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CN117470929A - 检测葡萄糖含量的装置及方法 - Google Patents

检测葡萄糖含量的装置及方法 Download PDF

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CN117470929A
CN117470929A CN202210864196.3A CN202210864196A CN117470929A CN 117470929 A CN117470929 A CN 117470929A CN 202210864196 A CN202210864196 A CN 202210864196A CN 117470929 A CN117470929 A CN 117470929A
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CN
China
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enzyme
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glucose
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CN202210864196.3A
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吴克南
陈明嘉
景振辉
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Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
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Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
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Abstract

本发明公开了一种检测葡萄糖含量的装置及方法，该装置包括：酶传感器电极，以及电子媒介。本发明的检测葡萄糖含量的装置避免了将电子媒介直接添加在酶电极中的不稳定状态，可以定量控制电子媒介的添加量，从而保证每一次样本测试时都有几乎等量的电子媒介促进作用，使得酶传感器在较长时期内具有较为一致的灵敏度，且在连续的测试中响应信号没有衰减。

Description

检测葡萄糖含量的装置及方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测葡萄糖含量的装置及方法。
背景技术
葡萄糖在食品安全、化工生产、临床医学等领域具有广泛的应用，对其准确检测具有重要意义。当前酶电极传感器检测方法是葡萄糖检测的主要方法。其一般原理是样本中的葡萄糖在酶膜里面的葡萄糖氧化酶催化作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在恒电位下产生电流信号，该电流信号可与样本中的葡萄糖浓度在一定范围内成线性关系。
第一代传感器中，天然氧气作为电子受体参与电子传递是酶反应的必要步骤，这就导致了氧气不足以及氧气含量波动对传感器检测范围以及检测稳定性的削弱。同时这种检测体系往往需要一个较大的恒电压(0.4V-0.6VvsAg/AgCl)才能产生理想的电流信号，此电压也可使样本中的电化学活性物质(抗坏血酸、尿酸等)在电极表面产生氧化，使得测试结果大于实际值。
第二代传感器为了弥补这种缺陷在酶电极中引入了人工电子介体的方法学，这种人工电子介体包括三氯化六铵合钌(Ru(NH3)6Cl3)，2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、铁氰化钾K3[Fe(CN)6]、二茂铁及其衍生物等可替代氧气在酶活性中心与电极表面传递电子，相较于一代传感器具有更高的检测范围和抗干扰性。然而这些电子介体在酶电极中的改性作用一般难以稳定持续：对于可溶性小分子电子介体(如铁氰化钾)很容易随着样本液流动而流失，对其的固定化也成为额外的技术难题；对于不溶性(如二茂铁)或微溶性电子介体较难直接与水溶性的酶建立联系，如使用有机试剂作为此类电子介体的溶剂，电子媒介在极性作用下可能在电极表面分布不均匀，额外的膜层也会降低电子传递的效率。因此，这种将电子媒介直接引入酶电极上的方法，由于分子的流失或者电子媒介膜层缓慢的变化导致的性能变化，使得传感器很难获得长期稳定一致的灵敏度。
另外，一般传感器在连续测试过程中，由于膜层亲疏水性的变化或者表面微凝块的形成容易导致传感器基线恢复比较缓慢，或样本电流的持续衰减，可以使用时间函数进行校正，但使用校正的方法对传感器膜层的一致性要求很高，额外的精度控制造成了更高的工艺成本。
因此，有必要提供一种具有长期稳定一致灵敏度的葡萄糖含量的检测装置。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种检测葡萄糖含量的装置，利用该装置检测葡萄糖含量时，有更高的灵敏度，且灵敏度可以在较长时间内保持稳定。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种检测葡萄糖含量的装置，该装置包括：酶传感器电极，以及电子媒介。
在其中一些实施例中，所述电子媒介为Ru(NH3)6Cl3、铁氰化钾、二茂铁甲醇或ABTS溶液。
在其中一些实施例中，所述电子媒介的浓度为0.25wt％～0.35wt％。
在其中一些实施例中，所述电子媒介的浓度为0.28wt％～0.32wt％。
在其中一些实施例中，所述电子媒介的浓度为0.29wt％～0.31wt％。
在其中一些实施例中，所述电子媒介为浓度0.29wt％～0.31wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液。
在其中一些实施例中，所述检测葡萄糖含量的装置，该装置还包括自动化进样装置、参比试剂、pt电极和Ag/AgCl电极。
在其中一些实施例中，所述参比试剂为浓度0.05wt％～2.5wt％的氯化钾、氯化钠或氯化银。
在其中一些实施例中，所述酶传感器电极为表面涂覆有酶液的电极丝，所述酶液为包括1wt％～5wt％葡萄糖氧化酶、1wt％～5wt％酶保护剂、0.1wt％～5wt％交联剂、0.1wt％～5wt％阳离子导电共聚物的Hepes缓冲液，pH5.0～6.5。
在其中一些实施例中，所述酶保护剂为牛血清白蛋白；所述交联剂为戊二醛或丙二醛；所述阳离子导电共聚物为聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚乙烯亚胺；所述电极丝的材料为金、铂或银。
本发明还提供了上述检测葡萄糖含量的装置的制备方法，包括以下步骤：
(1)、在Hepes缓冲液中依次加入阳离子导电共聚物、酶保护剂、葡萄糖氧化酶和交联剂，得到酶液；
(2)、将步骤(1)的酶液涂覆至电极丝上，烘干即得酶传感器电极；
(3)、配制浓度为0.25wt％～0.35wt％的电子媒介，灌包，即得。
本发明还提供了一种检测葡萄糖含量的方法，使用上述检测装置，包括以下步骤：将电子媒介和待测样本加入测试通道，通过酶传感器电极在恒电位下进行测试。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测葡萄糖含量的装置中，通过将电子媒介独立外置于酶传感器电极外，并且对电子媒介的浓度进行了优化筛选，在此构思下，本发明的检测葡萄糖含量的装置避免了将电子媒介直接添加在酶电极中的不稳定状态，可以定量控制电子媒介的添加量，从而保证每一次样本测试时都有几乎等量的电子媒介促进作用，使得酶传感器在较长时期内具有较为一致的灵敏度，且在连续的测试中响应信号没有衰减。
附图说明
图1为本发明中检测葡萄糖含量的方法的示意图。
图2为本发明试验例1中使用不同的检测装置进行检测的标准曲线图。
图3为本发明试验例2中不同的检测装置30天内的灵敏度结果。
图4为本发明试验例3中实施例1、实施例5和实施例6的检测装置对电流变化的影响。
图5为本发明试验例3中对比例1～6的检测装置对电流变化的影响。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本发明的第一个方面，提供了一种检测葡萄糖含量的装置，该装置包括：
(1)、自动化进样装置，所述自动化进样装置是用于将待测溶液泵入测试通道；
(2)、辅助检测试剂包，包括：
电子媒介包(A包)，所述电子媒介包中包括浓度为0.25wt％～0.35wt％的Ru(NH3)6Cl3、铁氰化钾、二茂铁甲醇或ABTS溶液；作为优选的，所述电子媒介为Ru(NH3)6Cl3溶液；作为优选地，所述电子媒介的浓度为0.28wt％～0.32wt％；更为优选地，所述电子媒介的浓度为0.29wt％～0.31wt％；
参比试剂包(B包)，所述参比试剂包中包括浓度为0.05wt％～2.5wt％的氯化钾、氯化钠或氯化银；
废液包(C包)，所述废液包为用于盛装废液的塑料袋；
(3)、酶电极测试卡，包括：
a、测试通道，包括样本通道、参比通道和废液通道；
b、三电极体系，包括pt电极的对电极、Ag/AgCl电极的参比电极、以及酶传感器电极的工作电极；所述酶传感器电极为表面涂覆有酶液的电极丝，所述电极丝的材料为金、铂或银；所述酶液为包括1wt％～5wt％葡萄糖氧化酶、1wt％～5wt％酶保护剂(牛血清白蛋白BSA)、0.1wt％～5wt％交联剂(戊二醛、丙二醛等)、0.1wt％～5wt％阳离子导电共聚物(聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA、聚乙烯亚胺PEI等)的Hepes缓冲液，pH值5.0～6.5。
在本发明的第二个方面，提供了一种检测葡萄糖含量的方法，使用上述检测葡萄糖含量的装置对待测样本中的葡萄糖进行检测，包括以下步骤：将电子媒介加入样本通道，同时将参比试剂加入参比通道，恒电位下对背景电流进行测试；再将待测样本加入样本通道，恒电位下对待测样本中的葡萄糖含量进行测试。本发明提供的葡萄糖的检测方法，是基于二代传感器的理念，具体检测方法参考图1，在每次测试开始时，外置的电子媒介和参比试剂首先进入测试通道，对背景电流进行测试，酶传感器电极膜中阳离子导电共聚物吸附进入膜层的电子媒介，随后待测样本进入测试通道，在电子媒介和葡萄糖氧化酶的共同作用下产生响应信号。测试完成后，参比试剂、电子媒介随着测试液的流动，随废液通道，一起流入废液包。
以下实施例中所使用的试剂均来源于市售。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量检测装置，该装置的构成及制备方法包括如下：
(1)、自动化进样装置，所述自动化进样装置是用于将待测溶液泵入测试通道；
(2)、制备辅助检测试剂包，包括：
电子媒介包(A包)，所述电子媒介包中装有浓度为0.3wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液；取0.3gRu(NH3)6Cl3溶解在99.7g纯水中，完全溶解后使用蠕动泵灌入铝塑袋中，获得浓度为0.3wt％的电子媒介包。
参比试剂包(B包)，所述参比试剂包中装有浓度为0.5wt％的氯化钾溶液；取0.5g氯化钾溶解在99.5g纯水中，完全溶解后使用蠕动泵灌入铝塑袋中，获得浓度为0.5wt％的参比试剂包。
废液包(C包)，所述废液包为用于盛装废液的塑料袋；
(3)、酶电极测试卡，包括：
测试通道，包括样本通道、参比通道和废液通道；
三电极体系，包括pt电极的对电极、Ag/AgCl电极的参比电极、以及酶传感器电极的工作电极；所述酶传感器电极的制备方法为：
a、取0.16g25％PDDA水溶液加入1.84g超纯水中，在90℃搅拌30min溶解获得PDDA母液备用；
b、取0.5gPDDA母液加入1.5gHepes缓冲液中，搅拌均匀后加入0.05g BSA；
c、在上述溶液中溶解0.06g葡萄糖氧化酶；
d、取0.02g的25％戊二醛水溶液加入c获得的溶液中，搅拌均匀，得到固定化酶液；
e、将d获得的酶液涂覆在测试卡的铂丝表面，测试卡在37℃干燥箱内烘干2h，获得酶传感器电极。
实施例2检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量的检测装置除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.3wt％的ABTS溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
实施例3检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量的检测装置除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.3wt％的铁氰化钾溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
实施例4检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量的检测装置除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.3wt％的二茂铁甲醇溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
实施例5检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量的检测装置除了电子媒介包(A包)中Ru(NH3)6Cl3的浓度为0.25wt％外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
实施例6检测葡萄糖含量的装置
本实施例的一种葡萄糖含量的检测装置除了电子媒介包(A包)中Ru(NH3)6Cl3的浓度为0.35wt％外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
对比例1
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，该装置中电子媒介Ru(NH3)6Cl3是一次性添加固定在电极膜上，反复参加反应，因此，内置电子媒介Ru(NH3)6Cl3时，理论上其在固定化酶液中的浓度应远大于外置Ru(NH3)6Cl3的浓度(每次新的电子媒介注入，电子媒介进入电极膜进行一次性反应，被吸附或被冲走)，在该对比例中，选取Ru(NH3)6Cl3在固定化酶液中的浓度为1％。
其具体的构成及制备方法包括如下：
(1)、自动化进样装置同实施例1；
(2)、制备辅助检测试剂包，包括：
参比试剂包(B包)同实施例1。
废液包(C包)同实施例1；
(3)、酶电极测试卡，包括：
测试液流动通道，包括样本通道、参比通道和废液通道；
三电极体系，包括pt电极的对电极、Ag/AgCl电极的参比电极、以及酶传感器电极的工作电极；所述酶传感器电极的制备方法为：
a、取0.16g25％PDDA水溶液加入1.84g超纯水中，在90℃搅拌30min溶解获得PDDA母液备用；
b、取0.5gPDDA母液加入1.5gHepes缓冲液中，搅拌均匀后加入0.05g BSA；
c、在上述溶液中溶解0.06g葡萄糖氧化酶0.02gRu(NH3)6Cl3；
d、取0.02g的25％戊二醛水溶液加入c获得的溶液中，搅拌均匀，得到固定化酶液；
e、将d获得的酶液涂覆在测试卡的铂丝表面，测试卡在37℃干燥箱内烘干2h，获得酶传感器电极。
对比例2
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，除了Ru(NH3)6Cl3在固定化酶液中的浓度为0.3％外，其他的结构和制备方法都同对比例1。
对比例3
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.1wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
对比例4
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.2wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
对比例5
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.4wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
对比例6
本对比例的一种葡萄糖含量的检测装置，除了电子媒介包(A包)中装有浓度为0.5wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液外，其他的结构和制备方法都同实施例1。
试验例1电子媒介外置和内置，对标准曲线的线性范围和灵敏度的影响
使用实施例1～4的葡萄糖含量的检测装置对一系列浓度的葡萄糖进行测试。具体方法请参考图1，包括以下步骤：
(1)、将200μL的电子媒介(A包)通过自动化进样装置进入样本通道，同时200μL参比试剂(B包)通过自动化进样装置进入参比通道，在0.35V的恒电位下产生背景电流信号；
(2)、随后，将200μL浓度90mM的葡萄糖样本(添加0.5mol/L的氯化钠，作为简化的电解质，用以模拟血液)通过自动化进样装置进入样本通道，在相同电位(0.35V)下进行测试，产生对应的响应电流信号；测试完成后参比液与样本液进入废液仓；
(3)、按照上述步骤(1)～(2)，分别对浓度为0，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM的葡萄糖样本(均添加有0.5mol/L的氯化钠)进行测试，产生相应的响应电流信号；
(4)、以葡萄糖浓度为横坐标，响应电流信号与背景电流信号的差值为纵坐标做图，所得曲线即为葡萄糖含量的标准曲线，曲线的斜率即为传感器的灵敏度。
使用对比例1～2的葡萄糖含量的检测装置对一系列浓度的葡萄糖进行测试。
包括以下步骤：
(1)、将200μL的浓度为0.5mol/L的氯化钠通过自动化进样装置进入样本通道，同时将200μL参比试剂(B包)通过自动化进样装置进入参比通道，在0.35V的恒电位下产生背景电流信号；
(2)、随后，将200μL浓度90mM的葡萄糖样本(添加0.5mol/L的氯化钠，作为简化的电解质，用以模拟血液)通过自动化进样装置进入样本通道，在相同电位(0.35V)下进行测试，产生对应的响应电流信号；测试完成后参比液与样本液进入废液仓；
(3)、按照上述步骤(1)～(2)，分别对浓度为0，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM的葡萄糖样本(均添加有0.5mol/L的氯化钠)进行测试，产生相应的响应电流信号；
(4)、以葡萄糖浓度为横坐标，响应电流信号与背景电流信号的差值为纵坐标做图，所得曲线即为葡萄糖含量的标准曲线，曲线的斜率即为传感器的灵敏度。
结果如图2和表1所示。
表1
从图2和表1可以看出，实施例1～4的葡萄糖含量的检测装置(电子媒介外置)的性能均显著优于对比例1～2的葡萄糖含量的检测装置(电子媒介内置)，这可能得益于外置的电子媒介使得每次测试时，待测样本与酶传感器都得到了充分且等量的促进作用。其中，实施例1的葡萄糖含量的检测装置(0.3％的Ru(NH3)6Cl3外置)效果最佳，说明流动的Ru(NH3)6Cl3溶液与酶活性中心之间的电子传递作用更为活跃。
试验例2电子媒介外置和内置，对标准曲线30天内灵敏度稳定性的影响
使用实施例1～4、以及对比例1～2的葡萄糖含量的检测装置，在30天内连续对一系列浓度(0，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM)的葡萄糖进行测试，得到30天内的标准曲线，并统计灵敏度的变化趋势。具体方法同试验例1。结果如图3所示。
图3结果表明，实施例1～4的葡萄糖含量的检测装置(电子媒介外置)，比对比例1～2的葡萄糖含量的检测装置(电子媒介内置)，30天内的灵敏性具有更好的稳定性，这可能是由于内置的电子媒介分子在连续的测试与冲洗中会发生缓慢的流失，而当电子媒介外置处理时，每次测试中电子媒介被吸附与补充，因此，具有更好的稳定性。其中，实施例1的葡萄糖含量的检测装置(0.3％的Ru(NH3)6Cl3外置)灵敏度稳定性最佳，说明Ru(NH3)6Cl3溶液可能对酶分子结构的影响更为温和。
试验例3 Ru(NH3)6Cl3溶液的浓度对电流变化的影响
使用实施例1、实施例5、实施例6、以及对比例1～6的葡萄糖含量的检测装置，对5mM的葡萄糖溶液连续测试10次，比较电流的变化情况，结果如图4、图5和表2所示。
表2
图4～图5和表2结果表明，当电子媒介的浓度在0.25％～0.35％范围内时，葡萄糖含量的检测装置的电流变化幅度都很小，这可能是由于此小范围的浓度下，电子媒介的流失与吸附达到平衡，高于这一浓度导致电子媒介在酶传感器电极膜内过量的累积，从而导致电流越测越高，低于这一浓度可能导致酶传感器电极膜吸附量不足，使得电流越测越低。其中，实施例1的葡萄糖含量的检测装置(0.3％的Ru(NH3)6Cl3外置)电流变化最为稳定。
因此，本试验例的结果表明，本发明的葡萄糖含量的检测装置可以实现酶传感器在连续测试中电流保持稳定的目标。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，该装置包括：酶传感器电极，以及电子媒介。
2.根据权利要求1所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述电子媒介为Ru(NH3)6Cl3、铁氰化钾、二茂铁甲醇或ABTS溶液。
3.根据权利要求1所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述电子媒介的浓度为0.25wt％～0.35wt％。
4.根据权利要求3所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述电子媒介的浓度为0.28wt％～0.32wt％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述电子媒介为浓度0.29wt％～0.31wt％的Ru(NH3)6Cl3溶液。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述检测葡萄糖含量的装置还包括自动化进样装置、参比试剂、测试通道、pt电极和Ag/AgCl电极；和/或所述参比试剂为浓度0.05wt％～2.5wt％的氯化钾、氯化钠或氯化银。
7.根据权利要求1～4任一项所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述酶传感器电极为表面涂覆有酶液的电极丝，所述酶液为包括1wt％～5wt％葡萄糖氧化酶、1wt％～5wt％酶保护剂、0.1wt％～5wt％交联剂、0.1wt％～5wt％阳离子导电共聚物的Hepes缓冲液，pH 5.0～6.5。
8.根据权利要求7所述的检测葡萄糖含量的装置，其特征在于，所述酶保护剂为牛血清白蛋白；所述交联剂为戊二醛或丙二醛；所述阳离子导电共聚物为聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚乙烯亚胺；所述电极丝的材料为金、铂或银。
9.权利要求1～8任一项所述的检测葡萄糖含量的装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、在Hepes缓冲液中依次加入阳离子导电共聚物、酶保护剂、葡萄糖氧化酶和交联剂，得到酶液；
(2)、将步骤(1)的酶液涂覆至电极丝上，烘干即得酶传感器电极；
(3)、将电子媒介灌包，即得。
10.一种检测葡萄糖含量的方法，其特征在于，使用权利要求1～8任一项所述的装置进行检测，包括以下步骤：将电子媒介和待测样本加入测试通道，通过酶传感器电极在恒电位下进行测试。
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