CN117491526A - 一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，该果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，以组分A(乙偶姻、2,3‑丁二酮)作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物，通过HS‑GC‑I MS分析确定发酵过程中不同时间点的组分A含量，以通过不同时间点的乙偶姻或2,3‑丁二酮含量变化情况来判断发酵进程，通过组分A含量达到一定值来确定发酵终点。该果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，可以实时监控果蔬汁乳酸发酵进程和判断发酵终点，一方面克服了通过平板计数法计算菌落总数来判断发酵进程比较滞后的缺陷；另一方面克服了通过pH值检测存在较多干扰造成不能较为准确反映发酵程度的缺陷。

Description

一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法

技术领域

本发明涉及发酵领域，尤其涉及一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法。

背景技术

果蔬汁通过乳酸菌发酵后，会产生一些生物活性成分，既可以丰富果蔬汁的营养价值，改善其感官特性，同时发酵后的果汁含有丰富的乳酸菌，兼具调节肠道菌群的作用。因此，发酵果汁受到的关注和研究越来越多，市场上的产品也越来越多。

目前，在益生菌果汁的发酵过程中，通常以pH值、活菌数量和乳酸含量作为测定发酵程度的指标。活菌计数和乳酸含量的检测比较复杂耗时，发酵过程不能实时监测，例如，现在采用平板计数法来进行活菌数的检测，此方法取样量大(200g)，检测周期长，往往需要36h以上，不能实时监测发酵过程中的乳酸菌活菌数。pH虽然可以实时监测，但它的影响因素较多，例如果汁中的有机酸、杂菌污染等因素都会导致pH的变化，使得其不能很好地反映乳酸菌的发酵程度。

风味物质是能对人的嗅觉和味觉产生刺激而获得感觉的物质。它给食品带来风味，而风味则是食品感官质量的重要指标之一。发酵过程利用微生物的生长和代谢活动，将复杂的有机化合物转化为简单的化合物，并可以产生某些挥发性化合物。固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)作为一种成熟的挥发性化合物分析技术被广泛应用于食品分析中。它可以充分提取挥发性成分，通过内标物质对检测到物质进行相对的量化，帮助我们了解每种化合物对产品风味的贡献。但这种技术的提取方法耗时，检测限相对较高，也不能用来实时监测发酵过程。

近年来，顶空-气相色谱-离子迁移光谱(HS-GC-IMS)是一种新的挥发性化合物分析技术，具有灵敏度高，样品无需前处理的特点，已广泛应用于食品领域，例如在食品新鲜度评价、食品风味鉴别等方面，但尚未在果蔬汁发酵过程中应用。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，可以较为准确实时监控果蔬汁乳酸发酵进程和判断发酵终点，克服了现有技术中存在的缺陷。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，以组分A作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物，通过HS-GC-IMS分析确定发酵过程中不同时间点组分A的含量，以通过不同时间点组分A的含量变化情况来判断发酵进程，通过组分A的含量达到一定值来确定发酵终点；

其中，组分A为乙偶姻或2,3-丁二酮。

进一步的，通过HS-GC-IMS分析得到发酵样品的气相离子迁移谱图，计算谱图中组分A的峰体积得出相应的组分A含量。

进一步的，HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度40-50℃，孵育时间10-30min，孵育转速350-550rpm；色谱分离采用非极性毛细管色谱柱，在38-45℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5-8min，10mL/min运行5-10min，50mL/min运行2-8min，150mL/min运行2-8min进行；IMS电离温度45℃。

进一步的，HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度45℃，孵育时间20min，孵育转速500rpm；色谱分离采用Multicapillary SE-54毛细管色谱柱(0.32mm×30m，0.25μm)，在40℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5min，10mL/min运行10min，50mL/min运行5min，150mL/min运行5min进行；IMS电离温度45℃。

进一步的，样品的取样间隔时间越短，结果越精准，间隔时间采用2h\4h\6h均可，但考虑到实际操作和监控精度多选择6h。

进一步的，所述果蔬汁可以选择酸樱桃汁、苹果汁、梨汁、猕猴桃汁、桃汁中的一种，但并不局限于为这几种。其中，酸樱桃汁采用Lactobacillus plantaru(LP)或Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)乳酸发酵；苹果汁、梨汁、猕猴桃汁、桃汁采用LGG乳酸发酵。

本发明采用上述结构，所具有的优点是：该监控方法，将挥发性代谢产物乙偶姻或2-戊酮作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物，并通过HS-GC-IMS分析可以快速获得乙偶姻或2-戊酮的含量，从而了解发酵过程中乙偶姻或2-戊酮含量的变化情况，进而可较好判断发酵进程和发酵终点。上述监控方法，一方面克服了通过平板计数法计算菌落总数来判断发酵进程比较滞后的缺陷；另一方面克服了通过PH值检测存在较多干扰造成不能较为准确反映发酵程度的缺陷。

该监控方法，除了能较为准确实时监测乳酸发酵果蔬汁中的活菌数量，还能在一定程度上代表总体风味的变化趋势，较好的实现了乳酸菌发酵过程的监测。

附图说明

图1为苹果汁乳酸菌LGG发酵过程风味物质特征峰汇总图；

图2为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落总数与乙偶姻变化趋势分析图；

图3为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落总数与乙偶姻的相关性分析图；

图4苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落总数分别与2,3-丁二酮、2-庚酮和2-戊酮的相关性分析图；

图5为苹果汁乳酸菌LGG发酵过程挥发性成分的PCA分析图；

图6为苹果汁乳酸菌LGG发酵过程的pH变化图；

图7为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵过程风味物质特征峰汇总图；

图8为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落总数与乙偶姻变化趋势分析图；

图9为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落总数与乙偶姻的相关性分析图；

图10为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落总数分别与2,3-丁二酮、2-庚酮和2-戊酮的相关性分析图；

图11为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵过程挥发性成分的PCA分析图；

图12为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵过程的pH变化图；

图13为图1的彩色视图；

图14为图3的彩色视图；

图15为图4为彩色视图；

图16为图7的彩色视图；

图17为图9的彩色视图；

图18为图10的彩色视图。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

本申请提供了一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，具体是将组分A(乙偶姻或2,3-丁二酮)作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物，通过HS-GC-I MS分析快速确定发酵过程中不同时间点的组分A含量，以通过不同时间点的组分A含量变化情况来判断发酵进程，通过组分A含量达到一定值来确定发酵终点。具体的，通过以下实施例来证明可以将组分A作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物。

实施例1：

采用乳酸菌LGG发酵苹果汁，具体的将配置好的苹果汁原料放入灭菌锅，90℃灭菌10min，目的为杀灭苹果汁原料液中其他杂菌，为发酵提供无菌环境。之后将灭菌冷却后的苹果汁原料液，按照4％(v:v)的接种量接入LGG乳酸菌，于37℃发酵48h。以上发酵过程为现有技术，此处不再过多赘述。

在上述发酵过程中，每间隔6h取样监测。每个时间点的样品数量为3个，其中一个样品通过现有的平板计数法计算菌落总数；一个样品用于测定PH；一个样品进行HS-GC-IMS分析，得到其中挥发性物质的气相离子迁移谱图，以N-酮C4-C9(国药北京化学试剂有限公司)计算挥发性化合物的保留指数(RI)，通过与GC-IMS库的保留时间和漂移时间比较，对各挥发性化合物进行定性，通过计算气相离子迁移谱图中挥发性化合物的峰体积来获得各挥发性化合物的含量。

HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度45℃，孵育时间20min，孵育转速500rpm；色谱分离采用MulticapillarySE-54毛细管色谱柱(0.32mm×30m，0.25μm)，在40℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5min，10mL/min运行10min，50mL/min运行5min，150mL/min运行5min进行；IMS电离温度45℃。

1.1为了直观表现上述发酵过程中挥发性物质的变化规律，绘制了挥发性物质的特征峰汇总图，如图1和图13所示。

通过图1或图13可知，风味物质在苹果汁发酵过程中变化较大。发酵新生成产物包括2,3-丁二酮及乙偶姻，在发酵18h时出现了比较明显的峰，这两种产物均来自于丙酮酸代谢。

1.2以乙偶姻为例，根据各发酵时间点测得的菌落数和乙偶姻含量，绘制随发酵时间变化菌落数和乙偶姻的变化情况图，具体见图2。需要说明是，在HS-GC-IMS分析检测过程中，会有部分乙偶姻单体转化为乙偶姻二聚体，因此图2分别绘制了乙偶姻单体和乙偶姻二聚体随发酵时间的含量变化曲线，而发酵过程中的乙偶姻含量实际为乙偶姻单体和乙偶姻二聚体的含量之和。

通过图2可知，乳酸菌LGG在苹果汁中0-12h为前滞期，菌落数与乙偶姻的变化均趋向平缓；12h后进入对数生长期；36h后基本进入稳定期，菌落数基本不再增加，乳酸菌LGG的菌落数在36h达到最大值，由初始菌落数7.93l og CFU/mL增加到8.98l og CFU/mL，乙偶姻也出现类似趋势，其含量在12-18h缓慢增加，18-36h迅速增加，当达到36h时，其增速变慢。这表明乙偶姻可以作为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落数变化的标记物。

1.3对标记物进行皮尔森相关性分析的结果

(1)为了明确1.2的结论，将乙偶姻单体和乙偶姻二聚体分别与乳酸菌LGG的菌落数进行皮尔森相关性分析，将乙偶姻和菌落数的发酵数据通过graphpad软件处理，结果见图3或图14。从图3或图14中可知，乙偶姻单体和乙偶姻二聚体与菌落数之间的皮尔森相关系数r分别为0.92和0.90；其中P1＝0.0041(乙偶姻)，P2＝0.001(乙偶姻二聚体)，P值均小于0.05。以上结果表明乙偶姻单体和乙偶姻二聚体与菌落数之间均为正相关且相关密切，苹果汁中乙偶姻与乳酸菌LGG菌落数的变化存在显著相关性，这说明了乙偶姻可作为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落数变化标记物。

(2)为了表明2,3-丁二酮同样可作为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落数变化的标记物，对2,3-丁二酮进行皮尔森相关性分析，将标记物和菌落数的发酵数据通过graphpad软件处理，结果见图4或图15。

对于2,3-丁二酮来说，其与菌落数之间的皮尔森相关系数r为0.91；P＝0.00068(2,3-丁二酮)，小于0.05。以上结果表明2,3-丁二酮与菌落数之间为正相关且相关密切，苹果汁中2,3-丁二酮与乳酸菌LGG菌落数的变化存在显著相关性，这说明了2,3-丁二酮可作为苹果汁乳酸菌LGG发酵菌落数变化标记物。

1.4对两个重复样品不同时间的苹果汁进行PCA分析，分析结果见图5。

通过图5可知，前2个主成分PC1(70％)与PC2(13％)之和为83％，大于70％，这说明前2个主成分能代表样品整体信息，PCA结果有效，各个时间段内两个样品的距离均相距相近，这表明本次实验中两个样品的重复性比较好。对于任意一个样品来说，在0-12h，由于乳酸菌LGG处于前滞期，因此前3组的分析样品在PCA图中分布较为聚集，组间风味相近；从18h开始，组间风味差异变大；而达到对数生长期末期时，由于生长代谢速率降低，风味物质变化缓慢，发酵42h与48h在PCA图中也较为接近。以上结果说明菌落总数变化在一定程度上可代表总体风味的变化趋势，间接说明了乙偶姻在发酵过程的含量变化趋势可以代表总体风味的变化趋势。以上结果与图2的变化结果一致。

1.5为了进一步表明通过乙偶姻作为菌落总数标记物来实判断发酵过程的准确性，对各时间段样品进行pH检测，检测结果见图6。

在乳酸发酵过程中乳酸菌会产生乳酸，并在发酵液中积累，使发酵液的pH不断下降，从图6中可以看出，发酵液pH的变化呈现出持续下降，pH的下降与乳酸积累及乳酸菌数量的增加有关。在0-12h和36h后，活菌数增加缓慢，比较平稳，而在上述两个时间段内，pH值的变化与活菌数变化较为一致，因此可以说pH的变化与活菌数的变化有关，但在12-30h之间，pH的变化与活菌数并不能很好的呈现出一致性，这也正好说明pH并不能很好的反应发酵过程，但乙偶姻可以作为菌落总数标记物来实时判断发酵过程。

实施例2：

采用乳酸菌LP发酵酸樱桃汁，具体的将配置好的酸樱桃汁原料放入灭菌锅，90℃灭菌10min，目的为杀灭酸樱桃汁原料液中其他杂菌，为发酵提供无菌环境。之后将灭菌冷却后的酸樱桃汁原料液，按照4％(v:v)的接种量接入LP乳酸菌，于37℃发酵48h。以上发酵过程为现有技术，此处不再过多赘述。

在上述发酵过程中，每间隔6h取样监测。每个时间点的样品数量为3个，其中一个样品通过现有的平板计数法计算菌落总数；一个用于测定PH值，一个样品进行HS-GC-I MS分析，得到其中挥发性物质的气相离子迁移谱图，以N-酮C4-C9(国药北京化学试剂有限公司)计算挥发性化合物的保留指数(RI)，通过与GC-IMS库的保留时间和漂移时间比较，对各挥发性化合物进行定性，通过计算气相离子迁移谱图中挥发性化合物的峰体积来获得各挥发性化合物的含量。

HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度45℃，孵育时间20min，孵育转速500rpm；色谱分离采用Multicapillary SE-54毛细管色谱柱(0.32mm×30m，0.25μm)，在40℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5min，10mL/min运行10min，50mL/min运行5min，150mL/min运行5min进行；IMS电离温度45℃。

2.1为了直观表现上述发酵过程中挥发性物质的变化规律，绘制了挥发性物质的指纹图谱，如图7或16所示。

通过图7可知，乳酸菌在发酵过程中消耗醛类，如苯甲醛、己醛、庚醛，苯甲醛及己醛二聚体在发酵24h几乎消失，并且醛代谢产物如1-庚醇、1-己醇含量在一段时间内有增加趋势，部分醇如1-丁醇含量降低，这是因为参与了酯化反应。除此以外2-庚酮在发酵42h含量比初始明显增加，同时2-戊酮在发酵36h出现明显的单体峰，说明乳酸菌LP可通过脂肪酸氧化生成相应的甲基酮类，但是相比于LGG，肪酸酸的代谢没有那么强烈，特别是对于2-庚酮，在整个发酵过程的含量增长趋势并不明显，只在发酵末期观测到含量增长。虽然LP与LGG均属乳酸菌，但由于其基因并不完全相同，因此从理论上讲，代谢方面确实存在着某些差异。对于糖代谢，与LGG类似，通过丙酮酸代谢生成了2,3-丁二酮与乙偶姻，分别在发酵18h与24h出现比较明显的峰。

2.2以乙偶姻为例，根据各发酵时间点测得的菌落数和乙偶姻含量，绘制随发酵时间变化菌落数和乙偶姻的变化情况图，具体见图8。需要说明是，在HS-GC-IMS分析检测过程中，会有部分乙偶姻单体转化为乙偶姻二聚体，因此图8分别绘制了乙偶姻单体和乙偶姻二聚体随发酵时间的含量变化曲线，而发酵过程中的乙偶姻含量实际为乙偶姻单体和乙偶姻二聚体的含量之和。

通过图8可知，发酵48h后菌落数由8.08l og CFU/mL上升到8.82l og CFU/mL，LP在0-12h处于前滞期，此时乳酸菌代谢活性不强，而乙偶姻的变化也不明显；当发酵12h后，LP进入对数生长期，大量繁殖，生长代谢旺盛，同时乙偶姻的含量也开始增加；当发酵30h时，乙偶姻单体的含量下降，这是因为当物质达到一定量时，单体的含量开始下降，发酵42h后，菌落数量趋于平缓。这表明乙偶姻大概率可以作为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落总数变化的标记物。

2.3对标记物进行皮尔森相关性分析的结果

(1)为了明确2.2的结论，将乙偶姻单体和乙偶姻二聚体分别与乳酸菌LP的菌落数进行皮尔森相关性分析，将乙偶姻和菌落数的发酵数据通过graphpad软件处理，结果见图9或图17。从图9或图17中可知，乙偶姻单体和乙偶姻二聚体与菌落数之间的皮尔森相关系数r分别为0.80和0.99；其P1＝0.01(乙偶姻单体)，P2＝9.3×10^-6(乙偶姻二聚体)，两个数值均小于0.05。以上结果表明乙偶姻单体和乙偶姻二聚体与菌落数之间为正相关且相关密切，酸樱桃汁中乙偶姻的含量变化与乳酸菌LP菌落数的变化存在显著相关性，这说明了乙偶姻可作为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落数变化标记物。

(2)为了表明2,3-丁二酮同样可作为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落数变化的标记物，对该标记物进行皮尔森相关性分析，将标记物和菌落数的发酵数据通过graphpad软件处理，结果见图10或图18。

对于2,3-丁二酮来说，其与菌落数之间的皮尔森相关系数r为0.97；其P＝0.000018(2,3-丁二酮)，小于0.05。以上结果表明2,3-丁二酮与菌落数之间为正相关且相关密切，酸樱桃汁中2,3-丁二酮的含量变化与乳酸菌LP菌落数的变化存在显著相关性，这表明了2,3-丁二酮可作为酸樱桃汁乳酸菌LP发酵菌落数变化标记物。

2.4对两个重复样品不同时间的酸樱桃汁进行PCA分析，分析结果见图11。

通过图11可知，前2个主成分PC1(70％)与PC2(13％)之和为83％，大于70％，这说明前2个主成分能代表样品整体信息，PCA结果有效，两个样品在12h时在PCA图中的距离较远，这可能是由于不同实验对数生长周期的开始时间出现差异，或由于时间测量误差等原因，导致短时间内两个样品风味差异较大。对于任意一个样品来说，在0-12h，由于乳酸菌LP处于前滞期，因此前3组分析样品在PCA图中分布较为聚集，组间风味相近；而达到对数生长期末期时，由于生长代谢速率降低，风味物质变化缓慢，发酵42h与48h在PCA图中也较为接近。以上结果说明菌落总数变化在一定程度上可代表总体风味的变化趋势。间接说明了乙偶姻在发酵过程的含量变化趋势也可以代表总体风味的变化趋势。以上结果与图8的变化结果一致。

2.5为了进一步表明通过乙偶姻作为菌落总数标记物来判断发酵过程的准确性，对各时间段样品进行pH测，检测结果见图12。

通过图12知，pH的变化与菌落数变化类似，具体的，在0-12h变化不大，12h后开始明显下降，42h后趋于平缓变化，发酵48h后pH降低到3.92。pH的变化进一步验证了乙偶姻可作为菌落总数标记物来判断发酵过程。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本领域技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员公知技术。

Claims (7)

1.一种果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，以组分A作为果蔬汁乳酸发酵过程中菌落总数变化的标记物，通过HS-GC-IMS分析确定发酵过程中不同时间点组分A的含量，以通过不同时间点组分A的含量变化情况来判断发酵进程，通过组分A的含量达到一定值来确定发酵终点；

其中，组分A为乙偶姻或2,3-丁二酮。

2.根据权利要求1所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，通过HS-GC-IMS分析得到发酵样品的气相离子迁移谱图，计算谱图中组分A的峰体积得出相应的组分A含量。

3.根据权利要求2所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度40-50℃，孵育时间10-30min，孵育转速350-550rpm；色谱分离采用非极性毛细管色谱柱，在38-45℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5-8min，10mL/min运行5-10min，50mL/min运行2-8min，150mL/min运行2-8min进行；IMS电离温度45℃。

4.根据权利要求3所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，HS-GC-IMS分析条件如下：取2mL待测样品放入20mL顶空瓶中，孵育温度45℃，孵育时间20min，孵育转速500rpm；色谱分离采用Multicapillary SE-54毛细管色谱柱(0.32mm×30m，0.25μm)，在40℃下进行气相色谱分离，以纯度为99.99％的氮气为载气，按2mL/min运行5min，10mL/min运行10min，50mL/min运行5min，150mL/min运行5min进行；IMS电离温度45℃。

5.根据权利要求2所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，取样的间隔时间为2h-6h。

6.根据权利要求5所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，取样的间隔时间为6h。

7.根据权利要求1所述的果蔬汁乳酸发酵进程的监控方法，其特征在于，所述果蔬汁为酸樱桃汁、苹果汁、梨汁、猕猴桃汁、桃汁中的一种。