CN117460815A - 细胞裂解方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞裂解的方法，所述方法用于在水性培养基中的细胞的细胞壁和/或细胞膜中形成至少一个孔，以用于将至少一种细胞内目标蛋白质和/或脂质从所述细胞释放至所述水性培养基中，所述方法包括：(c)使在所述水性培养基中的具有所述细胞内目标蛋白质和/或脂质的所述细胞经受电动液压粉碎；以及(d)将所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中分离，其中所述电动液压粉碎通过脉冲电流源而引起，使在所述水性培养基中的所述细胞在容器的水下无线电波路径的至少两个电极之间在40至130kV的范围内的工作电压、50至1500J/电极的冲击能量、1Hz的脉冲频率下经受电冲击放电40至1000秒，由此在所述细胞壁和/或细胞膜中形成至少一个孔。

Description

细胞裂解方法

技术领域

本发明涉及能够实现从细胞提取蛋白质和脂质的细胞裂解(lysis)的新方法。特别是，细胞破碎(fragmentation)的新方法包括使用电动液压破碎，也已知为休克疗法(shock therapy)以将细胞分级分离(fractionate)，以提取在该细胞内的蛋白质和/或脂质。

背景技术

许多生物产物例如蛋白质和脂质通常是在细胞内产生的，并且细胞必须被裂解以获得它们。已确立的细胞裂解方法本质上是机械的，例如在球磨机中的研磨和高压均质化。

球磨机是用于使细胞破裂的最有效的方法之一。该方法的有效性取决于几个参数：振动频率、消化时间、程数(number of passes)、细胞密度、研磨室的几何形状、以及使用的球的组成和堆积密度、尺寸和重量。还熟知的是，该方法的高效率(即，从该细胞提取的最多目标产物)是由球的碰撞和摩擦引起的细胞壁的完全破坏的结果。

在高压均质器中的机械细胞破裂(disruption)也是有效的。在该方法中，使用高压将细胞悬浮液输送通过开启的阀。该细胞的破裂和由此细胞内组分的释放是由在该开启的阀上的高剪切力引起的。还存在几个影响该方法的有效性的参数。例如，必须改变工作压力、阀的几何形状、细胞密度和温度，以适应不同的细胞。

这些细胞破裂的方法可以是有效的，但它们具有某些缺点。通过摩擦(即，球的撞击、通过开启的阀的输送等)转化的在消化期间引入的机械能导致样品被加热，并且该热量可造成目标蛋白质和/或脂质的破坏。此外，这两种已知的方法都造成细胞壁和细胞膜的完全破坏，从而释放另外的细胞内组分，包括不同尺寸的细胞碎片，这使机械裂解的选择性更低。将需要的目标产物与不需要的组分分离的后续步骤也是劳动和成本密集的。特别是，这些下游加工步骤是时间密集的，并占生产成本的多达75％。由于细胞裂解作为早期方法步骤，它对其余的纯化步骤具有高影响。对产物纯度(特别是对于药物)的要求越高，需要越多的清洁步骤，因此产物收率会减少多达80％。为了减少细胞裂解后的纯化步骤的数量并且为了使产物收率的损失最小化，本领域需要释放产物而不将细胞膜破坏成小片段的方法。

特别是，本领域需要这样的细胞破裂方法，所述方法提供用尽可能少的下游步骤(即，目标蛋白质回收、浓缩、纯化和包装)获得所需纯度的目标蛋白质和/或脂质的手段，从而节省成本并改善产物的品质，因为已知的是，对于目标产物所经历的每个步骤，存在产物的生物活性和稳定性受损的风险。

附图说明

图1是根据本发明的任意一方面的细胞裂解的方法的概况，其中在细胞裂解中使用电动液压粉碎。

图2示出在细胞膜内发生的一系列事件，以在细胞膜中形成孔。

图3是填充有水性培养基的裂解室的图片，其中在该培养基中的细胞在至少两个电极的存在下经受电动液压粉碎。虚线示出从在该水性培养基内的所述电极辐射的激波的覆盖范围。

具体实施方式

本发明尝试通过提供这样的方法来解决上述问题，所述方法克服机械和化学细胞裂解的缺点，并且尝试促进产物与其它不期望的细胞组分例如细胞碎片的分离。特别是，所述方法是电化学裂解，其中形成孔并且蛋白质和/或脂质从所述细胞的内部释放，而不将细胞壁分解成许多小片段。这是特别有利的，因为细胞膜的形式和尺寸由于孔的形成而保留，细胞内目标产物通过所述孔从所述细胞中释放，因此细胞团块与产物的分离也变得更容易。图1提供根据本发明的任意一方面的细胞裂解的方法的概况。

根据本发明的一个方面，提供细胞裂解的方法，所述方法用于在水性培养基中的细胞的细胞壁和/或细胞膜中形成多个孔，以用于将至少一种细胞内目标蛋白质和/或脂质从所述细胞释放至所述水性培养基中，所述方法包括：

(a)使在所述水性培养基中的具有所述细胞内目标蛋白质和/或脂质的所述细胞经受电动液压粉碎；和

(b)将所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中分离，

其中，所述电动液压粉碎通过脉冲电流源引起，使在所述水性培养基中的所述细胞在容器的水下无线电波路径的至少两个电极之间在40至130kV的范围内的工作电压、50至1500J/电极的冲击能量、1Hz的脉冲频率下经受电冲击放电40至1000秒，由此在所述细胞壁和/或细胞膜中形成至少一个孔。

电动液压粉碎或电动液压破碎(EHF)是目前正用于电池和相关产品的再循环的一种基于激波(shock wave)的技术。在该技术中，首先由具有低电导率的水性培养基包围目标材料。将至少两个电极引入至该水性培养基中，并且使用高压脉冲发生器产生激波。该激波穿过该目标材料，并且从机械弱位点(weak point)或金属与非金属的界面将它分解成小片段。因此，特别出人意料的是，EHF可以有效地用于细胞裂解。这是出人意料的，因为EHF从未与细胞组合用于生物学、生物技术和/或生物加工的领域中。此外，相比于在现有技术中使用的其它电冲击(impulse)方法，在细胞裂解中使用根据本发明的任意一方面的电动液压破碎使能够存在该两个电极(即，阴极和阳极)之间的更大的距离。该两个电极之间的该更大距离为至少约20cm或更大。该两个电极之间的该距离提供充足的场强，以引起细胞裂解而对产物收率没有负面影响。

根据本发明的任意一方面，电动液压粉碎可以用于细胞裂解。如在本文中使用的术语“细胞”是指生物细胞，即原核细胞和真核细胞。这些可以是哺乳动物细胞(例如，来自人类的细胞)；植物细胞；或微生物，例如酵母、真菌或细菌。细胞还可以包括病毒。原核细胞包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，并且真核细胞包括植物细胞、真菌细胞和动物细胞。特别是，根据本发明的任意一方面的细胞是指酵母细胞、细菌细胞和/或植物细胞。

合适的细菌、酵母或真菌特别是作为细菌菌株、酵母菌株或真菌菌株被保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))GmbH(DSMZ)，Brunswick，德国的那些细菌、酵母或真菌。根据本发明的合适的细菌属于以下所列出的属：

-http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm，

根据本发明的合适的酵母属于以下所列出的那些属：

-http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm，

并且根据本发明的合适的真菌是以下所列出的那些：

-http://www.dsmz.de/species/fungi.htm。

特别是，细胞可以选自曲霉(Aspergillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、产碱杆菌(Alcaligenes)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、副球菌(Paracoccus)属、乳球菌(Lactococcus)属、假丝酵母(Candida)属、毕赤酵母(Pichia)属、汉逊酵母(Hansenula)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、酵母(Saccharomyces)属、埃希氏菌(Escherichia)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、耶氏酵母(Yarrowia)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、红螺菌(Rhodospirillum)属、红细菌(Rhodobacter)属、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)属、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属和贪铜菌(Cupriavidus)属。更特别是，细胞可以选自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、协腹产碱杆菌(Alcaligenes latus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)、巴西伯克霍尔德氏菌(B.brasilensis)、苏格兰伯克霍尔德氏菌(B.caledonica)、加勒比伯克霍尔德氏菌(B.caribensis)、麝香石竹伯克霍尔德氏菌(B.caryophylli)、真菌伯克霍尔德氏菌(B.fungorum)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)、格氏伯克霍尔德氏菌(B.glathei)、荚壳伯克霍尔德氏菌(B.glumae)、禾根伯克霍尔德氏菌(B.graminis)、医院伯克霍尔德氏菌(B.hospita)、留里伯克霍尔德氏菌(B.kururiensis)、吩嗪伯克霍尔德氏菌(B.phenazinium)、瘤块伯克霍尔德氏菌(B.phymatum)、植物令伯克霍尔德氏菌(B.phytofirmans)、苗床伯克霍尔德氏菌(B.plantarii)、甘蔗伯克霍尔德氏菌(B.sacchari)、新加坡伯克霍尔德氏菌(B.singaporensis)、污垢伯克霍尔德氏菌(B.sordidicola)、居土伯克霍尔德氏菌(B.terricola)、热带伯克霍尔德氏菌(B.tropica)、根结伯克霍尔德氏菌(B.tuberum)、乌汶伯克霍尔德氏菌(B.ubonensis)、乌拉姆伯克霍尔德氏菌(B.unamae)、噬异伯克霍尔德菌(B.xenovorans)、花园伯克霍尔德氏菌(B.anthina)、吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)、泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis)、布兰克假丝酵母(Candidablankii)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、多能副球菌(Paracoccus versutus)、阿根廷假单胞菌(Pseudomonas argentinensis)、污泥假单胞菌(P.borbori)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、变黄假单胞菌(P.flavescens)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝酸盐还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单孢菌(P.resinovorans)、秸草假单胞菌(P.straminea)、栖青木假单胞菌(P.aurantiaca)、致金色假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、莓实假单胞菌(P.fragi)、隆德假单胞菌(P.lundensis)、腐臭假单胞菌(P.taetrolens)、南极假单胞菌(P.antarctica)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)、布拉奇福德假单胞菌(′P.blatchfordae′)、甘蓝假单胞菌(P.brassicacearum)、布伦那氏假单胞菌(P.brenneri)、雪松假单胞菌(P.cedrina)、皱纹假单胞菌(P.corrugata)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、格萨德氏假单胞菌(P.gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(P.libanensis)、曼德尔假单胞菌(P.mandelii)、边缘假单胞菌(P.marginalis)、地中海假单胞菌(P.mediterranea)、南方假单胞菌(P.meridiana)、米氏假单胞菌(P.migulae)、霉味假单胞菌(P.mucidolens)、东方假单胞菌(P.orientalis)、人参假单胞菌(P.panacis)、解蛋白假单胞菌(P.proteolytica)、罗兹氏假单胞菌(P.rhodesiae)、类黄假单胞菌(P.synxantha)、蒂瓦尔假单胞菌(P.thivervalensis)、托拉氏假单孢菌(P.tolaasii)、维隆氏假单胞菌(P.veronii)、脱氮假单胞菌(P.denitrificans)、穿孔假单胞菌(P.pertucinogena)、类黄褐假单胞菌(P.cremoricolorata)、黄褐假单胞菌(P.fulva)、蒙蒂尔氏假单胞菌(P.monteilii)、摩斯氏假单胞菌(P.mosselii)、副黄假单胞菌(P.parafulva)、恶臭假单胞菌(P.putida)、巴利阿里岛假单胞菌(P.balearica)、金海假单胞菌(P.stutzeri)、扁桃假单胞菌(P.amygdali)、洋榛假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊苣假单胞菌(P.cichorii)、燕麦晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、无花果假单胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假单胞菌(′P.helianthi′)、苦楝假单胞菌(P.meliae)、萨维斯氏假单胞菌(P.savastanoi)、丁香假单胞菌(P.syringae)、番茄假单胞菌(P.tomato)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava)、嗜松烷香烷假单胞菌(P.abietaniphila)、嗜酸假单胞菌(P.acidophila)、伞菌假单胞菌(P.agarici)、嗜碱假单胞菌(P.alcaliphila)、解碱假单胞菌(P.alkanolytica)、淀粉样假单胞菌(P.amyloderamosa)、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)、固氮假单胞菌(P.azotifigens)、大麻假单胞菌(P.cannabina)、隐居假单胞菌(P.coenobios)、结冰假单胞菌(P.congelans)、康氏假单胞菌(P.costantinii)、克罗斯韦假单胞菌(P.cruciviae)、德里假单胞菌(P.delhiensis)、外囊假单胞菌(P.excibis)、远东假单胞菌(P.extremorientalis)、菲特列堡假单胞菌(P.frederiksbergensis)、褐鞘假单胞菌(P.fuscovaginae)、石花菜假单胞菌(P.gelidicola)、格氏假单胞菌(P.grimontii)、印度假单胞菌(P.indica)、杰森假单胞菌(P.jessenii)、金州假单胞菌(P.jinjuensis)、基尔假单胞菌(P.kilonensis)、纳克马斯氏假单胞菌(P.knackmussii)、高丽假单胞菌(P.koreensis)、亚麻假单胞菌(P.lini)、黄假单胞菌(P.lutea)、莫拉维亚假单胞菌(P.moraviensis)、耳炎假单胞菌(P.otitidis)、海绵假单胞菌(P.pachastrellae)、帕勒罗尼亚氏假单胞菌(P.palleroniana)、罂粟假单胞菌(P.papaveris)、烂泥假单胞菌(P.peli)、腐卵假单胞菌(P.perolens)、草假单胞菌(P.poae)、浦项假单胞菌(P.pohangensis)、嗜冷假单胞菌(P.psychrophila)、耐冷假单胞菌(P.psychrotolerans)、拉梭假单胞菌(P.rathonis)、食爬虫假单胞菌(P.reptilivora)、喜树脂假单胞菌(P.resiniphila)、根围假单胞菌(P.rhizosphaerae)、浅红假单胞菌(P.rubescens)、萨氏假单胞菌(P.salomonii)、土假单胞菌(P.segitis)、败血假单胞菌(P.septica)、猴假单胞菌(P.simiae)、猪假单胞菌(P.suis)、耐热假单胞菌(P.thermotolerans)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、山黄麻假单胞菌(P.tremae)、琐细假单胞菌(P.trivialis)、齿螺状假单胞菌(P.turbinellae)、杜蒂科里尼西斯假单胞菌(P.tuticorinensis)、阴城假单胞菌(P.umsongensis)、温哥华假单胞菌(P.vancouverensis)、弗拉诺夫假单胞菌(P.vranovensis)、海黄色假单胞菌(P.xanthomarina)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobile)。更特别是，细胞可以是选自假单胞菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属和埃希氏菌属的细菌细胞。甚至更特别是，细胞可以选自恶臭假单胞菌、大肠埃希氏菌和泰国伯克霍尔德氏菌。

更特别是，细胞可以是酵母细胞。根据本发明的任意一方面的酵母细胞可以选自假丝酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属和拟威克酵母属(Wickerhamiella)。特别是，酵母细胞可以选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)、阴沟假丝酵母(Candida cloacae)、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、杜姆克氏拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母等。更特别是，酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。

除具有蛋白质衣壳的病毒以外的所有上述细胞都具有质膜，即蛋白质-脂质双层，所述蛋白质-脂质双层形成将细胞内容物与细胞外环境分隔的屏障。植物细胞、原核细胞、藻类细胞和真菌细胞另外具有提供物理支撑的细胞壁。细菌细胞壁由肽聚糖构成，并且酵母细胞壁由两层的β-葡聚糖构成。细菌细胞壁和酵母细胞壁两者都进一步被富含甘露聚糖(一种碳水化合物)的外部糖蛋白层包围。植物细胞壁由多层纤维素构成。根据本发明的任意一方面，短语“细胞壁和/或细胞膜”涵盖将细胞的细胞内环境与该细胞的外部环境分隔的所有层。

如在本文中使用的术语“细胞裂解”是指许多细胞之一的破裂，使得该细胞的外层被永久地或暂时地破裂以释放它们的内容物以用于进一步分析、修饰或使用。特别是，为了分析细胞内容物，例如基因组(DNA内容物)、蛋白质组(蛋白质内容物)、甲基化组(methylom)(DNA甲基化模式)、或转录组(RNA内容物))、以及细胞内结构例如细胞器、细胞骨架等，必须使该细胞破裂，即必须使它们的衣壳、细胞膜和/或细胞壁破裂。预期的是，外部细胞结构即衣壳、细胞膜和/或细胞壁刚性越大，越难以使它们破裂。特别是，细胞裂解可以是所述细胞壁和/或细胞膜的暂时破裂，使得在该细胞内的内容物可以被释放至外部环境，而所述细胞壁和/或细胞膜不被永久破坏。更特别是，暂时的细胞破裂或细胞裂解可以包括，当所述细胞是在水性培养基中并经受电动液压粉碎时在所述细胞的细胞膜和/或细胞壁中形成至少一个孔。该暂时的细胞破裂，即根据本发明的任意一方面的细胞裂解的方法的结果，可造成在细胞膜和/或细胞壁中形成至少一个孔。一个或多个孔是用于细胞内目标蛋白质和/或脂质离开该细胞进入在该细胞周围的水性培养基中的通道。

如在本文使用的术语“细胞壁”是指包围某些细胞类型即植物、酵母、真菌、藻类和某些原核生物的外部层。在一个实例中，该术语是指包围质膜并为细胞提供支撑的坚韧性或刚性层。在另一个实例中，细胞壁可以由一些组分构成，所述组分包括但不限于纤维素、半纤维素、果胶、肽聚糖、葡糖胺、壳质、糖蛋白和/或多糖。

如在本文中使用的术语“细胞膜”在最广泛的意义上通常是指将细胞的原生质与外部层和/或与细胞壁分隔的边界膜、外部膜、界面膜或原生质膜。细胞膜可以是脂质双层。

短语“多个孔”是指超过一个的孔。根据本发明的任意一方面的细胞膜和/或细胞壁可以包含多个孔(即，超过一个的孔)。如在本文中使用的术语“孔”是指开口，取决于在根据本发明的任意一方面的方法中所使用的目标细胞中存在什么，所述开口可以包括在细胞膜和/或细胞壁内的洞、裂口、腔、孔隙、裂隙、间隙或穿孔。在一个实例中，所述细胞可以是植物细胞，并且使用根据本发明的任意一方面的方法所形成的孔可以是贯穿该植物细胞的细胞壁和细胞膜的腔，其中所述腔具有足够大的直径以用于将目标蛋白质和/或脂质从该植物细胞内释放至周围水性培养基中。在另一个实例中，所述细胞可以是酵母细胞，并且当该酵母细胞经受电动液压粉碎时，在细胞膜和具有两层的β-葡聚糖的细胞壁中可以形成孔，形成用于一种或多种目标蛋白质和/或脂质从所述细胞的内部释放至周围水性培养基的通道。一个或多个孔可具有充足的尺寸以成为贯穿细胞膜和/或细胞壁的通道，以用于具有20kDa至120kDa之间的分子量的蛋白质和/或脂质的转运。特别是，所述孔可以是足够大以允许具有20kDa至120kDa之间的分子量的蛋白质从细胞内释放。更特别是，所述孔可以是足够大以允许具有以下分子量的蛋白质穿过：在20kDa至110kDa之间、在20kDa至100kDa之间、在20kDa至90kDa之间、在20kDa至80kDa之间、在20kDa至70kDa之间、在25kDa至120kDa之间、在25kDa至110kDa之间、在25kDa至100kDa之间、在25kDa至90kDa之间、在25kDa至80kDa之间、在25kDa至70kDa之间、在30kDa至120kDa之间、在30kDa至110kDa之间、在30kDa至100kDa之间、在30kDa至90kDa之间、或在30kDa至80kDa之间。

根据本发明的再另一方面，每个孔可以包括5至40nm之间的平均直径。应当理解，术语“孔”对孔的性质不施加任何几何限制，所述孔可以具有规则形态或不规则形态。还应当认识到，并非所有的孔都可以具有相同直径。如在本文中使用的术语“平均直径”是指不被预期在每个孔中相同的直径长度。“平均直径”是指在某种程度上代表多个孔或孔的总数的孔的直径。根据本发明的任意一方面的孔的平均直径可以是在1至50nm之间。特别是，所述孔的平均直径可以是在5至50之间、在10至50之间、在15至50之间、在20至50之间、在25至50之间、在30至50之间、在1至45之间、在5至45之间、在10至45之间、在15至45之间、在20至45之间、在25至45之间、在1至40之间、在5至40之间、在10至40之间、在15至40之间、在20至40之间、在25至40之间、在1至35之间、在5至35之间、在10至35之间、在15至35之间、在20至35之间、在25至35之间等。更特别是，所述孔的平均直径可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm。

在一个实例中，孔在细胞的细胞膜内形成，并且在另一个实例中，孔在细胞的细胞壁和细胞膜中。一个或多个孔可以在约75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的细胞膜和/或细胞壁表面上形成。这可以使用本领域已知的任何方法来测量。在一个实例中，共聚焦激光扫描显微镜可以用于估计被孔覆盖的膜和/或细胞壁的百分比。多个孔可以仅暂时地存在于细胞膜和/或细胞壁中。特别是，当根据本发明的任意一方面的细胞经受电动液压粉碎时，多个孔可以出现，并且当去除该电动液压粉碎时，该细胞中的所述多个孔可以停止存在。可理解的是，在该细胞经受电动液压粉碎的时间与在细胞膜和/或细胞壁中出现第一个孔的时间之间会存在第一潜伏期(latent)，并且在细胞不再经受电动液压粉碎的时间与在细胞膜和/或细胞壁中最后一个孔消失的时间之间会存在第二潜伏期。

根据本发明的任意一方面的细胞可以存在于水性培养基中。该水性培养基可以是具有≤400μS/cm的电导率的任何液体。任何电导计可以用于测量所述液体的电导率。特别是，该电导计可以是以电导率传感器或计量仪的形式。在一个实例中，该电导计可以是选自https://www.mt.com/de/en/ho me/perm-lp/product-organizations/pro/Conductivity-Meters-and-Sensors.html中的至少一种。特别是，该水性培养基可以是具有≤350、300、250、200、150、100、90、80、75、70μS/cm的电导率的任何液体。该水性培养基可以选自水、油类、表面活性剂、酸类、碱类、氧化剂、和它们的混合物。更特别是，该水性培养基可以是蒸馏水。进行根据本发明的任意一方面的细胞裂解的方法的容器可以能够容纳1至300升的所述水性培养基。更特别是，在该容器中的水性培养基的体积可以为约100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5升。如在本文中使用的术语“约”是指20％内的变化。特别是，如在本文中使用的术语“约”是指给定测量结果或值的±20％，更特别地是±10％，甚至更特别地是±5％。

如在本文中使用的术语“目标蛋白质和/或脂质”是指其在细胞中的表达令人感兴趣的蛋白质和/或脂质。根据本发明的任意一方面，可以释放至水性培养基中的来自细胞的目标蛋白质和/或脂质可以在该细胞中天然地产生。在另一个实例中，所述细胞可以被基因修饰，以在该细胞内产生目标蛋白质和/或脂质。所得目标蛋白质和/或脂质可以被称为异源目标蛋白质和/或脂质。特别是，术语“异源目标蛋白质和/或脂质”是指通常不由宿主细胞、组织或物种表达的重组蛋白质和/或脂质。根据本发明的任意一方面的术语“目标蛋白质和/或脂质”的使用包括异源目标蛋白质和/或脂质。所述目标蛋白质和/或脂质可以具有在20kDa至120kDa之间的分子量。特别是，所述目标蛋白质和/或脂质可以具有以下分子量：在20kDa至110kDa之间、在20kDa至100kDa之间、在20kDa至90kDa之间、在20kDa至80kDa之间、在20kDa至70kDa之间、在25kDa至120kDa之间、在25kDa至110kDa之间、在25kDa至100kDa之间、在25kDa至90kDa之间、在25kDa至80kDa之间、在25kDa至70kDa之间、在30kDa至120kDa之间、在30kDa至110kDa之间、在30kDa至100kDa之间、在30kDa至90kDa、或在30kDa至80kDa之间。更特别是，所述目标蛋白质可以具有以下分子量：在20kDa至110kDa之间、在20kDa至100kDa之间、在20kDa至90kDa之间、在20kDa至80kDa之间、在20kDa至70kDa之间、在25kDa至120kDa之间、在25kDa至110kDa之间、在25kDa至100kDa之间、在25kDa至90kDa之间、在25kDa至80kDa之间、在25kDa至70kDa之间、在30kDa至120kDa之间、在30kDa至110kDa之间、在30kDa至100kDa之间、在30kDa至90kDa之间、或在30kDa至80kDa之间。所述目标脂质可以具有以下分子量：在20kDa至110kDa之间、在20kDa至100kDa之间、在20kDa至90kDa之间、在20kDa至80kDa之间、在20kDa至70kDa之间、在25kDa至120kDa之间、在25kDa至110kDa之间、在25kDa至100kDa之间、在25kDa至90kDa之间、在25kDa至80kDa之间、在25kDa至70kDa之间、在30kDa至120kDa之间、在30kDa至110kDa之间、在30kDa至100kDa之间、在30kDa至90kDa之间、或在30kDa至80kDa之间。更特别是，所述目标脂质可以具有在30kDa至85kDa之间的分子量。甚至更特别是，所述目标脂质可以是来自酿酒酵母，并可以具有31kDa至84kDa之间分子量。根据本发明的任意一方面的目标脂质的实例可以是甾醇类(如羊毛甾醇、角鲨烯、酵母甾醇等)、磷脂类、脂肪酸等。

技术人员将理解，在根据本发明的任意一方面的方法中，从细胞中释放的目标蛋白质和/或脂质会与其它蛋白质和/或脂质一起释放。特别是，在根据本发明的任意一方面的方法的步骤(a)之后释放的细胞裂解产物可以富含目标蛋白质和/或脂质，但可以也包含其它组分。此类其它组分的实例包括但不限于，例如由宿主细胞或组织通常表达的蛋白质、细胞碎片和细胞肉汤(broth)。术语“细胞裂解产物”是指在根据本发明的任意一方面的细胞裂解方法的步骤(a)之后从细胞释放至水性培养基中的所得成分。该细胞裂解产物包含与目标蛋白质和/或脂质组合的如上限定的其它组分。

根据本发明的任意一方面，将目标蛋白质和/或脂质从细胞中分离的步骤(b)涉及将其它组分与所释放的目标蛋白质和/或脂质分离。由于根据本发明的任意一方面的细胞裂解方法不涉及细胞壁和/或细胞膜的完全破坏，因此在步骤(a)之后的细胞裂解产物中可能没有过多不需要的材料。任何已知的分离技术可以用于将目标蛋白质和/或脂质与其它组分分离。此类技术的实例包括但不限于例如尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、自由流动电泳、亲和色谱法、HPLC、冻干、提取、过滤(filtration)和离心、筛分、过滤(filtering)、洗涤、离心、微滤、填充床色谱法(“PBC”)、膨胀床色谱法(“EBC”)、或其它类型的柱色谱法。“将目标蛋白质和/或脂质从细胞中分离”的步骤不需要完全分离所有其它组分。由于根据本发明的任意一方面使用的细胞在步骤(a)中经受EHF处理和后EHF处理，因此并非所有细胞都已经被破坏，根据本发明的任意一方面的细胞裂解方法可以是有益于在步骤(b)中的后续下游处理(即，离心和过滤)。特别是，由于在EHF处理(即，步骤(a))之后剩余的细胞形式和尺寸，因此以电学方式裂解的细胞可以容易地与目标蛋白质和/或脂质分离(步骤(b))。由于可以减少纯化步骤的数量，因此下游处理变得更容易、更快、且成本密集更低(less cost intensive)。

离心可以用于将目标蛋白质和/或脂质从细胞中分离。可以使用任何类型的离心方法。离心的具体参数将至少部分地取决于以下因素：例如目标蛋白质的性质(例如，氨基酸序列和电荷)和/或脂质的性质、和表达目标蛋白质的宿主细胞的性质。可使用的离心方法的一个实例是连续盘堆离心机。在另一个实例中，EBC可以用于将目标蛋白质和/或脂质从细胞中分离。EBC是单程操作，其中，从粗制的含颗粒的溶液中纯化需要的蛋白质，而无需澄清、初始纯化或浓缩。尽管不必需，但EBC可以与先前的澄清步骤、纯化步骤或浓缩步骤例如离心、微滤等一起使用。EBC利用以均衡状态(equilibrium)悬浮的吸附床，所述均衡状态是由粒子沉降速度与向上液体流动速度之间的平衡而引起。吸附剂在所述床中膨胀，并在吸附剂粒子之间产生距离(该距离对应于空隙体积(void volume)，该空隙体积如在色谱技术中使用的该术语)，这提供细胞、细胞碎片和可存在于水性培养基中的其它颗粒的相对不受阻碍的通道。有用方案的具体参数将至少部分地取决于待分离的目标蛋白质的性质、所述目标蛋白质正在从宿主细胞中分离的宿主细胞、和其它此类因素。

EHF使用机械激波，所述机械激波在水性培养基中产生以引起能量耦合，所述能量耦合造成对细胞壁和/或细胞膜的组分的分离，从而造成至少一个孔或多个孔的形成。激波使用电-液压(electro-hydraulic)效应而产生，其中在作为一部分电极系统的至少两个电极之间的水性培养基中启动短期强电弧。还存在所使用的脉冲电容器，该脉冲电容器被充电至工作电压并借助于火花间隙被连接至在填充有水性培养基的容器中的电极系统。图3示出EHF可以如何用于造成细胞裂解。US20140326809、US7246761B2和CA2680667A1公开可用于根据本发明的任意一方面的方法中的合适的产生EHF的手段。特别是，所述工作电压为40kV至130kV，并且脉冲频率为1Hz。EHF持续时间可以依据材料(即，细胞、和细胞膜和/或细胞壁的厚度)而变化。通过产生激波，施加可以用于选择性细胞裂解的平行电场。静息膜电位在细胞膜方面占优势，依据细胞类型，所述静息膜电位为-50至-200mV。如果细胞暴露于电场，则该静息膜电位改变，并且由此丧失内稳态。膜稳定性的改变意味着磷脂现在会倾斜。该细胞膜不会撕裂，但形成预成孔(pre-pore)。该磷脂的再取向持续，直至在脂质双层中的实际孔形成，因此大分子(目标蛋白质和/或脂质)可以从该细胞的内部至外部穿透通过该双层。这在图2中示出。

根据本发明的任意一方面的方法的优点在于在电极之间的距离不影响细胞裂解方法的成功。由于所述激波的存在，所述电场均匀地扩散通过整个水性培养基，使得所有细胞可以独立于它们与所述电极的距离而裂解。为了实现最佳细胞裂解，所述工作电压可以在40至150kV的范围内。特别是，所述工作电压可以在40至140、40至130、40至120、40至110、40至100、50至150、50至140、50至130、50至120、50至110、50至100、60至150、60至140、60至130、60至120、60至110、60至100kV等的范围内。更特别是，所述工作电压可以为约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150kV。为了用所述工作电压实现最佳细胞裂解，在1Hz的频率的情况下，在水性培养基中存在的脉冲数可以是在40至1000之间。特别是，在1Hz的频率下，该脉冲数可以为40至900、40至800、40至700、40至600、40至500、40至400、40至300、40至200、40至100、50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、或100至500。由于根据本发明的任意一方面的最佳细胞裂解的脉冲频率可以为1Hz，因此脉冲数可以意指在水性培养基中的细胞可以经受EHF的秒数。

在一个实例中，为了实现最佳细胞裂解，所述工作电压为约40kV，所述脉冲频率为1Hz，并且施加了所述脉冲1000秒。在另一个实例中，所述工作电压为约130kV，所述脉冲频率为1Hz，并且施加了所述脉冲40秒。

在一个实例中，根据本发明的任意一方面的方法可以在能够进行激波破碎的设备中执行。该设备可以选自由Impulstec(Radebeul，德国)或Selfrag(瑞士)提供的设备等。更特别是，该设备可以是Impulstec EHF-400或SELFRAG Lab。

由于根据本发明的任意一方面的方法不造成细胞的完全破坏以用于待释放的目标蛋白质和/或脂质，因此所述细胞在步骤(b)之后可以被重复使用以用于下一培养。特别是，在EHF处理之后的细胞生存力可以为至少约5％。更特别是，细胞生存力可以为至少约4％、3％、2％或1％。然后，能存活的细胞可以被重新用于下一培养。可以使用本领域已知的任何方法以测定细胞生存力。在一个实例中，可以使用CFU/mL(菌落形成单位/mL)的测定。

根据本发明的任意一方面，约20％至90％的目标蛋白质和/或脂质可以从细胞释放至水性培养基中。特别是，在根据本发明的任意一方面的方法中，在细胞中存在的20％至90％、20％至85％、20％至80％、20％至75％、20％至70％、20％至65％、20％至60％、20％至55％、20％至50％、25％至90％、25％至85％、25％至80％、25％至75％、25％至70％、25％至65％、25％至60％、25％至55％、25％至50％、30％至90％、30％至85％、30％至80％、30％至75％、30％至70％、30％至65％、30％至60％、30％至55％、30％至50％、35％至90％、35％至85％、35％至80％、35％至75％、35％至70％、35％至65％、35％至60％、35％至55％、35％至50％、40％至90％、40％至85％、40％至80％、40％至75％、40％至70％、40％至65％、40％至60％、40％至55％、40％至50％、45％至90％、45％至85％、45％至80％、45％至75％、45％至70％、45％至65％、45％至60％、45％至55％、45％至50％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％、55％至90％、55％至85％、55％至80％、55％至75％、55％至70％、60％至90％、60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、65％至90％、65％至85％、65％至80％、65％至75％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、75％至90％、75％至85％、75％至80％的目标蛋白质和/或脂质可以从所述细胞释放至水性培养基中。更特别是，在根据本发明的任意一方面的细胞裂解方法中，来自细胞的约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％的目标蛋白质和/或脂质可以释放至水性培养基中。使用本领域已知的任何方法，可以测量释放至水性培养基中的目标蛋白质和/或脂质的百分比。在一个实例中，使用SDS-PAGE密度法，可以测量释放至水性培养基中的目标蛋白质和/或脂质的百分比。特别是，该SDS-PAGE密度法被描述于Muharram MM,Abdel-Kader MS中。将凝胶电泳用于消化酶木瓜蛋白酶的定量估计。Saudi Pharm J.2017；25(3):359-364。

在一个实例中，在细胞经受根据本发明的任意一方面的方法之前，可以首先将该细胞洗涤至少一次，以使尽可能多的培养基离开细胞沉淀物。

实施例

上文描述优选的实施方案，如由本领域技术人员会理解的，在不脱离权利要求的范围的情况下，所述优选的实施方案可以经受设计、构造或操作方面的变化或修改。例如，这些变化旨在被权利要求的范围所涵盖。

实施例1

使用具有1至3个电极的Impulstec EHF-400(Radebeul，德国)，通过EHF将具有细胞浓度62.5g/L和电导率150μS/cm的15L的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞悬浮液(Omas Ur-Hefe，Fala，德国)用于细胞裂解。在冷(4℃)蒸馏水中重新悬浮了该酵母细胞。将工作电压设定为40kV，频率为1Hz，并且将冲击能量设定为600J。将10,100或1000脉冲/激波施加至所述细胞。如使用电导计所测量的，在该细胞裂解之后的细胞悬浮液的电导率为1032μS/cm。使用来自PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒的二喹啉甲酸(BCA)测定，确定了释放的总蛋白质。使用该试剂盒所提供的标准方法。相比于作为基准的机械裂解物，释放了多37.1％的总蛋白质。如使用SDS-PAGE所示出，所释放的最大蛋白质具有约100kDa的尺寸。

实施例2

使用来自Selfrag(Switzerland)的SELFRAG Lab，通过EHF将具有细胞浓度62.5g/L和电导率153μS/cm的3L的酿酒酵母的细胞悬浮液用于细胞裂解。在冷(4℃)蒸馏水中重新悬浮了该酵母细胞。将工作电压设定为130kV，将冲击能量设定为1000J，并且频率为1Hz。施加了7或40脉冲/激波。在该细胞裂解之后的细胞悬浮液的电导率为1006μS/cm。通过BCA测定，确定了释放的总蛋白。相比于作为基准的机械裂解物，释放了多25.1％的总蛋白质。如使用SDS-PAGE所示出，所释放的最大蛋白质具有约100kDa的尺寸。

实施例3

细胞生存力的测量

通过菌落形成单位/毫升(CFU/mL)的测定，研究了细胞生存力。为此目的，在9mL的0.9％NaCl溶液中重新悬浮了1g的湿生物质。将未稀释的酵母和三种稀释液(10^-2；10^-4；10^-6)铺展(plate out)在Sabouraud(SAB)4％葡萄糖琼脂(Carl Roth，Karlsruhe，德国)上以用于各个处理。在每种情况下，将100μl线性地铺展。将琼脂板在30℃下孵育了48小时。然后，手动计数了菌落形成单位(CFU)。发现的是，在两个实施例中，4％的所述细胞可以被再循环。

Claims (15)

1.细胞裂解的方法，所述方法用于在水性培养基中的细胞的细胞壁和/或细胞膜中形成至少一个孔，以用于将至少一种细胞内目标蛋白质和/或脂质从所述细胞释放至所述水性培养基中，所述方法包括：

(a)使在所述水性培养基中的具有所述细胞内目标蛋白质和/或脂质的所述细胞经受电动液压粉碎；和

(b)将所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中分离，

其中，所述电动液压粉碎通过脉冲电流源引起，使在所述水性培养基中的所述细胞在容器的水下无线电波路径的至少两个电极之间在40至130kV的范围内的工作电压、50至1500J/电极的冲击能量、1Hz的脉冲频率下经受电冲击放电40至1000秒，由此在所述细胞壁和/或细胞膜中形成至少一个孔。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性培养基是具有小于400μS/cm的电导率的培养基。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述水性培养基是蒸馏水。

4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述细胞选自酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。

5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中从所述细胞中释放的所述细胞内目标蛋白质的尺寸为20kDa至100kDa。

7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述方法在能够进行激波破碎的设备中执行。

8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述工作电压为约40kV，所述脉冲频率为1Hz，并且施加所述脉冲1000秒。

9.根据权利要求1至7中的任意一项所述的方法，其中，所述工作电压为约130kV，所述脉冲频率为1Hz，并且施加所述脉冲40秒。

10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中1升至300升l的所述水性培养基存在于所述容器中。

11.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中使用至少一种选自以下的物理分离步骤来将所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中分离：尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、自由流动电泳、亲和色谱法、HPLC、冻干法、提取、过滤和离心。

12.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述目标脂质的尺寸为30至85kDa。

13.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，在步骤(b)之后，所述细胞被重复使用。

14.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中50％至90％的所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中释放。

15.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中70％至85％的所述目标蛋白质和/或脂质从所述细胞中释放。