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CN117510640B - 一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用 - Google Patents

一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用 Download PDF

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CN117510640B CN202311379984.4A CN202311379984A CN117510640B CN 117510640 B CN117510640 B CN 117510640B CN 202311379984 A CN202311379984 A CN 202311379984A CN 117510640 B CN117510640 B CN 117510640B
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Abstract

本发明公开了一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述纳米抗体能够识别玉米赤霉烯酮，且具有优异的有机溶剂耐受性和酸碱耐受性，可用于玉米赤霉烯酮的检测或用于制备相应的检测产品。进一步地，本发明基于所述纳米抗体还提供一种检测玉米赤霉烯酮的NHS磁珠‑微流控免疫检测方法，该方法对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，灵敏度高，操作简便，可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测，检测结果准确可靠。

Description

一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是从玉米中发现的由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌均能产生这种毒素。这类霉菌可在多种谷物与饲料上滋生，特别是在温度中等湿度较高的环境可以导致毒素的大量产生。我国畜牧业深受玉米赤霉烯酮的影响，对我国部分地区饲料进行随机采集，发现饲料中ZEN检出率高达90％以上，其中超标率在猪饲料中高达40％。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，可长期存在食物链中，食入后可引起动物急性或慢性中毒、损失机体组织，导致动物繁殖机能异常甚至死亡，给畜牧场造成巨大经济损失，严重威胁动物及人类健康。因此，对饲料和食品中玉米赤霉烯酮检测具有重要意义。
目前，玉米赤霉烯酮的检测主要集中在仪器检测方法和免疫分析方法。仪器检测方法包括高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。由于高灵敏度、操作简单、低成本等优势，酶联免疫吸附测定分析方法(ELISA)、胶体金免疫分析方法(GICA)和时间分辨荧光微球免疫分析方法被广泛应用于玉米赤霉烯酮快速检测。但已报道的上述报道的免疫分析方法均表现为窄的检测范围，无法实现国家最大残留限量浓度范围的广泛检测，这无异于会增加样品前处理的难度和降低方法的准确度。因此，探索一种简单、快速、可实现宽线性范围的免疫分析方法用于玉米赤霉烯酮检测是必要的和紧迫的。
微流控芯片免疫分析通过在芯片上加工出微型通道和其它功能单元以实现抗原和抗体的进样、反应、分离和检测等过程，其最终目标是把一种多功能、快速、高效、试样用量少的微型实验装置应用到免疫分析中以建立微全免疫分析系统。在微流控芯片上进行免疫检测，关键技术是抗体在芯片内的包被与固定，即免疫磁珠与微流控技术的融合。近年来，随着免疫磁珠和微流控技术的发展，形成了将功能化磁珠、抗原/抗体特异性识别和液滴微流控芯片有效结合的免疫磁珠-微流控技术一体化检测技术。与广泛使用的传感器相比，基于免疫磁珠-微流控免疫检测方法，具有仅通过磁力驱动的简单操作，同时实现芯片上多通道高通量检测，读取信号方便快捷的优点，有望在其的基础上建立玉米赤霉烯酮的检测方法可以满足简单、快速、宽线性范围的检测需求。
但免疫磁珠-微流控技术一体化检测技术仍然依赖于抗原与抗体的特异性结合，目前主要以单克隆抗体和多克隆抗体报道为主，此类抗体在极端条件下的稳定性差，容易失活。而纳米抗体克服了传统多克隆和单克隆抗体结构稳定性差、化学溶剂耐受性差等脆弱性，具有突出环境高适应性，且具有高亲和力、高表达、生产周期短、易大量制备而成本低等特点，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化。因此开发一种稳定性好，灵敏度高、能耐有机溶剂并适用于微流控免疫检测的抗玉米赤霉烯酮纳米抗体具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体及其应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过制备人工抗原免疫羊驼获得纳米抗体基因文库，后续通过生物淘筛，从羊驼免疫抗体基因文库中筛选得到了一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体，并将其命名为纳米抗体Nbzel-227。
优选地，所述纳米抗体Nbzel-227包括4个框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)和3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)，4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
优选地，FR1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
本发明还提供了一种编码所述纳米抗体Nbzel-227的基因，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。
本发明还提供了一种重组载体，所述载体中含有编码纳米抗体Nbzel-227的基因。
本发明还提供了一种重组细胞，所述细胞中含有上述重组载体。
由于本发明已给出了纳米抗体Nbzel-227的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组DNA技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。
进一步地，本发明对制备所得的纳米抗体Nbzel-227进行耐受性分析，发现所述纳米抗体Nbzel-227具有良好的热稳定性；优异的有机溶剂耐受性，其在30％的乙腈中，仍保持91％的活性，在50％的甲醇下仍保持80％的活性，而在50％的丙酮中活性提升至156％；优异的耐酸和耐弱碱性，在pH 3.4～9.4范围内，纳米抗体Nbzel-227的仍保持75％以上的活性，在实际样品检测的前处理过程中不会受到有机溶剂以及pH的影响，对玉米赤霉烯酮进行免疫检测的结果准确度高、特异性强、灵敏度高。
因此，本发明还提供所述纳米抗体在检测玉米赤霉烯酮中的应用。
进一步地，本发明还提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测玉米赤霉烯酮产品中的应用。
本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的方法，所述方法为用玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
进一步地，所述玉米赤霉烯酮半抗原的结构式如式(I)所示：
进一步地，所述包被原的结构式如式(Ⅱ)所示：
进一步地，所述载体蛋白为刀豆球蛋白A(ConA)。
具体地，所述包被原被称为ZEL-A-ConA。
本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的开放式液滴阵列微流控芯片，进一步地，所述开放式液滴阵列微流控芯片包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室、第二反应腔室、第三反应腔室和尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述第一反应腔室用于装载待测样品、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液；所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液；所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液。
进一步地，所述磁珠抗原为上述人工抗原与磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的上述抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体；所述缓冲盐溶液为PBS溶液；所述荧光探针溶液为Amplex Red/H2O2。
优选地，所述磁珠抗原为玉米赤霉烯酮人工抗原(ZEL-A-ConA)与NHS磁珠偶联物。
优选地，所述平行通道为15个。
优选地，所述平行通道间距离为5.0mm；连接反应腔室的微流控通道狭缝宽0.5mm。
本发明还提供所述开放式液滴阵列微流控芯片在检测玉米赤霉烯酮中的应用。
本发明还提供一种用于检测玉米赤霉烯酮的微流控免疫检测试剂盒，所述试剂盒含有上述所述磁珠抗原和上述所述酶标抗体。
进一步地，所述试剂盒还包括上述开放式液滴阵列微流控芯片。
进一步地，所述试剂盒还包括PBS溶液、Amplex Red/H2O2液。
本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的微流控免疫检测方法，通过将酶标抗体与磁珠抗原混合，再加入待测溶液，利用直接竞争法，结合凝胶成像，实现对标志物的特异性识别。
进一步地，所述方法为：将游离的待检溶液与磁珠抗原、酶标抗体混合在上述开放式液滴阵列微流控芯片的的第一反应腔室中，在磁铁的牵引下，结合了酶标抗体的磁珠抗原与未结合的磁珠抗原依次进入第二、三反应腔室，在第三反应腔室中结合了酶标抗体的磁珠抗原催化H2O2与底物Amplex Red反应生成荧光物质试卤灵(Resorufin)产生信号输出，根据凝胶成像仪(520nm)和image J软件处理荧光信号进行定量检测。经检验，基于NHS磁珠-微流控的免疫检测方法对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL。
因此，本发明还提供上述检测方法在分子检测领域的应用，所述分子检测领域包括食品质量安全检测和环境污染监测等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述纳米抗体具有良好的热稳定性，优异的有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮)耐受性及优异的耐酸性，不易受有机溶剂以及pH的影响。进一步地，本发明将所述纳米抗体用于检测玉米赤霉烯酮，其操作简单，耗时短，结果准确度高。本发明进一步提供一种检测玉米赤霉烯酮的NHS磁珠-微流控免疫检测方法，该方法操作简单，快速，结果准确可靠，灵敏度高，对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测。
附图说明
图1为纳米抗体Nbzel-227的氨基酸序列及结构域划分示意图。
图2为基于纳米抗体Nbzel-227建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
图3为不同比例有机溶剂/PBS作为稀释液时纳米抗体Nbzel-227的活性曲线图。
图4为纳米抗体Nbzel-227的酸碱耐受性分析结果图。
图5为开放式液滴阵列微流控芯片示意图；A为芯片制作流程，B为芯片详细尺寸图。
图6为基于NHS磁珠-微流控免疫检测方法检测玉米赤霉烯酮建立的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1构建羊驼免疫抗体文库
1、完全抗原ZEL-A-LF和ZEL-A-ConA的制备
本发明所用半抗原的结构式如式(I)所示：
本发明将式(I)所示半抗原通过活泼酯法分别偶联乳铁蛋白(LF)和刀豆球蛋白A(ConA)，制备获得完全抗原ZEL-A-LF和ZEL-A-ConA。其中，ZEL-A-LF为免疫抗原，ZEL-A-ConA为包被原。
所述完全抗原的结构式如式(Ⅱ)所示：
2、羊驼的免疫
用ZEL-A-LF作为免疫抗原对健康的羊驼进行动物免疫，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mg的免疫抗原。首次免疫时，用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后免疫，后续加强免疫用0..5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，之后每间隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。
免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。在第三次免疫后，采集50～100mL外周血，用于构建纳米抗体文库。
3、羊驼淋巴细胞的分离
羊驼外周血采集后需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：
将羊驼外周血与无菌生理盐水在容积为50mL的无RNA酶离心管中以2:1的体积比混合稀释，稀释后用商品化的淋巴细胞分离液进行淋巴细胞分离；在无菌的50mL离心管中加入15mL淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入15mL的稀释血液，800g离心25min；取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下1500g离心10min，弃上清；用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次1500g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞；每份淋巴细胞中加入适量的裂解液(TRNsol)后分装，每1mL作为一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用，用于总RNA的提取。
4、总RNA的提取
采用广州捷倍斯生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(R4105)提取上述分离保存的淋巴细胞总RNA，根据说明书进行操作即可。
提取总RNA后取少许样品，利用核酸电泳对RNA的质量进行检测，同时利用超微量分光光度计(nanodrop)中测定RNA的浓度。理想的RNA样品应完整无降解，从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，且无基因组DNA混杂，在260nm及280nm下的紫外吸收值比值(A260/A280)应在2.0左右。如果出现基因组DNA污染，应在反转录前用DNA酶去除基因组DNA，并再次通过电泳验证基因组DNA已除去且RNA没有在此过程中发生降解；如果RNA已经发生降解，则需要重新提取RNA。RNA应尽快反转录成cDNA或短暂保存在-80℃环境。
5、cDNA的合成
以提取的总RNA为模板，参照Takara公司的第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：
(1)按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；
表1 cDNA合成的第一步反应体系
Total RNA 3μg
Oligo(dT)18primer 1μL
RNase free ddH2O Up to 12μL
(2)按表格配制好反应体系后于65℃孵育5min，冰浴冷却2min；
(3)按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤(2)反应后的体系中加入试剂；
表2 cDNA合成的第二步反应体系
步骤(2)反应后的体系 12μL
5×Reaction Buffer 4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL
10mM dNTP Mix 2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL) 1μL
Total 20μL
(4)配制好反应体系后于42℃孵育60min，70℃孵育5min；反转录产物cDNA于-80℃保存。
6、纳米抗体目的基因的扩增
本发明利用巢式PCR对目的基因进行两步法扩增。
第一轮PCR：以反转录所得cDNA作为第一轮PCR模板，利用引物CALL001/CALL002进行第一轮PCR反应，引物CALL001和CALL002的核苷酸序列如表5所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。
表3巢式PCR第一步反应体系
第一轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，30cycle；72℃10min。
第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物F/R1或引物F/R2进行第二轮PCR反应，引物F、R1和R2的序列如表5所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。
表4第二轮PCR的反应体系
第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min 30cycle；72℃10min。
表5纳米抗体VHH目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列
CALL001 5′-gtcctggctgctcttctacaagg-3′
CALL002 5′-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3′
F 5′-catgccatgactgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc-3′
R1 5′-catgccatgactcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg-3′
R2 5′-catgccatgactcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg-3′
7、基因文库的构建
(1)VHH目标基因及载体的酶切
采用SfiI酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件为50℃恒温反应16h。
pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带；VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。
(2)酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16h后用DNA回收试剂盒清洁回收。
(3)电击转化
取5μL连接产物加入到50μL电转感受态E.coli TG1中，轻轻混匀后转移到0.2cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，电击后立即向电转杯分两次加入800μL和150μL预热到37℃的SOC培养基，收集到无菌离心管中，于37℃，250rpm培养1h复苏细胞。
取50μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100μL涂布于直径90mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120mm的LB-Amp培养皿，每1mL菌液涂布于2～3个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。
统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到107cfu以上，此数目即为纳米抗体基因文库的库容量。
将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，离心收集菌体，弃上清后重新加入LB-Amp液体培养基(每电转一管加入0.5mL)重悬，混合均匀后加入终浓度为25％的无菌甘油(v/v)，取50μL菌液进行梯度稀释后测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存，即为纳米抗体基因库。
8、噬菌体救援
根据上述转基因大肠杆菌细胞数测定结果接种10倍库容量以上的细胞于150mL的LB-Amp液体培养基中，控制OD600＜0.2，37℃下250rpm培养至对数期(OD600约0.4～0.6)；加入1mL滴度为1012cfu/mL以上的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入Kana(卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)37℃，250rpm培养过夜。将菌液转移到离心瓶，12000rpm 4℃离心15min，取上清，加入1/4体积的PEG/NaCl，冰浴2.5h以上。12000rpm 4℃离心15min，弃上清，沉淀用750μL TBS重悬，转移到1.5mL离心管，4000rpm25℃离心5min，过0.22μm聚醚砜滤膜。取10μL噬菌体测定滴度，其余混合均匀后加入终浓度50％的无菌甘油(v/v)，-80℃保存，即为纳米抗体噬菌体库，可直接用于亲和淘选。
实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
1、纳米抗体的亲和淘选
(1)抗原和载体蛋白固定化
亲和淘选使用吸附力较强的强吸附酶标板，每轮淘选包板1列，共4轮包板4列。以式(I)所示半抗原通过活泼酯法偶联刀豆球蛋白A(ConA)后制备所得的完全抗原ZEL-A-ConA作为检测抗原。
AB孔用包被原刀豆球蛋白A(刀豆球蛋白A)稀释至1mg/mL，CDEF孔用CB包被液将检测抗原ZEL-A-ConA稀释至10μg/mL，加入强吸附板微孔中，每孔100μL，37℃静置过夜。此外，因羊驼可能免疫过多种载体蛋白，将乳铁蛋白(LF)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)三种免疫载体蛋白混合稀释，使终浓度均为2mg/mL，单独包被1列免疫原载体蛋白孔。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％ Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 1％鱼胶蛋白溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。
(2)阳性噬菌体筛选
将实施例1的噬菌体文库加入到2个免疫原载体蛋白孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h(仅第1轮需要此步骤，第2，3，4轮直接从AB孔开始)。将游离噬菌体转移到包被原载体蛋白AB孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h。将游离噬菌体转移到3个有固定化抗原(ZEL-A-ConA)的微孔中，每孔100μL，37℃震荡孵育1h。弃去孔中游离的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次。加入100μL 10mg/mL的胰蛋白酶-TBS溶液37℃洗脱30min。收集噬菌体，取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于侵染5mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、三、四轮的淘选过程中，ZEL-A-ConA的包板浓度分别降到1000ng/mL、500ng/mL和100ng/mL，重复步骤(2)的筛选方案。用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。药物洗脱浓度分别1000ng/mL、500ng/mL和100ng/mL。以上条件可以根据实际免疫情况进行调整，如果血清效价较低，可以适当提高淘选时的检测抗原ZEL-A-ConA浓度；如果抑制率较低，则需适当提高竞争反应的药物浓度。
2、阳性克隆的鉴定
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：
(1)抗原固定化
检测抗原ZEL-A-ConA用包被液稀释至1μg/mL，每孔100μL，37℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％ Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 2％的脱脂奶粉溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。
(2)纳米抗体小量表达
从第3、4轮淘选的output滴度测定平板上每轮随机挑选96个单菌落，接种到每孔装有0.5mL LB-Amp的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃，180rpm培养过夜，作为菌液“母板”。
从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母板对应，37℃，180rpm培养4h至对数期，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。
(3)酶联免疫鉴定阳性克隆
将培养过夜的加入IPTG的深孔板4000rpm，10min离心，加入50μL上清到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％ H2SO4，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆进行阳性纳米抗体的鉴定。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的玉米赤霉烯酮标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min，加入50μL终止液(10％H2SO4，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。
选取在板1中OD值大于阴性对照孔3倍，且具有明显抑制的克隆，记录其为Nbzel-227菌株，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。
实施例3纳米抗体Nbzel-227编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
1、实验方法
将经过间接竞争ELISA鉴定获得的纳米抗体Nbzel-227的菌株送到测序公司进行测序，获得纳米抗体Nbzel-227的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得纳米抗体Nbzel-227的氨基酸序列。
2、实验结果
纳米抗体Nbzel-227的VHH的氨基酸序列如下(SEQ ID No.1)所示：
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSINALGWFRQAPGQEREAVAAISIRDGRIYYADSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCNAPKGSYSDSYYYTRILNNDYWGQGTQVTVSSAHHSEDPH
纳米抗体Nbzel-227的氨基酸编号及结构域示意图如图1所示，由图可以看出，所述纳米抗体Nbzel-227包括4个框架区(Framework region，FR)和3个互补决定区(Complementarity-determiningregion，CDR)。4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。其中，第1～25位氨基酸序列为FR1，其氨基酸序列为QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS(SEQ ID No.3)；第26～33位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸序列为GGTFSINA(SEQ ID No.7)；第34～50位氨基酸序列为FR2，其氨基酸序列为LGWFRQAPGQEREAVAA(SEQ ID No.4)；第51～58位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸序列为ISIRDGRI(SEQ ID No.8)；第59～96位氨基酸序列为FR3，其氨基酸序列YYADSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC(SEQ ID No.5)；第97～117位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸序列为NAPKGSYSDSYYYTRILNNDY(SEQ-ID-No.9)；第118～136位氨基酸序列为FR4，其氨基酸序列为WGQGTQVTVSSAHHSEDPH(SEQ ID No.6)。
纳米抗体Nbzel-227的核苷酸序列如下(SEQ ID No.2)所示：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGGTACCTTCAGTATCAATGCCCTGGGCTGGTTTCGCCAGGCGCCGGGCCAGGAACGCGAAGCGGTGGCGGCGATTAGTATTCGTGATGGTAGGATATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGGCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCCGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAACGCACCCAAGGGGAGTTATAGCGATAGTTACTACTACACGAGGATTCTCAATAATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCCAT
实施例4纳米抗体Nbzel-227的大量制备
本发明以蛋白表达的形式大量制备纳米抗体Nbzel-227，具体方法为：
用试剂盒提取纳米抗体Nbzel-227菌株的质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coli BL21(DE3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(含Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于750mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD600nm约为0.4～0.6时，加入IPTG(1:1000比例，v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体Nbzel-227。
实施例5利用纳米抗体Nbzel-227检测玉米赤霉烯酮
1、包被及封闭
用包被液将ZEL-A-ConA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入1％鱼胶蛋白溶液，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h，用密封袋装于4℃待用。
2、检测玉米赤霉烯酮
(1)实验方法
用包被液将ZEL-A-ConA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入120μL/孔2％的脱脂奶粉溶液，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的玉米赤霉烯酮标准，37℃条件下孵育40min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL的终止液(10％ H2SO4，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以玉米赤霉烯酮标准品的浓度为横坐标，B/B0(玉米赤霉烯酮)的孔的OD450/未加入玉米赤霉烯酮的孔的OD450为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于纳米抗体Nbzel-227建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图2所示，由图可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，针对玉米赤霉烯酮的半数抑制(IC50)分别为1.06ng/mL，线性范围分别为0.48～2.36ng/mL,最低检测限(LOD)分别为0.25ng/mL。
实施例6纳米抗体Nbzel-227的有机耐受性分析
(1)实验方法
用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％)的甲醇与PBS的混合液，和不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％)的丙酮作为稀释液，和不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％)的乙腈作为稀释液，将纳米抗体Nbzel-227稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对有机溶剂耐受能力。具体方法为：
将50μL的稀释好的纳米抗体Nbzel-227和50μL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H2SO4，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。
(2)实验结果
不同比例有机溶剂/PBS作为稀释液时，纳米抗体Nbzel-227的活性曲线图如图3所示，由图可以看出，随着有机浓度的提高，纳米抗体Nbzel-227的活性逐渐上升，直至30％的有机溶剂，活性才开始逐渐下降。在30％的乙腈中，仍保持91％的活性。甚至在50％的甲醇下仍保持80％的活性，而在50％的丙酮还能活性提升至156％。表明该纳米抗体Nbzel-227具有良好的有机溶剂耐受性，在实际样品检测的前处理过程中，可以添加高浓度的有机溶剂溶液。
实施例7纳米抗体在不同pH条件下的活性测定
(1)实验方法
用不同pH值(1.4，3.4，5.4，7.4，9.4，11.4)的0.01M PBS作为抗体稀释液。将纳米抗体Nbzel-227稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对甲醇耐受能力。具体方法为：
将50μL的稀释好的纳米抗体Nbzel-227和50μL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％ H2SO4，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。
(2)实验结果
测定结果如图4所示，由图可以看出，在pH 3.4～9.4范围内，纳米抗体Nbzel-227的仍保持75％以上的活性，甚至在酸性条件下(pH＝3.4～5.4)内，纳米抗体的活性提高，在pH＝5.4，结合活性提高至160％，结果表明纳米抗体Nbzel-227具有良好的耐酸和耐弱碱性，纳米抗体Nbzel-227更适合在酸性与弱碱性环境下工作。
实施案例8一种检测玉米赤霉烯酮的开放式液滴阵列微流控芯片
本发明所述开放式液滴阵列微流控芯片的制作，具体方法为：
所述芯片设计图如图5A，采用铸模工艺制得。首先，利用Auto CAD设计液滴阵列微流控芯片，并将其转换成计算机数控加工合金模具。PDMS前驱体以1:10比例的交联剂-碱制备(Sylgard 180，道康宁公司)。随后将其倒入该模具中，经真空泵排气泡后，放入烘箱在60℃条件下烘制3h，再在高温下进行疏水涂层处理，从而得到液滴阵列微流控芯片。
所述芯片如图5B包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道通过微流控通道狭缝设有依次相连的3个反应腔室和1个尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述芯片平行通道为15个；平行通道间距离为5.0mm；连接反应腔室的微流控通道狭缝宽0.5mm；第一反应腔室加入待测溶液、磁珠抗原和酶标抗体的混合溶液，第二反应腔室中加入PBS液滴，第三反应腔室中加入有显色底物Amplex Red/H2O2液滴；所述磁珠抗原为玉米赤霉烯酮人工抗原ZEL-A-ConA与NHS磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记实施例3所述的抗玉米赤霉烯酮纳米抗体Nb227。
实施例9基于NHS磁珠的玉米赤霉烯酮抗原-磁珠偶联物的制备
根据Beaver Beads Mag NHS的使用说明制备抗原-磁珠偶联物，具体方法为：
1、磁珠清洗：取500μL NHS磁珠于1.5mL离心管中，再将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；加入少量预冷的1mM盐酸溶液，混合均匀；将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
2、生物配体固定：加500μL抗原溶液(ZEL-A-ConA，31.25μg/mL)于上述离心管中与磁珠混合均匀。置于垂直混合仪上混合反应1h；采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
3、磁珠封闭：加500μL 3M乙醇胺于上述离心管中，洗涤磁珠4次，于垂直混合仪中封闭反应2h；然后加少量超纯水于离心管中，充分混合，用磁力分离架富集磁珠，弃上清液。
4、保存：加入少量含0.05％叠氮化钠的PBS缓冲溶液于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；加入少量0.05％叠氮化钠的PBS缓冲溶液于离心管中，4℃保存备用。
实施例10酶标抗体的制备
本发明所述酶标抗体的制备，具体方法为：
采用改良的过碘酸钠法制备酶标抗体HRP-Nb227，具体步骤为：称取5mg HRP，溶解于500μL醋酸盐缓冲液(pH 5.6)中。滴加100μL高碘酸钠溶液，低温搅拌30min。然后，依次向混合物中加入500μL乙二醇和30μL纳米抗体Nb227(0.272mg/mL)，各30min。反应完成后取出并在CBS溶液(pH 9.6)中透析过夜。将上述混合物与少量硼氢化钠溶液(5mg/mL)混合并反应2h。添加等量的饱和硫酸铵溶液以沉淀缀合物。反应30min，静置1h，低温离心20min(4500r/min)，留下沉淀。将沉淀用少量PBS(pH 7.4)溶解，装入透析袋中，在PBS溶液中透析过夜，收集上清即为HRP-Nb227。
实施例11一种用于检测玉米赤霉烯酮的NHS磁珠-微流控免疫检测方法
1、检测步骤
首先，向每个液滴阵列微流控芯片中注入400μL矿物油。然后，待测溶液与酶标抗体(1:1，v/v))的混合液30μL，PBS(0.1mol/L)与HRP-Nb227的混合液(1:1，v/v))的混合液30μL分别添加到两个平行通道的第一反应腔室中；将1.5μL制备好的磁珠抗原加入上述反应腔室中，37℃孵育30min；在第二反应室和第三反应腔室中分别加入30μL PBS和30μL显色液(15μL H2O2和15μL Amplex Red)；将反应后的探针在磁力牵引下依次拉入第二、第三反应腔室，最后牵引至第三反应腔室于37℃孵育5min，完成免疫测定。通过凝胶成像仪(520nm)采集荧光信号，并利用image J软件对信号进行定量计算分析。
2、标准曲线的建立
首先按照检测步骤测定系列梯度浓度(1000ng/mL、200ng/mL、40ng/、8ng/mL、1.6ng/mL、0.32ng/mL、0.064ng/mL、0ng/mL)的ZEN标准溶液。根据各标准品稀释液的浓度和灰度值拟合标准曲线，以浓度为横坐标，灰度值的差值为纵坐标。
3、定量分析
使用凝胶成像仪采集荧光信号，并利用image J软件转换成灰度值分析信号强度，代入建立的标准曲线计算得到待测溶液中玉米赤霉烯酮的含量。
4、实验结果
本发明用于检测玉米赤霉烯酮的NHS磁珠-微流控免疫检测方法对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，标准曲线如图6所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.含有权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在非诊断目的的检测玉米赤霉烯酮或在制备玉米赤霉烯酮检测产品中的应用。
6.一种非诊断目的的检测玉米赤霉烯酮的免疫检测方法，其特征在于，用玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联得到的人工抗原做包被原，用权利要求1所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
7.根据权利要求6所述免疫检测方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮半抗原的结构式如式(I)所示：
8.根据权利要求6所述免疫检测方法，其特征在于，所述载体蛋白为刀豆球蛋白A。
9.一种用于检测玉米赤霉烯酮的开放式液滴阵列微流控芯片，其特征在于，包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室、第二反应腔室、第三反应腔室和尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述第一反应腔室用于装载待测样品、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液；所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液；所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液；所述磁珠抗原为权利要求7中所述的人工抗原与磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的权利要求1所述的抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体；所述缓冲盐溶液为PBS溶液；所述荧光探针溶液为AmplexRed/H2O2。
10.一种非诊断目的的用于检测玉米赤霉烯酮的微流控免疫检测方法，其特征在于，通过将权利要求9中所述的酶标抗体与磁珠抗原混合，再加入待测溶液，利用直接竞争法，结合凝胶成像，实现对标志物的特异性识别。
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