、记忆T细胞、自身反应性T细胞，衰竭T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞。在一些实施例中，所述细胞选自由以下组成的组：心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和神经胶质细胞。

本公开提供了一种经基因修饰以表达包括本公开的多核苷酸的CAR的细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或ILC细胞。

本公开提供了一种生产细胞系，其中所述细胞系的细胞包括本公开的多核苷酸集合。

本公开提供了一种从所关注的基因产生所关注的多肽产物的方法，所述方法包括：(a)使用根据权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸集合修饰细胞系以产生生产细胞系；以及(b)培养所述生产细胞系以产生所述所关注的产物。在一些实施例中，所述所关注的多肽产物包括治疗性蛋白质或肽。在一些实施例中，所述所关注的多肽产物包括病毒。在一些实施例中，所述病毒选自由以下组成的组：腺病毒、慢病毒、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒(Epstein Barr virus)、乳多空病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。

本公开提供了一种生产细胞系，其中所述细胞系的细胞产生本公开的多核苷酸集合。

本公开提供了一种生产细胞系，其中所述细胞系的细胞产生包装在病毒衣壳中的本公开的多核苷酸集合。在一些实施例中，所述病毒衣壳选自由以下的衣壳组成的组：腺病毒、慢病毒、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。

本公开提供了一种病毒衣壳，所述病毒衣壳包括本公开的多核苷酸集合的多核苷酸集合。在一些实施例中，所述病毒衣壳选自由以下的衣壳组成的组：腺病毒、慢病毒、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。

本公开提供了一种产生本公开的病毒衣壳的细胞。在一些实施例中，所述病毒衣壳选自由以下的衣壳组成的组：腺病毒、慢病毒、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。

本公开提供了一种包括本公开的多核苷酸集合的组合物。

本公开提供了本公开的组合物用于治疗需要CAR疗法的受试者的用途。

本公开提供了包括本公开的多核苷酸集合的试剂盒。

本公开提供了一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括将本公开的任一个多核苷酸集合的多核苷酸转染到细胞中。在一些实施例中，所述嵌合多肽在细胞中表达。在一些实施例中，所述方法进一步包括在需要的受试者体内施用所述细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述小分子。

本公开提供了一种控制有需要的受试者体内的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的细胞的本公开的细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是自体T细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用本公开的小分子。

本公开提供了一种刺激对受试者体内的靶细胞群体或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的细胞的本公开的细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是自体T细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用本公开的小分子。

本公开提供了一种在有需要的受试者体内提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的细胞的本公开的细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是自体T细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用本公开的小分子。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的细胞的本公开的细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是自体T细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用本公开的小分子。

附图说明

图1A是可由小分子药物调节以破坏或诱导细胞信号传导活性的分裂嵌合抗原受体(CAR)的通用架构的示意图。

图1B是关闭开关ANR-CAR、开启开关DNCR CAR和开启开关GNCR CAR的示意图。

图2是诱导杀伤结构域(例如，胱天蛋白酶-9)响应于小分子药物的同源寡聚化的设计的示意图。

图3是示出在与Jeko1细胞或Jeko1-ROR1-KO细胞共培养的表达CAR的Jurkat细胞中CD69表达的小分子药物调节的诱导的图。

图4A是示出在存在或不存在其同源诱导物或干扰物小分子药物的情况下可调节CAR对靶细胞的杀伤的图组。

图4B是示出从分别表达图4A的Bcl-xL/Bad、NS3a/ANR、NS3a/GNCR1或NS3a/DNCR2的T细胞产生细胞因子IFNγ和IL-2的图组。

图5A是开启开关/安全开关可调节T细胞CAR的双重功能的示意图。

图5B是一对图，分别示出了在存在和不存在格佐匹韦或达诺瑞韦的情况下，Jurkat CD3ζ-信号传导报告系中的CAR信号传导和杀伤百分比。

图6A是一对图，分别示出了在存在和不存在格佐匹韦或达诺瑞韦的情况下，Jurkat CD3ζ-信号传导报告系中的CAR信号传导和药物诱导的细胞死亡。

图6B是一对图，分别示出了Jurkat CD3ζ-信号传导报告细胞从格佐匹韦治疗转换为达诺瑞韦治疗的CAR信号传导和药物诱导的细胞死亡。

图7A是具有胱天蛋白酶-9杀伤结构域的双链直接二聚化设计NCDC的示意图。

图7B是示出双链直接二聚化设计NCDC随药物浓度而变化的杀伤百分比的图。

图8A是CAR-NS3a-casp9和同源寡聚体螺旋束-NS3a胱天蛋白酶-9杀伤开关的示意图。

图8B是示出图8A的模板化二聚化设计的杀伤活性百分比的图。

图9A是用于最小化的DNCR2版本D1和D9的模型的示意图。

图9B是示出图9A的小型化设计的杀伤活性百分比的图。

图10是一对图，分别示出了Jurkat和原代T细胞的杀伤百分比，在一系列转导水平上表达FKBP(F36V)融合的杀伤结构域。

具体实施方式

核酸和相关术语

在一些实施例中，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”以及其语法变体可以互换使用，并且是呈单链形式或双链螺旋形式的指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)或其任何磷酸酯类似物(如硫代磷酸酯和硫酯)的磷酸酯聚合物形式。单链核酸序列是指单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。

在一些实施例中，“核酸”，并且具体是DNA或RNA分子，可以仅指分子的一级和二级结构，并且不将其限制为任何特定的三级形式。因此，此术语包含尤其在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，根据沿着未转录的DNA链(即，具有与信使RNA或mRNA同源的序列的链)在5'至3'方向上从左向右书写序列的正常惯例提供序列。除非另有说明，否则所有核酸和核苷酸序列都以5'至3'的方向从左向右书写。

核苷酸通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的通常已知的单字母符号来表示。因此，‘A’表示腺嘌呤，‘C’表示胞嘧啶，‘G’表示鸟嘌呤，‘T’表示胸腺嘧啶，并且‘U’表示尿嘧啶。

在一些实施例中，术语“多核苷酸”是指任何长度或类型的核苷酸的聚合物，包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。此术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包含三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)。所述术语还包含经修饰的，例如通过烷基化和/或通过加帽，以及未经修饰形式的多核苷酸。更具体地，“多核苷酸”包含聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)和聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包含mRNA，无论是剪接的还是未剪接的，作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，以及其它含有核苷酸主链的聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和聚吗啉代聚合物，以及其它合成序列特异性核酸聚合物，前提是聚合物含有处于允许碱基配对和碱基堆积的构型下的核碱基，如在DNA和RNA中发现的。

在一些实施例中，本公开的载体包括本公开的核酸序列和主链序列。

在一些实施例中，多核苷酸包含DNA，例如插入载体中的DNA。在其它方面，多核苷酸包含mRNA。在一些方面，mRNA是合成mRNA。在一些实施例中，合成mRNA包含至少一种非天然核碱基。在一些实施例仲，某一类的所有核碱基都已用非天然核碱基置换(例如，多核苷酸中的所有尿苷都可以用非天然核碱基，例如5-甲氧基尿苷置换)。

在一些实施例中，术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

在一些实施例中，术语“表达载体”是指设计用于细胞中的多肽表达的质粒、病毒或其它核酸。载体或构建体用于将基因导入宿主细胞中，由此载体将与细胞中的聚合酶相互作用以表达载体/构建体中编码的蛋白质。表达载体可以存在于细胞的染色体外，或者可以整合到染色体中。表达载体可以包含使载体适合在原核生物、真核生物或优选地两者中复制和整合的另外的序列(例如，穿梭载体)。本公开的多核苷酸可以作为表达载体的组分提供。

在一些实施例中，术语“克隆载体”是指设计用于产生多核苷酸的拷贝的质粒、病毒或其它核酸。克隆载体可以含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终止序列以及多聚腺苷酸化信号。此类构建体通常包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点以及3′LTR或其一部分。本公开的多核苷酸可以作为克隆载体的组分提供，所述克隆载体可以用于产生本公开的多核苷酸。

在一些实施例中，“启动子”是指指示基因转录起始于何处以及转录将在哪个方向继续的核苷酸序列。

在一些实施例中，“编码”是指多核苷酸(例如，基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列在具有定义的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列的生物过程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的能力。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则所述基因、cDNA或RNA编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

除非另有规定，否则“编码氨基酸序列”的核苷酸序列(包含“编码”本公开的嵌合多肽的多核苷酸)包含彼此的简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。

多肽和相关术语

通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示氨基酸。氨基酸残基缩略如下，其中缩略语显示在括号中：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)，组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

氨基酸序列以氨基到羧基方向从左向右书写。

在一些实施例中，术语“多肽”是指氨基酸亚基的序列。在一些实施例中，“肽”可以包括至多50个氨基酸。在一些实施例中，“肽”可以包括约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸。术语“多肽”可以指任何长度、大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用。

在一些实施例中，本公开的多肽包括天然或合成产生的或修饰的氨基酸，例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，如与标记组分缀合。在一些实施例中，本公开的多肽包括一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸(包含例如合成氨基酸，如同型半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)的人工化学类似物，以及本领域已知的其它修饰。在一些实施例中，本公开的多肽包括前述的基因产物、同源物、直链同源物、旁系同源物、片段和其它等同物、变体和类似物。在一些实施例中，本公开的多肽包括单个多肽或可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。在一些实施例中，本公开的多肽包括单链或多链多肽。在一些实施例中，本公开的多肽包括二硫键，所述二硫键可以在多链多肽中发现。

在一些实施例中，本公开的多肽包含L-氨基酸+甘氨酸、D-氨基酸+甘氨酸(其在体内对L-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或D-氨基酸+甘氨酸和L-氨基酸+甘氨酸的组合。本公开的多肽可以化学合成或重组表达。

本公开的多肽可以包含在多肽内部的N末端、C末端处的另外的残基或其组合；这些另外的残基不包含在确定本公开的多肽相对于参考多肽的同一性百分比中。此类残基可以是适于预期用途的任何残基，包含但不限于标签。

在一些实施例中，术语“标签”是指可检测部分，包含但不限于荧光蛋白、抗体表位标签、纯化标签、组氨酸标签或接头。在一些实施例中，本公开的标记的治疗剂或本公开的标记的配体包括适于纯化目的、驱动多肽的定位以及向多肽添加功能的可检测部分。

在一些实施例中，“嵌合多肽”是指包括源自第一来源的第一氨基酸序列的任何多肽，所述第一氨基酸序列与源自第二来源的第二氨基酸序列可操作地共价或非共价连接，其中所述第一来源和所述第二来源不同(两个不同的来源)。不同的第一来源和第二来源可以包含两个不同的生物实体，或者来自同一生物实体的两种不同的蛋白质，或者生物实体和非生物实体。本公开的嵌合蛋白可以包含源自至少2种不同生物来源的蛋白质。生物来源可以包含任何非合成产生的核酸或氨基酸序列(例如基因组或cDNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒体或上述任一种的突变体或类似物)。合成来源可以包含化学产生，而不是由生物系统产生(例如氨基酸序列的固相合成)的蛋白质或核酸序列。本公开的嵌合蛋白可以包含源自至少2种不同合成来源的蛋白质或源自至少一种生物来源和至少一种合成来源的蛋白质。本公开的嵌合蛋白可以包含源自第一来源的第一氨基酸序列，其与源自任何来源的核酸，或源自任何来源的小有机或无机分子共价或非共价连接。嵌合蛋白可以包含第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间、或第一氨基酸序列与核酸之间、或第一氨基酸序列与小有机或无机分子之间的接头分子。

在一些实施例中，多肽的“片段”或“截短的多肽”可以指比参考序列短的多肽的氨基酸序列。在一些实施例中，参考序列包括天然存在的序列或由其组成。与参考序列相比，片段可以包括N末端或C末端缺失(任选地称为截短)。可替代地或另外，与参考序列相比，片段可以在多肽的任一个或多个氨基酸位置处包括内部缺失。本公开的多肽可以作为参考多肽的片段或截短的版本提供。此外，本公开的多肽的所有可能的片段和截短的变体都在本公开中提供的实施例中被考虑。

在一些实施例中，术语“功能片段”是指保留多肽的功能的多肽片段。因此，在一些实施例中，生物活性肽的功能片段，如酶，保留了催化生物作用的能力，因为所述功能片段包括酶的催化结构域。本公开的多肽可以作为参考多肽的片段或截短的版本提供。此外，本公开的多肽的所有可能的片段和截短的变体都在本公开中提供的实施例中被考虑。在一些实施例中，即使与全长多肽相比功能片段的活性或功能片段的功效被修饰，本公开的功能片段也保留多肽的功能。在一些实施例中，即使与全长多肽相比功能片段的活性或功能片段的功效降低，本公开的功能片段也保留多肽的功能。

在一些实施例中，术语“功能变体”是指多肽、片段或一类多肽的成员的修饰的形式，其维持多肽的功能。在一些实施例中，即使与未经修饰的多肽相比功能变体的活性或功能变体的功效被修饰，本公开的功能变体也保留多肽的功能。在一些实施例中，即使与未经修饰的多肽相比功能变体的活性或功能变体的功效降低，本公开的功能变体也保留多肽的功能。

在一些实施例中，术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基置换存在于亲本或参考序列(例如，野生型序列)中的氨基酸残基。氨基酸可以例如通过化学肽合成或通过本领域已知的重组方法被取代。例如，通过用编码第二氨基酸的密码子取代编码第一氨基酸的密码子来进行用替代氨基酸残基取代氨基酸残基。可以为本公开的各种多肽组分提供氨基酸取代。

在一些实施例中，“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包含酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸置换，则取代被认为是保守的。另一方面，氨基酸串可以保守地用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的化学相似串置换。可以为本公开的各种多肽组分提供保守氨基酸取代。

在一些实施例中，术语“非保守氨基酸取代”可以指这些取代，其中(i)具有电正性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代电负性残基(例如，Glu或Asp)或被其取代，(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)取代疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被其取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基湖被其取代，或(iv)具有大体积疏水性或芳香族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)取代具有较小侧链的残基(例如，Ala或Ser)或没有侧链的残基(例如，Gly)或被其取代。可以为本公开的各种多肽组分提供非保守氨基酸取代。前述非保守取代之一可以改变蛋白质的功能特性的可能性也与取代相对于蛋白质功能重要区的位置有关：因此，一些非保守取代可能对生物特性几乎没有影响。可以为本公开的各种多肽组分提供不显著改变改变的组分的功能的非保守氨基酸取代。

在一些实施例中，术语“跨膜元件”或“跨膜结构域”可以指细胞外元件与细胞内元件之间的多肽元件。跨膜元件的一部分存在于细胞膜内。本公开的嵌合抗原受体(CAR)包含跨膜元件。

在一些实施例中，术语“细胞内元件”或“细胞内结构域”可以指存在于细胞的细胞质膜的细胞质侧上并将信号传输到真核细胞中的多肽元件。本公开的CAR包含细胞内元件。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞。

在一些实施例中，术语“细胞内信号传导元件”或“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并随后引导细胞执行专门功能的细胞内元件的一部分。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞。

在一些实施例中，术语“细胞外元件”或“细胞外元件”可以指存在于细胞的细胞质膜外的多肽元件。在表达CAR的细胞中，细胞外元件可以包括CAR的抗原结合元件。在一些实施例中，所述细胞是真核细胞。

序列同一性和相关术语

在一些实施例中，如果两个或更多个序列彼此100％相同，则称所述序列为“相同”。

在一些实施例中，“同一性”是指聚合物分子之间，例如多肽分子或多核苷酸分子之间的整体单体守恒。没有任何另外的限定词的“相同”，例如蛋白质A与蛋白质B相同，意味着序列100％相同(100％序列同一性)。将两个序列描述为“70％相同”等同于将其描述为具有例如“70％序列同一性”。

在一些实施例中，当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸占据时，那么分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位的数量和每个空位的长度，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。

在某些方面，第一氨基酸(或核酸)序列与第二氨基酸(或核酸)序列的同一性百分比(％ID)计算为％ID＝100(Y/Z)，其中Y是在第一序列与第二序列的比对中被评分为相同匹配的氨基酸(或核碱基)残基的数量(如通过目视检查或特定序列比对程序比对)并且Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。

在一些实施例中，例如，两个多肽序列的同一性百分比的计算可以通过将两个序列比对以达到最佳比较目的来进行。例如，为了最佳比对，可以在第一多肽序列和第二多肽序列中的一个或两个中引入间隙，并且为了比较目的可以忽略不相同的序列。在某些方面，为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应氨基酸位置处的氨基酸。

在一些实施例中，用于计算序列同一性百分比的序列比对的产生不限于完全由一级序列数据驱动的二元序列-序列比较。还应当理解，序列比对可以通过将序列数据与来自异质来源的数据，如结构数据(例如，晶体蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的定位)或系统发育数据整合来产生。整合异构数据以产生多序列比对的合适程序是T-Coffee，可在www.tcoffee.org上获得，并且可替代地例如可从欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute，EBI)，在网站ebi.ac.uk/Tools/psa上获得。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动策划。

可以从各种来源获得合适的软件程序，用于蛋白质序列和核苷酸序列两者的比对。一种用于确定序列同一性百分比的合适程序是bl2seq，其是可从美国政府的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其是生物信息学程序EMBOSS套件的一部分，并且也可从EBI获得。可以使用本领域已知的方法如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustalω)、MUSCLE等进行序列比对。与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可以各自具有其自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值取整为最接近的十分之一。例如，从80.11至80.14的值向下取整为80.1，而从80.15至80.19的值向上取整为80.2。还应注意，长度值将始终是整数。

在一些实施例中，“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此之间的相似性百分比的计算可以以与同一性百分比的计算相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑了本领域所理解的保守取代。应当理解，相似性百分比取决于所使用的比较尺度，例如是否比较氨基酸，例如根据其进化接近度、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性或其组合。

在一些实施例中，术语“连接的”可以指在C末端或N末端处的第一部分与第二部分的融合。在一些实施例中，术语“连接的”可以指将整个第一部分(或第二部分)插入第二部分(或分别为第一部分)中的任意两点，例如氨基酸。在一些方面，第一部分通过肽键或接头与第二部分连接。第一部分可以通过磷酸二酯键或接头与第二部分连接。接头可以是肽、多肽、核苷酸、核苷酸链或任何化学部分。

在一些实施例中，术语“可操作地连接”可以指在序列内功能连接的两个或更多个元件。在一些实施例中，两个元件可以在折叠的蛋白质中功能连接，其相对于线性序列不连续。在一些实施例中，遵循多顺反子序列的表达，两个元件可以功能连接。在一些实施例中，两个元件可以功能连接，因为一个元件可以直接或间接诱导或抑制另一个元件的表达或功能。

在一些实施例中，术语“非天然存在”可以指自然界中不存在的多肽或多核苷酸序列。在一些实施例中，非天然存在序列在自然界中不存在，因为所述序列相对于天然存在序列是改变的。在一些实施例中，非天然存在的序列在自然界中不存在，因为其是两个在自然界中没有一起出现的天然存在的序列(例如，嵌合多肽)的组合。在一些实施例中，非天然存在的多肽是嵌合多肽。在一些实施例中，多肽或多核苷酸不是天然存在的，因为序列含有在自然界中无法找到的部分(例如，片段)，即新序列。本文所描述的任何多核苷酸都可以作为非天然存在的序列提供，例如，具有相对于天然序列改变的序列，或者作为以自然界不存在的方式与其它多核苷酸连接的多核苷酸提供。本文所描述的任何多肽都可以作为非天然存在的序列提供，例如，具有相对于天然序列改变的序列，或者作为以自然界不存在的方式与其它多肽连接的多肽提供。

抗体和相关术语

在一些实施例中，术语“抗体”可以指各种抗体结构，包含但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要其表现出期望的抗原结合活性。

在一些实施例中，术语“抗体片段”可以指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的结合所述完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包含但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、如sdAb(VL或VH)等单结构域抗体、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。本公开的所关注的基因可以例如包含抗体片段。

在一些实施例中，术语“单链抗体”(scFv)可以指包含重(VH)链和轻(VL)链的可变区的抗体片段，其通过柔性肽接头连接。

在一些实施例中，术语“抗原结合分子”可以指与抗原决定簇特异性结合的分子。本公开的所关注的基因可以例如包含抗原结合分子。

在一些实施例中，术语“抗原”可以指引发免疫应答的分子。

在一些实施例中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”可以指包含抗原识别部分和细胞激活元件的融合蛋白。本公开的多核苷酸可以包含产生CAR的所关注的基因。

在一些实施例中，术语“CAR T细胞”或“CAR T淋巴细胞”可以指含有产生CAR多肽的能力的T细胞。例如，能够表达CAR的细胞是含有用于在细胞中表达CAR的核酸序列的T细胞。本公开的细胞可以是CAR T细胞。

在一些实施例中，术语“共刺激元件”或“共刺激信号传导结构域”或“共刺激多肽”可以指共刺激多肽的细胞内部分。在一些实施例中，与缺乏共刺激结构域的CAR相比，当在T细胞中表达时，包括共刺激结构域的CAR表现出增加或增强的T细胞扩增、功能、持久性和抗肿瘤活性。共刺激结构域可以通过结合来自一个或多个T细胞共刺激分子(如CD28或4-1BB)的细胞内信号传导结构域而在本公开的CAR中提供。

在一些实施例中，共刺激多肽可以包括从以下中的一种或多种中分离的或源自其的序列：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活自然杀伤细胞受体。在一些实施例中，共刺激多肽可以包括从以下中的一种或多种中分离的或源自其的序列：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3和MyD88。

治疗有效和相关技术

在一些实施例中，术语“治疗有效”可以指对受体提供有益效果，例如，对受试者的临床症状提供一些缓解、减轻或减少，或对受试者的临床状态提供改善。治疗效果不需要是完全的或治愈性的，只要能向受试者提供一些益处。

在一些实施例中，术语“治疗有效量”可以指足以赋予受体治疗有效益处的剂量。例如，本公开的融合蛋白、核酸、载体、细胞、组合物或药物组合物可以以治疗有效量施用。已经施用了本公开的融合蛋白、核酸、载体、细胞、组合物或药物组合物的受试者可以随后施用治疗有效量的本公开的小分子，以诱导或破坏本公开的融合蛋白的二聚体形成，以实现期望的细胞结果。

细胞术语

在一些实施例中，术语“干细胞”可以指未分化的或部分分化的细胞，所述细胞可以分化成各种类型的细胞并无限期增殖以产生更多相同的干细胞。

在一些实施例中，术语“多能干细胞”(PSC)可以指可以无限期地维持未分化状态并且可以分化为身体的大多数(如果不是全部细胞的话)细胞的细胞。

在一些实施例中，术语“诱导的多能干细胞”(iPS或iPSC)可以指可以直接从体细胞产生的多能干细胞。这包含但不限于来自成人的特化细胞，如皮肤或血细胞。

在一些实施例中，术语“多能细胞”可以指可以发育成多于一种细胞类型但比多能细胞更受限的细胞。例如，成人干细胞和脐血干细胞可以被认为是多能的。

在一些实施例中，术语“造血细胞”可以指起源于造血干细胞的细胞。这包含但不限于骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、血小板、单核细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和浆细胞。

在一些实施例中，术语“T淋巴细胞”或“T细胞”可以指在胸腺中正常发育的造血细胞。T淋巴细胞或T细胞包含但不限于自然杀伤T细胞、调控T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、γδT细胞和粘膜不变T细胞。

在一些实施例中，术语“间充质”可以指一种动物组织，其包含包埋在网状蛋白质和流体中的松散细胞，即细胞外基质。间充质直接产生身体的大部分结缔组织，包含骨骼、软骨、淋巴系统和循环系统。

在一些实施例中，术语“间充质细胞”可以指源自间充质组织的细胞。在一些情况下，本公开的细胞可以是间充质细胞。

在一些实施例中，术语“间充质基质细胞”(MSC)可以指从骨髓、脂肪和其它组织来源分离的纺锤形塑料-贴壁细胞，其在体外具有多能分化能力。例如，间充质基质细胞可以分化为成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(chondrocyte)(软骨细胞(cartilage cell))、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞(产生骨髓脂肪组织的脂肪细胞)。科学文献中建议用术语间充质基质细胞来代替术语“间充质干细胞”。在一些情况下，本公开的细胞可以是间充质基质细胞。

在本公开的一些实施例中，“自体细胞”是从可以作为疗法施用的同一个体获得的细胞(所述细胞是受试者的自体细胞)。本公开的自体细胞包含但不限于造血细胞和干细胞，如造血干细胞。

在本公开的一些实施例中，同种异体细胞是从不是作为疗法的细胞的预期的受体的个体获得的细胞(所述细胞与受试者是同种异体的)。关于本公开的方法的受试者，本公开的同种异体细胞可以选自免疫相容的供体。本公开的同种异体细胞可以被修饰以产生“通用”同种异体细胞，其适于施用于任何受试者而没有非预期的免疫原性。本公开的同种异体细胞包含但不限于造血细胞和干细胞，如造血干细胞。

在一些实施例中，术语“转染”或“转化”或“转导”可以指外源核酸转移或引入细胞或宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸或细胞的子代转染、转化或转导的细胞。

在一些实施例中，术语“细胞疗法”可以指出于治疗目的将一个细胞或多个细胞递送到受体体内。

小分子术语

在一些实施例中，术语“类似物”可以指本文所描述的化合物或一个类别的化合物的成员的化学修饰的形式，其维持所述化合物或类别的结合特性。例如，达诺瑞韦的类似物将包含化学修饰的形式的达诺瑞韦，其保留如本文所描述的与DNCR2和NS3a结合的能力。

在一些实施例中，术语“前药”可以包含任何共价结合的载体，当将此类前药施用于患者时，所述载体在体内释放本公开的小分子。本公开的前药可以通过修饰存在于化合物中的功能基团制备，其方式使得这些修饰在常规操控中或者在体内切割为亲本化合物。体内转化可以是例如一些代谢过程的结果，如羧酸酯、磷酸酯或硫酸酯的化学或酶促水解，或敏感官能团的还原或氧化。本公开范围内的前药包含其中羟基、氨基或巯基与任何基团结合的化合物，当本公开的前药施用于哺乳动物受试者时，其分别切割以形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。可以通过代谢切割在体内快速转化的官能团形成一类与本公开的化合物的羧基反应的基团。其包含但不限于此类基团，如烷酰基(如乙酰基、丙酰基、丁酰基等)、未经取代和经取代的芳酰基(如苯甲酰基和经取代的苯甲酰基)、烷氧基羰基(如乙氧基羰基)、三烷基甲硅烷基(如三甲基和三乙基甲硅烷基)、与二羧酸形成的单酯(如琥珀酰基)等。本公开的小分子可以作为前药施用。本公开的小分子可以作为前药向受试者施用。可以施用治疗有效量的本公开的此类前药。前药可以与本公开的多核苷酸、基因疗法载体或细胞的施用同时施用，或者在本公开的多核苷酸、基因疗法载体或细胞的施用之后施用。

调配物和相关技术

在一些实施例中，术语“药学上可接受的”可以指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。例如，本公开的小分子、多核苷酸、多肽、基因疗法载体或细胞可以作为组合物的一部分与其它药学上可接受的组分(包含药学上可接受的载体)一起施用。

在一些实施例中，术语“药学上可接受的盐”可以指本公开的小分子的衍生物，其中所述特定的化合物转化为其酸或碱盐。此类药学上可接受的盐包含但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐等。药学上可接受的盐包含例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规无毒盐包含那些衍生自如以下无机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由如以下有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨环、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸等。例如，本公开的小分子可以作为药学上可接受的盐提供。

在一些实施例中，术语“控释”可以指可以在延长的时间段内(即，在超过1小时的时间段内)释放一种或多种活性药剂的剂型的部分或全部。控释(CR)的特征也可以称为持续释放(SR)、延长释放(prolonged release，PR)或延长释放(extended release，ER)。当与本文所讨论的溶解曲线结合使用时，术语“控释”是指根据本公开的剂型的在大于1小时的时间段内递送活性剂的部分。例如，本公开的小分子可以在控释组合物中施用。

在一些实施例中，术语“速释”可以指在与胃液接触时基本上立即释放活性剂并且在约1小时内导致基本上完全溶解的剂型的一部分或全部。速释(IR)的特征也可以被称为即释(IR)。当与本文所讨论的溶解曲线结合使用时，术语“速释”是指根据本公开的剂型的在小于1小时的时间段内递送活性剂的部分。本公开的小分子可以在速释组合物中施用。

在一些实施例中，术语“赋形剂”可以指在体内没有活性的药理学惰性成分。参见例如Hancock,B.C.,Moss,G.P.以及amp；Goldfarb,D.J.(2020).《药物赋形剂手册(Handbook of pharmaceutical excipients)》.伦敦：药物出版公司(London:Pharmaceutical Press)，所述文献的全部公开内容通过引用并入本文。本公开的小分子可以与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂混合，如防腐剂、填充剂、聚合物、崩解剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、润滑剂、酸化剂和分配剂，这取决于施用方式和剂型的性质。此类成分，包含可以用于配制口服剂型的药学上可接受的载体和赋形剂。药学上可接受的载体包含水、乙醇、多元醇、植物油、脂肪、蜡聚合物，包含凝胶形成和非凝胶形成聚合物，以及其合适的混合物。赋形剂的实例包含淀粉、预胶化淀粉、Avicel、乳糖(lactose)、乳糖(milk sugar)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和胭脂红共混物。崩解剂的实例包含淀粉、藻酸和某些复杂的硅酸盐。润滑剂的实例包含硬脂酸镁、月桂烷基硫酸钠、滑石粉以及高分子量聚乙二醇。例如，本公开的小分子、多核苷酸、多肽、基因疗法载体或细胞可以在包含药学上可接受的赋形剂的组合物中提供和施用。

通用术语

如在整个公开中所使用的，术语“受试者”包含任何哺乳动物，包含但不限于人。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是新生儿、婴儿、学步的小孩、儿童、青少年、成人、老年人、百岁老人。在一些实施例中，受试者具有至少1条、2条或3条X染色体。在一些实施例中，受试者具有至少1条或2条Y染色体。在一些实施例中，受试者被诊断患有本公开的疾病或病症，或者以其它方式需要本公开的治疗。在一些实施例中，受试者有发展本公开的疾病或病症的风险，或者以其它方式需要预防本公开的疾病或病症。

在一些实施例中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，包含但不限于、家畜、马、狗、猫、猪、兔、豚鼠、啮齿动物、大鼠、沙鼠和小鼠。在一些实施例中，受试者是非灵长类哺乳动物，并且受试者被基因修饰。

除非上下文另外清楚地指明，否则“一个”、“一种”和“所述”包含其复数形式。

除非另有明确说明，否则“和”可以与“或”互换使用。

“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下明确公开了两个指定特征或组分中的每一个。因此，在如“A和/或B”等短语中使用的“和/或”包含“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在如“A、B和/或C”等短语中使用的“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一者：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

在一些实施例中，术语“约”意指大约、大致、左右或在其区中。当“约”与数值范围一起使用时，其可以通过将界限扩展到所阐述的数值的以上和以下来修饰该范围。

在一些实施例中，数字范围包含定义所述范围的数字。在规定了值的范围的情况下，还具体公开了所述范围的所述上限与下限之间的每个中间整数值以及其每个分数，以及这些值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可以独立地包含在所述范围内或排除在所述范围之外，并且包含任一限值、不包含两个限值或包含两个限值的每个范围也涵盖在本公开内。因此，范围应被理解为所述范围内的所有值的简写，包含所述的端点。例如，1到10的范围应被理解为包含来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组的任何数字、数字组合或子范围。

在明确详述值的情况下，应当理解，与所述数值大约相同的数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，所述组合的要素的每个子组合也被具体公开并且处于本公开的范围内。相反，在单独公开不同元素或元素组的情况下，也公开了其组合。在公开内容的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，也特此公开其中每个替代方案被单独排除或以与其它替代方案的任何组合形式被排除的所述公开的实例；公开内容的不止一个元素可以具有此类排除，并且具有此类排除的元素的所有组合特此被公开。

除非上下文另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语‘包含(include)’、‘包含(including)’等应在包容性意义，而不是排他性的或穷尽性的意义上解释；也就是说，以“包含但不限于”的意义解释。

单数或复数词语也分别包含复数和单数。因此，例如，在说明书描述了所关注的基因的情况下，本公开包含具有单个所关注的基因或多个所关注的基因的多核苷酸。

“上文”和“下文”以及类似意思的词语是指本申请的整体，而不是本申请的任何特定部分。

“集合”包含一个或多个元件或对象的集合。

单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。

本文包含标题以供参考并辅助定位各个部分。这些标题并不旨在限制与标题相关的概念的范围。这类概念在本说明书中可能具有适用性。

尽管为了清楚和理解的目的，通过说明和实例的方式对本公开进行了一些详细描述，但是对于本领域的技术人员来说，可以实践某些改变和修改是显而易见的。对“本公开”等的引用旨在指代本公开的各种实施例或方面中的任一个，并且不是将本公开限于单个实施例或方面。如贯穿本公开所使用的，术语“方面”和“实施例”是可互换的。在本公开的“某些”、“一些”或“其它”方面或实施例的上下文中讨论的特征可以在本公开任何实施例中找到，然而，在这些情况下，所述特征可以被认为是这些突出显示的实施例中的优选的特征。

描述和实例不应被解释为将本公开的范围限制于本文所描述的实施例和实例，而是应被解释为由涵盖落入本公开的真实范围和精神内的所有修改和替代。

小分子调控的细胞信号传导表达系统

本公开提供了一种用于控制受体介导的细胞激活和信号传导的小分子调节的细胞信号传导表达系统。所述系统通常包含多核苷酸集合，所述多核苷酸集合包含编码包含第一信号传导结构域和第一二聚化多肽的第一融合蛋白的第一多核苷酸和编码包含第二信号传导结构域和第二二聚化多肽的第二融合蛋白的第二多核苷酸，其中所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用由小分子的存在介导。

在一些实施例中，小分子介导第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的结合。

在一些实施例中，小分子破坏第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的结合。

在一些实施例中，第一小分子介导所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合，并且第二小分子破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合，其中所述第二小分子可以介导第三二聚化多肽与所述第一二聚化多肽的结合，并且所述第三二聚化多肽与第三信号传导结构域连接。

在一些实施例中，所述系统包含多核苷酸集合，其中与二聚化多肽连接的信号传导结构域是嵌合抗原受体(CAR)的一部分，并且其中小分子的施用调节T细胞信号传导功能。

在一些实施例中，所述系统包含编码包含与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的第一二聚化多肽的第一融合蛋白的多核苷酸集合，并且第二融合蛋白包含与CD3ζ结构域连接的第二二聚化多肽，并且其中小分子的施用介导CAR T细胞信号传导。

在一些实施例中，所述系统包含编码包含与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a的第一融合蛋白的多核苷酸集合，并且第二融合蛋白包含与CD3ζ结构域连接的ANR，并且其中小分子的施用下调CAR T细胞信号传导。

在一些实施例中，所述系统包含编码包含与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a的第一融合蛋白的多核苷酸集合，并且第二融合蛋白包含与CD3ζ结构域连接的DNCR2(或其设计的变体)或GNCR1(或其设计的变体)，并且其中小分子的施用激活CAR T细胞信号传导。

在一些实施例中，所述系统包含多核苷酸集合，其中第一信号传导结构域和第二信号传导结构域是杀伤结构域，并且其中施用小分子诱导细胞死亡。

本公开的小分子调节的细胞信号传导系统可用于在各种合成生物学应用(如治疗应用)中调节一系列靶分子(例如，信号传导蛋白)的活性。

在一个实施例中，本公开的小分子调节的细胞信号传导系统可以用于细胞疗法应用中，以编程细胞群体以执行和/或调节治疗功能。

一方面，本公开的小分子调节的细胞信号传导系统可以用于调节癌症疗法中使用的T细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)细胞。更具体地，本公开的小分子调节的细胞信号传导系统可以用于下调CAR和/或TCR，并且抑制过量的CAR/TCR信号传导，这可能导致在许多现有T细胞疗法中观察到的不期望的耗竭表型。

在一个实施例中，本公开的小分子调节的细胞信号传导系统可以用于基因疗法应用。

小分子调节的二聚体

本公开利用小分子调节的多肽二聚体来共定位信号传导结构域，并且由此调节信号传导功能。例如，二聚体可以共定位细胞外信号传导结构域和细胞质(细胞内)信号传导结构域，并且由此调节所关注的信号传导分子的活性。二聚化多肽形成二聚化复合物的相互作用可以通过小分子的存在来调节。

二聚体可以用于共定位跨膜受体的信号传导结构域。例如，二聚体可以用于共定位包含以下的跨膜CAR的信号传导结构域：

(i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含与缺乏细胞质信号传导结构域的细胞外信号传导结构域连接的第一二聚化多肽；以及

(ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含与对应的细胞质信号传导结构域连接的第二二聚化多肽，其中所述第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的相互作用由小分子的存在介导。

可以选择第一二聚化多肽和第二二聚化多肽，使得第一二聚化多肽和第二二聚多肽的相互作用由小分子的存在介导。在一些情况下，小分子可以介导二聚体的组装。在其它情况下，小分子可以介导二聚体的分解。在又其它情况下，第一小分子可以介导二聚体的组装，而第二小分子可以取代第一小分子，并且由此介导二聚体的分解。在仍其它情况下，第一小分子可以介导二聚体的组装，而第二小分子可以竞争胜过第一小分子并募集第三二聚化多肽进行二聚化。

小分子调节的多肽二聚体可以包含丙型肝炎病毒蛋白酶NS3a/4a蛋白(以下称为NS3a)或其修饰作为第一二聚化多肽，并且“阅读子”蛋白作为第二二聚化多肽。例如，可以选择阅读子蛋白以识别NS3a蛋白的特定药物结合状态。NS3a蛋白和NS3a阅读子蛋白已在于2020年6月11日公布的Baker等人,标题为“用于控制蛋白质功能和相互作用的试剂和方法(Reagents and Methods for Controlling Protein Function and Interaction)”的国际专利公开WO2020117778中进行了描述，所述国际专利公开通过全文通过引用的方式并入本文。

NS3a可以整合多种药物输入并使用不同的工程化阅读子蛋白作为二聚化配偶体将药物输入翻译为不同的输出。来自达诺瑞韦/NS3a复合物阅读子、格佐匹韦/NS3a复合物阅读子和ANR/NS3a复合物阅读子的NS3a蛋白和多效性应答输出已在以下中进行了描述：Foight,G.W.等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology》(2019)37:1209–1216；Cunningham-Bryant,D.等人,《美国化学学会杂志(Journal of the American ChemicalSociety)》(2019)141:3352–3355；以及Kügler,J.等人,《生物化学杂志(Journal ofBiological Chemistry)》(2012)287:39224–39232，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

在一个实例中，二聚体可以用于共定位包含以下的跨膜CAR的信号传导结构域：

(i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含NS3a多肽和缺乏细胞质信号传导结构域的细胞外信号传导结构域；以及

(ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含阅读子多肽和对应的细胞质信号传导结构域，其中NS3a与阅读子结合配偶体之间的相互作用可以通过小分子药物的存在来控制。

在一些实施例中，为二聚体选择的阅读子是达诺瑞韦/NS3复合物阅读子(DNCR)多肽(或其最小化的/修饰的变体)，其被设计为在小分子药物达诺瑞韦的存在下识别NS3a并与其结合，由此提供药物诱导型(“开启开关”)系统。在一个实例中，DNCR多肽是DNCR2。参见Foight,G.W.等人,《自然生物技术》(2019)37:1209–1216。

在一些实施例中，为二聚体选择的阅读子是格佐匹韦/NS3复合物阅读子(GNCR)多肽(或其最小化的/修饰的变体)，其被设计为在小分子药物格佐匹韦的存在下识别NS3a并与其结合，由此提供药物诱导型(“开启开关”)系统。在一个实例中，GNCR蛋白是GNCR1。参见Foight,G.W.等人,《自然生物技术》(2019)37:1209–1216。

在一些实施例中，为二聚体选择的阅读子是apoNS3a复合物阅读子(ANR)肽(或其最小化的/修饰的变体)。ANR与NS3a形成基础复合物，NS3a靶向药物会破坏所述基础复合物，由此提供药物可破坏系统。参见Cunningham-Bryant,D.等人,《美国化学学会杂志》(2019)141:3352-3355、Kügler,J.等人,《生物化学杂志》(2012)287:39224–39232以及Foight,G.W.等人,《自然生物技术》(2019)37:1209–1216。

嵌合抗原受体

所关注的信号传导分子可以包含嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以是融合蛋白，其包含作为抗原结合元件的细胞外元件、将受体锚定到细胞膜的跨膜元件和至少一种细胞内元件。这些CAR元件在本领域中是已知的，例如，如在于2014年8月28日公布的题为“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptors)”的专利申请US20140242701中所描述的，所述专利申请通过全文引用的方式并入。CAR可以是由多核苷酸表达的重组多肽，所述多核苷酸至少包含细胞外抗原结合元件、跨膜元件和包含源自刺激分子的功能信号传导元件的细胞内(细胞质)信号传导元件。

刺激分子可以例如是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。

细胞质信号传导元件可以例如包含源自至少一种共刺激分子的一种或多种功能信号传导元件。

共刺激分子可以例如选自4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。

CAR可以是嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合元件、跨膜元件和细胞内信号传导元件，所述细胞内信号传导元件包含源自刺激分子的功能信号传导元件。

CAR可以包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合元件、跨膜元件和细胞内信号传导元件，所述细胞内信号传导元件包含源自共刺激分子的功能信号传导元件和源自刺激分子的功能信号传导元件。

CAR可以是嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合元件、跨膜元件和细胞内信号传导元件，所述细胞内信号转导元件包含源自一个或多个共刺激分子的两个功能信号传导元件和源自刺激分子的功能信号传导元件。

CAR可以包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合元件、跨膜元件和细胞内信号传导元件，所述细胞内信号传导元件包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能信号传导元件和源自刺激分子的功能信号传导元件。

CAR可以在CAR融合蛋白的氨基末端(N末端)处包含任选的前导序列。CAR可以进一步包含在细胞外抗原结合元件的N末端处的前导序列，其中在细胞加工和CAR定位到细胞膜期间，前导序列任选地从抗原识别元件(例如，scFv)上切割。

图1A是可由小分子药物调节以破坏或诱导细胞信号传导活性的分裂嵌合抗原受体(CAR)的通用架构的示意图。所述附图展示了系统的表达的组分110，其中第一融合蛋白包含细胞外元件，所述细胞外元件是与第一二聚化多肽(“二聚体半体1”)融合的抗原结合或“抗原感测”结构域，并且第二融合蛋白包含与第二二聚化多肽(“二聚体半体2”)融合的细胞质信号传导结构域。第一二聚化多肽和第二二聚化多肽的相互作用可以通过破坏(即关闭)或诱导(即打开)信号传导活性的小分子药物来调节。

在一些实施例中，小分子调节的CAR表达系统可以是“关闭开关”CAR。已经描述了由肽apo-NS3a阅读子(ANR)和NS3a形成的化学可破坏二聚体。参见Cunningham-Bryant,D.等人,《美国化学学会杂志》(2019)141:3352–3355，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，小分子调节的CAR表达系统可以是“开启开关”CAR。已经描述了使用设计的化学诱导的二聚体达诺瑞韦-NS3a复合物阅读子(DNCR)/达诺瑞韦/NS3a和格佐匹韦-NS3a复合物阅读子GNCR1/格佐匹韦/NS3a的两种“开启开关”CAR。参见Foight,G.W.等人,《自然生物技术》(2019)37:1209–1212，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

图1B是关闭开关ANR-CAR、开启开关DNCR CAR和开启开关GNCR CAR的示意图120。所述附图展示了ANR CAR 125、DNCR CAR 130和GNCR CAR 135的表达的组分。ANR CAR 125默认为开启，并且可以通过任何NS3a抑制剂关闭，包含达诺瑞韦或格佐匹韦。DNCR CAR 130和GNCR CAR 135默认为关闭，并且可以分别通过添加达诺瑞韦或格佐匹韦来开启。

杀伤结构域

所关注的信号传导分子可以包含死亡或杀伤结构域，其可以启动导致细胞死亡的信号传导级联。细胞和基因疗法的效用可以通过安全机制来增强，所述安全机制能够在患者发生不良反应时特异性诱导治疗细胞中的细胞死亡。使用细胞死亡作为安全机制的概念先前已经通过用融合到小分子诱导型同二聚体FKBP-F36V(iCasp9)的胱天蛋白酶-9诱导细胞凋亡来证明，所述同二聚体被AP1903(利米多赛(rimiducid))二聚化(di Stais等人,《新英格兰医学杂志(New England Journal of Medicine)》(2011)365:1673-1683，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。化学诱导型异源二聚体也可以用于启动胱天蛋白酶-9的寡聚化，如FKBP/雷帕霉素(rapamycin)/FRB二聚体(rapaCasp9)所证明的(Stavrou,M.等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》(2018)26:1266-1276，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。

本公开利用小分子调节的二聚体系统DNCR/达诺瑞韦/NS3a和GNCR/格佐匹韦/NS3a通过杀伤结构域的药物诱导的同源寡聚化来激活细胞死亡。小分子调节的二聚体系统DNCR/达诺瑞韦/NS3a和GNCR/格佐匹韦/NS3a系统可以用于调节通过同源寡聚化激活的任何杀伤结构域(例如，胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-4、RIPK1、RIPK3)。

图2是诱导杀伤结构域(例如，胱天蛋白酶-9)响应于小分子药物的同源寡聚化的设计的示意图200。所述附图展示了双链异源二聚体安全开关210、单链异源二聚体安全开关215和同源寡聚体NS3a支架安全开关220a和220b的表达的组分。双链异源二聚体安全开关210包含与杀伤结构域融合的小分子诱导的二聚体NS3a和DNCR或GNCR的每个半体。在一个实例中，NS3a杀伤结构域仅在小分子药物达诺瑞韦的存在下与DNCR杀伤结构域结合。单链异源二聚体安全开关215包含小分子诱导的二聚体的两个半体，所述小分子诱导的二聚体连接在具有杀伤结构域的单个构建体中，使得小分子药物的添加诱导多聚化，即模板化的同源寡聚化。同源寡聚体NS3a支架安全开关220a和220b包含与同源二聚体受体(如CAR(安全开关220b))或同源寡聚体螺旋束(安全开关220)连接的NS3a二聚化多肽，并且其它二聚化多肽融合杀伤结构域，使得小分子药物的添加介导杀伤结构域的寡聚化。蛋白质同源寡聚体螺旋束的设计已在Boyken,D.E等人,《科学(Science)》(2016)352:680–687中进行了描述，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

1.1.1.多核苷酸

本公开的系统通常包含多核苷酸集合，所述多核苷酸集合包含编码第一融合蛋白的第一多核苷酸和编码第二融合蛋白的第二多核苷酸。

在一些实施例中，多核苷酸集合包含可以包含以下的多核苷酸组分：

(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码包含第一信号传导结构域和第一二聚化多肽的第一融合蛋白，

(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含第二信号传导结构域和第二二聚化多肽的第二融合蛋白，

(iii)与第一多核苷酸和/或第二多核苷酸可操作地连接的一个或多个启动子序列，

(iv)任选的分离元件，所述分离元件包含阻止所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白融合的多核苷酸序列，以及

(v)一个或多个任选的调控序列，

其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸、启动子序列以及任选的分离元件和调控元件被配置成表达和调节控制所关注的信号传导功能。

编码第一融合蛋白和第二融合蛋白、启动子序列以及任选的分离元件和调控序列的多核苷酸可以被配置在载体主链中，用于表达和调节控制所关注的信号传导功能。

在各种实施例中，编码融合蛋白的多核苷酸组分可以包含编码分离融合蛋白的分离元件的多核苷酸序列。

在一些实施例中，分离元件可以包含选自由P2a和T2a组成的组的核糖体跳跃序列。

在一些实施例中，分离元件可以包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含选自由以下组成的组的至少两个核糖体跳跃序列：T2a-RFP-P2a、P2a-T2a和T2a-P2a。

在一些实施例中，分离元件可以包含内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实施例中，分离元件可以包含组成型启动子序列。

在一些实施例中，包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的多核苷酸组分编码一个或多个与第一多核苷酸和/或第二多核苷酸可操作地连接的组成型启动子序列。

在各种实施例中，组成型启动子序列可以包含选自由以下组成的组的组成型启动子序列：MND、hPGK、CMV、CAG、SFFV、EF1α、UBC和CD43。

在一些实施例中，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸可以编码选自由polyA组成的组的一个或多个任选的调控序列。

在一些实施例中，编码第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的多核苷酸进一步包含分离信号传导结构域和二聚化多肽的柔性接头序列。

在一些实施例中，第一多核苷酸或第二多核苷酸编码NS3a二聚化多肽(或其设计的变体)，并且第一多核苷酸或第二多核苷酸中的另一个编码对应的阅读子二聚化多肽，所述阅读子二聚化多肽选自由DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其设计的变体，包含但不限于GNCR1-3rep、G33和G38)组成的组。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码包含与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a二聚化多肽的第一融合蛋白以及包含与CD3ζ结构域连接的ANR二聚化多肽的第二融合蛋白，其中小分子下调CAR T细胞信号传导。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码包含与缺乏CD3ζ结构域的跨膜CAR的细胞质端连接的NS3a二聚化多肽的第一融合蛋白以及包含与CD3ζ结构域连接的DNCR2(或其设计的变体)或GNCR1(或其设计的变体)的第二融合蛋白，其中小分子激活CAR T细胞信号传导。

在一些实施例中，编码第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的多核苷酸进一步编码跨膜结构域和/或共刺激结构域。

在一些实施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸编码包含杀伤结构域的信号传导结构域，其中小分子的施用诱导细胞死亡。

在一些实施例中，编码第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的多核苷酸包含选自由以下组成的组的杀伤结构域：胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-4、RIPK1或RIPK3或其变体。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码包含胱天蛋白酶-9(或其变体)的催化结构域的第一信号传导结构域和包含胱天蛋白酶-9(或其变体)的催化结构域的第二信号传导结构域。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码与信号传导结构域连接的第一二聚化多肽，所述信号传导结构域包含胱天蛋白酶-9(或其变体)的催化结构域，并且第二二聚化多肽与同源寡聚化结构域连接。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码选自由与杀伤结构域连接的DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其变体，包含但不限于GNCR1-3rep、G33和G38)组成的组的第一二聚化多肽，并且第二二聚化多肽是NS3a并且与选自由以下组成的组的同源寡聚化结构域连接：二聚体-NS3aH1(SEQ ID NO:42)、三聚体-NS3aH1(SEQ ID NO:45)、五聚体-NS3aH1(SEQ ID NO:44)、六聚体-NS3a(SEQ ID NO:43)或其变体。

在一些实施例中，多核苷酸集合编码选自由与杀伤结构域连接的DNCR2(或其设计的变体，包含但不限于DNCR2_1至DNCR2_34和DNCR2-3rep)或GNCR1(或其变体，包含但不限于GNCR1-3rep、G33和G38)组成的组的第一二聚化多肽，并且第二二聚化多肽是NS3a并且与CAR或其它同源寡聚化受体连接。

载体和载体构型

本公开的多核苷酸可以作为载体的一部分提供。合适的载体的实例包含表达载体、病毒载体和质粒载体。表达载体可以包含质粒、噬菌粒、病毒以及其衍生物。

在一些方面，病毒载体可以包含编码基因编辑多肽的多核苷酸，如可用于实施基因编辑技术的多肽。此类基因编辑技术的实例包含RNA/DNA引导的核酸内切酶(例如，CRISPR(聚类的规则间隔的短回文重复序列))、TALEN(转录激活子样效应子核酸酶)、ZFN(锌指核酸酶)、重组酶、大范围核酸酶或病毒整合。

在一些方面，本公开的多核苷酸可以作为同源性定向修复(HDR)载体的一部分提供。同源性定向修复机制可以用于将多核苷酸集合整合到染色体中。可以用于将多核苷酸集合整合到染色体中的机制的实例包含序列特异性核酸酶，如转座酶、CRISPR/Cas9、ZF核酸酶、TALE核酸酶、重组酶和本领域已知的其它同源重组靶向载体。

载体组分通常包含但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。用于真核宿主细胞中的载体还可以编码信号序列或其它在所关注的成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的多肽。所选择的信号序列优选地是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列。在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔地3'非翻译区获得。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。

表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为可选标志物。典型选择基因编码满足以下条件的蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如，安比西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)在相关情况下，补体营养缺陷，或(c)提供不可从复合培养基获得的重要营养物。

本公开的多核苷酸在一些情况下可以作为单个载体的一部分提供。本公开的多核苷酸可以作为一组至少两个载体的一部分提供；包含第一多核苷酸的第一载体和包含第二多核苷酸的第二载体。在一些情况下，本公开的多核苷酸可以作为一组三个载体提供：包含第一多核苷酸的第一载体、包含第二多核苷酸的第二载体和包含第三多核苷酸的第三载体。

适于与本公开的多核苷酸一起使用的载体的实例包含腺病毒载体、逆转录病毒载体，如慢病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦·巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和转座子载体。本公开的多核苷酸可以作为同源性定向修复载体的一部分提供。

某些病毒载体基于非细胞病变真核病毒，其中非必需基因已被所关注的基因置换。非细胞病变病毒包含逆转录病毒，其生命周期涉及基因组病毒RNA逆转录到DNA中，随后前病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人基因疗法试验。最有用的是那些复制缺陷型逆转录病毒(即，能够引导期望的蛋白质的合成，但不能制造感染性颗粒)。此类基因改变的逆转录病毒表达载体对于体内基因的高效转导具有普遍的实用性。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包含将外源遗传物质掺入质粒、用质粒转染包装细胞系、用包装细胞系产生重组逆转录病毒、从组织培养基中收集病毒颗粒以及用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)在Kriegler,M.,《基因转移与表达，实验室手册(Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual)》,纽约的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman Co.,NewYork)(1990)和Murry,E.I,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第7卷,新泽西州克利夫顿的胡马纳出版公司(Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.)(1991)中提供。

在一些方面，所述病毒是腺相关病毒，是双链DNA病毒。腺相关病毒可以被工程化为复制缺陷型病毒，并且能够感染多种细胞类型和物种。其进一步具有如热稳定性和脂质溶剂稳定性等优点；在包含造血细胞在内的不同谱系的细胞中具有高转导频率；以及缺乏重复感染抑制，从而允许多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性方式整合到人细胞DNA中，由此最小化插入突变的可能性和逆转录病毒感染的插入的基因表达特征的变化性。另外，在没有选择性压力的情况下，野生型腺相关病毒感染已在组织培养中进行了超过100次传代，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以以染色体外的方式发挥作用。

其它载体包含质粒载体。质粒载体在本领域中已经被广泛描述，并且对于本领域技术人员来说是众所周知的。参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),1989。在过去的几年里，已经发现质粒载体对于在体内将基因递送到细胞特别有利，因为其不能在宿主基因组内复制并整合到宿主基因组中。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以表达来自质粒内可操作地编码的基因的肽。可从商业供应商获得的一些常用质粒包含pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特异性质粒的另外的实例包含pcDNA3.1，目录号V79020；pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc-His，目录号V86320；以及pBudCE4.1，目录号V53220，全部来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)。一些常用的转座子系统包含piggyBAC^TM、Tol2和Sleeping Beauty^TM(参见例如，Balasubramanian等人,用于产生高产重组CHO细胞池和细胞系的三种转座子的比较(Comparison of three transposons for the generation of highly productiverecombinant CHO cell pools and cell lines).《生物技术与生物工程(Biotechnologyand Bioengineering)》(2015)113,第1234-1243页)。其它质粒对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的。另外，质粒可以使用标准分子生物学技术进行定制设计，以去除和/或添加DNA的特定片段。

本公开提供了一种多核苷酸集合，所述多核苷酸集合包含以下作为一种或多种载体的一部分：

(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码包含第一二聚化多肽的第一融合蛋白，以及

(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含第二对应的二聚化多肽的第二融合蛋白，其中：

(iii)所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白进一步包含第一信号传导结构域；并且

(iv)所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白中的另一个进一步包含第二信号传导结构域；并且

(v)所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽响应于小分子调控因子的相互作用有效地调节信号传导功能。

在一些实施例中，本公开提供了一种多核苷酸集合，所述多核苷酸集合包含以下作为一种或多种载体的一部分：

(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含对应的第二二聚化多肽的第二融合蛋白，其中：

(iii)所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白进一步包含细胞外信号传导结构域；并且

(iv)所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白中的另一个进一步包含细胞质信号传导结构域；并且

(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码包含NS3a二聚化多肽和第一信号传导结构域的第一融合蛋白；以及

(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含阅读子二聚化多肽和第二信号传导结构域的第二融合蛋白，其中所述NS3a和阅读子二聚化多肽响应于小分子调控因子的相互作用有效地调节信号传导功能。

(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码包含第一二聚化多肽和第一信号传导结构域的第一融合蛋白；以及

(ii)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码包含第二二聚化多肽的第二融合蛋白，其中所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用由第一小分子调控因子介导；以及

(iii)第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码包含第三二聚化结构域和第三信号传导结构域的第三融合蛋白，其中第二小分子调控因子破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合并介导所述第三二聚化多肽与所述第一二聚化多肽结合，由此有效地调节第二信号传导功能。

包含载体的组合物

本公开的多核苷酸集合可以作为载体的一部分提供。在一些实施例中，多核苷酸集合的第一多核苷酸组分和第二多核苷酸组分可以作为单个载体的一部分提供。

本公开提供了一种包含单个载体的组合物，所述单个载体包含：

(i)编码第一二聚化多肽的第一多核苷酸组分，以及

(ii)编码第二二聚化多肽的第二多核苷酸组分，

其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码第一信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的另一个进一步编码第二信号传导结构域，并且所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用调节信号传导功能。

在一些实施例中，本公开提供了一种包含单个载体的组合物，所述单个载体包含：

(i)编码第一二聚化多肽的第一多核苷酸组分，以及

(ii)编码第二二聚化多肽的第二多核苷酸组分，

其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码细胞外信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的另一个进一步编码细胞质(细胞内)信号传导结构域，并且所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用调节信号传导功能。

在一些方面，所述组合物可以用于治疗需要疗法的受试者。本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)单个载体，所述单个载体包含编码第一二聚化结构域的第一多核苷酸组分和编码第二二聚化结构域的第二多核苷酸组分，其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码第一信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中另一个进一步编码第二信号传导结构域，以及

(ii)药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)单个载体，所述单个载体包含编码第一二聚化结构域的第一多核苷酸组分和编码第二二聚化结构域的第二多核苷酸组分，其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码细胞外信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中另一个进一步编码细胞质信号传导结构域，以及

(ii)药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

在一些实施例中，多核苷酸集合的第一多核苷酸组分和第二多核苷酸组分可以作为一组至少两个载体的一部分提供，其中例如第一载体包含第一多核苷酸组分，并且第二载体包含第二多核苷酸组分。

本公开提供了一种组合物，所述组合物包含：

(i)第一载体，所述第一载体包含编码第一二聚化多肽的第一多核苷酸组分，以及

(ii)第二载体，所述第二载体包含编码第二二聚化多肽的第二多核苷酸组分，

(ii)第二载体，所述第二载体包含编码第二二聚化多肽的第二多核苷酸组分，其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码第一信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中另一个进一步编码第二信号传导结构域，以及

(iii)药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

(i)第一载体，所述第一载体包含编码第一二聚化结构域的第一多核苷酸组分，以及

(ii)第二载体，所述第二载体包含编码第二二聚化结构域的第二多核苷酸组分，其中所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中的任一个进一步编码细胞外信号传导结构域，并且所述第一多核苷酸组分或所述第二多核苷酸组分中另一个进一步编码细胞质信号传导结构域，以及

(iii)药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

在一些方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含：

(i)第一载体，所述第一载体编码包含第一二聚化多肽和第一信号传导结构域的第一融合蛋白；以及

(ii)第二载体，所述第二载体编码包含第二二聚化多肽的第二融合蛋白，其中所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用由第一小分子调控因子介导；以及

(iii)第三载体，所述第三载体编码包含第三二聚化结构域和第三信号传导结构域的第三融合蛋白，其中第二小分子调控因子破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合并介导所述第三二聚化多肽与所述第一二聚化多肽结合。

(iii)第三载体，所述第三载体编码包含第三二聚化结构域和第三信号传导结构域的第三融合蛋白，其中第二小分子调控因子破坏所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的结合并介导所述第三二聚化多肽与所述第一二聚化多肽结合，以及

(iv)药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

宿主细胞

表达系统可以用于细胞中，例如包括本文所公开的核酸或本文所公开的表达系统的体外、体内或离体细胞。

在一些方面，所述细胞包括原核细胞。在一些方面，所述细胞包括酵母细胞。在一些方面，所述细胞包括哺乳动物细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞包括HEK293T、Jurkat、Jeko1、CHO、Cos、HeLa、HKB11或BHK细胞。

在一些方面，所述细胞(例如，体外、体内或离体细胞或任何宿主细胞)是人细胞。在一些方面，所述细胞存在于患者体内或源自患者。在一些方面，患者源性细胞是肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调控T细胞、效应子T细胞、CD4+效应子T细胞，CD8+效应子T电池、记忆T细胞、自身反应性T细胞、衰竭T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、先天淋巴样细胞(ILC)、心脏细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)和/或造血干细胞(HSC)。在一些方面，所述细胞包括免疫细胞。在一些方面，所述细胞包括T细胞。在一些方面，所述细胞包括调控T细胞。在一些方面，所述细胞包括自然杀伤T细胞。在一些方面，所述细胞包括NK细胞。在一些方面，所述细胞包括效应子T细胞，例如CD4+效应子T细胞和/或CD8+效应子T细胞。

在一些方面，所述人细胞源自同种异体供体。在一些方面，所述同种异体细胞是肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调控T细胞、效应子T细胞、CD4+效应子T细胞，CD8+效应子T电池、记忆T细胞、自身反应性T细胞、衰竭T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心脏细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)和/或造血干细胞(HSC)。

在一些方面，所述人细胞源自自体供体。在一些方面，所述自体细胞是肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调控T细胞、效应子T细胞、CD4+效应子T细胞，CD8+效应子T电池、记忆T细胞、自身反应性T细胞、衰竭T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心脏细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)和/或造血干细胞(HSC)。

在一些方面，细胞被工程化以包括编码本文所描述的多核苷酸的一种或多种核酸或表达本文所描述的多肽。在一些方面，本公开提供了包括本文所公开的核酸或本文所公开的表达载体的宿主细胞。在一些方面，核酸或表达载体被整合到宿主细胞染色体中。在一些方面，核酸或表达载体是附加型的。

包含宿主细胞的组合物

本公开的多核苷酸集合可以在宿主细胞中提供。细胞可以被瞬时或稳定地工程化以掺入本公开的多核苷酸集合。本公开提供了一种包括多核苷酸集合的细胞，所述多核苷酸集合包含编码包含与第一二聚化多肽连接的第一信号传导结构域的第一融合蛋白的第一多核苷酸，以及编码包含与第二二聚化多肽连接的第二信号传导结构域的第二融合蛋白的第二多核苷酸，其中所述第一二聚化多肽和所述第二二聚化多肽的相互作用控制信号传导功能。

本公开提供了一种组合物，所述组合物包括经修饰以表达多核苷酸集合的细胞。在一些方面，所述细胞组合物可以用于产生所关注的多肽产物。表达的多肽可以从无细胞提取物中回收或从培养基中回收。

在一些方面，所述组合物可以用于治疗需要疗法的受试者。本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)已被修饰以表达多核苷酸集合的细胞，以及(ii)药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。

所述细胞可以包含表达提供治疗益处的所关注的基因的本公开的多核苷酸。所关注的基因的表达可以赋予细胞攻击肿瘤细胞的能力。所关注的基因可以是嵌合抗原受体(CAR)，例如靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体。所关注的基因可以表达与铰链连接的单链抗体片段，铰链与跨膜区连接。跨膜区可以与细胞内信号传导结构域连接。跨膜区可以与共刺激结构域连接。

组合物的细胞可以例如是T细胞。组合物的细胞可以例如是CAR-T细胞。

在一些实施例中，本公开提供了一种细胞组合物，所述细胞组合物包括用于减少、改善或抑制免疫细胞群体(例如，表达CAR的免疫细胞)中的耗竭和/或功能障碍的手段。在一些方面，所述手段包括将CAR表达为多核苷酸集合中的所关注的基因。

制备小分子的方法

本公开的小分子可以使用已知技术合成。达诺瑞韦(4-氟-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-甲酸(2R,6S,12Z,13aS,14aR,16aS)-14a-[(环丙基磺酰基)氨基甲酰基]-6-({[(2-甲基-2-丙酰基)氧基]羰基}氨基)-5,16-二氧代-1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,13a,14,14a,15,16,16a-六氢环丙基[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂环十五烷-2-基酯)可以使用已知技术合成。参见例如，Carreira,Erick Moran,Hisashi Yamamoto和N.K.Yee.“不对称合成的工业应用(Industrial Applications of Asymmetric Synthesis).”《综合手性(Comprehensive Chirality)》9,阿姆斯特丹(Amsterdam):爱思唯尔出版社(Elsevier),2012.第9.19.6节,达诺瑞韦，所述文献的公开内容通过引用并入本文。

制备多核苷酸

本公开提供了产生本公开的多核苷酸的方法，如本公开的DNA载体以及其子组分，以及本公开的包装载体和质粒。标准分子生物学技术可以用于组装本公开的多核苷酸。多核苷酸可以化学合成。

制备包装的病毒衣壳

本公开包含制备含有本公开的多核苷酸的病毒衣壳的方法。通常，本公开的病毒衣壳可以通过向细胞供应本公开的包装多核苷酸来产生。包装多核苷酸可以作为质粒供应给包装细胞。可以培养包装细胞以产生含有本公开的多核苷酸的病毒衣壳。优选地，包装的病毒衣壳是不能复制的。

多种可商购获得的试剂盒适于产生本公开的包装的病毒衣壳。实例包含：慢病毒包装混合物(可从密理博西格玛公司(Millipore Sigma)获得)；LV-Max慢病毒包装混合物(可从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)获得)。

通过包装细胞产生的病毒衣壳可以被纯化以用于下游方法，如递送到细胞以用于产生多肽，递送到细胞以用于基于细胞的疗法，或递送到受试者以用于基因疗法方法。纯化可以包含用于从宿主细胞或培养基中消除污染物的处理。纯化步骤可以包含基于质粒的物理和/或化学特征的步骤。化学特性可以包含例如，亲水性-疏水性。物理特性可以包含例如，大小。基于粒度的纯化策略的实例包含密度梯度超速离心、超滤、沉淀、两相萃取系统和尺寸排阻色谱法。在一些情况下，沉淀可以与离心一起使用，例如使用聚乙二醇、硫酸铵或磷酸钙。在一些情况下，可以使用具有PEG、葡聚糖或聚乙烯醇的水性两相分离系统。在一些情况下，使用基于膜的切向流过滤技术；实例包含超滤、渗滤和微滤。在其它实施例中，色谱手段可以用于纯化病毒衣壳。在仍其它实施例中，免疫亲和性方法可以用于使用对相关衣壳具有特异性的单克隆抗体捕获衣壳。参见Morenweiser,R.,“病毒载体和疫苗的下游加工(Downstream processing of viral vectors and vaccines)”,《基因疗法(GeneTherapy)》(2005)12,S103–S110(2005)，所述文献全部公开内容通过引用并入本文。

合适的病毒衣壳的实例包含但不限于腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒(Sendai virus)载体、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)。

1.1.2.制备细胞

本公开提供了制备经修饰的细胞以表达所关注的多肽产物的方法。

在某些实施例中，本公开提供了制备治疗细胞的方法，所述治疗细胞表达用于治疗需要细胞疗法的受试者的多核苷酸集合。一方面，本公开提供了一种从整合到单个载体中的多核苷酸集合产生或制备表达所关注的多肽产物的治疗细胞的方法。一方面，本公开提供了一种从整合到两个(或更多个)载体中的多核苷酸集合产生或制备表达所关注的多肽产物的治疗细胞的方法。

在某些实施例中，本公开的多核苷酸在宿主细胞中维持为染色体外多核苷酸。在某些实施例中，本公开的多核苷酸存在于宿主细胞中的载体(例如，表达载体)中。在某些实施例中，本公开的多核苷酸或其子集或子组分整合到宿主细胞的染色体中。

可以使用各种方法将编码本公开的多核苷酸的表达载体引入细胞中以产生本公开的细胞。参见例如，Green等人,《分子克隆：实验室手册》.纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,NY):冷泉港实验室出版社(2014)。

将核酸改变引入所关注的基因的方法在本领域中是众所周知的。实例包含靶向的同源重组(例如“击跑配合”、“双重置换”)、位点特异性重组酶(例如Cre重组酶和Flp重组酶)、PB转座酶(例如Sleeping Beauty、piggyBac、To12或Frog Prince)、通过工程化的核酸酶(例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录-激活子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统)的基因组编辑和使用重组腺相关病毒(rAAV)平台的基因组编辑。用于将核酸改变引入所关注的基因的试剂可以使用公开可获得的来源来设计，或者从全斯博萨根公司(Transposagen)、Addgene公司(Addgene)和加莫生物科技公司(Sangamo Biosciences)商购获得。本公开的载体可以利用这些方法将本公开的多核苷酸整合到宿主基因组中。本公开的多核苷酸和载体可以包含编码实施用于将本公开的多核苷酸整合到宿主基因组中的这些方法所需的多肽的多核苷酸。

适于将多核苷酸整合到宿主细胞基因组中的各种方法是本领域已知的，包含随机整合或位点特异性整合(例如，“着陆垫”方法)；参见例如，Zhao,M.等人,(2018)《应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)》102:6105-6117；Lee,J.S.等人,(2015)《科学报告(Sci.Rep.)》5:8572；以及Gaidukov,L等人,(2018)《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》46:4072-4086。本公开的载体可以利用这些方法将本公开的多核苷酸整合到宿主基因组中。本公开的载体可以包含编码实施用于将本公开的多核苷酸整合到宿主基因组中的这些方法所需的多肽的多核苷酸。

宿主细胞可以使用本领域已知的方法和组合物进行培养。适于培养本公开的宿主细胞的可商购获得的培养基的实例包含Ham's F10(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基(MEM)(西格玛公司)、RP MI-1640(西格玛公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium，DMEM)(西格玛公司)。

培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸酯)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN^TM药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可以包含以本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必要补充剂。培养条件，如温度、pH等，对于普通技术人员来说将是显而易见的。

1.1.3.制备多肽和细胞产物

本公开提供了产生多肽的方法。所述方法可以使用用本公开的小分子处理的本公开的细胞。

本公开提供了产生包括多核苷酸集合的载体、将载体递送到细胞中(例如，体内、体外或离体)以及表达多核苷酸集合以提供和/或控制细胞功能的方法。表达可以通过本公开的小分子来调节。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)使用编码所关注的多肽产物的多核苷酸集合修饰细胞来产生生产细胞系；(b)在有利于多肽产物的表达的条件下培养所述生产细胞系，(c)通过向所述细胞系递送本公开的小分子来调节所述多肽产物的产生；以及(d)任选地，回收表达的多肽。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)使用编码所关注的多肽产物的多核苷酸集合修饰细胞来产生生产细胞系；(b)在有利于多肽产物的表达的条件下培养所述生产细胞系，(c)测量所述所关注的多肽；(d)通过向所述细胞系递送本公开的小分子来调节所述多肽产物的产生；以及(e)任选地，回收表达的多肽。

表达的多肽可以例如从无细胞提取物中回收或从培养基中回收。

在一个实例中，所关注的多肽产物是治疗蛋白质或肽。

在另一个实例中，所关注的多肽产物是选自由以下组成的组的病毒或病毒衣壳：腺病毒、慢病毒、杆状病毒、爱泼斯坦·巴尔病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。

所关注的多肽产物可以在细胞内产生，或者直接分泌到培养基中。如果多肽是在细胞内产生的，细胞可以被裂解。颗粒碎片可以例如通过离心或超滤去除。在多肽分泌到培养基中的情况下，可以任选地浓缩来自此类表达系统的上清液，例如使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Ami con或Millipore Pellicon超滤单元。可以在前述任一步骤中包含蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包含抗生素以防止外来污染物的生长。

多肽可以使用例如以下进行纯化：羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法、在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSE^TM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、低pH疏水相互作用色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、在免疫亲和或离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂(如DEAE)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤。

所关注的多肽产物可以被纯化以获得基本上均匀的制剂，用于进一步测定和使用。所关注的多肽产物可以被纯化以获得对于药物用途而言足够均匀的制剂。

细胞疗法方法

本公开提供了治疗需要细胞疗法的受试者的方法。所述方法包括以下步骤：(a)向所述受试者施用有效量的包括编码所关注的多肽产物的治疗细胞的药物组合物；以及(b)向所述受试者施用治疗有效量的小分子。

在某些实施例中，所述方法包含以下步骤：

(i)向所述受试者施用有效量的包括编码所关注的治疗多肽产物(例如，CAR)的治疗细胞和药学上接受的载体的药物组合物；

(ii)向所述受试者施用治疗有效量的小分子调控因子；

(iii)监测所述治疗多肽产物的水平；以及

(iv)任选地，调节所述小分子调控因子的剂量以将所述治疗多肽产物在所述受试者体内的水平调节为期望的水平。

在某些实施例中，所述方法包含以下步骤：

(i)向所述受试者施用有效量的包括编码所关注的治疗多肽产物(例如，CAR)的治疗细胞和药学上可接受的载体的药物组合物；

(ii)向所述受试者施用治疗有效量的小分子调控因子；

(iii)监测所述治疗多肽产物的水平；以及

(iv)任选地，施用治疗有效量的第二小分子调控因子以终止所述细胞疗法。

一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症(例如，肿瘤)的方法。可以使用本文所公开的药物组合物治疗的癌症的实例包含但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、肉瘤和结肠癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、脑癌(例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤)、前列腺癌、膀胱癌，直肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、血癌(例如，急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、EBV诱导的B细胞淋巴瘤)。

在一些情况下，用于治疗受试者的细胞可以是自体细胞。在一些情况下，用于治疗受试者的细胞可以是同种异体细胞。

一方面，本公开提供了一种在控制有需要的受试者体内的T细胞介导的免疫应答的方法。

一方面，本公开提供了一种刺激对受试者体内的靶细胞群体或组织的T细胞介导的免疫应答的方法。

一方面，本公开提供了在受试者体内提供抗肿瘤免疫的方法。

一方面，本公开提供了一种控制有需要的受试者体内的T细胞介导的信号传导活性的方法。

一方面，本公开提供了一种暂停有需要的受试者体内的T细胞介导的信号传导活性的方法。

一方面，本公开提供了一种终止有需要的受试者体内的T细胞介导的疗法的方法。

基因疗法方法

本公开提供了通过将本公开的多核苷酸集合递送给受试者来治疗有需要的受试者的方法。本公开的多核苷酸集合可以被递送到受试者的细胞中。所述方法可以包含向受试者施用药学有效量的多核苷酸集合。施用可以是通过施用包含本公开的一种或多种多核苷酸的病毒颗粒。施用可以是通过施用包含本公开的一种或多种多核苷酸的药物组合物。

在某些实施例中，所述方法包含以下步骤：

(i)向所述受试者施用有效量的包含编码所关注的治疗多肽产物(例如，CAR)的多核苷酸集合和药学上可接受的载体的药物组合物；

(ii)向所述受试者施用治疗有效量的小分子调控因子；

(iii)监测所述治疗多肽产物的水平；以及

所述受试者可以是哺乳动物受试者。所述受试者可以是人受试者。

以下是本文所公开的基因疗法方面可用于的疾病的实例：

●血细胞病症

·镰状细胞性贫血(Hb SS)>5,000分之1；在非裔美国人中，为400分之1

·镰状细胞病(Hb S/C)>25,000分之1

·Hb S/β-地中海贫血(Hb S/Beta-Thalassemia)(Hb S/Th)>50,000分之1

·变体血红蛋白病(包含Hb E)

·葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)

·先天性氨基酸代谢缺陷

·酪氨酸血症I(TYR I)<100,000分之1

·精氨酸琥珀酸尿症(ASA)<100,000分之1

·瓜氨酸血症(CIT)<100,000分之1

·苯丙酮尿症(PKU)>25,000分之1

·枫糖尿病(MSUD)<100,000分之1

·高胱氨酸尿症(HCY)<100,000分之1

·酪氨酸血症II

·精氨酸血症

·良性高苯丙氨酸血症

·生物蝶呤辅因子生物合成缺陷

·生物蝶呤辅因子再生缺陷

·酪氨酸血症III

·高甲硫氨酸血症

·II型瓜氨酸血症

·先天性有机酸代谢缺陷

·I型戊二酸血症(GA I)>75,000分之1

·羟甲基戊二酰裂解酶缺乏症(HMG)<100,000分之1

·异戊酸血症(IVA)<100,000分之1

·3-甲基巴豆酰基-CoA羧化酶缺乏症(3MCC)>75,000分之1

·甲基丙二酰基-CoA突变酶缺乏症(MUT)>75,000分之1

·甲基丙二酸尿症，cblA和cblB形式(MMA，Cbl A,B)<100,000分之1

·β-酮硫解酶缺乏症(BKT)<100,000分之1

·丙酸血症(PROP)>75,000分之1

·多重-CoA羧化酶缺乏症(MCD)<100,000分之1

·甲基丙二酸血症(Cbl C,D)

·丙二酸血症

·2-甲基-3-羟基丁酸尿症

·异丁酰基-CoA脱氢酶缺乏症

·2-甲基丁酰基-CoA脱氢酶缺乏症

·3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶缺乏症

·II型戊二酸血症

·HHH综合征(高氨血症、高白血症、高瓜氨酸尿综合征)

·β-甲基巴豆酰基羧化酶缺乏症

·腺苷钴胺素合成缺陷

●先天性脂肪酸代谢缺陷

·长链羟基酰基-CoA脱氢酶缺乏症(LCHAD)>75,000分之1·长链羟基酰基-CoA脱氢酶缺乏症(MCAD)>25,000分之1·超长链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(VLCAD)>75,000分之1·三功能蛋白缺乏症(TFP)<100,000分之1

·肉碱摄取缺陷(CUD)<100,000分之1

·中/短链L-3-羟基酰基-CoA脱氢酶缺乏症

·中链酮酰基-CoA硫解酶缺乏症

·二烯酰基-CoA还原酶缺乏症

·II型戊二酸血症

·1型肉碱棕榈酰转移酶缺乏症

·2型肉碱棕榈酰转移酶缺乏症

·短链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(SCAD)

·肉碱/酰基肉碱转移酶缺乏症(转移酶)

·短链羟基酰基-CoA脱氢酶缺乏症(SCHAD)

·长链酰基-CoA脱氢酶缺乏症(LCAD)

·多酰基-CoA脱氢酶缺乏症(MADD)

●其它多系统疾病

·囊性纤维化(CF)>5,000分之1

·先天性甲状腺功能减退症(CH)>5,000分之1

·生物素酶缺乏症(BIOT)>75,000分之1

·先天性肾上腺增生(CAH)>25,000分之1

·经典型半乳糖血症(GALT)>50,000分之1

·半乳糖激酶缺乏症

·半乳糖差向异构酶缺乏症

●其它

·严重联合免疫缺陷(SCID)-2009年添加

·严重先天性心脏缺陷(使用脉搏血氧计筛查)-2010年添加

·庞贝病(Pompe disease)-2013年添加

·I型粘多糖病-2015年添加

·X连锁肾上腺脑白质营养不良-2018年添加

表A序列

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-FKBP-P2A-Dap10-CD28tm-41BB-FRB(T2098L)-tagBFP

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>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-NS3aH1-P2A-Dap10-CD28tm-41BB-DNCR2-CD3z-tagBFP

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>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-NS3aH1-P2A-Dap10-CD28tm-41BB-ANR-CD3z-tagBFP

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>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-BclxL-P2A-Dap10-CD28tm-41BB-BadBH3-CD3z-tagBFP

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>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-CD3z

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>Dap10-CD28tm-41BB-BadBH3-CD3z-P2a-EGFRt

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSASGSASGSASGSGSAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEFEGSFKGSASGSASAGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQ ID NO:8

>Dap10-CD28tm-41BB-ANR-CD3z-P2a-EGFRt

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSASGSASGSASGSGSGELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNFGSASGSASAGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQ IDNO:9

>Dap10-CD28tm-41BB-DNCR2-CD3z-P2a-EGFRt

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSASGSASGSASGSGSSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHGSASGSASAGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQ ID NO:10

>Dap10-CD28tm-41BB-GNCR1-CD3z-P2a-EGFRt

MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSASGSASGSASGSGSDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSGSASGSASAGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQ ID NO:11

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-CD3z-P2a-EGFRt

MVLQTQVFISLLLWISGAYG(scFV_铰链)CPPCPMFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM SEQID NO:12

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-BclxL

MVLQTQVFISLLLWISGAYG(scFV_铰链)CPPCPMFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELASGSASGSASMSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESEMETPSAINGNPSWHLADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQALREAGDEFELRYRRAFSDLTSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRDGVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKEMQVLVSRIAAWMATYLNDHLEPWIQENGGWDTFVELYGNN SEQ ID NO:13

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-NS3aH1gs

MVLQTQVFISLLLWISGAYG(scFV_铰链)CPPCPMFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELASGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:14

>DNCR2-Casp9gsD330A-P2a-EGFP-NLS

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK SEQ ID NO:15

>iCasp-9(FKBP-F36V-casp-9)

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:16

>iCasp-9-D330A(FKBP-F36V-casp-9)

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKT SEQ ID NO:17

>rapaCasp-9(FRB-FKBP-casp-9)

MASRILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKLEYSGGGSLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGGSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ IDNO:18

>NS3a-Casp9-T2a-DNCR2-Casp9

MKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHSGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:19

>NS3a-Casp9-T2a-GNCR1-Casp9

MKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSSGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:20

>NS3a-DNCR2-Casp9

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>NS3a-GNCR1-Casp9

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>DNCR2-8link-NS3a-Casp9

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>DNCR2-5link-NS3a-Casp9

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>DNCR2-3link-NS3a-Casp9

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHSGSKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:25

>DNCR2-noLink-NS3a-Casp9

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:26

>D1-noLink-NS3a-Casp9

MDDNEAEKLIREAEEAAKDAEEAAERTGDPEVRELARELVRLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGSGGSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:27

>D9-NS3a-Casp9

MELEEVLKDLEEALERLRNEELRRLIEEIAELLRRRDDHSIIYMIEALIFVIEAVERTGDERIEKLLEELIKRIRNGDDDSAIMRIVLAVYLIEENLREKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGSGGSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:28

>D20-NS3a-Casp9

MYAKEAAEFAREAAERTGDPEVRELARELERLARRGSSEHALMRIVLAIYLAEENLREKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGSGGSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:29

-GNCR1-8link-NS3a-Casp9

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSSGGSGSGSKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:30

-GNCR1-5link-NS3a-Casp9

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSSGGGSKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:31

>GNCR1-3link-NS3a-Casp9

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSSGSKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSSEQ ID NO:32

>GNCR1-noLink-NS3a-Casp9

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSGGGGSGGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:33

>DNCR2-Casp9D330A

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQID NO:34

>DNCR2-Casp9

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQID NO:35

>D1-Casp9D330A

MDDNEAEKLIREAEEAAKDAEEAAERTGDPEVRELARELVRLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLRESGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:36

>D9-Casp9D330A

MELEEVLKDLEEALERLRNEELRRLIEEIAELLRRRDDHSIIYMIEALIFVIEAVERTGDERIEKLLEELIKRIRNGDDDSAIMRIVLAVYLIEENLRESGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS SEQ ID NO:37

>D20-Casp9D330A

MYAKEAAEFAREAAERTGDPEVRELARELERLARRGSSEHALMRIVLAIYLAEENLRESGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSSEQ ID NO:38

>GNCR1-Casp9D330A

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLAAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSSEQ ID NO:39

>GNCR1-Casp9

MDIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKSGSASGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSSEQ ID NO:40

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-NS3aH1

MVLQTQVFISLLLWISGAYG(scFV_铰链)CPPCPMFWVLVVVGGVL ACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELASGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:41

>二聚体-NS3aH1

MTRTEIIRELERSLREQEELAKRLKELLRELERLQREGSSDEDVRELLREIKELVEEIEKLAREQKYLVEELKRQDGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:42

>六聚体-NS3a

MTEDEIRKLRKLLEEAEKKLKKLEDKTRRSEEISKTDDDPKAQSLQLIAESLMLIAESLLIIAISLLLSSRNGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:43

>五聚体-NS3aH1

MTRRKQEMKRLKKEMEKIREETEEVKKEIEESKKRPQSESAKNLILIMQLLINQIRLLALQIRMLALQLQEGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:44

>三聚体-NS3aH1

MSEYEIRKALEELKASTAELKRATASLRASTEELKKNPSEDALVENNRLIVEHNAIIVENNRIIAAVLELIVRAIKGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP SEQ ID NO:45

>hIgKSP-(scFV-铰链)-CD28tm-4-1BB-NS3aH1-NS3aH1

MVLQTQVFISLLLWISGAYG(scFV_hinge)CPPCPMFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELASGSASGSASMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPGSSGSSGSSGGKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPSEQ ID NO:46

>FKBP(F36V)-Casp-1

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGSGNPAMPTSSGSEGNVKLCSLEEAQRIWKQKSAEIYPIMDKSSRTRLALIICNEEFDSIPRRTGAEVDITGMTMLLQNLGYSVDVKKNLTASDMTTELEAFAHRPEHKTSDSTFLVFMSHGIREGICGKKHSEQVPDILQLNAIFNMLNTKNCPSLKDKPKVIIIQACRGDSPGVVWFKDSVGVSGNLSLPTTEEFEDDAIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPTMGSVFIGRLIEHMQEYACSCDVEEIFRKVRFSFEQPDGRAQMPTTERVTLTRCFYLFPGH SEQ ID NO:47

>FKBP(F36V)-Casp-4

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGSGEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGN SEQ ID NO:48

>FKBP(F36V)-Casp-3

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMGLCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMRDVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFIIQACRGTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGSWFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPCIVSMLTKELYFYH SEQ ID NO:49

>FKBP(F36V)-Casp-3-Casp-9界面

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMGLCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMRDVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFIIQACRGTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGSWFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPGCFNFLTKELYFYH SEQ ID NO:50

>RIPK3-FKBP(F36V)-FKBP-F36V)

MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGSGRLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO:51

>MLKL-FKBP(F36V)-FKBP-F36V)

MENLKHIITLGQVIHKRCEEMKYCKKQCRRLGHRVLGLIKPLEMLQDQGKRSVPSEKLTTAMNRFKAALEEANGEIEKFSNRSNICRFLTASQDKILFKDVNRKLSDVWKELSLLLQVEQRMPVSPISQGASWAQEDQQDADEDRRAFQMLRRDNEKIEASLRRLEINMKEIKETLRQYLPPKCMQEIPQEQIKEIKKEQLSGSPWILLRENEVSTLYKGEYHRAPVAIKVFKKLQAGSIAIVRQTFNKEIKTMKKFESPNILRIFGICIDETVTPPQFSIVMEYCELGTLRELLDREKDLTLGKRMVLVLGAARGLYRLHHSEAPELHGKIRSSNFLVTQGYQVKLAGFELRKTQTSMSLGTTREKTDRVKSTAYLSPQELEDVFYQYDVKSEIYSFGIVLWEIATGDIPFQGCNSEKIRKLVAVKRQQEPLGEDCPSELREIIDECRAHDPSVRPSVDEILKKLSTFSKGSMLEGVQVETISPEGGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETGSGMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE

SEQ ID NO:52

>APAF1-FKBP(F36V)-FKBP-F36V)

MDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVVSSSSGKDSVSGITSGSMLEGVQVETISPEGGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETGSGMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE SEQ ID NO:53

>DNCR2-Casp-1

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHTGSGGGSGNPAMPTSSGSEGNVKLCSLEEAQRIWKQKSAEIYPIMDKSSRTRLALIICNEEFDSIPRRTGAEVDITGMTMLLQNLGYSVDVKKNLTASDMTTELEAFAHRPEHKTSDSTFLVFMSHGIREGICGKKHSEQVPDILQLNAIFNMLNTKNCPSLKDKPKVIIIQACRGDSPGVVWFKDSVGVSGNLSLPTTEEFEDDAIKKAHIEKDFIAFCSSTPDNVSWRHPTMGSVFIGRLIEHMQEYACSCDVEEIFRKVRFSFEQPDGRAQMPTTERVTLTRCFYLFPGHSEQ ID NO:54

>DNCR2-Casp-4

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHTGSGGGSGEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKERAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLTARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNNRNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDFIAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMPTIERLSMTRYFYLFPGNSEQ ID NO:55

>DNCR2-Casp-3

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHTGSGGGSGMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMGLCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMRDVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFIIQACRGTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGSWFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPCIVSMLTKELYFYH SEQ IDNO:56

>DNCR2-Casp-3-Casp9界面

MSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNHTGSGGGSGMENTENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGISLDNSYKMDYPEMGLCIIINNKNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMRDVSKEDHSKRSSFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFIIQACRGTELDCGIETDSGVDDDMACHKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGSWFIQSLCAMLKQYADKLEFMHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPGCFNFLTKELYFYH SEQ IDNO:57

>RIPK3-DNCR2

MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH SEQ ID NO:58

>MLKL-DNCR2

MENLKHIITLGQVIHKRCEEMKYCKKQCRRLGHRVLGLIKPLEMLQDQGKRSVPSEKLTTAMNRFKAALEEANGEIEKFSNRSNICRFLTASQDKILFKDVNRKLSDVWKELSLLLQVEQRMPVSPISQGASWAQEDQQDADEDRRAFQMLRRDNEKIEASLRRLEINMKEIKETLRQYLPPKCMQEIPQEQIKEIKKEQLSGSPWILLRENEVSTLYKGEYHRAPVAIKVFKKLQAGSIAIVRQTFNKEIKTMKKFESPNILRIFGICIDETVTPPQFSIVMEYCELGTLRELLDREKDLTLGKRMVLVLGAARGLYRLHHSEAPELHGKIRSSNFLVTQGYQVKLAGFELRKTQTSMSLGTTREKTDRVKSTAYLSPQELEDVFYQYDVKSEIYSFGIVLWEIATGDIPFQGCNSEKIRKLVAVKRQQEPLGEDCPSELREIIDECRAHDPSVRPSVDEILKKLSTFSKGSSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH SEQ ID NO:59

>APAF1-DNCR2

MDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVVSSSSGKDSVSGITSGSSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH SEQ ID NO:60

>APAF1-NS3a-DNCR2

MDAKARNCLLQHREALEKDIKTSYIMDHMISDGFLTISEEEKVRNEPTQQQRAAMLIKMILKKDNDSYVSFYNALLHEGYKDLAALLHDGIPVVSSSSGKDSVSGITSGSMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQEMSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPTGSGGGSSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH SEQ ID NO:61

>RIPK3-NS3a-P2a-RIPK3-DNCR2

MSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNMKKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMSCVKLWPSGAPAPLVSIEELENQELVGKGGFGTVFRAQHRKWGYDVAVKIVNSKAISREVKAMASLDNEFVLRLEGVIEKVNWDQDPKPALVTKFMENGSLSGLLQSQCPRPWPLLCRLLKEVVLGMFYLHDQNPVLLHRDLKPSNVLLDPELHVKLADFGLSTFQGGSQSGTGSGEPGGTLGYLAPELFVNVNRKASTASDVYSFGILMWAVLAGREVELPTEPSLVYEAVCNRQNRPSLAELPQAGPETPGLEGLKELMQLCWSSEPKDRPSFQECLPKTDEVFQMVENNMNAAVSTVKDFLSQLRSSNRRFSIPESGQGGTEMDGFRRTIENQHSRNDVMVSEWLNKLNLEEPPSSVPKKCPSLTKRSRAQEEQVPQAWTAGTSSDSMAQPPQTPETSTFRNQMPSPTSTGTPSPGPRGNQGAERQGMNWSCRTPEPNPVTGRPLVNIYNSSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH SEQID NO:62

表B序列

表C序列

>亮氨酸拉链-GCN4(二聚体)

QRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGDAAR

>pRO2.5(三聚体)

SEYEIRKALEELKASTAELKRATASLRASTEELKKNPSEDALVENNRLIVEHNAIIVENNRIIAAVLELIVRAIK

>2L4HC2_23(二聚体)

TRTEIIRELERSLREQEELAKRLKELLRELERLQREGSSDEDVRELLREIKELVEEIEKLAREQKYLVEELKRQD

>5H2LD__10_A(五聚体)

TRRKQEMKRLKKEMEKIREETEEVKKEIEESKKRPQSESAKNLILIMQLLINQIRLLALQIRMLALQLQE

>6H2LD__8_A(六聚体)

TEDEIRKLRKLLEEAEKKLKKLEDKTRRSEEISKTDDDPKAQSLQLIAESLMLIAESLLIIAISLLLSSRNG

>ANR

GELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNF

>DNCR2

SSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH

>DNCR2_1

DDNEAEKLIREAEEAAKDAEEAAERTGDPEVRELARELVRLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLRE

>DNCR2_2

EERELARELERLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIEYAREAAEFAREAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLRE

>DNCR2_3

DENEAEHSRRYAKEAAEFAREAAERTGDPEVRELARELERLAREAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLRE

>DNCR2_4

DENELEHIRRYLKEILEFVREVVERTGDEHIRRLLEELERLVKKVIEELKRRPDLHHNEHAFMRLVLAVYLAEENLRE

>DNCR2_5

DENELEHIRRYLKEVLEFVREILERTGDEEVKKLIEELERLVKKIEEELKRD

PRRHHNEHAVMRLVLAVYLLEENLRE

>DNCR2_6

DEEELHKRVEELWKELHELVRRHSHDSDLNELLHIIEYLREVLEFVREVLE

RTGDEHIKRLLHELVKRIVETIEELKRNSHHSNNEHAVMRIVLAVYLAEEN

LRE

>DNCR2_7

DEEELERRLEELWRRIKERVERHSHDSDLNELLHIIEYLREVVEFVREVVE

RTGDEHIKRLLLELIREIVEVIEKLERNLHDSNNEHAVMRIVLAVYLAEEN

LRE

>DNCR2_8

EVEEVLKDLEEAIERLHDHEINRLAKEVLKILRKRDDHSIIYAVEVMIFVIE

VLERTGDEKVRELIRELAEIIRRKGGTDGAVMRLVLAIYLLEENLRE

>DNCR2_9

ELEEVLKDLEEALERLRNEELRRLIEEIAELLRRRDDHSIIYMIEALIFVIEA

VERTGDERIEKLLEELIKRIRNGDDDSAIMRIVLAVYLIEENLRE

>DNCR2_10

EAEEAAKDAEEAAERLHDPEVRELARELVRLAKETTHEDGLHSIVYAIEA

AIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLARNGDHSGALMRIVLAIYLAEENL

RE

>DNCR2_11

EAEEAAKDAEEAAERLHDPEVRELARELVRLAKERDDHSIVYAIEAAIFA

LEAAERTGDPEVRELARELVRLAREGDHSSALMRIVLAIYLAEENLRE>DNCR2_12

DDNEAEKLIREAEEVLKDIEEILERLHDEEIIRLVEEVQKILKELLERVHKH

PHDSDLNELLHIIFYMMEVLIFVLEVLERTGDEEIRKLVWHIVRIILEILEEL

RRNPKHSNNEHALMRLLLAIYLLEENLRE

>DNCR2_13

EAEEAAKDAEEAAERLHDPEVRELARELVRLAKEVDDHSIVYAIEAAIFA

LEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAI

YLAEENLRE

>DNCR2_14

EFEEVLKDLEEVVERLHNEEIRRLLERLIELLRRVRDHSFIYLVEAVIFVLE

VLERTGDHRVEELLEKLVRLVIEVLEELERHPHKENNEHAAMRFVLAVYL

IEENLRE

>DNCR2_15

EWEEVLKDLEEALERLHDEEIRRLLERVVELLREDTDHSIVYLIEALIFVIE

AVERTGDERIHRLLEELVRRIIKVIEELHRHPHKENNEHAAMRFVLAVYLI

EENLRE

>DNCR2_16

EERELARELERLARERRDHSIEYAREAAEFAREAAERTGDPEVRELARELV

RLARNGSDEHALMRIVLAIYLAEENLRE

>DNCR2_17

EERELARELERLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIEYAREAAEFAREAA

ERTGDPEVRELARELVRLARNGSDEHALMRIVLAIYLAEENLRE

>DNCR2_18

DEEEIRKRIEEQWRRDTDHSWEYLREVAEFAREILERTGDERIKELVLRILE

LIENGTDDHAIMRLVLALYLIEENLRE

>DNCR2_19

DEEELREEVEHLWREDTDHSWEYLREALEFLREIVERTGDERLRELLKKA

LELVRHGTDGHAIMRLVLAAYLLEENLRE

>DNCR2_20

YAKEAAEFAREAAERTGDPEVRELARELERLARRGSSEHALMRIVLAIYL

AEENLRE

>DNCR2_21

YAKEVAEFVREVWERTGDERVEELLKKLEELRRNGSDEHALMRLVLAVY

LIEENLRE

>DNCR2_22

YWKEVAEFLREVLERTGDEEVKKLLEEFEELRRRGSDEHALMRLVLAVY

LIEENLRE

>DNCR2_23

DEEELERKIEEQVRKLREEVERRSHDSDLNEALHSMEYLREIAEFAREIVE

RTGDEELRKLLKEILRLIHENPEDVGHAIMRLILALYLLEENLRE

>DNCR2_24

DDNEAEKLIREAEEAAKDAEEAAERTGDPEVRELARELVRLAKEAAEEV

QRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVE

AAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARER

VREAVERAEEVQRD

>DNCR2_25

EERELARELERLAKEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIEYAREAAEFAREAA

ERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAE

ENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2_26

DENEAEHSRRYAKEAAEFAREAAERTGDPEVRELARELERLAREAAEEV

QRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAV

ERAEEVQRD

>DNCR2_27

DENELEHIRRYLKEILEFVREVVERTGDEHIRRLLEELERLVKKVIEELKRR

PDLHHNEHAFMRLVLAVYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVER

AEEVQRD

>DNCR2_28

DENELEHIRRYLKEVLEFVREILERTGDEEVKKLIEELERLVKKIEEELKRD

PRRHHNEHAVMRLVLAVYLLEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVER

AEEVQRD

>DNCR2_29

DEEELHKRVEELWKELHELVRRHSHDSDLNELLHIIEYLREVLEFVREVLE

RTGDEHIKRLLHELVKRIVETIEELKRNSHHSNNEHAVMRIVLAVYLAEEN

LREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2_30

DEEELERRLEELWRRIKERVERHSHDSDLNELLHIIEYLREVVEFVREVVE

RTGDEHIKRLLLELIREIVEVIEKLERNLHDSNNEHAVMRIVLAVYLAEEN

LREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2_31

DDNEAEKLIREAEEVLKDIEEILERLHDEEIIRLVEEVQKILKELLERVHKH

PHDSDLNELLHIIFYMMEVLIFVLEVLERTGDEEIRKLVWHIVRIILEILEEL

RRNPKHSNNEHALMRLLLAIYLLEENLREAEESGDPEKREKARERVREAV

ERAEEVQRD

>DNCR2_32

EAEEAAKDAEEAAERLHDPEVRELARELVRLAKEVDDHSIVYAIEAAIFA

LEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAI

YLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2_33

EFEEVLKDLEEVVERLHNEEIRRLLERLIELLRRVRDHSFIYLVEAVIFVLE

VLERTGDHRVEELLEKLVRLVIEVLEELERHPHKENNEHAAMRFVLAVYL

IEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2_34

EWEEVLKDLEEALERLHDEEIRRLLERVVELLREDTDHSIVYLIEALIFVIE

AVERTGDERIHRLLEELVRRIIKVIEELHRHPHKENNEHAAMRFVLAVYLI

EENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRD

>DNCR2-3rep

TSSDEEEARELIEEAKEAAEDAQEAAERTGDPEVRELARELKRLAQEAAE

EVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLA

VEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKAR

ERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH

>GNCR1

DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLT

ACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIK

LASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHP

DSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEAS

KAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKS

>GNCR1-3rep

DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLT

ACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIK

LASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHP

DSQKARDEIKEASQKAEEVERRCWRAAEN

>G33

DIEKLCKKAEEEAKEEGNELAVAAVLTACLLAQEWPNSHIAKLCIKAASEAAERGDSQAARAVILAIMLAAENPNNEHAEECIRLAMEAARDGTSEHAERVERECWKHME

>G38

DIEKLCKKAEEEAKEVGDNLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAESGDKQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEGSKHGWSQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAREGNSQKAEEVKERCKS

>P2a

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

>T2a

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表1

试剂盒

本公开提供了包括本公开的多核苷酸的试剂盒或制品以及用于将多核苷酸递送到细胞的制剂。多核苷酸可以作为本公开的载体的一部分提供。在一些实施例中，试剂盒或制品进一步包括用于使用多核苷酸集合转化细胞以表达所关注的基因以产生所关注的多肽的说明书。

在一些情况下，试剂盒还可以包含本公开的小分子。

实例

方法

使用T细胞的慢病毒转导和流式细胞术分析来评估基于NS3a的调节的CAR。所评估的CAR对靶细胞系Jeko1上表达的ROR1抗原具有特异性。Jurkat和Jeko1细胞系从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)获得，并且维持在具有含有10％胎牛血清(吉博科公司(Gibco))的Glutamax(吉博科公司)的RPMI 1640培养基中。对于慢病毒转导，将Jurkat细胞与慢病毒在完全培养基中加制造商推荐的浓度(西里安生物技术公司(Sirion Biotech))的LentiBOOST中温育。转染后十八小时，通过添加1体积的新鲜培养基稀释慢病毒和LentiBOOST。

从华盛顿州西雅图的血液工作公司(Bloodworks,Seattle WA)获得来自正常供体的预选的、冷冻保存的原代人CD4 T细胞。将人T细胞在补充有免疫细胞血清替代物(赛默飞世尔公司)、2mM L-谷氨酰胺(吉博科公司)、2mM Glutamax(吉博科公司)、200IU/ml IL-2(R&D系统公司(R&Dsystems))、120IU/ml IL-7(R&D系统公司)和20IU/ml IL-15(R&D系统公司)的OpTmizer培养基(赛默飞世尔公司)中培养。

慢病毒是在HEK293T悬浮系中使用标准方案产生的。按照制造商的方案，使用Lenti-X(宝生物工程公司(Takara Bio))将病毒上清液浓缩10x。

对于慢病毒转导，用1:100稀释的T细胞TransAct(美天旎公司(Miltenyi))刺激T细胞30小时。然后将病毒添加到T细胞中，持续18小时至24小时。然后通过添加7体积的不含TransAct的新鲜培养基终止刺激和病毒感染，并且在分析前将细胞培养另外3天至7天。

纯化的与人Ig Fc连接的重组Ror1在内部产生并与Alexa 647染料缀合用于检测，并且用作流式细胞术试剂来检测ROR1 CAR。

在染色和死亡分析之前，将杀伤开关阳性细胞(1e5)与诱导物药物温育24小时至48小时。通过添加未转染的Jurkat或原代T细胞，将条件相对于含有约50％的转导阳性(+)细胞归一化，以获得关于死亡的准确统计。

在Ze5细胞仪(伯乐公司(Biorad))上进行流式细胞术。为了确定标志物的表达，将介于1×10⁵个与2×10⁵个之间的总细胞转移到U形底96孔培养皿(康宁公司(Corning))中。用细胞染色缓冲液(百进生物公司(BioLegend))洗涤细胞两次，然后用Zombie Violet(1:1000，百进生物公司)和ROR1特异性CAR构建体的ROR1-FC染色(室温下20分钟)。细胞在细胞染色缓冲液中洗涤两次，然后在室温下用1x膜联蛋白V结合缓冲液(BD)中的膜联蛋白V-PE(BD)染色15分钟。染色后，将细胞用膜联蛋白V结合缓冲液洗涤一次，重悬于AnneinV结合缓冲溶液中并立即分析。

使用FlowJo 10(树星公司(Tree Star))分析流式细胞术数据。通过对活细胞进行门控，然后计算100*((GFP阳性DMSO条件百分比)-(GFP阴性药物条件百分比))/(GFP阳性DMSO条件百分比)来计算杀伤百分比。

为了诱导CD69表达的流分析，将Jurkat细胞与Jeko1细胞或Jeko1-ROR1-KO细胞以1:1混合。将药物添加到500nM的最终浓度。在表面标志物的流分析之前，将培养物与药物一起温育24小时。

对于原代T细胞对Jeko1杀伤的IncuCyte分析，将5e4 Jeko1-NucLight Red靶细胞与5e4 CAR阳性T细胞在96孔平底板中混合。在时间零点将药物添加到适当的最终浓度，并且每6小时对板成像一次以获得来自Jeko1细胞的NucLight Red信号。在共培养设置后24小时取上清液用于细胞因子释放的MSD分析。IL-2和IFNγ使用V-Plex定制人细胞因子试剂盒(中尺度发现公司(Meso Scale Discovery)，K151A0H-4)按照制造商的方案进行测量。

对于具有CAR和DNCR2-casp-9杀伤开关(与EGFP转导制造商)的CD3ζ-信号传导tdTomato报告系的IncuCyte分析，5e4 CAR+细胞在预先接种5e4 Jeko1细胞的poly-D-Lys包被的板中每孔铺板。将药物(例如，格佐匹韦、达诺瑞韦)添加到给定的最终浓度，并且在20X、800毫秒暴露下对细胞进行tdTomato和EGFP信号成像，每3小时4个图像/孔。当药物条件改变时，在PBS中于48小时时将细胞从Incucyte板移到v形底板中进行2次洗涤。

在分析前24小时设置用于CAR/杀伤开关构建体的流分析的共培养物。将CAR阳性细胞(1e5细胞；第I部分和第II部分阳性，即ROR1+和EGFRt+(第II部分标志物))与1e5Jeko1细胞和药物混合。如下文所描述的，分析细胞的ROR1、EGFRt(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGE)、tdTomato、EGFP和活力。

通过对活细胞进行门控，然后计算100*((GFP阳性DMSO条件百分比)-(GFP阴性药物条件百分比))/(GFP阳性DMSO条件百分比)来计算杀伤百分比。

在Ze5细胞仪(伯乐公司)上进行CAR实验的流式细胞术。纯化的与人Ig Fc连接的重组Ror1在内部产生并与Alexa 647染料缀合用于检测，并且用作流式细胞术试剂来检测ROR1 CAR。为了确定标志物的表达，将介于1×10⁵个与2×10⁵个之间的总细胞转移到U形底96孔培养皿(康宁公司)中。将细胞用细胞染色缓冲液(百进生物公司)洗涤两次，然后用总体积为25μL的明亮染色缓冲液(BD公司(BD))的相关试剂在冰上染色30分钟(用于CD69实验)。可替代地，在细胞染色缓冲液中用以1:1000稀释的eFluor780可固定活力染料(e生物科学公司(eBioscience))对细胞进行染色。染色后，将细胞用细胞染色缓冲液洗涤两次，任选地固定在FluoroFix缓冲液(百进生物公司)中，并且在黑暗中保持在4℃下，直到分析。使用FlowJo10(树星公司)分析流式细胞术数据。

以下实例中使用的药物以及其靶蛋白在表2中示出。用于检测的T细胞标志物和荧光染料在表3中示出。

表2.使用的药物以及其靶蛋白

表3.用于检测的T细胞标志物和荧光染料

靶标	荧光染料	克隆	供应商
				CD69	PE	FN50	百进生物公司
CD3	BUV805	SK7	BD公司
				EGFR	BV421	AY13	百进生物公司

CAR活性的时间控制

在Jurkat细胞系中评估上文参考图1B描述的三种基于NS3a的调节的CAR。CAR对靶细胞系Jeko1上表达的ROR1抗原具有特异性。在此实例中，可调节CAR的两条多肽链从通过P2a分离的单个慢病毒表达。将三种基于NS3a的CAR的性能与化学诱导型(“开启开关”)二聚体FKBP/AP21967/FRB(T2098L)系统和化学可破坏(“关闭开关”)二聚体Bcl-xL/A-1155463/Bad进行了比较。简而言之，在不存在或存在500nM同源小分子药物的情况下，将表达设计的小分子可调节CAR的Jurkat细胞与Jeko1靶细胞1:1混合。将相同的Jurkat细胞与缺乏ROR1的Jeko1敲除(KO)细胞1:1混合作为阴性对照。使用未转染的Jurkat细胞、表达不含CD3ζ信号传导结构域的开启开关CAR的细胞和常规单链ROR1-CAR作为对照。CD69的表达是T细胞激活标志物，通过流式细胞术在活CD3+/ROR1+细胞上门控检测。

图3是示出在与Jeko1细胞或Jeko1-ROR1-KO细胞共培养的表达CAR的Jurkat细胞中CD69表达的小分子药物调节的诱导的图。在不存在(黑色条)或存在(浅灰色条)500nM同源小分子药物的情况下，将表达可调节CAR的Jurkat细胞与Jeko1靶细胞1:1混合。将相同的Jurkat细胞与缺乏ROR1的Jeko1敲除(KO)细胞共培养作为阴性对照(深灰色条)。数据显示，当表达可调节CAR的Jurkat细胞与Jeko1靶细胞1:1共培养时，如Jurkat表面标志物染色的流式细胞术分析所示，响应于CAR信号传导，Jurkat细胞上的CD69表达被激活。所有三种开启开关CAR(“ON CAR”FKBP/FRB、NS3a/GNCR1和NS3a/DNCR2)在存在其同源诱导物小分子药物的情况下显示出比不存在小分子药物时更多的具有CD69表达的细胞。ANR关闭开关CAR(被格佐匹韦破坏)比Bcl-xL/Bad关闭开关CAR表现出更好的性能，因为后者在存在干扰物药物的情况下显示CD69表达几乎没有减少。未转导的Jurkat或用不含CD3ζ信号传导结构域的开启开关CAR转导的Jurkat(FKBP/FRBΔCD3ζ)未显示CD69表达的激活。常规单链ROR1-CAR(“常规CAR”)响应于500nM达诺瑞韦没有显示出显著的调节作用。可调节CAR的关闭状态(没有用于开启开关CAR的药物，具有用于关闭开关CAR的药物)与CD69激活响应于具有ROR1抗原敲除(ROR1 KO)的靶Jeko1细胞的比较表明，这些CAR中没有一个达到完全关闭状态。

接下来评估了CD4+和CD8+原代人T细胞的1:1混合中的可调节CAR。在此实例中，从两个单独的慢病毒载体表达两条多肽链，以减少可能由参考图3描述的单个载体构建体中P2a元件的不完全跳跃引起的任何背景。简而言之，在存在或不存在500nM诱导物或干扰物药物的情况下，将表达可调节CAR两部分的T细胞与含有NucLight Red标志物的Jeko1靶细胞1:1混合，用于跟踪靶细胞生长。使用的药物是A-1155463(对于Bcl-xL/Bad二聚体)、格佐匹韦(对于NS3a/ANR二聚体)、格佐匹韦(对于NS3a/GNCR1二聚体)和达诺瑞韦(对于NS3a/DNCR2二聚体)。使用未转导的细胞和表达常规单链ROR1-CAR的细胞作为对照。使用IncuCyte杀伤测定跟踪细胞生长。通过在24小时取上清液并使用定制的V-plex试剂盒(中尺度发现公司，MSD)测量来自CAR T细胞的细胞因子产生。

图4A是示出在存在或不存在其同源诱导物或干扰物小分子药物的情况下可调节CAR对靶细胞的杀伤的图400、410、415和420的组。数据显示，开启开关CAR，GNCR1-CAR(图415)和DNCR2-CAR(图420)在关闭状态下几乎没有活性(缺乏药物的“媒剂”对照)，与未转染的T细胞相比缺乏靶细胞杀伤。然而，在其各自的诱导物小分子药物存在的情况下，开启开关CAR对Jeko1生长的控制不如常规ROR1 CAR。关闭开关CAR、Bcl-xL/BAD(图400)和NS3a/ANR(曲线图410)显示出对靶细胞生长的控制接近于常规CAR的控制，但是为一种更渗漏的关闭状态，对靶细胞的杀伤比未转染的T细胞更多。

图4B是示出从分别表达图4A的Bcl-xL/Bad、NS3a/ANR、NS3a/GNCR1或NS3a/DNCR2的T细胞产生细胞因子IFNγ和IL-2的图425、430、435和440的组。数据显示，每种可调节CAR的细胞因子产生的大多数趋势都朝着正确的调节方向发展，但可调节CAR导致的整体细胞因子产生低于常规CAR。

因为基于NS3a的二聚化系统可以对两种不同的诱导物药物(用于DNCR2的达诺瑞韦和用于GNCR1的格佐匹韦)做出应答，可以使用这两种药物输入来控制两种不同信号传导输出。在一个实例中，双功能CAR系统包含用于激活CAR信号传导的激活或开启开关组分和用于诱导细胞凋亡的安全开关组分。

图5A是开启开关/安全开关可调节T细胞CAR的双重功能的示意图。所述附图展示了在小分子诱导物格佐匹韦存在下相互作用的系统的表达的开启开关组分510(NS3a/CAR和GNCR1-CD3ζ)。CAR的激活诱导受体二聚化。当添加小分子达诺瑞韦时，其竞争胜过格佐匹韦，将安全开关组分515(DNCR2-胱天蛋白酶-9)募集到与NS3a融合的同源二聚体CAR中。同源二聚化的NS3a导致胱天蛋白酶-9的二聚化和激活，从而导致T细胞死亡。

为了评估使用两种药物输入来控制两种不同的信号传导输出，使用表达红色荧光蛋白tdTomato的Jurkat细胞CD3ζ-信号传导报告系来跟踪CAR信号传导，并且使用DNCR2-胱天蛋白酶-9构建体的转导标志物(EGFP)的缺失来跟踪Jurkat的细胞死亡。

图5B是一对图520和525，分别示出了在存在和不存在格佐匹韦或达诺瑞韦的情况下，Jurkat CD3ζ-信号传导报告系中的CAR信号传导和杀伤百分比。现在参考图520，数据显示双功能CAR被500nM的格佐匹韦(“格佐匹韦”)激活，但不被500nM的达诺瑞韦(“达诺瑞韦”)激活，如通过tdTomato gMFI测量的。现在参考图525，数据显示GNCR1-CAR/DNCR2-casp-9系统中的安全开关是由500nm的达诺瑞韦(达诺瑞韦)触发的，如通过杀伤百分比的增加所指示的，但不被500nM的格佐匹韦(格佐匹韦)触发。在此实例中，Jurkat细胞的杀伤百分比是通过药物处理的群体中转导标志物EGFP阳性群体相对于DMSO处理的对照的损失来测量的。格佐匹韦和达诺瑞韦对用DNCR2-casp-9表达常规CAR的Jurkat细胞没有影响。

在IncuCyte测定中测试了随着时间的推移在CAR信号传导与细胞凋亡的诱导之间切换的能力。简而言之，将表达双重功能GNCR1-CAR/DNCR2-casp9的CD3ζ-信号传导报告系与Jeko 1细胞1:1混合，并且用500nM格佐匹韦或达诺瑞韦或DMSO处理。在48小时内，通过tdTomato强度跟踪CAR信号传导，并且通过跟踪转导标志物EGFP强度监测药物诱导的细胞死亡(即安全开关的激活)。

图6A是一对图600和610，分别示出了在存在和不存在格佐匹韦或达诺瑞韦的情况下，Jurkat CD3ζ-信号传导报告系中的CAR信号传导和药物诱导的细胞死亡。数据显示，在48小时内，CAR信号传导(图600)仅被格佐匹韦激活，如所设计的，并且只有达诺瑞韦处理导致细胞活力降低，如通过EGFP强度的损失所指示的(图610)。

然后测试了从用格佐匹韦诱导CAR信号传导转换为用达诺瑞韦诱导细胞凋亡的能力。简而言之，CAR信号传导在时间零点被格佐匹韦处理激活。48小时后，对细胞进行洗涤并用达诺瑞韦处理。CAR信号传导(tdTomato强度)和细胞活力(EGFP强度)在另外的72小时时段内被跟踪。

图6B是一对图615和620，分别示出了Jurkat CD3ζ-信号传导报告细胞从格佐匹韦治疗转换为达诺瑞韦治疗的CAR信号传导和药物诱导的细胞死亡。在时间零点(实线)添加格佐匹韦处理，没有格佐匹韦的处理(黑色虚线)作为对照。在48小时(箭头所示)洗涤细胞，并且用达诺瑞韦(黑色实线)或处理或不处理(灰色线)。数据显示，CAR信号传导(图615)在格佐匹韦处理后增加，并且在达诺瑞韦处理后下降。数据还显示，细胞活力保持恒定，直到48小时用达诺瑞韦处理，此时，先前用格佐匹韦处理的细胞(黑色实线)和未用格佐匹韦处理的细胞(黑色虚线)两者的EGFP信号开始下降。

现在参考图6A和图6B，数据展示了在两个不同信号传导输出的控制之间临时切换的能力。CAR信号传导的小分子调节可以作为暂停CAR-T细胞活性的安全开关，而诱导型胱天蛋白酶-9开关可以作为破坏T细胞疗法的末端安全开关。

1.1.4.小分子药物诱导的细胞死亡

细胞和基因疗法的效用可以通过安全机制来增强，所述安全机制能够在患者发生不良反应时特异性诱导治疗细胞中的细胞死亡。设计了若干种不同的策略，以通过小分子药物诱导的杀伤结构域的同源寡聚化来激活细胞死亡，如本文上文参考图2所描述的。这些策略包含通过诱导型异源二聚体的直接二聚化或使诱导型异源二聚体的一半与同源-寡聚支架(例如，CAR)或同源-寡聚螺旋束通过融合而同源-寡聚化。

首先通过将NS3a和DNCR2分别与胱天蛋白酶-9(NCDC)的催化结构域融合来测试Jurkat细胞的药物诱导的死亡。将通过AP1903(利米多赛)二聚化的小分子诱导型同源二聚体FKBP-F36V(iCasp9)和诱导型异源二聚体FKBP/雷帕霉素/FRB二聚体(rapaCasp9)用作对照。简而言之，将表达NCDC、iCasp9或rapaCasp9的Jurkat细胞分别暴露于达诺瑞韦、利米多赛或雷帕霉素24小时，并且通过流式细胞术进行分析，其中门控组用于测量表达最高量的GFP杀伤开关转导标志物的前约10％细胞的杀伤。

图7A是具有胱天蛋白酶-9杀伤结构域的双链直接二聚化设计NCDC的示意图。图7B是示出双链直接二聚化设计NCDC随药物浓度而变化的杀伤百分比的图。数据显示，二聚化药物达诺瑞韦的滴定导致适度杀伤表达最高的Jurkat细胞。相比之下，iCasp9或rapaCasp9分别杀伤了此高表达群体中约80％至100％对利米多赛或雷帕霉素的应答。

为了减少NS3a-casp-9/DNCR2-casp-9杀伤开关构建体中两次编码胱天蛋白酶-9结构域所产生的大遗传货物，尝试了涉及NS3a的模板化同源寡聚化的策略。图8A是CAR-NS3a-casp9和同源寡聚体螺旋束-NS3a胱天蛋白酶-9杀伤开关的示意图。将NS3a与CAR构建体(CAR-NS3a)的C末端或设计的同源寡聚螺旋束的C末端，包含二聚体、三聚体、五聚体和六聚体。对于两种杀伤开关，胱天蛋白酶-9与DNCR2或GNCR1融合。

为了评估图8A的杀伤开关设计，构建体在Jurkat细胞中表达，用500nM达诺瑞韦(DNCR2-casp-9)或500nM格佐匹韦(GNCR1-casp-9)处理，并且如本文上文所描述的通过杀伤百分比测量细胞死亡。

图8B是示出图8A的模板化二聚化设计的杀伤活性百分比的图。数据显示，当在Jurkat中表达时，用500nM达诺瑞韦(DNCR2-casp-9)或500nM格佐匹韦(GNCR1-casp-9)处理在不同程度上诱导Jurkat死亡。NS3a的所有同源寡聚支架用DNCR2-casp-9诱导了强烈的死亡，但只有CAR-NS3a和六聚体-NS3a用GNCR1-casp-9诱导了适度的死亡。这可能是由于当与DNCR2对达诺瑞韦/NS3a复合物的高亲和力相比，GNCR1对格佐匹韦/NS3a复合物的较低亲和力(参见Foight,G.W.等人,《自然生物技术》(2019)37:1209-1216)。最佳的两种支架，CAR-NS3a和具有DNCR2-casp-9的二聚体-NS3a诱导与iCasp9相当的杀伤。具有达诺瑞韦或格佐匹韦处理DNCR2-casp-9和GNCR1-casp-9在没有支架NS3a的情况下没有诱导Jurkat死亡。

为了进一步减小CAR构建体的大小，使用罗塞塔蛋白(Rosetta protein)设计，通过修剪螺旋的长度和数量来设计DNCR2的最小化版本。图9A是用于最小化的DNCR2版本D1和D9的模型的示意图。D1和D2的模型显示为与达诺瑞韦/NS3a的复合物，紧接着全长DNCR2/达诺瑞韦/NS3a。

DNCR2的小型化版本D1和D9与胱天蛋白酶-9融合，并且在Jurkat细胞中与同源寡聚化的NS3a支架共表达。还评估了包含NS3a(CAR-2xNS3a)的另外的拷贝的CAR构建体。将原始DNCR2-casp-9用作对照。将表达与胱天蛋白酶-9融合的不同DNCR2变体以及CAR-NS3a、CAR-NS3a-NS3a或二聚体-NS3a的Jurkat细胞用500nM达诺瑞韦处理，并且如本文上文所描述的通过杀伤百分比来测量细胞死亡。

图9B是示出图9A的小型化设计的杀伤活性百分比的图。数据显示，当与胱天蛋白酶-9融合并与同源寡聚化的NS3a支架共表达时，最小化的DNCR2版本D1和D9诱导的Jurkat死亡与原始DNCR2-casp-9相当。通过将NS3a的另外的拷贝与CAR构建体(CAR-2xNS3a)融合进一步增加了杀伤。

探索了其它人杀伤结构域在Jurkat和原代人T细胞中诱导细胞死亡的能力。将FKBP-F36V与一组杀伤结构域融合，所述杀伤结构域包含胱天蛋白酶-9D330A、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-4和坏死性凋亡诱导蛋白RIPK3。简而言之，表达FKBP(F36V)融合的杀伤结构域的Jurkat和原代人CD4+/CD8+T细胞用10nM利米多赛处理，并且如本文上文所描述的通过杀伤百分比来测量细胞死亡。

图10是一对图，并且分别示出了Jurkat和原代T细胞的杀伤百分比，在一系列转导水平上表达FKBP(F36V)融合的杀伤结构域。EGFP百分比(％EGFP)表示杀伤结构域的不同转导水平。数据显示，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-9的低基础活性突变体D330A在两种细胞类型中都诱导了类似的杀伤。这种杀伤与具有表达杀伤开关的慢病毒构建体的细胞的转导水平成比例，如通过EGFP转导标志物阳性的细胞的百分比所测量的。RIPK3(一种坏死诱导蛋白)在此测定中不能诱导细胞死亡。通过延伸，胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-4可能与胱天蛋白酶-9功能类似，用DNCR/NS3a二聚体系统诱导细胞死亡。

Claims

1.一种融合蛋白，其包括与二聚化结构域可操作地连接的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括包含抗原感测结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且其中所述嵌合多肽在细胞内与所述二聚化结构域可操作地连接。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述嵌合多肽包括T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或嵌合受体。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述抗原感测结构域包括以下中的一种或多种：

重链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合；

重链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合和轻链可变区的三个互补决定区(CDR)的集合；

基于纤连蛋白的支架；

其中抗原感测区与靶抗原特异性结合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原感测区包括从哺乳动物序列分离的或源自其的一个或多个序列。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原感测区包括从人序列分离的或源自其的一个或多个序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原感测区包括人源化或全人抗体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原感测区包括单链可变片段(scFv)。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞外结构域进一步包括铰链区、间隔子序列或安全开关中的一个或多个。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述铰链区包括从CD4(分化簇4)多肽、CD8(分化簇8)多肽或CD28(分化簇28)多肽分离的或源自其的序列。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述铰链区包括从人序列分离的或源自其的序列。

11.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述间隔子序列包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。

12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述间隔子序列包括从人序列分离的或源自其的序列。

13.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述安全开关包括从表皮生长因子受体(EGFR)多肽分离的或源自其的序列。

14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述安全开关包括截短的EGFR(EGFRt)多肽。

15.根据权利要求13或14所述的融合蛋白，其中所述安全开关包括从人序列分离的或源自其的序列。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。

17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述跨膜结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞内结构域包括一个或多个共刺激结构域。

19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述一个或多个共刺激结构域包括从CD3ζ(分化簇3ζ)多肽分离的或源自其的序列。

20.根据权利要求18或19所述的融合蛋白，其中所述一个或多个共刺激结构域包括从以下分离的或源自其的序列：CD28多肽、4-1BB(分化簇137)多肽、ICOS(诱导型T细胞共刺激分子)多肽、OX40多肽或CD27(分化簇27)多肽。

21.根据权利要求18或19所述的融合蛋白，其中所述一个或多个共刺激结构域包括：

(a)第一共刺激结构域，所述第一共刺激结构域包括从CD28多肽、4-1BB多肽或ICOS多肽分离的或源自其的序列；以及

(b)第二共刺激结构域，所述第二共刺激结构域包括从4-1BB多肽、OX40多肽或CD27多肽分离的或源自其的序列。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述一个或多个共刺激结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述嵌合多肽包括进一步包括诱导型细胞因子结构域的细胞内结构域。

24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述诱导型细胞因子结构域包括能够诱导IL-12细胞因子的表达的经激活的T细胞的核因子(NFAT)多肽。

25.根据权利要求1至21中任一项所述的融合蛋白，其中所述嵌合多肽包括进一步包括细胞因子受体的细胞内结构域的细胞内结构域。

26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中细胞因子受体的所述细胞内结构域包括IL-2受体β(IL-2Rβ)链片段。

27.根据权利要求25或26所述的融合蛋白，其中所述嵌合多肽包括进一步包括信号转导子和转录激活子(STAT3/5)结合基序的细胞内结构域。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的融合蛋白，其中所述嵌合多肽包括进一步包括至少一个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)序列的细胞内结构域。

29.根据权利要求1至27中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基到羧基末端包括所述嵌合多肽、接头和所述二聚化结构域。

30.根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述接头包括以下中的一种或多种：DNA序列、RNA序列、氨基酸序列和聚合物。

31.根据权利要求29或30所述的融合蛋白，其中：

所述接头包括序列GGGGS；或

所述接头包括介于2个与20个氨基酸之间的长度；或

所述接头包括包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的序列。

32.根据权利要求29或30所述的融合蛋白，其中所述接头包括寡聚化结构域。

33.根据权利要求32所述的融合蛋白，其中所述寡聚化结构域包括以下序列：

TRRKQEMKRLKKEMEKIREETEEVKKEIEESKKRPQSESAKNLILIMQLLI NQIRLLALQIRMLALQLQE(五聚体)；或

TEDEIRKLRKLLEEAEKKLKKLEDKTRRSEEISKTDDDPKAQSLQLIAESL MLIAESLLIIAISLLLSSRNG(六聚体)。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括NS3a多肽。

35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述NS3a多肽包括以下序列：(a)

MAKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLLGCIITSATGRDKNQVDGEVQVLSTATQSFLATCVNGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPVSYLKGSAGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVESMETTMRSP；或

(b)

MKKKGSVVIVGRINLSGDTAYSQQTRGLEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP；或

(c)

KKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP。

36.根据权利要求1至33中任一项所述的融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括DNCR多肽。

37.根据权利要求36所述的融合蛋白，其中所述DNCR多肽包括序列SSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH.。

38.根据权利要求1至33中任一项所述的融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

39.根据权利要求38所述的融合蛋白，其中所述GNCR多肽包括序列DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKS.。

40.根据权利要求1至33中任一项所述的融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括apoNS3a阅读子(ANR)多肽。

41.根据权利要求40所述的融合蛋白，其中所述ANR多肽包括序列GELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNF。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的融合蛋白，其进一步包括杀伤结构域。

43.根据权利要求42所述的融合蛋白，其中所述杀伤结构域包括从以下分离的或源自其的序列：胱天蛋白酶-9(Cas9)多肽、胱天蛋白酶-1(Cas1多肽)、胱天蛋白酶-4(Cas4)多肽、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1(RIPK1)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3(RIPK3)多肽或其催化结构域。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的融合蛋白，其进一步包括可切割肽。

45.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述可切割肽包括P2A序列或T2A序列。

46.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述P2A序列包括序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP.。

47.根据权利要求45所述的融合蛋白，其中所述T2A序列包括序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPG.。

48.一种核酸，其编码根据权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白。

49.根据权利要求48所述的核酸，其进一步包括内部核糖体进入序列(IRES)。

50.根据权利要求49所述的核酸，其中所述IRES包括序列CCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCC.。

51.根据权利要求48至50中任一项所述的核酸，其进一步包括以下中的一种或多种：启动子、增强子、内含子、外显子、非翻译区(UTR)和翻译后调控元件(PRE)。

52.根据权利要求51所述的核酸，其中所述启动子包括诱导型启动子。

53.根据权利要求52所述的核酸，其中所述诱导型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：YB_TATA启动子、人β珠蛋白启动子(huBG)、minIL2启动子、最小CMV(minCMV)启动子和TRE3G启动子。

54.根据权利要求51所述的核酸，其中所述启动子包括组成型启动子。

55.根据权利要求54所述的核酸，其中所述组成型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：MND启动子、hPGK启动子、CMV启动子、CAG启动子、SFFV启动子、EF1α启动子、UBC启动子和CD43启动子。

56.一种载体，其包括根据权利要求48至55中任一项所述的核酸。

57.根据权利要求56所述的载体，其中所述载体包括能够驱动哺乳动物细胞中的核酸的表达的表达载体。

58.根据权利要求57所述的载体，其中所述表达载体包括质粒。

59.根据权利要求56所述的载体，其中所述载体包括能够将所述核酸引入到哺乳动物细胞的递送载体。

60.根据权利要求56所述的载体，其中所述递送载体包括以下中的一种或多种：病毒载体、非病毒载体、脂质体、胶束、聚合物囊泡和纳米颗粒。

61.根据权利要求60所述的载体，其中所述病毒载体包括从病毒基因组分离的或源自其的一个或多个序列。

62.一种细胞，其包括根据权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55中任一项所述的核酸或根据权利要求56至61中任一项所述的载体。

63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

64.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。

65.根据权利要求62至64中任一项所述的细胞，其中所述细胞是体细胞。

66.根据权利要求62至64中任一项所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。

67.根据权利要求66所述的细胞，其中所述细胞不是人胚胎干细胞。

68.根据权利要求62至67中任一项所述的细胞，其中所述细胞是离体的或体外的。

69.根据权利要求62至67中任一项所述的细胞，其中所述细胞是体内的。

70.根据权利要求60至67中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

71.根据权利要求70所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或其前体。

72.根据权利要求71所述的细胞，其中所述前体是造血干细胞(HSC)。

73.一种组合物，其包括根据权利要求1至47中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55中任一项所述的核酸、根据权利要求56至61中任一项所述的载体或根据权利要求62至72中任一项所述的细胞。

74.一种药物组合物，其包括根据权利要求72所述的组合物以及药学上可接受的载体。

75.一种第二融合蛋白，其包括与二聚化结构域可操作地连接的信号传导结构域，其中

(a)在存在小分子诱导物的情况下，所述二聚化结构域能够与权利要求1至47中任一项的第一融合蛋白的所述二聚化结构域形成二聚体，或

(b)在存在抑制剂的情况下，包括所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域和所述第一融合蛋白的所述二聚化结构域的二聚体可被破坏。

76.根据权利要求75所述的第二融合蛋白，其进一步包括衔接子序列、跨膜结构域和共刺激结构域中的一个或多个。

77.根据权利要求76所述的第二融合蛋白，其中所述衔接子序列包括从DAP10多肽分离的或源自其的序列。

78.根据权利要求76或77所述的第二融合蛋白，其中所述跨膜结构域包括从CD4多肽、CD8多肽、CD28多肽分离的或源自其的序列。

79.根据权利要求78所述的第二融合蛋白，其中所述跨膜结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

80.根据权利要求75至79中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述共刺激结构域包括从CD3ζ(分化簇3ζ)多肽分离的或源自其的序列。

81.根据权利要求75至80中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述共刺激结构域包括从以下分离的或源自其的序列：CD28多肽、4-1BB多肽、ICOS多肽、OX40多肽或CD27多肽。

82.根据权利要求80或81所述的第二融合蛋白，其中所述共刺激结构域包括从人序列分离的或源自其的序列。

83.根据权利要求75至82中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述融合蛋白从氨基到羧基末端包括所述二聚化结构域、接头和调控结构域。

84.根据权利要求83所述的第二融合蛋白，其中所述接头包括以下中的一种或多种：DNA序列、RNA序列、氨基酸序列和聚合物。

85.根据权利要求83或84所述的第二融合蛋白，其中：

所述接头包括序列GGGGS；或

所述接头包括介于2个与20个氨基酸之间的长度；或

所述接头包括包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的序列。

86.根据权利要求84或85所述的第二融合蛋白，其中所述接头包括寡聚化结构域。

87.根据权利要求86所述的第二融合蛋白，其中所述寡聚化结构域包括以下序列：

88.根据权利要求75至87中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括NS3a多肽。

89.根据权利要求88所述的第二融合蛋白，其中所述NS3a多肽包括以下序列：

(a)

(b)

(c)

KKKGSVVIVGRINLSGDTAYAQQTRGEEGCQETSQTGRDKNQVEGEVQIVSTATQTFLATSINGVLWTVYHGAGTRTIASPKGPVTQMYTNVDKDLVGWQAPQGSRSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSAGGPLLCPAGHAVGIFRAAVSTRGVAKAVDFIPVESLETTMRSP.。

90.根据权利要求88或89所述的第二融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包括包含DNCR多肽、GNCR多肽或ANR多肽的二聚化结构域。

91.根据权利要求75至87中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括DNCR多肽。

92.根据权利要求91所述的第二融合蛋白，其中所述DNCR多肽包括序列

SSDEEEARELIERAKEAAERAQEAAERTGDPRVRELARELKRLAQEAAEEVKRDPSSSDVNEALKLIVEAIEAAVDALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSSDVNEALHSIVYAIEAAIFALEAAERTGDPEVRELARELVRLAVEAAEEVQRNPSSRNVEHALMRIVLAIYLAEENLREAEESGDPEKREKARERVREAVERAEEVQRDPSGWLNH.。

93.根据权利要求75至87中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

94.根据权利要求93所述的第二融合蛋白，其中所述GNCR多肽包括序列

DIEKLCKKAEEEAKEAQEKADELRQRHPDSQAAEDAEDLANLAVAAVLTACLLAQEHPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAARAVILAIMLAAENPNADIAKLCIKAASEAAEAASKAAELAQRHPDSQAARDAIKLASQAAEAVERAIWLAAENPNADIAKKCIKAASEAAEEASKAAEEAQRHPDSQKARDEIKEASQKAEEVKERCKS.。

95.根据权利要求75至87中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述二聚化结构域包括apo NS3a阅读子(ANR)多肽。

96.根据权利要求95所述的第二融合蛋白，其中所述ANR多肽包括序列GELDELVYLLDGPGYDPIHSDVVTRGGSHLFNF.。

97.根据权利要求91至96中任一项所述的第二融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域。

98.根据权利要求75至97中任一项所述的第二融合蛋白，其进一步包括杀伤结构域。

99.根据权利要求98所述的第二融合蛋白，其中所述杀伤结构域包括从以下分离的或源自其的序列：Cas9多肽、Cas1多肽、Cas4多肽、RIPK1多肽、RIPK3多肽或其催化结构域。

100.根据权利要求75至99中任一项所述的第二融合蛋白，其进一步包括可切割肽。

101.根据权利要求100所述的第二融合蛋白，其中所述可切割肽包括P2A序列或T2A序列。

102.根据权利要求101所述的第二融合蛋白，其中所述P2A序列包括序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP.。

103.根据权利要求102所述的第二融合蛋白，其中所述T2A序列包括序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPG.。

104.一种核酸，其编码根据权利要求75至103中任一项所述的第二融合蛋白。

105.根据权利要求104所述的核酸，其进一步包括内部核糖体进入序列(IRES)。

106.根据权利要求105所述的核酸，其中所述IRES包括序列CCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCC.。

107.根据权利要求104至106中任一项所述的核酸，其进一步包括以下中的一种或多种：启动子、增强子、内含子、外显子、非翻译区(UTR)和翻译后调控元件(PRE)。

108.根据权利要求107所述的核酸，其中所述启动子包括诱导型启动子。

109.根据权利要求108所述的核酸，其中所述诱导型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：YB_TATA启动子、人β珠蛋白启动子(huBG)、minIL2启动子、最小CMV(minCMV)启动子和TRE3G启动子。

110.根据权利要求107所述的核酸，其中所述启动子包括组成型启动子。

111.根据权利要求110所述的核酸，其中所述组成型启动子包括从以下分离的或源自其的序列：MND启动子、hPGK启动子、CMV启动子、CAG启动子、SFFV启动子、EF1α启动子、UBC启动子和CD43启动子。

112.一种载体，其包括根据权利要求104至111中任一项所述的核酸。

113.根据权利要求112所述的载体，其中所述载体包括能够驱动哺乳动物细胞中的核酸的表达的表达载体。

114.根据权利要求113所述的载体，其中所述表达载体包括质粒。

115.根据权利要求112所述的载体，其中所述载体包括能够将所述核酸引入到哺乳动物细胞的递送载体。

116.根据权利要求112所述的载体，其中所述递送载体包括以下中的一种或多种：病毒载体、非病毒载体、脂质体、胶束、聚合物囊泡和纳米颗粒。

117.根据权利要求115所述的载体，其中所述病毒载体包括从病毒基因组分离的或源自其的一个或多个序列。

118.一种细胞，其包括根据权利要求75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求104至111中任一项所述的核酸或根据权利要求112至117中任一项所述的载体。

119.根据权利要求118所述的细胞，其进一步包括小分子诱导物。

120.根据权利要求119所述的细胞，其中所述小分子诱导物包括达诺瑞韦(danoprevir)。

121.根据权利要求120所述的细胞，其中所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括DNCR多肽。

122.根据权利要求119所述的细胞，其中所述小分子诱导物包括格佐匹韦(grazoprevir)。

123.根据权利要求122所述的细胞，其中所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

124.根据权利要求118所述的细胞，其进一步包括抑制剂。

125.根据权利要求124所述的细胞，其中所述抑制剂包括NS3a抑制剂。

126.根据权利要求124或125所述的细胞，其中所述抑制剂包括小分子。

127.根据权利要求124至126中任一项所述的组合物，其中

(a)所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域；或

(b)所述第一融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域；并且

其中所述抑制剂包括达诺瑞韦或格佐匹韦。

128.根据权利要求118至127中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

129.根据权利要求128所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。

130.根据权利要求118至129中任一项所述的细胞，其中所述细胞是体细胞。

131.根据权利要求118至129中任一项所述的细胞，其中所述细胞是干细胞。

132.根据权利要求131所述的细胞，其中所述细胞不是人胚胎干细胞。

133.根据权利要求118至132中任一项所述的细胞，其中所述细胞是离体的或体外的。

134.根据权利要求118至132中任一项所述的细胞，其中所述细胞是体内的。

135.根据权利要求118至134中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

136.根据权利要求135所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或其前体。

137.根据权利要求136所述的细胞，其中所述前体是造血干细胞(HSC)。

138.一种组合物，其包括根据权利要求75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求104至111中任一项所述的核酸、根据权利要求112至117中任一项所述的载体或根据权利要求118至137中任一项所述的细胞。

139.根据权利要求138所述的组合物，其进一步包括小分子诱导物。

140.根据权利要求139所述的组合物，其中所述小分子诱导物包括达诺瑞韦。

141.根据权利要求140所述的组合物，其中所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括DNCR多肽。

142.根据权利要求139所述的组合物，其中所述小分子诱导物包括格佐匹韦。

143.根据权利要求142所述的组合物，其中所述第一融合蛋白或所述第二融合蛋白的所述二聚化结构域包括GNCR多肽。

144.根据权利要求138所述的组合物，其进一步包括抑制剂。

145.根据权利要求144所述的组合物，其中所述抑制剂包括NS3a抑制剂。

146.根据权利要求144或145所述的组合物，其中所述抑制剂包括小分子。

147.根据权利要求144至146中任一项所述的组合物，其中

(c)所述第一融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域；或

(d)所述第一融合蛋白包括包含ANR多肽的二聚化结构域，并且所述第二融合蛋白包括包含NS3a多肽的二聚化结构域；并且

其中所述抑制剂包括达诺瑞韦或格佐匹韦。

148.一种药物组合物，其包括根据权利要求138至147中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。

149.一种根据权利要求1至47或75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55或104至111中任一项所述的核酸、根据权利要求56至61或112至117中任一项所述的载体、根据权利要求62至72或118至137中任一项所述的细胞、根据权利要求73或138至147中任一项所述的组合物或根据权利要求74或148所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。

150.一种根据权利要求1至47或75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55或104至111中任一项所述的核酸、根据权利要求56至61或112至117中任一项所述的载体、根据权利要求62至72或118至137中任一项所述的细胞、根据权利要求73或138至147中任一项所述的组合物或根据权利要求74或148所述的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。

151.根据权利要求149或150所述的用途，其中所述疾病或病症包括以下中的一种或多种：自身免疫性疾病或病症；炎性疾病或病症；免疫缺陷疾病或病症；缺血性疾病或病症；血液疾病或病症；骨病或病症；神经系统疾病或病症；心脏病或病症；血管疾病或病症；代谢疾病或病症；皮肤疾病或病症；消化系统疾病或病症；线粒体疾病或病症；肌肉疾病或病症；肝病或病症；肾病或病症；听力疾病或病症；眼科疾病或病症；以及增殖性疾病或病症。

152.根据权利要求149或150所述的用途，其中所述疾病或病症包括癌症。

153.根据权利要求149至152中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症包括由传染病引起的感染或疾病或病症。

154.根据权利要求149至152中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症包括遗传性疾病或病症。

155.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至47或75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55或104至111中任一项所述的核酸、根据权利要求56至61或112至117中任一项所述的载体、根据权利要求62至72或118至137中任一项所述的细胞、根据权利要求73或138至147中任一项所述的组合物或根据权利要求74或148所述的药物组合物，其中所述疾病或病症的体征或症状的严重程度降低，由此治疗所述疾病或病症。

156.一种预防疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至47或75至103中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求48至55或104至111中任一项所述的核酸、根据权利要求56至61或112至117中任一项所述的载体、根据权利要求62至72或118至137中任一项所述的细胞、根据权利要求73或138至147中任一项所述的组合物或根据权利要求74或148所述的药物组合物，其中所述疾病或病症的体征或症状的发作或复发被延迟或被抑制，由此预防所述疾病或病症。

157.根据权利要求155或156所述的方法，其中所述疾病或病症包括以下中的一种或多种：自身免疫性疾病或病症；炎性疾病或病症；免疫缺陷疾病或病症；缺血性疾病或病症；血液疾病或病症；骨病或病症；神经系统疾病或病症；心脏病或病症；血管疾病或病症；代谢疾病或病症；皮肤疾病或病症；消化系统疾病或病症；线粒体疾病或病症；肌肉疾病或病症；肝病或病症；肾病或病症；听力疾病或病症；眼科疾病或病症；以及增殖性疾病或病症。

158.根据权利要求155或156所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症。

159.根据权利要求155至158中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括由传染病引起的感染或疾病或病症。

160.根据权利要求155至158中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括遗传性疾病或病症。