CN117460537A - 核酸递送 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可以将治疗分子诸如核酸递送至哺乳动物细胞以及递送至人和动物体内的脂质/树枝状聚合物系统。例如，本发明提供了能够将核酸有效递送至淋巴器官、骨骼肌、脑和脂肪组织以及肿瘤组织、肝和肺的系统。提供了DNA和RNA的递送。具体地，本发明的该系统可以递送mRNA。

Description

核酸递送

技术领域

本发明涉及可以将治疗分子(诸如核酸)递送至哺乳动物细胞以及递送至人和动物体内的组合物。示出了递送至某些细胞类型，例如递送至淋巴组织和循环中的白细胞。还示出了递送至某些器官和组织。例如，本发明提供了能够将核酸有效递送至脾、淋巴器官、骨骼肌、脑和脂肪组织以及肺、肿瘤组织、心脏、骨骼肌、脂肪组织、脑、肝和肾的组合物。提供了DNA和RNA的递送。具体地，示出了mRNA的递送。

背景技术

为了让作为变革医疗保健的下一代精准医学的核酸疗法充分发挥潜力，必须解决药物递送这一关键挑战。目前的病毒和非病毒载体平台的局限性严重阻碍了发展，许多疗法由于脱靶效应、免疫系统激活和难以大规模生产而在临床转化阶段失败。

在体内递送核酸的背景下，病毒衍生剂是最强效的载体，其中一些在临床上已取得了很大进展(Sheridan等人，2011)。具体地，腺相关病毒(AAV)是用于体内递送的有效系统(Wang等人，2019)。然而，此类系统的应用受到限制，因为它们仅能够转运＜5kb的DNA，而不能转运RNA或更大的DNA。此外，尽管病毒载体取得了进展，但使用这类核酸递送载体仍存在问题，诸如潜在的随机插入和免疫毒性。例如，AAV递送可以是高度免疫原性的，特别是当需要高剂量靶向除肝以外的组织时。AAV递送系统还存在重复给药的限制。患者通常会对AAV递送系统产生免疫力，使得重复给药不可行。最后，AAV递送系统生产起来很昂贵，并且难以按照良好生产规范(GMP)等级大规模生产。

鉴于病毒系统的缺点，目前正在研究用于将核酸递送到体内细胞和组织的非病毒载体。已经开发了用于递送较小核酸诸如siRNA和反义寡核苷酸(ASO)的不同递送技术。这些技术包括生物缀合的寡核苷酸递送系统，其中siRNA或ASO缀合至抗体或配体(Benizri等人，2019)。但siRNA和ASO疗法只能实现基因沉默或外显子跳跃，而不能实现基因表达。对于许多疾病，用DNA或mRNA表达功能性基因将是有利的。应用缀合系统来有效递送较大基因有效载荷诸如质粒DNA或mRNA具有挑战性。质粒DNA或mRNA是较大的带负电的分子，不易穿过带负电的细胞膜。当递送媒介物包封它们并中和电荷时，这对于有效递送很有用。

脂质纳米颗粒(LNP)作为包封性非病毒递送媒介物，已被用于mRNA递送，例如在COVID-19疫苗中(Qui等人，2021)。为了教导免疫系统对抗病毒，在注射部位局部转染相对少量的免疫细胞和肌细胞就已足够。因此，肌内施用基于RNA的COVID-19疫苗。然而，只有转染许多特定类型的细胞(这可能需要静脉内注射)，才能有效治疗多种多样的疾病。目前临床上使用的LNP的表面特性使得它们在静脉内施用时非常适合靶向肝。但是目前临床上使用的LNP不太适合靶向许多其他组织。

也已经研究了各种基于脂质体的系统，例如涉及不带电荷的脂质诸如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或阳离子脂质诸如1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)和N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(Braum，2019；Ren等人，2000)。类似的脂质体已在临床上用于核酸递送，结果显示出适度功效。

已经研究了将肽添加到基于脂质的载体中。在肽/脂质混合系统中，肽和脂质与核酸缔合而形成可以被细胞内化的纳米颗粒。肽成分可以是直链的(Kwok等人，2016)或支链的，诸如肽树枝状聚合物(Kwok等人，2013)。然而，这项有关肽/脂质混合系统的先前工作仅是在体外无血清条件下对双链质粒DNA(pDNA)和短干扰RNA(siRNA)进行的，与体内条件有很大不同。尚不清楚该系统是否可以用于体内核酸递送。仅报道了在体内使用肽树枝状聚合物/脂质纳米颗粒递送短单链寡核苷酸(Saher等人，2018；Saher等人，2019)，观察到与单独的ASO相比，ASO肝递送只有20％至30％的低增加。从该数据可以得出结论，肽树枝状聚合物系统可能不能将甚至更大的核酸诸如mRNA递送至体内组织。以前从未证实在体内使用肽树枝状聚合物/脂质混合系统递送长核酸诸如mRNA。

本发明是根据上述考虑而设计的。

发明内容

核酸疗法的开发依赖于有效的核酸递送。本发明人已使用肽树枝状聚合物开发了用于核酸递送的框架。这些树枝状聚合物是支链肽，它们在充当树枝状聚合物分子内的分支单元的″分支残基″之间展示一个、两个、三个或四个氨基酸残基。本发明出人意料地能有效递送较大的核酸(例如，大于反义寡核苷酸ASO)。虽然一些较小的核酸诸如ASO即使没有载体系统也容易被摄入细胞中，但本发明的组合物允许较大的核酸诸如mRNA被有效地递送。这开辟了CRISPR介导的基因编辑和相关技术等领域的临床应用，而无需病毒递送载体。

专门开发组织特异性mRNA递送系统代表着一项重大进展，因为目前仍缺乏绕过肝的临床mRNA或CRISPR盒(即sgRNA和Cas9 mRNA)递送系统。本发明可以有效地将细胞中的CRISPR盒和mRNA递送至各种组织，特别是递送至肺和富含免疫细胞的组织，包括脾、淋巴结和骨髓。这允许开发对肝外组织的mRNA和CRISPR疗法。将mRNA递送至免疫细胞，在更大程度上递送至包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞的髓样细胞的能力，使得该技术能够被开发用于治疗所有癌症类型(包括实体瘤和血癌，诸如骨髓增生异常综合征(MDS)和慢性粒单核细胞白血病(CMML)、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩病、葡萄膜炎、炎性肠病)以及其他免疫细胞相关障碍，诸如戈谢病。本发明还允许将mRNA递送至肺和/或免疫细胞，使得对肺相关疾病诸如囊性纤维化和慢性阻塞性肺部疾病的治疗成为可能。

本发明人还已发现其基于树枝状聚合物的系统具有令人惊讶的通用性。可以使用一系列第一代、第二代和第三代树枝状聚合物递送DNA和RNA分子。在一个示例中，与一些主要的商业试剂诸如Lipofectamine 2000相比，基于树枝状聚合物诸如与脂质缔合的G1，2，3-KL树枝状聚合物(″第三代″树枝状聚合物)的载体系统可以将DNA的细胞转染提高6至10倍。在另一个示例中，与一些主要的商业试剂诸如Lipofectamine 2000相比，基于树枝状聚合物诸如与脂质缔合的G1，2-RL,3-LR树枝状聚合物(″第三代″树枝状聚合物)的载体系统可以将细胞转染核酸诸如mRNA提高10倍。此外，可以靶向某些器官和组织。如下文更详细描述的，本发明人已发现基于树枝状聚合物的系统令人惊讶地稳健和通用，在体外在存在血清的情况下表现出高活性并且在体内表现出意想不到的组织靶向特性。下面讨论DNA和RNA的有效递送。

本发明人已发现，对于DNA递送，G1,2，3-KL和G1，2，3-RL(″第三代″树枝状聚合物)以及在一定程度上G1，2-KL、G1，2-RL(均为″第二代″树枝状聚合物)能够在存在血清的情况下转染HeLa和Neuro2A细胞。(血清组分对体内DNA递送，特别是全身递送提出了挑战，因为诸如白蛋白之类的组分可能干扰阳离子制剂。)这一意外发现促使本发明人研究细胞进入的背后机制，并评估这种载体系统在体内的能力。令人惊讶的是，发现基于G1，2，3-RL的载体在全身递送后介导功能性核酸有效递送至某些组织中。对肝和骨骼肌有高靶向性。内吞途径分析表明G1,2，3-RL DNA复合物通过网格蛋白、小窝介导的内吞作用和巨胞饮作用来递送DNA。

本发明人已发现，对于mRNA递送，具有1代或2代的树枝状聚合物(例如RHCG1-R、RHCG1，2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL、2-LR)可以有效地转染细胞并且介导与具有3代的树枝状聚合物类似的转染效率(见图28A，其示出了在完全生长培养基条件(包括血清)下转染HeLa细胞的功效)。这指示用于RNA递送的混合系统的特定通用性。

本发明中使用的树枝状聚合物是第一代、第二代或第三代肽树枝状聚合物，这意味着它们具有散布在″分支″残基(诸如赖氨酸)之间的至多三″层″肽基序(其通常是二肽基序)。第一代树枝状聚合物具有以下结构，其以N端至C端取向示出并将Lys当作分支单元：

(N端-Pep1)₂-Lys-(核心)-(C端)

第二代树枝状聚合物具有以下结构，其以N端至C端取向示出并将Lys当作分支单元：

(N端-Pep2)₄-Lys₂-(Pep1)₂-Lys-(核心)-(C端)

第三代树枝状聚合物具有以下结构，其以N端至C端取向示出并将Lys当作分支单元：

(N端-Pep3)₈-Lys₄-(Pep2)₄-Lys₂-(Pep1)₂-Lys-(核心)-(C端)

图31中以图解的方式表示了第三代树枝状聚合物(N端在左侧并且C端在右侧)。

圆形表示核心序列。每个三角形表示分支残基，诸如赖氨酸。每个矩形表示肽基序。第三代树枝状聚合物的第一层中有两个肽基序，第二层中有四个肽基序，并且第三层中有八个肽基序。N端和C端可以用另外的化学基序来衍生化，如本文所讨论的。例如，虽然在未衍生化的实施方案中，C端是羧酸，但在其他实施方案中，作为用于合成树枝状聚合物的化学途径的结果，C端被衍生化，例如以包含伯酰胺基团CONH₂(而不是COOH)。还设想了功能上重要的衍生化诸如靶向部分(例如抗体、肽基团、糖基团和/或脂质链)，其可以连接到N端和/或C端，或连接在沿着树枝状聚合物的其他位置。

如本文所述，树枝状聚合物可以是第一代、第二代或第三代。这可以在结构上定义如下：第一代树枝状聚合物包含核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序。两个第一肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。第二代树枝状聚合物还包含两个第二分支残基(例如赖氨酸)和四个第二肽基序，其中第二分支残基中的一者共价键合至第一肽基序中的一者，并且另一第二分支残基共价键合至另一第一肽基序，并且其中每个第二分支残基共价键合至两个第二肽基序。四个第二肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。第三代树枝状聚合物还包含四个第三分支残基(例如赖氨酸)和八个第三肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至第三分支残基中的一者，使得每个第三分支残基共价键合至一个第二肽基序，并且其中每个第三分支残基共价键合至两个第三肽基序。八个第三肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。当存在时，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自可以包含(1)具有碱性侧链的氨基酸，诸如但不限于赖氨酸(K)或精氨酸(R)或组氨酸(H)，(2)具有酸性侧链的氨基酸，诸如但不限于天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)，(3)具有非极性侧链的氨基酸，诸如但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、β-丙氨酸(B)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、氨基己酸(X)和半胱氨酸(C)，以及(4)具有不带电的极性侧链的氨基酸，诸如但不限于天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)。

下表2中给出了优选的树枝状聚合物。特别讨论了某些示例。例如，在每个肽基序是Arg-Leu(RL)二肽的树枝状聚合物中，该结构可以表示为G1-RL、G1，2-RL和G1，2，3-RL。在每个肽基序是Lys-Leu(KL)二肽的树枝状聚合物中，该结构表示为G1-KL、G1，2-KL和G1，2，3-KL。在每个肽基序是Leu-Arg(LR)二肽的树枝状聚合物中，该结构表示为G1-LR、G1，2-LR和G1，2，3-LR。

(″G1″、″G2″和″G3″分别指第一层、第二层和第三层的″第1代″、″第2代″和″第3代″肽基序。每个氨基酸残基可以是L-氨基酸或D-氨基酸。D-氨基酸可以使用单字母代码中的小写字母表示。另选地，其中每个氨基酸是D-同工型的树枝状聚合物可以在树枝状聚合物的简式表示之前加上在前的″D-″进行书写。

因此，在第一方面，本发明提供了一种用于医学的组合物，其中该组合物包含第一代、第二代或第三代肽树枝状聚合物、核酸和脂质。该组合物还包含核酸和脂质。肽树枝状聚合物至少包含：核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序。该分支残基可以是赖氨酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸或二氨基丙酸。该核酸包括至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸的核酸。

在第二方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含肽树枝状聚合物、核酸和脂质，其中该肽树枝状聚合物至少包含：核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序。该分支残基可以是赖氨酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸或二氨基丙酸。该核酸包括至少30、至少35、至少40、至少45或至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸的单链核酸。

在第三方面，本发明提供了一种将核酸递送至需要递送的受试者的细胞中的方法，该方法包括向受试者施用药学有效量的组合物。该组合物包含肽树枝状聚合物、核酸和脂质，其中该肽树枝状聚合物至少包含：核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序。该分支残基可以是赖氨酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸或二氨基丙酸。该核酸包括至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸的核酸。该核酸可以是单链的。

在一些实施方案中，该核酸是RNA。例如，该RNA可以选自mRNA、ssRNA、dsRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、IncRNA、siRNA、saRNA和/或自扩增RNA。优选地，该RNA是mRNA。

在一些实施方案中，该核酸是DNA。例如，该DNA可以包括ssDNA、dsDNA、质粒和/或cDNA。

为了避免任何疑问；该组合物可以包含超过一种核酸(例如超过一种类型的RNA分子)。类似地，该组合物可以包含超过一种脂质。该组合物可以包含超过一种肽树枝状聚合物。

在一些实施方案中，该组合物包含RNA核酸和DNA核酸。RNA核酸和DNA核酸可以是单个核酸分子的一部分。

在一些实施方案中，该核酸包括经修饰的核酸。本文描述了示例性的核酸修饰。

优选地，该核酸编码转基因并且能够在靶细胞中表达转基因。该转基因可以是蛋白质或肽。附加地或另选地，该核酸可以调节内源基因的表达或活性。该调节可以是该基因的表达的增加和/或该基因的另外拷贝的外源表达的增加，或者该调节可以是该基因的表达的降低。

在一些实施方案中，经调节的内源基因是表达蛋白质或肽的基因。

在一些实施方案中，该蛋白质或肽包括抗原、激素、受体、嵌合抗原受体、转录因子和/或细胞因子。

在一些实施方案中，该转基因包括肿瘤抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或寄生于哺乳动物的微生物的蛋白。

在一些实施方案中，该组合物可以用作疫苗。

在一些实施方案中，该核酸包括或编码自扩增RNA。

在一些实施方案中，用途包括治疗受试者的遗传性障碍。

在一些实施方案中，该核酸表达在受试者中无功能、下调、失活或受损的基因的功能型式。

在一些实施方案中，该核酸编码和/或包含用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统的一种或多种组分。例如，用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统可以是CRISPR/Cas系统。该核酸可以编码Cas蛋白或肽，和/或包括sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。该核酸可以包括编码Cas蛋白或肽的mRNA以及含sgRNA的RNA序列。该组合物可以包含编码Cas蛋白或肽的mRNA以及含sgRNA的另一RNA(作为单独的分子)。在一些实施方案中，当存在时，sgRNA、crRNA、tracrRNA和编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者是单个核酸的一部分。在一些实施方案中，当存在时，sgRNA、crRNA、tracrRNA和编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者存在于两个或更多个核酸上。

在一些实施方案中，该组合物靶向脾、淋巴组织、骨骼肌、脑和脂肪组织，以及靶向肺、肿瘤组织、心脏、骨骼肌、脂肪组织、脑、肝和肾。

在一些实施方案中，该组合物靶向脾、淋巴组织、肺和/或骨。在这些实施方案中，该核酸可以是RNA，例如mRNA。

在一些实施方案中，将该核酸递送至作为白细胞的细胞，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞或单核细胞；淋巴结组织细胞、髓样细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、肝细胞、星形细胞、神经元、星形胶质细胞、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞、干细胞和/或肿瘤细胞。

在一些实施方案中，向受试者施用该组合物，使得该核酸递送至免疫细胞。

在一些实施方案中，该核酸在靶细胞中表达免疫分子或转录因子。该免疫分子可以是T细胞受体、嵌合抗原受体、细胞因子、诱饵受体、抗体、共刺激受体、共刺激配体、检查点抑制剂、免疫缀合物或肿瘤抗原。

在一些实施方案中，该细胞是B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞或肿瘤相关中性粒细胞。

在一些实施方案中，该核酸是RNA，例如mRNA。

在一些实施方案中，该组合物用于治疗受试者的癌症的方法中。该癌症可以是血癌，例如白血病、淋巴癌、骨髓瘤或骨髓增生异常综合征；或肺癌、贲门癌、肉瘤或肝癌。该治疗还可以包括施用抗癌剂。该癌症可以是非小细胞肺癌、晚期黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胆管癌(胆管细胞癌)、胆囊癌、神经内分泌肿瘤、肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。

在一些实施方案中，该组合物用于治疗肺部疾病的方法中。例如，该组合物可以用于治疗慢性阻塞性肺部疾病(COPD)或囊性纤维化(CF)。

在一些实施方案中，该组合物用于治疗受试者的自身免疫性疾病的方法中。

在一些实施方案中，该组合物用于治疗受试者的庞贝病、肌肉萎缩疾病、肌病或肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症。在这些实施方案中，该核酸可以是DNA。

在一些实施方案中，该组合物用于治疗受试者的肢体缺血，诸如糖尿病性肢体缺血，并且其中该转基因是肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)。

在一些实施方案中，两个第一肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物还包含两个第二分支残基(例如赖氨酸)和四个第二肽基序，其中第二分支残基中的一者共价键合至第一肽基序中的一者，并且另一第二分支残基共价键合至另一第一肽基序，并且其中每个第二分支残基共价键合至两个第二肽基序。

在一些实施方案中，四个第二肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物还包含四个第三分支残基(例如赖氨酸)和八个第三肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至第三分支残基中的一者，使得每个第三分支残基共价键合至一个第二肽基序，并且其中每个第三分支残基共价键合至两个第三肽基序。

在一些实施方案中，八个第三肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

每个肽基序独立地包含天然存在的L-或D-氨基酸和/或非天然存在的L-或D-氨基酸，例如β-丙氨酸(B)或氨基己酸(X)。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和/或第三肽基序包含具有碱性侧链的氨基酸。

在一些实施方案中，核心序列包含具有可电离基团的氨基酸残基，诸如组氨酸。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和/或第三肽基序包含具有非极性侧链的氨基酸。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和/或第三肽基序包含具有酸性侧链的氨基酸。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和/或第三肽基序包含具有不带电的极性侧链的氨基酸。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序(当存在时)包含a)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；和/或b)亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)或异亮氨酸(I)。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和/或第三肽基序包含亮氨酸(L)和/或精氨酸(R)残基。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物包含表2中列出的结构。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物还包含组织和/或细胞靶向基序。该组织或细胞靶向基序可以包括肌肉靶向基序例如GAASSLNIA(SEQ ID NO：1)、整合素靶向基序例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)或化学修饰，例如包含甘露糖糖基化。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物还包含细胞穿透肽。该细胞穿透肽可以包含TAT衍生序列。该细胞穿透肽可以包含肽序列XRXRRBRRXRRBRXB(SEQ ID NO：2)，其中X是6-氨基己酸并且B是β-丙氨酸。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物还包含烷基链、烯基链、抗体或其片段、糖和/或脂肪酸。烷基或烯基链可以例如在该肽树枝状聚合物的C端缀合至核心肽序列。另选地，该烷基或烯基链可以缀合至该肽树枝状聚合物的N端。

在一些实施方案中，烷基或烯基链包含约5个碳至约50个碳，优选地约12至约30个碳。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物包含与该肽树枝状聚合物的C端缀合的脂肪酸。在其他实施方案中，该肽树枝状聚合物包含与该肽树枝状聚合物的N端缀合的脂肪酸。

在一些实施方案中，该组合物的脂质包括阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和/或可电离脂质。

在一些实施方案中，该组合物的脂质包括饱和脂肪酸。附加地或另选地，该组合物的脂质可以包括不饱和脂肪酸。

在一些实施方案中，该脂质包含1、2、3、4、5或6条脂肪酸链。优选地，该脂质包含2、3、4或6条脂肪酸链。

在一些实施方案中，该脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)。在一些实施方案中，该脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。

在一些实施方案中，N/P比率介于约0.01∶1与100∶1之间。例如，N/P比率可介于约0.05∶1与50∶1之间，或介于约0.1∶1与30∶1之间。还设想了更窄的范围，诸如0.2∶1与25∶1之间以及0.5∶1与20∶1之间。

在一些实施方案中，N/P比率介于1∶1与50∶1之间。在一些实施方案中，在向受试者施用后，在脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的该组合物。

在一些实施方案中，N/P比率介于0.01∶1与1∶1之间。在一些实施方案中，在向受试者施用后，在肺、脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的该组合物。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物、核酸和脂质形成带正电的颗粒。

在其他实施方案中，该肽树枝状聚合物、核酸和脂质形成带负电的颗粒或带中性电荷的颗粒。

在一些实施方案中，与使用基于脂质的核酸递送系统将相同核酸递送至相同组织或细胞类型相比，核酸至靶组织或靶细胞的递送增加了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、75％、85％、90％、95％、100％。靶细胞或靶组织是本文所定义的细胞类型或器官/组织。例如，靶组织可以是脾、淋巴器官、骨骼肌、脑和脂肪组织，以及肺、肿瘤组织、心脏、骨骼肌、脂肪组织、脑、肝和肾。基于脂质的核酸递送系统可以是DOTMA/DOPE。

可以将组合物静脉内、肌内、瘤内、皮下、皮内或腹膜内施用于受试者。

在一些实施方案中，该组合物包含在液体内。在其他实施方案中，该组合物作为干燥组合物(例如干燥粉末)提供。可以使用冻干和/或冷冻干燥技术制备干燥组合物。

在特定实施方案中；第三代肽树枝状聚合物包含：第一赖氨酸残基和两个第一肽基序；两个第二赖氨酸残基和四个第二肽基序；四个第三赖氨酸残基和八个第三肽基序；以及与该第一赖氨酸残基共价键合的核心肽序列，

(i)其中该第一赖氨酸残基共价键合至两个第一肽基序，该两个第一肽基序分别共价键合至该两个第二赖氨酸残基；

(ii)其中每个第二赖氨酸残基共价键合至两个第二肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至该第三赖氨酸残基中的一者；以及

(iii)其中每个第三赖氨酸残基共价键合至该第三肽基序中的两者，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序独立地是单肽、二肽、三肽或四肽基序。该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序中的每一者可以包含精氨酸(R)或赖氨酸(K)；和/或b)亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)或异亮氨酸(I)。(术语″共价键合″是指所列举的部分之间的直接共价键合，没有任何中间原子。因此，在第一赖氨酸残基和每个第二赖氨酸残基之间仅存在单肽基序、二肽基序、三肽基序或四肽基序；并且在每个第二赖氨酸残基和每个第三赖氨酸残基之间仅存在单肽基序、二肽基序、三肽基序或四肽基序。)

在一些实施方案中，当存在时，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自可以包含(1)具有碱性侧链的氨基酸，诸如但不限于赖氨酸(K)或精氨酸(R)或组氨酸(H)，(2)具有酸性侧链的氨基酸，诸如但不限于天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)，(3)具有非极性侧链的氨基酸，诸如但不限于甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、β-丙氨酸(B)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、氨基己酸(X)和半胱氨酸(C)，以及(4)具有不带电的极性侧链的氨基酸，诸如但不限于天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)。

优选地，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少一者包含精氨酸(R)。第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少两者可以包含精氨酸(R)。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序全都包含精氨酸(R)。

优选地，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少一者包含亮氨酸(L)。第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少两者可以包含亮氨酸(L)。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序全都包含亮氨酸(L)。

在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自是二肽基序。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自是三肽基序。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自是四肽基序。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序各自独立地是单肽、二肽、三肽或四肽基序。优选地，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少一者是包含亮氨酸(L)和精氨酸(R)两者的二肽基序。在一些实施方案中，第一肽基序、第二肽基序和第三肽基序中的至少两者是包含亮氨酸(L)和精氨酸(R)两者的二肽基序。在特别优选的实施方案中，每个肽基序是包含亮氨酸(L)和精氨酸(R)两者的二肽基序。每个氨基酸残基独立地选自L-同工型或D-同工型。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物选自表2中所列的该肽树枝状聚合物中的任一者。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RL)₈(KRL)₄(KRL)₂K-核心的G1，2，3-RL。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RL)₈(KRL)₄(KLR)₂K-核心的G1-LR，G2,3-RL。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(rl)₈(krl)₄(krl)₂k-核心的G1，2，3-rl(其中″r″是D-精氨酸，T是D-亮氨酸并且″k″是D-赖氨酸。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)₈(KRL)₄(KRL)₂K-核心的G1，2-RL，G3-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RL)_s(KLR)₄(KLR)₂K-核心的G1，2-LR，G3-RL。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)₈(KLR)₄(KLR)₂K-核心的G1，2，3-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(R)2KRHC-NH2的RHCG1-R。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(R)4(KR)2KRHC-NH2的RHCG1，2-R。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)2KRHC-NH2的RHCG1-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)4(KRL)2KRHC-NH2的RHCG1-RL，2-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)₈(KRL)₄(KRL)₂KGSC-NH₂的G1,2-RL，3-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RLR)2KRHC-NH2的RHCG1-RLR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RLR)4(KRLR)2KRHC-NH2的RHCG1,2-RLR

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LRLR)2KGSC-NH2的G1-LRLR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)8(KRL)4(KRL)2KRHC-NH2的RHCG1,2-RL，3-LR。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(RL)s(KRL)4(KRL)₂KGSC-NH₂的G1,2,3-RL。

在一些实施方案中，该肽树枝状聚合物是包含(LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIAXRXRRBRRXRRBRXB-NH2的NTX1(其中X＝6-氨基己酸并且B＝β-丙氨酸)。

(″G1″是指第一层的″第1代″肽基序。″G2″是指第二层的″第2代″肽基序。″G3″是指第三层的″第3代″肽基序。)

因此，本发明提供用于医学的组合物，该组合物包含：本文所述的核酸、脂质和树枝状聚合物。该树枝状聚合物可以是第一代树枝状聚合物或第二代树枝状聚合物或第三代树枝状聚合物。优选地，N/P比率(即，肽的量(通过肽上的带1+电荷的氮原子的数量N来测量)比核酸的量(通过主链中带1-电荷的磷酸基团的数量P来测量))大于0.05∶1，例如大于0.1∶1。(N/P比率术语可以表示为″N/P″、″N∶P″或″NP″。)在一些实施方案中，N/P比率为0.15∶1或约0.15∶1或至少0.15∶1。在一些实施方案中，N/P比率为0.16∶1或约0.16∶1或至少0.16∶1。在一些实施方案中，N/P比率为至少或大于1∶1，例如约2∶1或更大、约2.5∶1或更大、约3∶1或更大、约4∶1或更大、约5∶1或更大、约10∶1或至多20∶1。在一些实施方案中，N/P比率为约5∶1、约8∶1、约10∶1或约20∶1。在一些实施方案中，N/P比率在约2∶1至约20∶1或约2.5∶1至约10∶1的范围内。

该组合物的脂质组分可以包括DOTMA、DOPE、DOPC和/或DOPG。

脂质组分的量可以表示为相对于该组合物中核酸的量的重量：重量比率(″w/w″或″w∶w″)，可以在1∶50至50∶1的范围内。更优选地，脂质的量(按重量计)相对于核酸的量(按重量计)为1∶1至50∶1，或2∶1至20∶1。脂质核酸比率可以为至少2∶1。最优选地，脂质：核酸的重量∶重量比率为约10∶1。这些比率涉及总脂质的重量。如本文所述，该组合物可以包含含有超过一种脂质组分的脂质，例如两种、三种或四种脂质的混合物。脂质组分的重量是这些脂质组分的总(组合)重量。优选地，每种脂质组分以大约相等的比例混合。

相关地，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的核酸、脂质和第一代、第二代或第三代树枝状聚合物以及药学上可接受的赋形剂。

形成本发明的组合物的一部分的核酸可以是反义寡核苷酸(ASO)。优选地，ASO为至少20个核苷酸长、至少25个核苷酸长、至少30个核苷酸长、至少35个核苷酸长，或具有如结合本文其他地方所公开的核酸指定的长度，例如至少40个核苷酸长。

形成本发明的组合物的一部分的核酸可以是mRNA分子。形成本发明的组合物的一部分的核酸可以是IncRNA分子。形成本发明的组合物的一部分的核酸可以包含CRISPR序列。形成本发明的组合物的一部分的核酸可以包含双链区。该核酸可以是siRNA分子。该核酸可以是小激活RNA(saRNA)分子。该核酸可以是自扩增RNA分子。该核酸可以是可以在靶细胞中表达siRNA或saRNA分子的DNA质粒。该核酸可以是DNA质粒(线性或环状的)，例如可以在靶细胞中表达转基因的质粒。

该转基因可以是病毒蛋白、细菌蛋白或寄生于哺乳动物的微生物的蛋白。表达病毒蛋白、细菌蛋白或寄生微生物蛋白的组合物可以用作疫苗。例如，可以将有效量的组合物全身(例如静脉内)递送至受试者以实现病毒蛋白、细菌蛋白或寄生微生物蛋白在受试者骨骼肌中的表达，从而引发对该病毒、细菌或寄生蛋白的免疫应答。因此，本发明提供了给受试者接种疫苗的方法，以及用于给受试者接种疫苗的组合物。在此类示例中，该转基因可以在本文所述的免疫细胞中表达，例如白细胞，诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞或单核细胞；淋巴结组织细胞。

该转基因可以表达用于基因疗法的治疗性蛋白质。基因疗法可以用于治疗患者的遗传性障碍。遗传性障碍可以是单基因遗传障碍，例如患者的肌营养不良症。在单基因遗传障碍是肌营养不良症的实施方案中，该转基因可以是肌营养不良蛋白。在障碍是局部缺血的实施方案中，该转基因可以是肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在障碍是肌肉萎缩的实施方案中，该转基因可以是卵泡抑素。在障碍是神经肌肉疾病的实施方案中，该转基因可以是酸性α-葡糖苷酶(GAA)。虽然该转基因可以在本文所公开的组织中的一者或多者中表达，但表达的蛋白质可以从组织分泌到循环中。

设想了本发明可以用于递送核酸疗法以治疗肌病。还设想了本发明可以用于递送核酸疗法以治疗肌营养不良症，诸如杜氏肌营养不良症、肌强直性营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、贝克型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症、遗传性肌营养不良症、先天性肌营养不良症和远端型肌营养不良症。

核酸疗法可以用于治疗肌肉萎缩病症，诸如恶病质。核酸疗法可以用于治疗其他肌肉障碍，诸如遗传性肌肉障碍，例如先天性肌强直或家族性周期性麻痹。核酸疗法可以用于治疗运动神经元疾病，诸如ALS(肌萎缩侧索硬化)、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)或脊髓性肌萎缩症(SMA)。核酸疗法可以用于治疗线粒体病诸如弗里德希氏共济失调(FA)，或线粒体肌病诸如卡恩斯-塞尔综合征(KSS)、莱氏综合征(亚急性坏死性脑肌病)、线粒体DNA耗竭综合征、线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)、线粒体神经胃肠脑肌病(MNGIE)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)、神经病、共济失调和视网膜色素变性症(NARP)、皮尔逊综合征或进行性眼外肌麻痹(PEO)。核酸疗法可以用于治疗先天性肌病，诸如帽肌病、中央核肌病、先天性纤维类型不均衡肌病、轴空肌病、中央轴空病、多微小轴空肌病、肌球蛋白沉积性肌病、肌管性肌病或杆状体肌病。核酸疗法可以用于治疗远端肌病，诸如GNE肌病/Nonaka肌病/遗传性包涵体肌病(HIBM)、Laing远端肌病、Markesbery-Griggs迟发性远端肌病、Miyoshi肌病、Udd肌病/胫骨肌营养不良症、VCP肌病/IBMPFD、声带和咽部远端肌病或Welander远端肌病。核酸疗法可以用于治疗内分泌肌病，诸如甲亢肌病或甲减肌病。核酸疗法可以用于治疗炎性肌病，诸如皮肌炎、包涵体肌炎或多肌炎。核酸疗法可以用于治疗代谢性肌病，诸如酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD，庞贝病)、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症(科里病、福布斯病)、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症(垂井病)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症或磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔病)。核酸疗法可以用于治疗肌原纤维肌病或肩腓骨肌病。核酸疗法可以用于治疗神经肌肉接头疾病，诸如先天性肌无力综合征(CMS)、兰伯特-伊顿肌无力综合征(LEMS)或重症肌无力(MG)。核酸疗法可以用于治疗周围神经疾病，诸如腓骨肌萎缩症(CMT)或巨轴索神经病(GAN)。核酸疗法可以用于治疗心血管疾病，诸如血栓闭塞性脉管炎/伯格病、糖尿病周围神经病变(也在ALS、严重肢体缺血和足部溃疡中测试)、外周动脉疾病、肢体缺血、严重肢体缺血(也称为慢性肢体威胁性缺血和糖尿病性肢体缺血)、严重外周动脉闭塞性疾病(PAOD)或间歇性跛行/动脉硬化。核酸疗法可以用于治疗传染病，诸如COVID-19、HIV、HBV、HCV、埃博拉病毒和马尔堡病毒、西尼罗河热、SARS、禽流感、HPV、巨细胞病毒或疟疾。核酸疗法可以用于治疗癌症，诸如肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、急性髓细胞性白血病或B细胞淋巴瘤。核酸疗法可以用于治疗过敏，诸如花生过敏。核酸疗法可以用于治疗多发性硬化症(MS)。核酸疗法可以用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)。

庞贝病由人酸性α-葡糖苷酶(GAA)的缺陷引起，这种酶是从糖原裂解末端α1-4和α1-6葡萄糖的溶酶体酶。本发明的组合物可以用于治疗庞贝病。可以向患有庞贝病的受试者施用包含编码GAA的核酸的本发明的组合物，以将该核酸递送至受试者的靶组织，从而在本文所述的靶组织(特别是肝和骨骼肌)中表达GAA。该酶可以从组织分泌到循环中。

卵泡抑素是阻遏骨骼肌生长并促进肌肉萎缩的TGF-β超家族配体的抑制剂。可以向患有肌肉萎缩障碍的受试者施用包含编码卵泡抑素的核酸的本发明的组合物，以将该核酸递送至受试者的靶组织，从而在本文所述的靶组织(特别是肝和骨骼肌)中表达卵泡抑素。该蛋白质可以从组织分泌到循环中。

因此，本发明提供了用于治疗此类障碍的方法和用于此类治疗中的组合物。

树枝状聚合物的核心肽基序是单个氨基酸残基或短肽基序，诸如二肽或三肽基序。核心序列可以包含任何氨基酸(L-和/或D-异构体)，例如甘氨酸(G)、丝氨酸(s)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)和/或组氨酸(H)。核心序列还可以包含非天然存在的氨基酸(L-和/或D-异构体)，例如β-丙氨酸(B)和/或氨基己酸(X)。在核心是三肽基序的情况下，其可以包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)以及半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)。优选地，核心包含可电离残基，诸如组氨酸(H)。核心序列可以包含精氨酸(R)、组氨酸(H)和半胱氨酸(C)。核心序列可以包含精氨酸(R)或甘氨酸(G)、组氨酸(H)或丝氨酸(S)以及半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)。例如，核心序列可以是GSC或RHC。三肽基序可以包含丙氨酸(A)、赖氨酸(K)和亮氨酸(L)。例如，核心序列可以是KLA。核心肽可以共价键合至另一部分，诸如细胞特异性靶向肽，或者可以用脂质分子衍生化。树枝状聚合物的(例如核心肽基序的)一个、一些或所有氨基酸可以共价键合至另一部分，诸如抗体、细胞特异性靶向肽、糖配体诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖和GalNAc(或包含它们的聚糖)和/或脂质取代基。技术人员能够容易地选择不会不利地影响溶解度或核酸结合特性的另外部分。

组合物的脂质组分可以包含脂质的混合物，包括阳离子脂质。例如，脂质组分可以包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)。可以易于确定DOPE∶DOTMA比率以获得给定应用的最佳特性，但该比率通常在1∶5至5∶1的范围内。

优选地，该范围为3∶1至1∶3，或2∶1至1∶2。最优选地，DOPE∶DOTMA比率为1∶1。在其他实施方案中，脂质包括1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)，例如作为唯一脂质或与DOPE组合。

在其他实施方案中，组合物的脂质组分可以包括其他脂质，作为DOPE和DOTMA的补充(或替代)。下面阐述示例性脂质组分：

阳离子脂质：

N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)

1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)

2,3-二油烯基氧基-N-(2[精胺-甲酰胺基]乙基)-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐(DOSPA)

3p-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-chol)

中性脂质：

1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)

1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)

胆固醇

阴离子脂质：

1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-(1′-外消旋-甘油)(DOPG)

可电离脂质：

DLin-DMA

DLin-KC2-DMA

DLin-MC3-DMA

其他潜在脂质包括4-(2-氨基乙基)-吗啉基-胆固醇-半琥珀酸酯(MoChol)、胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、胆固醇-(3-咪唑-1-基丙基)氨基甲酸酯(CHIM)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、胆固醇硫酸酯(chol-S0₄)。

设想了任何前述脂质可以在本发明的组合物中单独使用或彼此组合使用。另外，脂质可以通过与PEG基团诸如PEG2000连接来衍生化。

本发明提供了将核酸递送到靶细胞中的方法，该方法包括使靶细胞与本发明的组合物接触。靶细胞可以是肌细胞、肝细胞、星形细胞、神经元、星形胶质细胞、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞或肿瘤相关中性粒细胞、干细胞或肿瘤细胞。该方法可以在体外进行。可以从患者获得该细胞，并且可以在进行该方法后向该患者施用该细胞，即该方法可以离体进行。另选地，该方法可以在体内进行，作为医学用途或治疗的一部分。该方法涉及通过网格蛋白介导的内吞作用、小窝介导的内吞作用和/或微胞饮作用进入细胞。此类体内治疗可以涉及向受试者施用组合物以将核酸递送至特定的一个或多个靶组织；例如递送至受试者的肌肉和/或肝。该组合物可以作为单剂量或作为两个或更多个剂量施用。

本发明还提供了新型树枝状聚合物，诸如表2中所示的那些。在一些实施方案中，树枝状聚合物是第三代树枝状聚合物，诸如G1，2，3-LR树枝状聚合物、G1，2，3-rl树枝状聚合物、G1-LR，G2，3-RL树枝状聚合物、G1，2-RL，G3-LR树枝状聚合物和G1，2-LR，G3-RL树枝状聚合物，它们可以被共同定义为包含以下部分的肽树枝状聚合物：第一赖氨酸残基和两个第一二肽基序；两个第二赖氨酸残基和四个第二二肽基序；四个第三赖氨酸残基和八个第三二肽基序；以及与第一赖氨酸残基共价键合的核心肽序列，(i)其中第一赖氨酸残基共价键合至两个第一二肽基序，这两个第一二肽基序分别共价键合至两个第二赖氨酸残基；(ii)其中每个第二赖氨酸残基共价键合至两个第二二肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至第三赖氨酸残基中的一者；以及(iii)其中每个第三赖氨酸残基共价键合至第三二肽基序中的两者，其中第一二肽基序、第二二肽基序和第三二肽基序各自包含亮氨酸(L)和精氨酸(R)，并且其中第一二肽基序、第二二肽基序和第三二肽基序中的至少一者由亮氨酸-精氨酸(LR)二肽基序组成(其中″LR″基序是根据标准N端至C端惯例来叙述的)。每个氨基酸残基独立地选自L-同工型或D-同工型。这些新型树枝状聚合物可以形成本发明的组合物的一部分，并且可以用于本文所公开的本发明的其他方面。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或明确避免的。

附图说明

现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方案和实验，其中：

图1.具有不同赖氨酸和亮氨酸排列的用于DNA递送的树枝状聚合物的转染效率的比较。改变一代中赖氨酸和亮氨酸的位置不会显著改变(A)HeLa或(B)Neuro2A细胞中的转染效率。将树枝状聚合物G1，2，3-KL结构修饰成其变体诸如G1，2，3-K(去除了所有亮氨酸的G1，2，3-KL型式)并将所有L型氨基酸取代成D型不会显著改变(C)HeLa或(D)Neuro2A细胞中的转染效率。G0，1，2，3-KL(具有带KL基序的零代的G1，2，3-KL型式)在(E)HeLa或(F)Neuro2A细胞中没有显著差异。条件：用0.25μgpCI-Luc转染1×10⁴个细胞。误差条是指以一式三份进行的实验的平均值±SEM。D/D是DOTMA/DOPE。

图2.具有不同代(G1、G2和G3)和阳离子残基(例如KL对RL)的用于DNA递送的树枝状聚合物的转染效率的比较。(A)HeLa细胞中的转染效率，(B)Neuro2A细胞中的转染效率。在存在肽树枝状聚合物与D/D的情况下用表达荧光素酶的质粒(pCI-Luc)转染细胞(转染后24小时测量)。通过将发光值除以用D/D DNA复合物(w/w 1∶1，0.25pg)处理的细胞的类似值来归一化发光值，以产生转染％。条件：用0.25μg pCI-Luc转染1×10⁴个细胞。误差条是指以一式三份进行的实验的平均值±SEM。*表示p＜0.05。D/D是DOTMA/DOPE。

图3.G1，2，3-RL与用于DNA递送的其他商业转染试剂(包括DOTMA/DOPE、聚乙烯亚胺和Lipofectamine 2000)的转染效率的比较。(A)在不存在血清的情况下HeLa细胞中的转染、(B)在存在血清的情况下HeLa细胞中的转染、(C)在不存在血清的情况下Neuro2A细胞中的转染以及(D)在存在血清的情况下Neuro2A细胞中的转染。在存在G1，2，3-RL与D/D的情况下用表达荧光素酶的质粒(pCI-Luc)转染细胞(转染后24小时测量)。通过将发光值除以用D/D DNA复合物处理的细胞的类似值来归一化发光值，以产生转染％。条件：在无血清或存在10％血清的情况下用0.25μg pCI-Luc转染1×10⁴个细胞4小时。误差条是指以一式三份进行的实验的平均值±SEM。在HeLa和Neuro2A细胞中，G1，2,3-RL比其他试剂显著更强效地介导转染。*表示p＜0.05，***表示p＜0.001，并且****表示p＜0.0001。D/D是DOTMA/DOPE。

图4.在血清条件下具有不同代(G1、G2和G3)和阳离子残基(例如KL对RL)的用于DNA递送的树枝状聚合物的转染效率的比较。(A)HeLa细胞中的转染效率，(B)Neuro2A细胞中的转染效率。在存在肽树枝状聚合物与D/D的情况下用表达荧光素酶的质粒(pCI-Luc)转染细胞(转染后24小时测量)。通过将发光值除以用D/D DNA复合物(w/w 1∶1，0.25μg)处理的细胞的类似值来归一化发光值，以产生转染％。条件：在存在10％血清的情况下用0.25μgpCI-Luc转染1×10⁴个细胞4小时。误差条是指以一式三份进行的实验的平均值±SEM。在HeLa和Neuro2A细胞中，G1，2，3-RL(N/P介于5至20之间)比其他组显著更强效地介导转染。*表示p＜0.05；G1，2，3-RL(N/P为10、20)比其他组显著更强效地介导转染，***表示p＜0.001。D/D是DOTMA/DOPE。

图5.G1，2，3-RL-D/D-DNA纳米颗粒的细胞摄取途径。氯丙嗪抑制网格蛋白介导的内吞作用；染料木黄酮和粗糠柴苦素分别抑制小窝介导的内吞作用和微胞饮作用。

图6.静脉内施用包含G1，2，3-RL与D/D和表达卵泡抑素的质粒DNA的组合物后，卵泡抑素在骨骼肌中的表达。给小鼠注射G1，2，3-RL复合物两次，并且收获组织以通过qPCR测定卵泡抑素的mRNA表达水平。

图7.静脉内施用所公开的组合物后小鼠的体重。

图8.静脉内施用包含G1，2，3-RL或G1，2，3-LR与DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)和表达荧光素酶的微环DNA的组合物后，小鼠组织中的荧光素酶表达。以20∶1的NP比率注射这些组合物。给小鼠注射这些组合物，并且24小时后收获组织以测量心脏、肾、肝、肺、脾和骨骼肌中的荧光素酶信号。

图9.肌内施用包含G1，2-RL，3-LR与DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)和表达荧光素酶的微环DNA的组合物后，小鼠骨骼肌中的荧光素酶表达。以20∶1的NP比率注射该组合物。给小鼠注射这些组合物，并且48小时后收获骨骼肌组织以测量荧光素酶信号。

图10.静脉内施用包含G1，2，3-RL(上图)或G1，2-RL，3-LR(下图)与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达。以8∶1和0.15∶1的NP比率注射每种树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号。当以0.15∶1的NP比率注射时，包含G1，2，3-RL和G1，2-RL，3-LR的组合物能够将mRNA递送至富含免疫细胞的组织，包括肺、脾和淋巴结。以NP 8∶1注射的G1，2-RL，3-LR能够将mRNA靶向递送至脾。

图11.静脉内施用包含G1，2，3-RL(上图)或G1，2-RL，3-LR(下图)与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达。以8∶1和0.15∶1的NP比率注射每种树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、心脏、肾、脂肪组织和脑中的荧光素酶信号。

图12.以8∶1的NP比率静脉内施用包含G1，2,3-RL或G1，2-RL，3-LR与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达的比较。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号(图12A，上图)。提供相同的数据以允许在肺、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结(图12A，下图)与肌肉(腓肠肌)、肝、心脏、肾、脂肪组织和脑(图12B)之间进行比较。与以8∶1的NP比率注射的G1,2,3-RL相比，以8∶1的NP比率注射的包含G1，2-RL，3-LR的组合物能够以更高的效率将mRNA递送至富含免疫细胞的组织。

图13.静脉内施用两个剂量的包含G1，2,3-RL与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达。以NP比率＝0.15∶1注射树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号。

图14.静脉内施用包含G1，2，3-RL、G1，2-RL，3-LR或NTX1与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达。以0.15∶1的NP比率注射每种树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号。与包含G1，2，3-RL和G1，2-RL，3-LR的组合物相比，包含NTX1(其包含骨骼肌靶向结构域和细胞穿透肽结构域)的组合物能够以更高的效率将mRNA递送至富含免疫细胞的组织。

图15.静脉内施用包含G1，2，3-RL、G1，2-RL，3-LR或NTX1与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达并与给小鼠注射包含DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA但没有树枝状聚合物的组合物进行比较。以0.15∶1的NP比率注射每种树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号。

图16.静脉内施用包含G1，2-RL，3-LR与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达并与给小鼠注射包含DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA但没有树枝状聚合物的组合物进行比较。以8∶1的NP比率注射树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑、颈部淋巴结和腹股沟淋巴结中的荧光素酶信号。相对于仅包含mRNA的组合物或包含DOTMA/DOPE和mRNA的组合物，包含NTX1、G1，2，3-RL和G1，2-RL，3LR的组合物均显示出mRNA向所有组织的递送增加。

图17.在用树枝状聚合物组合物或市售转染试剂转染后，HeLa或C2C12细胞中的荧光素酶和eGFP表达。用以下物质转染HeLa细胞：1)单独的荧光素酶mRNA、包含G1，2-RL，3-LR(NP＝0.16∶1)、DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和荧光素酶mRNA的组合物或包含Lipofectamine2000^TM和荧光素酶mRNA的组合物(左上图)；或2)单独的eGFP mRNA、包含G1，2-RL，3-LR(NP＝0.16∶1)、DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和eGFP mRNA的组合物或包含DLin-MC3-DMA∶胆固醇∶DSPC∶DMG-PEG脂质纳米颗粒和eGFP mRNA的组合物(右上图)。用以下物质转染C2C12细胞：单独的荧光素酶mRNA、包含G1，2-RL，3-LR(NP＝8∶1)、DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和荧光素酶mRNA的组合物、包含Lipofectamine 2000^TM和荧光素酶mRNA或聚乙烯亚胺和荧光素酶mRNA的组合物(下图)。转染后24小时测量荧光素酶和eGFP表达。与市售转染试剂诸如Lipofectamine 2000和LNP相比，本发明的肽树枝状聚合物能更有效地在体外转染HeLa细胞。

图18.用荧光标记的sgRNA和Cas9 mRNA或用G1,2-RL，3-LR与荧光标记的sgRNA和Cas9 mRNA以0.15∶1或8∶1的NP比率转染后，HeLa细胞中的RNA转染效率。用TM-罗丹明标记sgRNA，并且用Cy5荧光团标记Cas9 mRNA。将细胞转染2小时并通过流式细胞术测定。暴露于包含G1，2-RL，3LR的组合物的100％HeLa细胞对于sgRNA和Cas9 mRNA呈双阳性，证明了极高的转染效率。

图19.用tracrRNA(trRNA)、crRNA和Cas9 mRNA或用G1，2-RL，3-LR与tracrRNA、crRNA和Cas9 mRNA以0.15∶1或8∶1的NP比率转染后，HeLa细胞中的RNA转染效率。用ATTO 55荧光团标记tracrRNA，用荧光素标记crRNA，并且用Cy5荧光团标记Cas9 mRNA。将细胞转染2小时并通过流式细胞术测定。

图20.用tracrRNA(trRNA)、crRNA或Cas9 mRNA转染后HeLa细胞中的RNA转染效率。用或不用G1，2-RL，3-LR转染细胞。用ATTO 55荧光团标记tracrRNA，用荧光素标记crRNA，并且用Cy5荧光团标记Cas9 mRNA。将细胞转染2小时并通过流式细胞术测定。

图21.mRNA递送至脾中的免疫细胞。给小鼠静脉内注射单独的mRNA或mRNA与NTX1(NP＝0.15∶1)、G1，2-RL，3-LR(NP＝0.15∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP＝8∶1)。用AlexaFluor488标记mRNA。注射后2小时从小鼠收获脾以用于处理。使用包含NTX1、G1，2-RL，3-LR(NP 8∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP 0.15∶1)的组合物将mRNA递送至存在于脾中的多种多样的免疫细胞是可能的。

图22.mRNA递送至骨髓中的免疫细胞。给小鼠静脉内注射单独的mRNA或mRNA与NTX1(NP＝0.15∶1)、G1,2-RL，3-LR(NP＝0.15∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP＝8∶1)。用AlexaFluor488标记mRNA。注射后2小时从小鼠收获骨髓以用于处理。

图23.mRNA递送至血液中的免疫细胞。给小鼠静脉内注射单独的mRNA或mRNA与NTX1(NP＝0.15∶1)、G1，2-RL，3-LR(NP＝0.15∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP＝8∶1)。用AlexaFluor488标记mRNA。注射后2小时从小鼠收获血液以用于处理。使用包含NTX1、G1，2-RL，3-LR(NP 8∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP 0.15∶1)的组合物将mRNA递送至存在于血液中的多种多样的免疫细胞是可能的。

图24.mRNA递送至淋巴结中的免疫细胞。给小鼠静脉内注射单独的mRNA或mRNA与NTX1(NP＝0.15∶1)、G1，2-RL，3-LR(NP＝0.15∶1)或G1，2-RL，3-LR(NP＝8∶1)。用AlexaFluor488标记mRNA。注射后2小时从小鼠收获淋巴结以用于处理。

图25.体外DNA递送至HeLa和C2C12细胞。用单独的DNA、用G1，2,3-RL(N∶P＝5∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA以及用G1,2，3-RL(N∶P＝5∶1)和DOPG/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA转染HeLa细胞(上图)。用单独的DNA、用聚乙烯亚胺与DNA、用G1，2-RL，3-LR(N∶P＝8∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA以及用NTX2(N∶P＝8∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA转染C2C12细胞(肌源性细胞系)(下图)。两个实验中使用的DNA编码荧光素酶报告基因。NTX2是缀合至肌肉靶向肽ASSLINA((LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIA(Acp)-NH2)的G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物。

图26.mRNA制剂给药后的天冬氨酸转氨酶(AST；26A，上图)、TNF-α(26A，下图)、IL-6(26B，上图)和IL-1β(26B，下图)水平。用单独的mRNA或用mRNA、树枝状聚合物和DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)处理小鼠。在X轴中指示树枝状聚合物与mRNA的N∶P比率。除了G1,2，3-RL和G1，2-RL，3-LR也给药两次外，所有制剂都给药一次。对于注射2个剂量的小鼠，在第2个剂量之前24小时注射第1个剂量。在第2个剂量后6小时收获小鼠的血浆以用于测量AST或细胞因子水平。对于给药1次的小鼠，在给药后6小时收获血浆以用于测量AST和细胞因子水平。使用本发明的树枝状聚合物在体内递送mRNA不会引起显著的肝毒性或显著的免疫反应。

图27.DNA制剂给药后的天冬氨酸转氨酶(左上图)、TNF-α(右上图)、IL-6(左下图)和IL-1β(右下图)水平。用单独的DNA或用G1，2，3-RL和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)处理小鼠。在收获血浆样品并测量AST或细胞因子水平之前，将所有制剂给药两次。使用本发明的树枝状聚合物在体内递送DNA不会引起显著的肝毒性或显著的免疫反应。

图28.肽树枝状聚合物与脂质系统在体外进行的mRNA转染。用单独的mRNA或用mRNA与肽树枝状聚合物(N∶P＝0.16∶1)和DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)转染HeLa细胞。所使用的mRNA表达eGFP报告基因。转染24小时后，收获细胞以测定eGFP表达。用每次转染的蛋白质的总量对eGFP表达进行归一化。通过归一化经G1，2-RL，3-LR、DOTMA/DOPE和mRNA处理的细胞的转染值来计算基因表达水平。在测试条件下，具有不同核心及第1代、第2代和第3代肽基序的第1代、第2代和第3代树枝状聚合物可以将mRNA有效地转染进细胞。

图29.肽树枝状聚合物与脂质系统在体外进行的mRNA转染。用单独的mRNA或用mRNA与肽树枝状聚合物和DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)转染HeLa细胞。G1，2-RL,3-LR的N∶P比率为0.16∶1，而所有其他树枝状聚合物的N∶P比率为8∶1。所使用的mRNA表达eGFP报告基因。转染24小时后，收获细胞以测定eGFP表达。用每次转染的蛋白质的总量对eGFP表达进行归一化。通过归一化经G1，2-RL，3-LR、DOTMA/DOPE和mRNA处理的细胞的转染值来计算基因表达水平。在测试条件下，具有不同核心及第1代、第2代和第3代肽基序的第1代、第2代和第3代树枝状聚合物可以将mRNA有效地转染进细胞。

图30.静脉内施用包含G1，2-RL，3-LR或RHCG1-RL，2-LR与DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和表达荧光素酶的mRNA的组合物后小鼠组织中的荧光素酶表达。以0.15∶1或8∶1的N∶P比率注射树枝状聚合物组合物。给小鼠注射这些组合物，并且6小时后收获组织以测量肌肉(腓肠肌)、肝、肺、心脏、脾、肾、脂肪组织、脑和淋巴结中的荧光素酶信号。第2代树枝状聚合物能够以比第三代树枝状聚合物G1，2-RL，3-LR更高的效率将mRNA靶向递送至脾和肺。

图31.以图解的方式表示了第三代树枝状聚合物(N端在左侧并且C端在右侧)。

具体实施方式

现在将参考上述附图和下面的技术定义来讨论本发明的各方面和实施方案。另外的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所提及的所有文献均以引入方式并入本文。

目前的免疫疗法应答率约为15％至20％，迫切需要改善治疗结局。一种策略是递送mRNA以表达蛋白质(诸如CEBPA、IRF8、cGAS-STING、SOCS1和/或SOCS3)来逆转肿瘤微环境中的髓样细胞的免疫抑制表型，这将提供更有利于免疫疗法应答的环境。另一种策略可以是将mRNA转移到肿瘤中的免疫细胞中以表达细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和/或干扰素)来激活免疫细胞，从而对抗癌细胞。还可以将mRNA递送至巨噬细胞以表达嵌合抗原受体，使得巨噬细胞可以被激活以杀死肿瘤细胞。递送mRNA以在抗原递呈细胞中表达肿瘤抗原将有助于激活免疫系统以攻击癌细胞。这些策略可以应用于治疗所有肿瘤，特别是非小细胞肺癌、晚期黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胆管癌(胆管细胞癌)、胆囊癌、神经内分泌肿瘤、肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。

核酸递送

本发明的组合物可以用于将本文所述的核酸递送至人或动物身体的某些组织。例如，递送至以下组织：

1.骨骼肌

2.肝

3.肺

4.心脏

5.白色脂肪组织

6.棕色脂肪组织

7.脑

8.脾

9.骨髓

10.关节

11.肾

12.胃肠道

13.肿瘤

14.眼睛

15.胸腺

16.皮肤

17.淋巴结

18.胰腺

19.肾上腺

20.睾丸

21.前列腺

22.卵巢

23.子宫

24.膀胱

25.隔膜

mRNA转染

通过在完全生长培养基条件下转染HeLa细胞来研究树枝状聚合物的代数对mRNA递送的影响。我们已经证实，具有1或2代的树枝状聚合物(例如RHCG1-R、RHCG1，2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL，2-LR)可以有效地转染细胞并且介导与具有3代的树枝状聚合物类似的转染效率(图28A)。这确实与DNA转染有很大不同，因为在完全生长培养基中，具有1或2代的树枝状聚合物对细胞的转染效果不如具有3代的树枝状聚合物(图4)。有趣的是，将第1代或第2代树枝状聚合物的N∶P比率从0.16增加至8进一步提高了转染效率(图29A)。

本发明人研究了树枝状聚合物的核心序列对转染的影响，并已证实三肽序列诸如GSC(例如来自G1，2-RL，3-LR)是有效的。二肽核心序列诸如KA和YM也是有效的。核心肽长度的这种变化不影响mRNA转染，表明核心中有2个氨基酸的树枝状聚合物的转染效果将与核心中有3个氨基酸的树枝状聚合物一样好(图28A)。不同的三肽核心序列诸如RFW、RYM的表现与GSC相当。尽管将含有阳离子基团的精氨酸添加到了核心，但这并未提高或降低转染。有趣的是，当核心处的3个氨基酸从GCS改变为RHC时，转染可以提高50％。这表明树枝状聚合物的核心中的可电离基团诸如组氨酸可以提高转染(图28A)。

12个氨基酸核心序列(例如，树枝状聚合物″线性G1，2-RL，3-LR″)的使用证明了转染效率不受核心序列长度增加的影响(图28A)。该结果表明可以在核心中引入更长的氨基酸链和/或更长的结构而不影响转染效率。实际上，在核心中含有27个氨基酸的NTX1比G1，2-RL，3-RL更有效地转染。这表明更长的核心序列确实可以增强转染。来自NTX1的转染增强有可能是由于核心序列内细胞穿透肽的存在。

本发明人探究了各代内的氨基酸数量对转染的影响。因此，我们测试了仅具有1个氨基酸(R)、2个氨基酸(RL或LR)、3个氨基酸(RLR)和4个氨基酸(LRLR)的树枝状聚合物。这些研究表明，在每一代中具有1、2、3或4个氨基酸的树枝状聚合物仍然可以将mRNA很好地转染进细胞中(图28A)。即使使用在每一代中具有不同氨基酸数量的树枝状聚合物，也显示转染效率不受影响。

基于G1，2-RL，3-LR结构，本发明人设计了3代树枝状聚合物的文库，其中我们将碱性氨基酸R替换为K，和/或将疏水氨基酸L改变为酸性氨基酸(诸如E)和/或具有非极性侧链的氨基酸(诸如M、F、β-丙氨酸(B)、氨基己酸(X)和W)和/或具有极性侧链的氨基酸(诸如Q、T和Y)。

将树枝状聚合物内的R替换为K降低了mRNA转染效率(图28A)。然而，与G1，2-RL，3-LR相比，将疏水氨基酸改变为其他疏水氨基酸和/或具有极性或非极性侧链的氨基酸可能不影响转染或可能使转染降低30％至40％。然而，所有这些树枝状聚合物诱导的mRNA转染都显著高于单独的mRNA对照。

本发明人还研究了树枝状聚合物内的L或D型氨基酸对mRNA转染的影响。基于G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物，我们发现在每一代树枝状聚合物中将部分或全部氨基酸从L型改变为D型不会影响转染效率。在树枝状聚合物内将赖氨酸取代成二氨基丁酸将减少转染，尽管该树枝状聚合物的转染仍然显著高于单独的mRNA对照。

本发明人证明G1-LL，2-RR可以用于用我们的配制方案递送mRNA，在该配制方案中我们使用0.16∶1N∶P比率的G1-LL，2-RR与DOTMA/DOPE(w/w 10∶1)。有趣的是，曾使用该树枝状聚合物在体外和体内以不同的制剂递送ASO(Saher 2018)。所使用的制剂是DOTMA/DOPE(相对于ASO的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与ASO。我们已经在转染细胞时尝试了这一制剂(即DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)，但转染效率较差。该制剂(DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)仅产生我们改进的制剂(DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和N∶P＝0.16∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)的mRNA转染效率的10％。

本发明人已探究了在不同代中具有RL或LR或rl的用于mRNA递送的3代树枝状聚合物。我们发现这些树枝状聚合物中的大部分类似地转染细胞，其中G1，2-RL，3-LR在mRNA转染中最有效。总之，我们的数据表明在每一代中具有疏水和阳离子氨基酸的树枝状聚合物将产生对细胞的有效mRNA递送。

由于存在比G1，2-RL，3-LR更有效转染细胞的第1代和第2代树枝状聚合物，我们已选择这些树枝状聚合物来进一步测试转染。在各种N∶P比率下，这些树枝状聚合物通常可以比G1，2-RL，3-LR更好地转染。具体地，在N∶P＝4∶1下，RHCG1-R、RHCG1，2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL，2-LR、RHCG1-RLR和G1-LRLR的转染效果可以比G1,2-RL，3-LR好700％至1815％。这些数据表明，对DNA和mRNA递送的要求截然不同。对于mRNA，有一种趋势是，在完全生长培养基条件下，具有1代或2代的树枝状聚合物将比3代树枝状聚合物转染细胞的效果更好。然而，在完全生长培养基条件下，第3代树枝状聚合物将DNA转染进细胞的效果要比第1代或第2代树枝状聚合物好得多(图4)。

特别优选用于mRNA递送的本发明的某些树枝状聚合物包括RHCG1-R、RHCG1,2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL,2-LR、G1，2-RL，3-LR、RHCG1-RLR、RHCG1，2-RLR、G1-LRL、RHCG1，2-RL，3-LR和G1，2，3-R。

RNA干扰

本发明通过递送核酸促进了靶基因表达的治疗性下调。这些包括RNA干扰(RNAi)。小RNA分子可以用于调节基因表达。

这些包括小干扰RNA(siRNA)对mRNA的靶向降解、转录后基因沉默(PTG)、微RNA(miRNA)对mRNA的发育调节的序列特异性翻译阻遏以及靶向转录基因沉默。

RNAi机制和小RNA在异染色质复合物靶向和特定染色体位点表观遗传基因沉默中的作用也已得到证实。双链RNA(dsRNA)依赖性转录后沉默，也称为RNA干扰(RNAi)，是dsRNA复合物可以在短时间段内靶向特定的同源基因以沉默的现象。其充当促进具有序列同一性的mRNA降解的信号。21-nt siRNA通常足够长以诱导基因特异性沉默，但足够短以逃避宿主应答。靶向基因产物的表达可大幅下降，几分子siRNA就能诱导90％沉默。

在本领域中，这些RNA序列根据它们的来源被称为″短或小干扰RNA″(siRNA)或″微RNA″(miRNA)。这两种类型的序列均可以用于通过结合互补RNA并触发mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA翻译成蛋白质来下调基因表达。siRNA由长双链RNA加工而成，并且当在自然界中发现时通常是外源来源的。微干扰RNA(miRNA)是内源性编码的小型非编码RNA，由短发夹加工而成。siRNA和miRNA均可以在没有RNA裂解的情况下抑制携带部分互补靶序列的mRNA的翻译，并且降解携带完全互补序列的mRNA。

因此，本发明提供了这些序列在本发明的组合物中用于下调靶基因表达的用途。

siRNA配体通常是双链的，并且为了优化RNA介导的靶基因功能下调的效果，优选选择siRNA分子的长度以确保介导siRNA识别mRNA靶标的RISC复合物能正确识别siRNA，并且使得siRNA足够短以减少宿主应答。

miRNA配体通常是单链的，并且具有部分互补的区域，使得配体能够形成发夹。miRNA是从DNA转录但不翻译成蛋白质的RNA基因。编码miRNA基因的DNA序列比miRNA长。该DNA序列包括miRNA序列和近似反向互补序列。当该DNA序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补碱基对形成部分双链的RNA片段。微RNA序列的设计在John等人，2004中进行了讨论。

通常，旨在模拟siRNA或miRNA的作用的RNA配体具有10个与40个之间的核糖核苷酸(或其合成类似物)，更优选地17个至30个之间的核糖核苷酸，更优选地19个与25个之间的核糖核苷酸并且最优选地21个与23个之间的核糖核苷酸。在采用双链siRNA的本发明的一些实施方案中，该分子可以具有对称的3′突出端，例如一个或两个(核糖)核苷酸的突出端，通常为UU或dTdT 3′突出端。基于本文所提供的公开内容，技术人员可以容易地设计合适的siRNA和miRNA序列，例如使用诸如Ambion的在线siRNA finder之类的资源。siRNA和miRNA序列可以合成产生并外源添加以引起基因下调或使用表达系统(例如载体)产生。在优选的实施方案中，siRNA是以合成方法合成的。

可以在细胞中加工较长的双链RNA以产生siRNA(参见例如Myers等人(2003))。较长的dsRNA分子可以具有对称的3′或5′突出端(例如有一个或两个(核糖)核苷酸)，或者可以具有平端。较长的dsRNA分子可以为25个核苷酸或更长。优选地，较长的dsRNA分子为25至30个核苷酸长。更优选地，较长的dsRNA分子为25至27个核苷酸长。最优选地，较长的dsRNA分子为27个核苷酸长。

在一个实施方案中，siRNA、较长的dsRNA或miRNA通过从载体转录而内源性地(在细胞内)产生。可以以本领域已知的任何方式将载体引入细胞中。任选地，可以使用组织特异性启动子来调节RNA序列的表达。在另一个实施方案中，siRNA、较长的dsRNA或miRNA通过从载体转录而外源性地(在体外)产生。

另选地，可以使用本领域已知的标准固相或溶液相合成技术合成siRNA分子。核苷酸之间的连键可以是磷酸二酯键或替代物，例如下式的连接基团：P(O)S(硫代(thioate))；P(S)S(二硫代(dithioate))；P(O)NR′2；P(O)R′；P(O)OR6；CO；或CONR′2(其中R是H(或盐)或烷基(1-12C)且R6是烷基(1-9C))通过-O-或-s-连接至相邻核苷酸。

长链非编码RNA

哺乳动物基因组被普遍转录，产生大量转录物，包括成千上万个长链非编码RNA分子(IncRNA)。已证实IncRNA可以调节染色质状态、转录、RNA稳定和某些基因的翻译。

RNA激活(RNAa)

RNA激活(RNAa)是由RNA介导的通过高度调节和进化保守的途径增强基因表达的过程。RNAa可以由小激活RNA(saRNA)诱导，其是一类由21个核苷酸的dsRNA组成的非编码RNA，在两端具有2个核苷酸的突出端。尽管saRNA以序列特异性方式介导基因激活，但saRNA具有与siRNA相同的结构和化学组分。为了激活基因表达，将saRNA的引导链加载到AGO2上，然后将复合物转运到细胞核中。一旦进入细胞核，引导链-AGO2复合物就直接与基因启动子或相关转录物结合，从而募集关键组分(包括RNA聚合酶II)以起始基因激活(Kwok等人，2019)。

反义寡核苷酸(ASO)

反义寡核苷酸(ASO)是与靶序列互补的DNA或RNA单链。ASO与靶核酸杂交。例如，ASO可以用于靶向细胞中的编码或非编码RNA分子。靶标结合后，ASO/靶标复合物可以被酶促降解(例如通过RNA酶H)。

信使RNA(mRNA)

技术人员知道信使RNA(mRNA)是RNA的单链分子，其引领基因的编码序列通过核糖体翻译成对应的氨基酸序列。mRNA是在转录过程中产生的，在该过程中酶(RNA聚合酶)将基因转化成初级转录物mRNA(也称为前mRNA)。该前mRNA通常仍含有内含子，即不会继续编码最终氨基酸序列的区域。这些内含子在RNA剪接过程中被去除，仅留下外显子，即编码蛋白质的区域。该外显子序列构成成熟mRNA。然后成熟mRNA被核糖体读取，从而产生编码的蛋白质。本发明可以用于将mRNA分子递送至靶细胞和组织，作为诱导所需蛋白质或肽的表达的手段。当需要瞬时表达时，通过mRNA递送诱导肽/蛋白质表达是特别有用的。

mRNA和IncRNA通常是具有带负电侧和疏水侧的大分子。因此，mRNA和IncRNA将需要疏水相互作用和亲水相互作用之间的平衡以被包封并递送至靶组织和细胞。疏水相互作用和亲水相互作用之间的这种平衡将不同于例如在两侧都有电荷的双链核酸诸如pDNA和siRNA。由于mRNA和IncRNA显著大于例如ASO，因此对封装和递送的要求也可能不同。因此，与ASO递送相比，用于mRNA和IncRNA递送的树枝状聚合物的最佳NP比率和DOTMA/DOPE的w/w比率将不同。

经修饰的核酸

除了天然存在的碱基之外，还可以使用经修饰的核苷酸碱基，并且这些经修饰的核苷酸碱基可以向包含它们的核酸赋予有利特性。

例如，经修饰的碱基可以增加核酸分子的稳定性，从而减少所需的量。提供经修饰的碱基还可以提供比未修饰的核酸更稳定或更不稳定的核酸分子。

术语″经修饰的核苷酸碱基″涵盖具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，经修饰的核苷酸包括具有与低分子量有机基团共价连接的糖的核苷酸，该低分子量有机基团不同于3′位的羟基基团并且不同于5′位的磷酸基团。因此，经修饰的核苷酸可以包括2′取代的糖，诸如2′-0-甲基-；2′-0-烷基；2′-0-烯丙基；2′-S-烷基；2′-S-烯丙基；2′-氟-；2′-卤代或叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖；差向异构糖，诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。

经修饰的核苷酸是本领域已知的，并且包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶以及其他杂环。这些类别的嘧啶和嘌呤是本领域已知的，并且包括假异胞嘧啶、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶5-氧乙酸、辫苷、2-巯基胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基胞嘧啶。

基于核酸的疫苗

如世界卫生组织(WHO)所定义的DNA疫苗及RNA疫苗涉及将含有编码抗原(寻求针对该抗原的免疫应答并且该免疫应答依赖于靶抗原的原位产生)的DNA序列或RNA的质粒直接引入(待接种疫苗的受试者的)适当组织中。这些方法提供了优于传统方法的许多潜在优点，包括同时刺激B细胞和T细胞应答、提高疫苗稳定性、不存在任何感染因子以及相对容易大规模生产。作为DNA疫苗接种原理的证据，已使用来自多种感染因子的基因获得了动物中的免疫应答，这些感染因子包括流感病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、疟原虫和支原体。在一些情况下，还已获得了对动物的疾病的预防。然而，DNA疫苗的价值和优点必须根据具体情况进行评估，并且它们的适用性将取决于针对其进行免疫的因子的性质、抗原的性质和保护所需的免疫应答的类型。

DNA和RNA疫苗接种领域正在快速发展。目前开发的疫苗不仅使用DNA，还包括助剂，这些助剂帮助DNA进入细胞，将其靶向特定细胞或可以充当刺激或指导免疫应答的佐剂。截至2020年，WHO指出获得上市许可的第一批核酸疫苗可能使用来源于细菌细胞的质粒DNA，但在将来，其他核酸疫苗可能使用RNA或可能使用核酸分子与其他实体的复合物。然而，随着COVID-19大流行于2020年爆发，人们齐心协力将首批基于RNA的COVID-19疫苗推向市场，这些疫苗在2020年中后期获准使用。自获得批准以来，这些基于RNA的疫苗已在世界范围内成功推出，以让人群获得对COVID-19的免疫力。

与其他疫苗技术一样，DNA疫苗的肌内递送是一种常见的方法(Lim等人，2020)。骨骼肌中肌细胞(肌肉细胞)的低复制速率使其成为DNA疫苗接种的有吸引力的靶标，因为稳定表达不依赖于基因组整合。

目前市场上的RNA疫苗使用编码抗原的mRNA作为有效载荷。目前正在探究的提高RNA疫苗有效性的领域是使用自扩增RNA。自扩增RNA共享mRNA的许多结构特征，并且可以包括5′帽、3′多聚腺苷酸尾以及5′和3′非翻译区(UTR)。除了编码感兴趣的抗原之外，自扩增RNA还将包括用于自扩增的系统。例如，自扩增RNA也可以编码RNA依赖性RNA聚合酶(RDRA)、启动子和感兴趣的抗原。

在通过受试者翻译机制翻译RDRA后，RDRA可以结合自扩增RNA并复制RNA。包括用于自扩增的系统减小了疫苗中所需的最小RNA，并且因此将减少受试者经历副作用的可能性。

医学疗法：基因疗法

本发明设想了在基因疗法方案中的用途。核酸可以存在于组合物中，该组合物在引入靶细胞中时会使得治疗性基因产物(例如转基因)表达。靶细胞包括肌细胞、肝细胞、星形细胞、脑细胞(神经元、星形胶质细胞)、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞、干细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、B细胞、T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞或肿瘤细胞。

为了使基因疗法切实可行，希望采用这样的DNA/RNA转移系统：其(1)将治疗性序列导向到靶细胞中，(2)介导将治疗性核酸摄取到一部分靶细胞群中，以及(3)适用于体内治疗应用。

本发明的含有核酸的组合物可以在无菌药学上可接受的载剂中保存和施用。各种无菌溶液可以用于组合物的施用，包括水、PBS、乙醇、脂质等。DNA/RNA的浓度将足以提供治疗剂量，这将取决于转运到细胞中的效率。

如上所述那样配制的基因序列的实际递送可以通过多种技术进行，包括直接注射、肺和其他上皮表面的滴注、或通过静脉内注射。施用可以通过注射针、套管针、插管、导管等，作为推注、多个剂量或延长输注等进行。

基因编辑

本发明设想了在基因编辑疗法中的用途，这些基因编辑疗法包括使用本领域熟知的技术诸如CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9系统)、TALENS和锌指核酸酶的基因编辑疗法。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶、crispr RNA(crRNA)和反式激活crRNA(trRNA或tracrRNA)。在该系统中，crRNA包含与靶DNA互补的序列并用于将Cas核酸酶导向至基因组中的靶位点，并且tracrRNA用作Cas活性所需的Cas核酸酶的结合支架。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含Cas核酸酶和单引导RNA(sgRNA)以将Cas核酸酶导向至靶基因中的靶位点。sgRNA包含在单个核酸中与支架tracrRNA融合的靶标特异性crRNA。

在一些实施方案中，该核酸包括编码Cas蛋白或肽(例如Cas9蛋白质或肽)的DNA或mRNA。在一些实施方案中，该核酸包括sgRNA。在一些实施方案中，该核酸包括crRNA和/或tracrRNA。在一些实施方案中，该核酸包括编码Cas蛋白或肽的DNA或mRNA、crRNA和tracrRNA。在一些实施方案中，该核酸包括编码Cas蛋白或肽的DNA或mRNA及sgRNA。

CRISPR/Cas系统也可以用于指导靶基因的修复或修饰。例如，CRISPR/Cas系统可以包含核酸模板以促进DNA修复或通过例如促进同源定向修复来将外源核酸序列引入靶基因中。CRISPR/Cas系统也可以用于例如使用碱基编辑技术将靶向修饰引入到靶基因组DNA中。这可以使用与碱基编辑器诸如胞苷脱氨酶融合的Cas蛋白来实现，如在例如以引用方式并入的W02017070633A2中所公开的。在另一个示例中，CRISPR/Cas系统可以用于″重写″基因组中的核酸序列。例如，CRISPR/Cas系统可以是先导编辑系统(Prime editing system)。在这种先导编辑系统中，可以使用融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含催化受损的Cas结构域(例如″切口酶″)和逆转录酶。催化受损的Cas结构域可能能够切割DNA单链以产生带切口的DNA双链体。先导编辑系统可以包括先导编辑引导RNA(pegRNA)，该pegRNA包括含有引物结合位点和逆转录酶模板序列的延伸sgRNA。在DNA双链体在催化受损的Cas的作用下产生切口时，引物结合位点允许带切口的DNA链的3′端与pegRNA杂交，而RT模板用作合成编辑的遗传信息的模板。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统可以包括核酸模板以指导感兴趣的靶基因的修复。在其他实施方案中，Cas蛋白或肽可以包括碱基编辑器。在更进一步的实施方案中，CRISPR/Cas系统可以是先导编辑系统。

CRISPR/Cas基因沉默和基因激活

CRISPR/Cas系统已适用于基因沉默和激活。设想了此类系统与本发明一起使用。例如，在一些实施方案中，该核酸可以编码包含与转录阻遏因子或激活因子融合的Cas蛋白或肽的融合蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是催化失活的。融合蛋白可以由sgRNA或crRNA导向至基因组中的感兴趣的位点。在融合蛋白结合感兴趣的位点后，转录阻遏因子或激活因子可以调节感兴趣的基因的表达。

联合疗法

本发明的化合物或通过本发明的方法鉴定的化合物可以用于治疗需要治疗的受试者的肿瘤和癌症。这些化合物可以单独施用或与其他抗癌剂联合施用。

″抗癌剂″是指可用于治疗肿瘤病症的任何药剂。一类抗癌剂包括化学治疗剂。″化学疗法″是指通过各种方法(包括静脉内、口服、肌内、腹膜内、膀胱内、皮下、经皮、经颊或吸入或以栓剂的形式)向癌症患者施用一种或多种化学治疗药物和/或其他药剂。一些化学治疗剂是细胞毒性的。

细胞毒性化学治疗剂通过非受体介导的机制或方式触发细胞死亡。细胞毒性化疗剂通过干扰细胞分裂、代谢或细胞存活所必需的功能而触发细胞死亡。由于这种作用机制，快速生长(这意味着增殖或分裂)或代谢活跃的细胞将比不快速生长或代谢活跃的细胞优先被杀死。体内不同细胞的分裂或利用能量(其是支持细胞功能的代谢活性)的状态决定了触发细胞死亡的化学治疗剂的剂量。细胞毒性化学治疗剂非排他性地涉及烷化剂、抗代谢物、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤药和三氧化二砷、卡莫司汀、氟达拉滨、IDA ara-C、myalotang、GO、二氯甲二乙胺、环磷酰胺、吉西他滨、苯达莫司汀、全身照射、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、喷司他丁和放射。

抗癌剂还包括蛋白激酶抑制剂，其可以用于治疗各种各样的癌症，包括血癌和肺癌。蛋白激酶通常促进细胞增殖、存活和迁移，并且通常在癌症中组成型过表达或有活性。因此，蛋白激酶的抑制剂是癌症治疗中常见的药物靶标。用于临床的激酶抑制剂的示例包括克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布格替尼、博舒替尼、达沙替尼、伊马替尼、尼洛替尼、普纳替尼、维罗非尼、达拉非尼、依鲁替尼、帕博西尼、索拉非尼和瑞博西尼。

抗癌剂还包括用于免疫疗法的药剂，包括抗体。免疫疗法可以引发、放大、减少或抑制免疫应答，这取决于具体的疾病背景。例如，表达PDL1配体的肿瘤细胞通过与T细胞上表达的PD-1受体结合来抑制受试者的正常免疫应答。这样，肿瘤细胞抵抗免疫诱导的细胞凋亡并促进肿瘤进展。抗PD-1和抗PDL1抗体已成功地用于临床以抑制该免疫检查点并促进免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤。免疫疗法的其他示例包括溶瘤病毒疗法、T细胞疗法和癌症疫苗。

药物组合物

本文所提供的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如溶剂、增溶剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂或抗微生物防腐剂。″药学上可接受的″是指″通常被认为安全″的分子实体和组合物，例如当施用于人时，其是生理学上可耐受的并且通常不产生过敏或类似的不良反应，诸如胃不适等。在一些实施方案中，该术语是指经美国联邦或州政府的监管机构批准的分子实体和组合物，如联邦食品、药品和化妆品法第204(s)条和第409条规定的GRAS清单，其须经FDA或类似名单、美国药典或另一公认的药典进行上市前审查和批准，方可用于动物，更特别是人类。当使用时，组合物的赋形剂不会不利地影响活性成分的稳定性、生物利用率、安全性和/或功效。因此，技术人员将理解，所提供的组合物中，剂型的任何组分之间都不存在不相容性。赋形剂可以选自由缓冲剂、张度剂、螯合剂、抗氧化剂、抗微生物剂和防腐剂组成的组。

治疗性产物的表达

由本发明的组合物递送的核酸可以表现出治疗作用(例如，通过直接作用以下调或上调靶基因)，或者其可以经由包含与启动子可操作地连接的编码序列的表达盒来表达基因产物(该基因产物可以是治疗性蛋白质或治疗性核酸)。在本说明书中，术语″可操作地连接″可以包括这样的情况，其中所选核苷酸序列和调节核苷酸序列以一定方式共价连接，使得将编码序列的表达置于调节序列的影响或控制之下。因此，如果调节序列能够影响形成部分或全部所选核苷酸序列的编码序列的转录，则调节序列与所选核苷酸序列可操作地连接。在适当的情况下，可以随后将所得的转录物翻译成期望的蛋白质或多肽。

施用途径

可以配制根据本发明各方面的组合物以用于通过多种途径施用，包括但不限于静脉内、肠胃外、动脉内、肌内、肿瘤内、皮下、口服和鼻内。可以通过注射将组合物施用于人或动物受试者，例如通过静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或肿瘤内注射。

受试者

待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选地是哺乳动物，更优选地是人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选地是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。治疗用途可以是用于人或动物(兽用)。

***

在前述说明书中或在所附权利要求书中或在附图中所公开的、以其具体形式或根据用于执行所公开的功能的装置或用于获得所公开的结果的方法或过程来表达的特征，在适当时，可以单独地或以这些特征的任何组合用于以其各种形式来实现本发明。

虽然已结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等同修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，上文阐述的本发明的示例性实施方案被认为是例示性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种改变。

为了避免任何疑问，本文所提供的任何理论解释均是为了增进读者的理解。本发明人不希望受任何这些理论解释的束缚。

本文所用的任何章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所述主题。

在整个本说明书(包括随后的权利要求书)中，除非上下文另有要求，词语″包含″和″包括″及其变型形式诸如″含有″、″具有″和″包括″将被理解为暗示包括所述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。必须注意，如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式″一个″、″一种″和″该″包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。范围在本文中可以表示为从″约″一个特定值和/或至″约″另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词″约″将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方案。与数值相关的术语″约″是任选的，并且意指例如+/-10％。

实施例

实施例1-采用展示阳离子和疏水残基的肽树枝状聚合物与脂质的组合的基因递 送

引言

基于阳离子脂质的核酸递送系统是迄今描述的研究最多、最有效的非病毒载体平台之一，并且具有天然氨基酸的肽载体的合理设计和开发由于氨基酸的无毒性质而对于治疗应用特别有吸引力。本发明人已使用肽树枝状聚合物开发了用于核酸递送的结构框架。结构框架涉及与赖氨酸残基结合的三层肽(或二肽)基序。本发明人已发现，阳离子氨基酸残基(Lys或Arg)在每一代(层)中的分布使得肽树枝状聚合物比电荷仅定位在表面上的树枝状聚合物更有效地转染(Kwok等人，2013)。使用固相肽树枝状聚合物合成程序，本发明人可以精确地操纵掺入到树枝状支架内的每个氨基酸残基的位置。这样就允许更好地控制树枝状聚合物的结构和功能，这对于以前研究的系统诸如聚合物或其他树枝状聚合物(其中修饰主要在分子的表面上进行)通常是不可能的。

肽树枝状聚合物/脂质载体显示出高转染效率、结果的良好再现性和低毒性。

本发明人假设(1)树枝状骨架、(2)树枝状聚合物紧密度、(3)树枝状尺寸、(4)树枝状聚合物结构单元手性和(5)树枝状聚合物内的氨基酸组成可能是改善基因转移的重要参数。本发明人通过基于具有交替LysLeu基序的有效G1，2，3-KL产生新的树枝状聚合物文库来探究结构特征，并且发现转染活性是代依赖性的，其中3代对于转染是最佳的。在每一代中获得均匀的电荷分布是重要的，然而每一代内电荷的确切位置并不重要。当使用不同手性的树枝状聚合物和在每一代内具有不同氨基酸数量的那些树枝状聚合物时，观察到一些活性。然而，将树枝状聚合物内的阳离子氨基酸从Lys改变为Arg(即，从LysLeu改变为ArgLeu基序)改善了血清条件下的转染。这样就允许通过全身递送来进行体内基因转移，这与树枝状聚合物-DNA复合物的改善的稳定性相关。G1，2,3-RL复合物能有效地将基因递送至一组组织。

结果

分子识别单元在确定核酸递送功效中的作用

为了评估在保持疏水性和阳离子特性的平衡恒定的同时微调树枝状聚合物的分子识别单元对DNA包装和递送的影响，本发明人基于G1，2，3-KL的衍生物研究了具有不同的(1)骨架、(2)紧密度、(3)尺寸、(4)结构单元中的手性和(5)氨基酸组成的树枝状聚合物。具有DOTMA/DOPE(D/D)的树枝状聚合物-DNA复合物。使用下表中的某些树枝状聚合物评估在广泛使用的人宫颈癌HeLa和小鼠成神经细胞瘤Neuro2A细胞中的转染效率：

表1.示例性树枝状聚合物。G1，2，3-KL；G1，2-KL；G1-KL；G1，2，3-LR；G1-LR,G2.3-RL；G1，2，3-rl；G1，2-RL，G3-LR；G1，2-LR，G3-RL；G1，2，3-RL；G1，2，-RL；G1-RL；G1，2-LK，G3-KL；G1，2，3-LK；Ala-G1，2，3-KL；G 1，2，3-K；G0，1，2，3-KL；和D-G1，2.3-KL(也表示为″G1，2，3-k1″)在整个树枝状聚合物中具有交替的电荷(Lys或Arg)和疏水(Leu)残基分布。G1，2，3-K在每一代的肽基序中仅具有单个氨基酸。存在于核心序列的C端的NH₂基团是肽合成方法的结果。分子量(MW)不包括抗衡离子(三氟乙酸根)。

还使用下表中的某些树枝状聚合物对mRNA和DNA的体内和体外转染效率进行了评估，并在下面的实施例中进行了讨论：

表2.另外的示例性树枝状聚合物。存在于核心序列的C端的NH2基团是肽合成方法的结果。X＝6-氨基己酸，B＝β-丙氨酸，Dab＝2，4-二氨基丁酸。小写字母是指D型氨基酸，而大写字母是指L型氨基酸。1是D型亮氨酸。甘氨酸没有D型或L型。

测定了表1和2中公开的一组树枝状聚合物的流体动力学尺寸、多分散指数和ζ电位。

表3.肽树枝状聚合物、脂质和mRNA复合物的流体动力学尺寸和ζ电位。树枝状聚合物的N∶P比率为0.16∶1，并且脂质DOTMA/DOPE相对于mRNA的w/w比率为10∶1。存在于核心序列的C端的NH2基团是肽合成方法的结果。X＝6-氨基己酸，B＝β-丙氨酸，Dab＝2，4-二氨基丁酸。小写字母是指D型氨基酸，而大写字母是指L型氨基酸。1是D型亮氨酸。甘氨酸没有D型或L型。

表4.肽树枝状聚合物、脂质和mRNA复合物的流体动力学尺寸和ζ电位。树枝状聚合物的N∶P比率为8∶1，并且脂质DOTMA/DOPE相对于mRNA的w/w比率为10∶1。存在于核心序列的C端的NH基团是肽合成方法的结果。X＝6-氨基己酸，B＝β-丙氨酸，Dab＝2，4-二氨基丁酸。小写字母是指D型氨基酸，而大写字母是指L型氨基酸。1是D型亮氨酸。甘氨酸没有D型或L型。

树枝状结构、对称性、拓扑结构和手性的变化

各种树枝状结构提供支架内的不同氨基酸分布和分支点之间的氨基酸数量，以给出显示多样紧凑度和尺寸的结构(例如，参见上表1)。

为了研究拓扑变化的影响，将一些或所有KL位置颠倒的树枝状聚合物(G1，2-LK，3-KL和G1，2，3-LK)与G1，2,3-KL进行比较。与G1，2,3-KL相比，G1，2,3-LK在DNA结合和转染方面没有显著差异(图1A、B)。对于G1，2,3-K(其中总电荷与G1，2,3-KL相同，但尺寸和分子量降低(G1，2，3-K的MW/电荷比G1，2，3-KL低1.5倍))，转染功效稍微降低；不如G1，2，3-KL有效(图1C、D)。有一种趋势是，与G1，2，3-KL相比，G1，2,3-K在较低的N/P比率(2.5)下转染效果更好，而增加N/P比率会降低转染效果。

为了研究手性的影响，合成了具有D型氨基酸的G1，2，3-KL树枝状聚合物(表示为D-G1，2，3KL)。将树枝状聚合物的L型氨基酸替换为D型对转染没有任何显著影响(图1C、D)。

通过测试G0,1，2，3-KL和Ala-G1，2，3-KL研究了转染焦点处的氨基酸序列的重要性。焦点中的GlySerCys序列(在先前研究的所有树枝状聚合物中是恒定的)被替换为具有附加带电残基的LysLeuAla。该变化不影响转染结果(图1E、F)。

总之，上述结果表明，每一代树枝状聚合物内的电荷分布是转染功效的决定因素。最佳结构的进一步变化可以轻微改变转染活性，但总体效果并不重要，前提条件是电荷分布本身不改变。这一观察结果与我们以前的观察结果一致，即电荷仅集中在外部的代中，而不是均匀分布在每一代中，导致转染效率大大降低。

具有不同代的KL和RL树枝状聚合物的转染效率的比较

探索了在递送效率中基于KL重复单元的从G1至G2至G3的代数。KL单元也被替换为RL重复单元以比较具有不同pKa的质子化碱性基团的效果。有趣的是，我们观察到各代和细胞中的转染之间的关系(图2)。转染的代依赖性揭示了第一代树枝状聚合物G1-KL或G1-RL在具有赖氨酸或精氨酸作为带电残基的情况下不转染HeLa或Neuro2A细胞。这可能是由于G1肽在物理上没有大到足以完全包封质粒DNA以形成稳定的纳米颗粒的事实，如通过复合物稳定性测定法所显示的(数据未示出)。

然而，对于第二代，与G1,2-KL相比，含有精氨酸的G1,2-RL显示出更高的转染效率(在HeLa细胞中N/P比率为10或20，并且在Neuro2A细胞中N/P比率为20)(图2)。G1，2-RL对G1,2-KL的这种转染优势符合G1，2-RL形成比G1，2-KL与DNA更稳定的转染复合物的能力(数据未示出)。对于相应的最佳活性，G2树枝状聚合物的最佳N/P比率显著高于G3树枝状聚合物的最佳N/P比率。我们的结果还显示G1，2-KL以比Neuro2A细胞中更高的效率转染HeLa细胞。这凸显了某些转染子的活性可能依赖于细胞的事实，这是由于不同的组分诸如蛋白聚糖等以及它们在细胞表面上的浓度可能对转染复合物的结合以及最终的基因递送至细胞有影响。

总之，G3树枝状聚合物在HeLa和Neuro2A细胞中都有效转染。我们的第三代树枝状聚合物在HeLa和Neuro2A细胞中的转染效果比一些广泛使用的商业试剂(诸如聚乙烯亚胺(PEI)、Lipofectin(也称为DOTMA/DOPE)和Lipofectamine 2000)好2至600倍(图3)。

在存在血清的情况下，G1，2，3-RL-树枝状聚合物/DOTMA/DOPE制剂的效率是单独的DOTMA/DOPE的至多800倍(单独使用D/D的转染被定义为100％)。与单独的D/D相比，G 1，2，3-KL在HeLa细胞中产生200倍的转染效率改善(图4A)。在Neuro 2A细胞中，G1，2，3-KL和G1，2，3-RL的活性分别是单独的DOTMA/DOPE的340和1500倍(图4B)。这一观察结果可以通过以下事实解释：RL树枝状聚合物比KL树枝状聚合物更强地结合DNA，因此它们更稳定并且对来自血清中带电组分的攻击具有抗性。

转染试剂介导的细胞毒性是体内应用的重要参数。将含有树枝状聚合物的制剂的毒性与对照的毒性进行比较。树枝状聚合物的大部分修饰没有诱导对HeLa细胞更高的毒性，其中细胞活力与G1，2，3-KL(约40％或更高)和商业试剂Lipofectamine 2000(约20％)相当，并且与补充脂质(D/D，约40％)类似。将代数从1增加到3没有增加毒性。由树枝状聚合物制剂引起的毒性的实际机制还不是很清楚，然而，来自制剂的部分毒性是由于如之前所示的D/D的添加以及还来自单独的D/D对照。实际上，与D/D对照相比，大多数脂质-树枝状聚合物-DNA复合物没有介导更高的毒性，而与广泛使用的lipofectamine 2000相比，大多数树枝状聚合物复合物引起更高的细胞活力。树枝状聚合物复合物的毒性与转染效率不直接相关，因为无效的G1-KL或RL制剂也诱导40％的细胞死亡。在Neuro2A细胞中，大多数树枝状聚合物-DNA复合物的毒性(80％或更高的细胞活力)不如它们在HeLa细胞中的毒性。总之，转染后的细胞活力显著高于参考试剂Lipofectamine 2000(-45％)。

摄取机制

研究了本发明的组合物的摄取机制。氯丙嗪用于抑制网格蛋白介导的内吞作用。还使用染料木黄酮和粗糠柴苦素；已报道这些药剂分别抑制小窝介导的内吞作用和微胞饮作用。

本发明人观察到氯丙嗪的添加将转染显著地抑制了80％(图5B)，表明网格蛋白介导的内吞作用在通过树枝状聚合物系统的DNA递送中发挥着重要作用。染料木黄酮和粗糠柴苦素将转染抑制了约50％(图5D、F)。这表明肽树枝状聚合物系统通过至少三种不同途径介导细胞摄取，其中网格蛋白介导的内吞作用作为内化的关键途径。触发不同细胞内化途径的能力将允许不同细胞类型摄取纳米颗粒，并且因此将解释该树枝状聚合物系统在体内递送DNA货物的事实。

讨论

本发明人先前已报道了基于RL和KL(即疏水基团和阳离子基团的组合)的第三代树枝状聚合物的电荷分布对转染的影响(Kwok等人，2013)。提供在三代中的均匀分布产生了有效的转染试剂(与DOTMA/DOPE组合)，而电荷仅集中在表面上(第三代)显著降低了DNA转染。对本文所公开的第三代树枝状聚合物变体的本研究(例如上表1)显示，对于有效转染，树枝状结构中的电荷分布比支架内氨基酸的拓扑结构和手性更重要。

本发明人证明了代数对于转染很重要，趋势是增加代数会提高转染效率。提高的转染效率符合提高的复合物稳定性。例如，G1，2，3-RL是用于在血清条件下转染和体内基因递送的高效树枝状聚合物(数据未示出)。

通过全身施用，G1，2，3-RL、DOTMA/DOPE复合物递送DNA以用于在所有测定的组织中的功能性基因表达。基因表达在肝和骨骼肌中特别高，没有观察到毒性。将DNA递送至所有不同组织符合以下观察结果：G1，2，3-RL和DOTMA/DOPE复合物可以经由网格蛋白介导的内吞作用、小窝介导的内吞作用和巨胞饮作用来介导细胞内化，这是在所有细胞类型中以不同水平表达的货物摄取过程(数据未示出)。

G1，2，3-RL、DOTMA/DOPE、DNA组成的生物分布不同于本领域中描述的其他系统。例如，观察到基于脂质、基于肽的系统和树枝状聚合物PAMAM支架在IV施用后主要将DNA递送至肺和脾。PEI和两亲肽将DNA有效地递送至肺和肝，但使用PEI时观察到毒性。相比之下，本发明提供了一种递送至肌肉而无毒性的有效手段。肾和脾中的相对低的基因表达意味着本发明的组合物不被肾和网状内皮系统清除。因此，肝中的高基因表达表明主要递送至肝细胞和星形细胞(数据未示出)。

本发明的组合物还可以将核酸功能性地递送至脑。虽然穿越或绕过血脑屏障(BBB)的途径尚不确定，但转胞吞作用(即，内皮细胞在屏障的一端内吞货物而在另一端胞吐的过程)是一种可能。已报道转胞吞作用通过其他合成系统诸如双头基两亲分子系统绕过BBB来递送货物。

令人惊讶的是，本发明的组合物将DNA有效地递送至骨骼肌，尽管事实上大多数非病毒基因递送系统显示对该靶标的无效递送(数据未示出)。骨骼肌仅表达小窝蛋白3(Cav3)，这可能表明本发明的递送系统与Cav3组分相互作用以介导有效的细胞内化。

本发明的肽树枝状聚合物代表了通用平台，提供了有效的和潜在的靶标定制的转染试剂，其在氨基酸组成、树枝状聚合物的拓扑结构以及C端和N端上的可能修饰方面都有很大的化学空间。肽树枝状聚合物/DOTMA/DOPE系统可以绕过生物屏障以在体内将DNA质粒递送至细胞核而无需任何其他佐剂。设想了帮助内体逃逸和/或核定位的细胞特异性靶向结构域、肽或其他分子可以与树枝状聚合物缀合以进一步改善细胞/组织靶向递送和基因表达。

材料和方法

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2，3-KL((KL)₈(KKL)₄(KKL)₂KGSC-NH₂)(72.3mg，10.3μmol，9％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.47分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₆₀O₃₉S计算值/实测值4540.1/4539.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2-KL((KL)₄(KKL)₂KGSC-NH₂)(90.5mg，27.9μmol，41％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.36分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₉₆H₁₈₂N₂₈O₁₉S计算值/实测值2096.8/2096.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1-KL((KL)₂KGSC-NH₂)(46.0mg，41.7μmol，60％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.23分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₃₈H₇₄N₁₂O₉S计算值/实测值875.1/875.4[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2，3-RL((RL)₈(KRL)₄(KRL)₂KGSC-NH₂)(14.6mg，2.0μmol，2％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.50分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。HRMS(NSI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₈₈O₃₉S计算值/实测值4932.3/4931.4[M]⁺；5106.3/5105.7[M+TFA+Na+K]⁺；5220.3/5219.9[M+2TFA+Na+K]⁺；5616.4/5616.3[M+6TFA]⁺；5730.4/5730.3[M+7TFA]⁺；5844.5/5844.3[M+8TFA]⁺；5958.5/5958.3[M+9TFA]⁺；6072.5/6072.3[M+10TFA]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2-RL((RL)₄(KRL)₂KGSC-NH₂)(143.2mg，42.1μmol，38％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.45分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₉₆H₁₉₀N₄₀O₁₉S计算值/实测值2264.9/2264.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1-RL((RL)₂KGSC-NH₂)(78.5mg，56.6μmol，51％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.37分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₃₈H₇₄N₁₆O₉s计算值/实测值931.2/931.2[M]⁺；1045.2/1045.4[M+1 TFA]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2-LK,3-KL((KL)₈(KLK)₄(KLK)₂KCGSC-NH₂)(56.7mg，8.1μmol，7％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.47分钟(2.2分钟内A/D100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₆₀O₃₉S计算值/实测值4540.1/4539.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2，3-LK((LK)₈(KLK)₄(KLK)₂KGSC-NH₂)(32.4mg，4.6μmol，4％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.41分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₆₀O₃₉S计算值/实测值4540.1/4539.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后从TentaGel S树脂(500mg，0.22mmol g-1)获得Ala-G1，2，3-KL((LysLeu)₈(LysLysLeu)₄(LysLysLeu)₂LysGlySerAla-NH₂)，其为泡沫状无色固体形式的Ala-G1，2，3-KL(36.6mg，5.2μmol，5％)。分析型RP-HPLC：tR＝1.46分钟(2.2分钟内100％A至100％D，λ＝214nm)；MS(ESI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₆₀O₃₉实测值/计算值4508.0/4508.1[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G1，2，3-K((K)₈(KK)₄(KK)₂KGSC-NH₂)(79.9mg，14.6μmol，12％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.17分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₁₃₄H₂₆₈N₄₆O₂₅S计算值/实测值2955.9/2956.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的G0，1，2，3-KL((KL)₈(KKL)₄(KKL)₂KKLC-NH₂)(54.2mg，7.5μmol，6％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.47分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₂₂₅H₄₃₇N₆₁O₃₈S计算值/实测值4637.3/4638.0[M]⁺。

在制备型RP-HPLC后获得泡沫状无色固体形式的D-G1，2，3-KL((kl)₈(kkl)₄(kkl)₂kgsc-NH₂)(28.3mg，4.0μmol，5％)。分析型RP-HPLC：t_R＝1.44分钟(2.2分钟内A/D 100/0至0/100，λ＝214nm)。MS(ESI+)：C₂₁₈H₄₂₂N₆₀O₃₉S计算值/实测值4540.1/4540.0[M]⁺，其含有少量杂质。

DNA转染

细胞系、转染试剂和质粒。在5％CO₂和37℃的潮湿气氛中，将HeLa细胞维持在含有10％(v/v)FCS和1％(v/v)P/S的RPMI培养基中。质粒pCI-Luc衍生自插入了荧光素酶基因的质粒pCI(英国南安普顿的普洛麦格公司(Promega，Southampton，UK))。支链PEI(25kDa)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。Lipofectamine 2000(L2000)和Lipofectin(DOTMA∶DOPE，1∶1(w/w))得自英杰公司(Invitrogen)。根据制造商的说明书，PEI、L2000和lipofectin用作阳性对照转染剂。

转染程序。在转染前24小时，将HeLa细胞接种(100个μL/孔中10,000个细胞)在96孔板中以达到70％汇合度。通过将树枝状聚合物(100μL，从60μg至105μg，具体取决于N/P比率)与lipofectin(4μg；100μL)混合来形成质粒转染复合物。将这些混合物与pCI-Luc(4μg；100μL)以不同N/P比率在OptiMEM中在25℃下一起温育30分钟。将转染对照复合物(PEI、Lipofectin或L2000)(OptiMEM中总共100μL)以相应制造商推荐浓度与pCI-Luc(4μg；100μL)混合。为了在无血清培养基中转染，在将DNA复合物覆盖在细胞上之前，添加OptiMEM以稀释复合物，使得在96孔板的一个孔中的100μL总体积中每种复合物含有0.25μgDNA。为了在血清培养基中转染，在将DNA复合物覆盖在细胞上之前，添加完全生长培养基以稀释复合物，使得在96孔板的一个孔中的100μL总体积中每种复合物含有0.25μgDNA。从细胞去除完全培养基后，将复合物添加板中。将板在37℃下温育4小时。然后，在测定荧光素酶活性之前，用完全生长培养基替换转染溶液24小时。

转基因表达测定法。将细胞用PBS洗涤两次，并与报告基因裂解缓冲液(20μL，普洛麦格公司)一起在4℃下温育20分钟，然后在-80℃下温育过夜。细胞在室温下解冻后，将荧光素酶测定缓冲液(100μL，普洛麦格公司；根据制造商的方案制备)添加到每个孔中。在FLUOstar Optima光度计(BMG实验室技术公司(BMG Labtech))中通过相对光单位(RLU)测量发光产物。

蛋白质含量测定。通过将每种细胞裂解物(20μL)与Bio-Rad蛋白测定试剂(180μL，英国赫默尔亨普斯特德的伯乐公司(Bio-Rad，Hemer Hempstead，UK))混合来测定该裂解物的蛋白质含量。温育10分钟后，测量590nm处的吸光度，并使用BSA标准曲线将吸光度转换为蛋白质浓度。每mg蛋白质的RLU代表荧光素酶活性。这两个值的比率是每个蛋白质单位的活性(以RLU/mg计)。转染图中显示的值在用DOTMA/DOPE对照转染实验归一化后表示，并以百分比显示。

细胞活力。如″转染程序″中所述的那样转染细胞。转染24小时后，去除培养基并用PBS洗涤细胞两次。之后，将细胞在室温下干燥1小时(以允许核染剂渗透)。将结晶紫溶液(50μL的储备溶液，由西格玛奥德里奇公司供应)添加到细胞中。将它们在室温下温育15分钟。用蒸馏水洗涤(5次)后，将细胞在室温下干燥30分钟。然后，添加MeOH(200μL)并将悬浮液在室温下温育1小时。活细胞保留的结晶紫染色剂的相对量通过甲醇溶液在550nm处的吸光度来确定。

荧光淬灭测定法

将PicoGreen(英杰公司)添加到DNA中，并在TE缓冲液(10mM Tris/HCl，pH 7.5；1mM EDTA)中稀释至0.002μg/μL的最终DNA浓度。将PicoGreen以1∶150(v/v)的比率添加到DNA中，使得每100μL的溶液含有0.2μg DNA。将混合物在室温下温育10分钟。在温育期间，将不同量的转染试剂稀释在TE缓冲液中。然后，向平底96孔板的每个孔中添加50μL的lipofectin(0.2μg)和50μL的树枝状聚合物(量取决于所选择的N/P比率，其在0.625∶1至40∶1之间变化)。然后，向每个孔中添加100μL的DNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)。作为对照，将100pL DNA-PicoGreen溶液(0.2pg DNA)添加到100pL TE缓冲液中。在室温下温育30分钟后，向每个孔中添加100μL的TE缓冲液。然后用荧光读板仪(FLUOstar Optima，BMG实验室技术公司)检测PicoGreen信号，其中激发波长为485nm并且发射波长为520nm。针对DNA对照来对来自复合物的PicoGreen信号进行归一化，以产生检测到的PicoGreen信号的百分比。

复合物解离测定法

将PicoGreen(英杰公司)添加到DNA中，并在TE缓冲液(10mM Tris/HCl，pH 7.5；1mM EDTA)中稀释至0.002μg/μL的最终DNA浓度(将PicoGreen以1∶150(v/v)的比率添加到DNA中，使得每100μL的溶液含有0.2μg DNA)。将混合物在室温下温育10分钟。在温育期间，将不同量的转染试剂稀释在TE缓冲液中。然后，向平底96孔板的每个孔中添加50μL的lipofectin(0.2μg)和50μL的树枝状聚合物(量取决于所选择的N/P比率，其在0.625∶1至40∶1之间变化)。然后，向每个孔中添加100μL的DNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)。作为对照，将100μL DNA-PicoGreen溶液(0.2μg DNA)添加到100μL TE缓冲液中。在室温下温育30分钟后，将在100μL的TE缓冲液中稀释的不同浓度的肝素(0.2至1.4U/mL，西格玛奥德里奇公司)添加至DNA复合物或单独的DNA(0.2μg，总体积200μL)中。在室温下温育30分钟后，使用微板读数器(FLUOstar Optima，BMG实验室技术公司)记录来自PicoGreen的荧光信号，其中激发波长为485nm并且发射波长为520nm。DNA对照用于对该信号进行归一化。

体内荧光素酶DNA表达测定法

给小鼠注射树枝状聚合物、脂质和DNA制剂，并且分别在静脉内和肌内注射后24小时和48小时将组织分离并速冻以用于荧光素酶表达分析。

用补充有蛋白酶抑制剂的1x报告基因裂解缓冲液将组织匀浆。根据组织的不同，将1.5至3倍的裂解缓冲液用于组织匀浆。匀浆后，将裂解物离心并将上清液用于测定荧光素酶表达和蛋白质含量。按照制造商的说明书，使用荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司)，用光度计测量荧光素酶表达水平。按照制造商的说明书，使用伯乐(Biorad)蛋白质测定试剂盒在595nm吸光度下测量蛋白质含量。

体内荧光素酶mRNA表达测定法

肽树枝状聚合物-脂质-mRNA颗粒

将肽树枝状聚合物稀释至相应浓度，并与mRNA以期望的NP比率(诸如NP＝0.15∶1或8∶1)混合。将溶液在室温下温育10分钟。将脂质诸如DOTMA/DOPE稀释至相应浓度，并与树枝状聚合物-mRNA复合物以期望的NP比率(诸如NP＝4.7∶1)混合。将溶液在室温下温育20分钟。当需要时，在注射前将溶液进一步稀释。

脂质-mRNA颗粒对照

将DOTMA/DOPE稀释至相应浓度，并与树枝状聚合物-mRNA复合物混合。将溶液在室温下温育20分钟。当需要时，在注射前将溶液进一步稀释。

小鼠和递送途径

我们研究中进行的所有动物程序都符合英国法律，并获得了伦理批准。6至8周龄的雌性CD-1小鼠(n＝39)在到达后经过1周的适应期。将所有小鼠称重，并使用30G胰岛素注射器(BD生物科学事业部(BD biosciences))经尾静脉进行制剂的静脉内递送(100μl)。

生物发光成像(BLI)

在注射后6小时对所有小鼠进行成像。使用IVIS Lumina II(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))成像系统进行BLI。以150mg/kg的剂量给小鼠施用D-虫荧光素(30mg/mL，XenoLight，珀金埃尔默公司)。在接受D-虫荧光素后将小鼠在含有5％异氟烷的室中麻醉6分钟，然后放置在加热的成像平台上，同时保持2.5％异氟烷。在施用D-虫荧光素后10分钟对小鼠进行成像，设定曝光时间以确保所采集的信号在有效检测范围内(开式滤光片，像素合并(binning)8，光圈级数(f-stop)1)。通过使用Living Image软件(珀金埃尔默公司)测量所定义的感兴趣区(ROI)中的光子通量(光子/s)来定量生物发光信号。在体内全身成像后，对小鼠实施安乐死，采集心脏血液，并提取组织用于离体成像。在此，将每种组织置于含有0.3mg/mLD-虫荧光素的PBS溶液的24孔成像板(黑色面，艾本德公司(Eppendorf))的各个孔中。将成像板置于成像平台(Lumina II系统)的中心，并使用上文详述的采集设置测量信号。最后，将组织置于储存小瓶中并在液氮中快速冷冻。

内吞实验

将细胞与每种抑制剂(氯丙嗪、染料木黄酮和粗糠柴苦素)在37℃下预温育30分钟。随后，如转染部分所述，在存在抑制剂的情况下，在37℃下再进行4小时转染。

体内研究

使用包含DNA的组合物诱导FST表达

在第1天和第3天给小鼠注射单独的表达卵泡抑素的DNA或表达卵泡抑素的DNA与G1，2，3-RL以及D/D脂质。在第5天，收获组织以用于RNA提取。然后从mRNA合成cDNA以用于qPCR。卵泡抑素(FST)在小鼠骨骼肌中的相对表达水平示于图6中。

免疫原性/耐受性

在上述DNA递送类型的IV方案期间监测体重。没有观察到体重减轻(参见图7)。

在第1天和第3天，还监测了未接受注射或仅接受DNA静脉内注射或接受DNA、G1，2，3-RL和D/D制剂静脉内注射的小鼠的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。所有组的AST水平保持基本上低于200U/L，并且ALT水平保持低于100U/L。(AsT和ALT的这些水平比肝损伤(由四氯化碳诱导)的疾病模型中的阈值水平(大于7000U/L)低得多。(Bonnet等人，2008))

还测量了小鼠中的细胞因子水平以检查免疫原性。在第5天收集血清以用于测量AST和ALT水平。未观察到实质性的升高。对于IFN-γ，水平保持低于2pg/mL，没有显著增加(其他非病毒系统可以将IFN-γ升高至60,000pg/mL(Bonnet等人，2008))。对于TNF-α，水平保持低于20pg/mL，没有显著增加(脂多糖可以将TNF-α升高至5000pg/mL(Bonnet等人，2008))。对于IL-6，施用了本发明组合物的小鼠组的水平保持低于20pg/mL，没有显著增加(其他非病毒系统可以将IL-6水平升高至15000pg/mL(Bonnet等人，2008))。对于IL-1-β和IL-10，水平也保持非常低，没有显著增加。

使用包含DNA的组合物诱导荧光素酶表达

给小鼠注射树枝状聚合物、脂质和DNA制剂，该制剂被制备用于在注射后检测荧光素酶表达。分别在静脉内和肌内注射后24小时和48小时将组织分离并速冻以用于荧光素酶表达分析。

静脉内注射的包含G1,2，3-RL和G1，2，3-LR两者的组合物将DNA靶向递送至骨骼肌，如通过荧光素酶表达所确定的，其中G1，2，3-LR显示出最有效递送至骨骼肌(图8)。

肌内注射的包含G1，2-RL，3-LR的组合物也能够将DNA递送至骨骼肌，如通过荧光素酶表达所确定的(图9)。

使用包含mRNA的组合物诱导荧光素酶表达

给小鼠注射包含DOTMA/DOPE、编码荧光素酶的mRNA和G1，2，3-RL(图10，上图；″G1，2，3-RL、脂质和mRNA制剂″)或G1,2-RL，3-LR(图10，下图；″G1，2，3-RL、脂质和mRNA制剂″)的组合物。制备每种制剂并以8∶1和0.15∶1的NP比率注射每种制剂。准备好小鼠以用于在注射后检测荧光素酶表达。

改变G1，2，3-RL或G1,2-RL，3-LR制剂的NP比率引起小鼠组织中mRNA生物分布的变化。0.15∶1的NP比率靶向多种多样的免疫细胞组织，包括肺、脾和淋巴结，相比之下，NP＝8∶1特异性地靶向脾并在较低程度上靶向淋巴结(图10)。这表明改变组合物的NP比率可以改变组合物的组织分布。例如，增加NP比率可以改善对淋巴器官的靶向。

G1，2，3-RL和G1，2-RL，3-LR、脂质和mRNA制剂也可以成功地将mRNA递送至组织，这些组织包括肌肉、肝、心脏、肾和脂肪组织(图11)。具体地，NP比率为8∶1或0.15∶1的G1，2-RL，3-LR、脂质和mRNA制剂能够诱导腓肠肌和四头肌组织、肝、心脏、肾和脂肪组织中的显著表达。

在注射了包含G1，2，3-RL、DOTMA/DOPE和mRNA的组合物的小鼠与注射了包含G1，2-RL.3-LR、DOTMA/DOPE和mRNA的组合物的小鼠之间进行荧光素酶表达的比较。相对于G1，2，3-RL，观察到G1，2-RL，3-LR向所有测试组织的递送增加(图12)。这表明树枝状聚合物序列的选择可以用于靶向特定组织。

重复给药实验

为了确定组合物是否可以重复给药并保持递送至组织，在接受单个或重复剂量(2个剂量，间隔24小时)的DOTMA/DOPE、mRNA和肽树枝状聚合物的小鼠之间进行了比较。与单独的mRNA相比，接受两个剂量的任一组合物的小鼠显示出增加的荧光素酶表达。通常，与接受单个剂量的小鼠相比，接受两个剂量的小鼠中的荧光素酶表达显示出大约相同程度的荧光素酶表达或增加的荧光素酶表达。处理后6小时测定荧光素酶表达。

组织/细胞靶向肽-树枝状聚合物融合蛋白

在包含DOTMA/DOPE、mRNA和G1，2，3-RL、G1，2-RL，3-LR或NXT1之一的组合物之间进行荧光素酶表达的比较(图14)。NXTI树枝状聚合物包括具有核心肽序列的G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物，该核心肽序列包含肌肉靶向肽和细胞穿透肽。与G1，2，3-RL和G1，2-RL，3-LR相比，NXT1能更有效地介导mRNA递送至多种组织，包括肌肉。令人惊讶的是，与G1，2，3-RL和G1，2-RL，3-LR相比，NXT1也能更有效地将mRNA递送至脾和淋巴结。NXT1和G1，2-RL，3-LR在将mRNA递送至肺方面显示类似的效率。

与单独的脂质相比，树枝状聚合物增加mRNA递送至组织

为了确定树枝状聚合物的存在是否改善mRNA递送至组织，给小鼠注射包含以下任一者的组合物：i)单独的mRNA；ii)mRNA和DOTMA/DOPE；iii)G1，2，3-RL、DOTMA/DOPE和mRNA；iv)G1，2-RL，3-LR、DOTMA/DOPE和mRNA或v)NTX1、mRNA和DOTMA/DOPE，并且准备好小鼠以用于在注射后检测荧光素酶表达。每种树枝状聚合物组合物中的NP比率为0.15∶1。如图15所展示，与单独的mRNA或单独的mRNA和DOTMA/DOPE相比，G1，2，3-RL、G1，2-RL，3-LR和NTX1的存在提高了mRNA递送至肺、脾和淋巴结的效率。

还在注射了包含i)单独的mRNA、ii)mRNA、G1，2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE或iii)mRNA和DOTMA/DOPE的组合物的小鼠之间进行了比较。该实验中的NP比率为8∶1。这表明，与单独的mRNA或mRNA和脂质相比，在存在树枝状聚合物的情况下，mRNA递送至脾显著增强。此外，与单独的脂质相比，在包含树枝状聚合物的组合物中，荧光素酶在肺和淋巴结中的表达降低。该数据进一步表明，与单独的DOTA/DOPE相比，G1，2-RL，3-LR改善了mRNA递送至脾的特异性。

树枝状聚合物：脂质递送系统与市售脂质递送系统的比较

使用包含G1，2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE(NP＝0.16∶1)的组合物或市售Lipofectamine^TM2000，以编码荧光素酶的mRNA转染HeLa细胞。如图17左上图所示，与市售转染试剂Lipofectamine^TM2000相比，包含NP比率＝0.16∶1的G1,2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE的组合物使体外转染效率增加约一个数量级。类似地，与使用DLin-MC3-DMA∶胆固醇∶DSPC∶DMG-PEG脂质纳米颗粒递送系统转染的mRNA相比，使用NP比率＝0.16∶1的G1,2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE以编码eGFP的mRNA转染的HeLa细胞使eGFP表达增加大约4倍(图17，右上图)。

用单独的mRNA、用G1，2-RL，3-LR(N∶P＝8∶1)和DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)与mRNA、用DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)与mRNA、用聚乙烯亚胺与mRNA以及用Lipofectamine 2000与mRNA转染C2C12细胞24小时。如图17下图所示，与市售的基于脂质的转染试剂相比，树枝状聚合物制剂改善了mRNA递送至C2C12细胞。

体外CRISPR实验

根据制造说明书使用Label核酸标记试剂盒(米卢斯生物公司(Mirus BioLLC))标记RNA。简而言之，用TM-罗丹明荧光团标记由与tracerRNA(trRNA)融合的CRISPRRNA(crRNA)组成的单引导RNA(sgRNA)，而用Cy5荧光团标记Cas9 mRNA。分别用荧光素和ATTO 550荧光团标记crRNA和trRNA。

用标记的RNA与(1)NP比率＝0.15∶1的G1，2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE或(2)NP比率＝8∶1的G1,2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE的制剂的不同组合转染HeLa细胞。所有组合物中脂质与RNA的比率为10∶1w/w，并且DOTMA∶DOPE的重量比为1∶1。将细胞与每种制剂一起温育2小时，随后用胰蛋白酶消化并固定。通过流式细胞术来测定细胞中RNA摄取的百分比。不含制剂的纯RNA用作对照。

观察到暴露于sgRNA+Cas9 mRNA制剂的大约100％的HeLa细胞对sgRNA和Cas9mRNA呈双阳性，证明G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物是高效转染试剂(图18)。

在包含crRNA、trRNA和Cas9 mRNA的树枝状聚合物和脂质制剂中，树枝状聚合物制剂可以介导所有三种组分在约4％的细胞中的递送(图19)。在仅包含crRNA、trRNA或Cas9mRNA之一的树枝状聚合物和脂质制剂中，阳性细胞的百分比不同。在包含trRNA或Cas9mRNA的组合物中，约100％的细胞对核酸呈阳性。相比之下，当暴露于仅包含crRNA的组合物时，仅4％的细胞对crRNA呈阳性(图20)。总之，该数据表明，虽然G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物可以成功地介导相对短的RNA(例如，在该研究中使用的crRNA为36个核苷酸长)递送至细胞，但RNA的成功递送随着待转染的RNA的长度增加而增加(在该研究中使用的trRNA和Cas9mRNA分别为67和5421个核苷酸长)。

免疫细胞靶向

使用5ml/kg的剂量体积，经由静脉内注射分别向十五只5至7周龄雌性CD-1小鼠(英国查尔斯河实验室(Charles River UK))给予1mg/kg的单一用Alexa Fluor488标记的mRNA、或用Alexa Fluor488标记的mRNA与NTX1和DOTMA/DOPE、或用Alexa Fluor488标记的mRNA与G1，2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE、或用Alexa Fluor488标记的mRNA与G1，2-RL，3-LR和DOTMA/DOPE。第1组接受媒介物，并且第5组仅接受mRNA作为对照。所有组的小鼠在IV施用后2小时被宰杀。在安乐死时，从所有小鼠收集全血、脾、腹股沟淋巴结和股骨。从经EDTA处理的全血、脾、腹股沟淋巴结和骨髓中获得白细胞(WBC)以用于流式细胞术分析。简而言之，从股骨中冲洗出骨髓(BM)，并将脾和淋巴结通过70μm过滤器处理成单细胞悬液。将血液、BM和脾中的红细胞裂解，然后将从所有组织中分离的WBC用不同的抗体组染色以鉴定免疫细胞的特定亚群。在使用ACEANovocyte 3005流式细胞仪分析样品之前，在96孔板格式中进行染色。

NTX1和G1，2-RL，3-LR介导脾中存在的免疫细胞中的mRNA的摄取(图21)。用树枝状聚合物和脂质配制的mRNA被(A)B细胞、(B)T细胞、(C)单核细胞和巨噬细胞、(D)中性粒细胞和(E)树突细胞摄取。具体地，树枝状聚合物和脂质制剂可以在注射后相对短的时间段内(注射后2小时)将mRNA递送至单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。NTX1(NP＝0.15∶1)和G1，2-RL，3LR(NP＝0.15∶1和8∶1)介导mRNA递送至约5％或更多的单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。考虑到从注射到组织收获的短时间段，假设mRNA向所分析的每种免疫细胞类型的递送将随时间而增加是合理的。

NTX1和G1，2-RL，3-LR介导骨髓中存在的免疫细胞中的mRNA的摄取(图22)。用树枝状聚合物和脂质配制的mRNA被(A)单核细胞和巨噬细胞、(B)树突细胞、(C)CD38+细胞、(D)B细胞和(E)中性粒细胞摄取。具体地，树枝状聚合物和脂质制剂可以在注射后相对短的时间段内(注射后2小时)将mRNA递送至单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。考虑到从注射到组织收获的短时间段，假设mRNA向所分析的每种免疫细胞类型的递送将随时间而增加是合理的。

体外DNA递送

图25的上图示出了用单独的DNA、用G1，2，3-RL(N∶P＝5∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA以及用G1，2，3-RL(N∶P＝5∶1)和DOPG/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA转染的HeLa细胞中的荧光素酶表达。包含G1，2，3-RL和DOTMA/DOPE或DOPG/DOPE的组合物能够在体外成功转染HeLa细胞。

类似地，图25的下图示出了用单独的DNA、用聚乙烯亚胺与DNA、用G1，2-RL，3-LR(N∶P＝8∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA以及用NTX2(N∶P＝8∶1)和DOTMA/DOPE(相对于DNA的w/w＝1∶1)与DNA转染的C2C12细胞(肌源性细胞系)中的荧光素酶表达。NTX2是缀合至肌肉靶向肽ASSLINA((LR)8(KRL)4(KRL)2KGSCGAASSLNIA(Acp)-NH2)的G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物。两种树枝状聚合物都能够在体外成功转染C2C12细胞。与没有肌肉靶向结构域的树枝状聚合物相比，包含肌肉靶向结构域的树枝状聚合物进一步提高了转染效率。

体内毒性测定法

给小鼠注射mRNA制剂1次或2次。对于2次IV注射，在第2次注射前24小时对小鼠进行注射。在第2次IV注射后6小时，收获小鼠的血浆并测量AST水平和其他细胞因子水平。对于注射1次的小鼠，注射后6小时收获血浆以用于测量AST水平和其他细胞因子水平。

天冬氨酸转氨酶(AST)是一种生物标记物，其可用作肝健康的量度，并且还可用作确定药剂的肝毒性的标记物。所有测试的树枝状聚合物-脂质-mRNA组合物与仅包含DOTMA/DOPE的组合物相比显示出AST水平未显著增加，并且实际上与单独的mRNA相比显示出AST水平降低(图26A，上图)。这些结果表明所测试的树枝状聚合物组合物未表现出任何显著的肝毒性。

还在接受各种树枝状聚合物-脂质-mRNA制剂注射的小鼠中测量了TNF-α、IL-6和IL-1β。如图26A的下图及图26B的上图和下图所示，与单独的mRNA或DOTMA/DOPE和mRNA组合物相比，所测试的树枝状聚合物组合物都没有分别显著增加TNF-α、IL-6或IL-1β的血浆水平。这些数据表明，树枝状聚合物组合物在暴露于所述组合物的小鼠中未引起显著的免疫反应。这进一步证明了用于将mRNA递送至体内组织的树枝状聚合物组合物的安全性。

还给小鼠注射单独的DNA或包含G1，2，3-RL、DNA和DOTMA/DOPE组合物的制剂，并在24小时后测量AST、TNF-α、IL-6和IL-1β的血浆水平。如图27所示，注射包含树枝状聚合物的制剂没有引起AST(左上)、TNF-α(右上)、IL-6(左下)或IL-1β(右下)的血浆水平的显著增加。这些数据表明，使用本发明树枝状聚合物递送DNA是安全的并且在过程中未引起肝损伤或不良免疫反应。

肽树枝状聚合物转染效率的比较

通过在完全生长培养基条件下转染HeLa细胞来研究树枝状聚合物的代数对mRNA递送的影响。我们已经证实，具有1或2代的树枝状聚合物(例如RHCG1-R、RHCG1，2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL，2-LR)可以有效地转染细胞并且介导与具有3代的树枝状聚合物类似的转染效率(图28)。这确实与DNA转染有很大不同，因为在完全生长培养基中，具有1或2代的树枝状聚合物对细胞的转染效果不如具有3代的树枝状聚合物(图4)。有趣的是，将第1代或第2代树枝状聚合物的N∶P比率从0.16增加至8进一步提高了转染效率(图29)。

我们已研究了树枝状聚合物的核心序列对转染的影响。我们已将3个氨基酸的核心序列GSC从G1,2-RL，3-LR改变为仅两个氨基酸，诸如KA和YM。这种变化不影响mRNA转染，表明核心中有2个氨基酸的树枝状聚合物的转染效果将与核心中有3个氨基酸的树枝状聚合物一样好。接下来，与GSC相比，我们将3个氨基酸的核心序列取代成不同的氨基酸，诸如RFW、RYM。尽管将含有阳离子基团的精氨酸添加到了核心，但这并未提高或降低转染。有趣的是，当核心处的3个氨基酸从GCS改变为RHC时，转染提高了50％。这表明树枝状聚合物的核心中的可电离基团诸如组氨酸可以提高转染(图28A)。

我们在树枝状聚合物(线性G1，2-RL，3-LR)的核心中引入12个氨基酸，并且转染效率不受影响(图28A)。该结果表明可以在核心中引入更长的氨基酸链和/或更长的结构而不影响转染效率。实际上，在核心中含有27个氨基酸的NTX1比G1，2-RL，3-RL更有效地转染。这表明更长的核心序列确实可以增强转染。来自NTX1的转染增强有可能是由于核心序列内细胞穿透肽的存在。

我们还探究了各代内的氨基酸数量对转染的影响。因此，我们测试了仅具有1个氨基酸(R)、2个氨基酸(RL或LR)、3个氨基酸(RLR)和4个氨基酸(LRLR)的树枝状聚合物。我们的转染研究表明，在每一代中具有1、2、3或4个氨基酸的树枝状聚合物仍然可以将mRNA很好地转染进细胞中(图28A)。我们甚至测试了在每一代中具有不同氨基酸数量的树枝状聚合物，结果显示转染效率不受影响。

基于G1，2-RL，3-LR结构，我们已设计了3代树枝状聚合物的文库，其中我们将碱性氨基酸R替换为K，和/或将疏水氨基酸L改变为酸性氨基酸(诸如E)和/或具有非极性侧链的氨基酸(诸如M、F、β-丙氨酸(B)、氨基己酸(X)和W)和/或具有极性侧链的氨基酸(诸如Q、T和Y)。

将树枝状聚合物内的R替换为K降低了mRNA转染效率(图28A)。然而，与G1，2-RL，3-LR相比，将疏水氨基酸改变为其他疏水氨基酸和/或具有极性或非极性侧链的氨基酸可能不影响转染或可能使转染降低30％至40％。潜在的模式尚不明晰，并将进行进一步研究。然而，所有这些树枝状聚合物诱导的mRNA转染都显著高于单独的mRNA对照。

我们还已研究树枝状聚合物内的L或D型氨基酸对mRNA转染的影响。基于G1，2-RL，3-LR树枝状聚合物，我们发现在每一代树枝状聚合物中将部分或全部氨基酸从L型改变为D型不会影响转染效率。在树枝状聚合物内将赖氨酸取代成二氨基丁酸将减少转染，尽管该树枝状聚合物的转染仍然显著高于单独的mRNA对照。

我们已证明G1-LL，2-RR可以用于用我们的配制方案递送mRNA，在该配制方案中我们使用0.16∶1 N∶P比率的G1-LL，2-RR与DOTMA/DOPE(w/w 10∶1)。有趣的是，曾使用该树枝状聚合物在体外和体内以不同的制剂递送ASO(Saher 2018)。所使用的制剂是DOTMA/DOPE(相对于ASO的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与ASO。我们已经在转染细胞时尝试了这一制剂(即DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)，但转染效率较差。该制剂(DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝2∶1)和N∶P＝20∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)仅产生我们改进的制剂(DOTMA/DOPE(相对于mRNA的w/w＝10∶1)和N∶P＝0.16∶1的G1-LL，2-RR与mRNA)的mRNA转染效率的10％。

我们已探究了在不同代中具有RL或LR或rl的用于mRNA递送的3代树枝状聚合物。我们发现这些树枝状聚合物中的大部分类似地转染细胞，其中G1，2-RL，3-LR在mRNA转染中最有效。总之，我们的数据表明在每一代中具有疏水和阳离子氨基酸的树枝状聚合物将产生对细胞的有效mRNA递送。

由于存在比G1，2-RL，3-LR更有效转染细胞的第1代和第2代树枝状聚合物，我们已选择这些树枝状聚合物来进一步测试转染。我们证实，在各种N∶P比率下，这些树枝状聚合物通常可以比G1，2-RL，3-LR更好地转染。具体地，在N∶P＝4∶1下，RHCG1-R、RHCG1，2-R、RHCG1-LR、RHCG1-RL，2-LR、RHCG1-RLR和G1-LRLR的转染效果可以比G1，2-RL，3-LR好700％至1815％。这些数据表明，对DNA和mRNA递送的要求截然不同。对于mRNA，有一种趋势是，在完全生长培养基条件下，具有1代或2代的树枝状聚合物将比3代树枝状聚合物转染细胞的效果更好。然而，在完全生长培养基条件下，第3代树枝状聚合物将DNA转染进细胞的效果要比第1代或第2代树枝状聚合物好得多(图4)。

图30示出了以8∶1的NP比率递送的包含RHC肽核心的第2代树枝状聚合物主要将mRNA靶向递送至脾(上图)并在较低程度上递送至肺(下图)。在0.15∶1的NP比率下，相对于8：1的NP比率，mRNA递送至肺增加。调节mRNA表达

可以通过给小鼠注射包含PEG2000脂质的组合物来调节mRNA表达。与注射了包含G1，2-RL，3-LR、DOTMA/DOPE和mRNA的组合物的小鼠相比，注射了包含G1，2-RL，3-LR、DOTMA/DOPE/PEG2000和mRNA的组合物的小鼠具有减弱的荧光素酶表达。

编号的段落

以下编号的段落阐述了本发明的特定特征和特征组合。

1.一种用于医学的组合物，其中该组合物包含肽树枝状聚合物、核酸和脂质，其中该肽树枝状聚合物包含：第一赖氨酸残基和两个第一肽基序；两个第二赖氨酸残基和四个第二肽基序；四个第三赖氨酸残基和八个第三肽基序；以及与该第一赖氨酸残基共价键合的核心肽序列，

(i)其中该第一赖氨酸残基共价键合至该两个第一肽基序，该两个第一肽基序分别共价键合至该两个第二赖氨酸残基；

(ii)其中每个第二赖氨酸残基共价键合至两个第二肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至该第三赖氨酸残基中的一者；以及

(iii)其中每个第三赖氨酸残基共价键合至该第三肽基序中的两者，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序独立地由单肽或二肽基序组成，并且其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序各自包含a)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；和/或b)亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、组氨酸(H)或异亮氨酸(I)，其中每个氨基酸残基独立地选自L-同工型或D-同工型。

2.根据段落1所述用于用途的组合物，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序中的至少两者包含精氨酸(R)。

3.根据段落1或段落2所述用于用途的组合物，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序中的至少两者包含亮氨酸(L)。

4.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序各自是二肽基序。

5.根据段落4所述用于用途的组合物，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序各自包含亮氨酸(L)和精氨酸(R)。

6.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该核酸包含双链区。

7.根据段落6所述用于用途的组合物，其中该核酸是DNA质粒。

8.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该核酸是或编码mRNA分子或反义寡核苷酸(ASO)。

9.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该核酸包含CRISPR序列。

10.根据段落6所述用于用途的组合物，其中该核酸是siRNA或saRNA分子。

11.根据段落7所述用于用途的组合物，其中该DNA质粒可以在靶细胞中表达siRNA或saRNA分子。

12.根据段落7或段落8所述用于用途的组合物，其中该核酸可以在靶细胞中表达转基因。

13.根据段落12所述用于用途的组合物，其中该转基因是病毒蛋白、细菌蛋白或寄生于哺乳动物的微生物的蛋白。

14.根据段落13所述用于用途的组合物，该组合物用作疫苗。

15.根据段落12所述用于用途的组合物，该组合物用于患者的遗传性障碍的基因疗法。

16.根据段落15所述用于用途的组合物，其中该遗传性障碍引起该患者的肌营养不良症。

17.根据段落15所述用于用途的组合物，其中该遗传性障碍引起该患者的肌病。

18.根据段落12所述的组合物，该组合物用于治疗糖尿病性肢体缺血的方法，其中该转基因是肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)。

19.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该核心肽序列由三肽基序组成。

20.根据段落18所述的组合物，其中该三肽基序包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和半胱氨酸(C)和/或丙氨酸(A)。

19.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)。

20.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。

21.根据前述段落中任一段落所述用于用途的组合物，其中该用途包括将该核酸递送至该患者的肌肉。

22.一种药物组合物，该药物组合物包含根据前述段落中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。

23.一种将核酸递送到靶细胞中的方法，该方法包括使该靶细胞与根据段落1至20中任一项所述的组合物接触，其中该靶细胞是肌细胞、肝细胞、星形细胞、神经元、星形胶质细胞、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞或肿瘤细胞。

24.一种肽树枝状聚合物，该肽树枝状聚合物包含：第一赖氨酸残基和两个第一肽基序；两个第二赖氨酸残基和四个第二肽基序；四个第三赖氨酸残基和八个第三肽基序；以及与该第一赖氨酸残基共价键合的核心肽序列，

(i)其中该第一赖氨酸残基共价键合至该两个第一肽基序，该两个第一肽基序分别共价键合至该两个第二赖氨酸残基；

(ii)其中每个第二赖氨酸残基共价键合至两个第二肽基序，其中每个第二肽基序分别共价键合至该第三赖氨酸残基中的一者；以及

(iii)其中每个第三赖氨酸残基共价键合至该第三肽基序中的两者，其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序各自由(i)亮氨酸-精氨酸(LR)二肽基序或(ii)精氨酸-亮氨酸(RL)基序组成；其中该第一肽基序、该第二肽基序和该第三肽基序中的至少一者是(i)亮氨酸-精氨酸(LR)，其中每个氨基酸残基独立地选自L-同工型或D-同工型。

25.一种组合物，该组合物包含核酸、脂质和根据段落24所述的肽树枝状聚合物。

26.根据段落25所述用于医学的组合物。

27.根据段落25所述的组合物用于在体外或离体将该核酸递送到细胞中的用途。

28.根据段落1至22或24至26中任一项所述的组合物或肽树枝状聚合物，该组合物或该肽树枝状聚合物用于治疗庞贝病、肌肉萎缩疾病或肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症。

参考文献

为了更全面地描述和公开本发明和本发明所属的现有技术，上面引用了许多出版物。下面提供这些参考文献的完整引用。这些参考文献中的每一篇的全部内容并入本文。

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Philippidis，第四名男孩在安斯泰来AT132临床试验中死亡(Fourth Boy Diesin Clinical Trial of Astellas′AT132)，《人类基因疗法》(Human Gene Therapy)，32，19-20(2021)。Qiu等人，开发用于细胞内mRNA递送和基因组编辑的生物可降解脂质纳米颗粒(Developing Biodegradable Lipid Nanoparticles for Intracellular mRNADelivery and Genome Editing)，《化学研究评述》(Acc.Chem.Res)，54(21)，4001-4011(2021)。

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关于标准分子生物学技术，参见Sambrook,J.、Russel,D.W.，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第3版，2001年，纽约冷泉港(Cold SpringHarbor，New York)：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

Claims (167)

1.一种用于医学的组合物，所述组合物包含肽树枝状聚合物、核酸和脂质，

其中所述肽树枝状聚合物至少包含：核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序，其中所述分支残基是赖氨酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，

并且其中所述核酸包括至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸的核酸。

2.根据权利要求1所述用于用途的组合物，其中所述核酸是RNA。

3.根据权利要求2所述用于用途的组合物，其中所述RNA选自mRNA、ssRNA、dsRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、IncRNA、siRNA、saRNA和/或自扩增RNA。

4.根据权利要求3所述用于用途的组合物，其中所述RNA是mRNA。

5.根据权利要求1所述用于用途的组合物，其中所述核酸是DNA。

6.根据权利要求5所述用于用途的组合物，其中所述DNA包括ssDNA、dsDNA、质粒和/或cDNA。

7.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物包含RNA核酸和DNA核酸。

8.根据权利要求7所述用于用途的组合物，其中所述RNA核酸和DNA核酸是单个核酸分子的一部分。

9.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核酸包括经修饰的核酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核酸编码转基因并且能够在靶细胞中表达所述转基因。

11.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述用途涉及通过调节内源基因的表达或活性来治疗所述受试者的疾病。

12.根据权利要求11所述用于用途的组合物，其中所述调节是所述基因的表达的增加和/或所述基因的另外拷贝的外源表达的增加。

13.根据权利要求11所述用于用途的组合物，其中所述调节是所述基因的表达的降低。

14.根据权利要求11至13中任一项所述用于用途的组合物，其中所述内源基因被翻译成蛋白质或肽。

15.根据权利要求14所述用于用途的组合物，其中所述蛋白质或肽包括抗原、激素、受体、嵌合抗原受体、转录因子和/或细胞因子，诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和/或干扰素。

16.根据权利要求10所述用于用途的组合物，其中所述转基因包括肿瘤抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或寄生于哺乳动物的微生物的蛋白。

17.根据前述权利要求中任一项用于用途的组合物，其中所述组合物是疫苗。

18.根据权利要求17所述用于用途的组合物，其中所述核酸包括或编码自扩增RNA。

19.根据权利要求1至16中任一项所述用于用途的组合物，其中所述用途包括治疗所述受试者的遗传性障碍。

20.根据权利要求19所述用于用途的组合物，其中所述核酸表达在所述受试者中无功能、下调、失活或受损的基因的功能型式。

21.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核酸编码和/或包含用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统的一种或多种组分。

22.根据权利要求21所述用于用途的组合物，其中所述用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统是CRISPR/Cas系统。

23.根据权利要求21或22所述用于用途的组合物，其中所述核酸编码Cas蛋白或肽，和/或包括sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。

24.根据权利要求23所述用于用途的组合物，其中所述核酸包括编码Cas蛋白或肽的mRNA以及含sgRNA的RNA序列。

25.根据权利要求24用于用途的组合物，其中所述编码Cas蛋白或肽的mRNA和所述含sgRNA的RNA序列是单独分子。

26.根据权利要求23或24所述用于用途的组合物，其中当存在时，所述sgRNA、所述crRNA、所述tracrRNA和所述编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者是单个核酸的一部分。

27.根据权利要求23或24所述用于用途的组合物，其中当存在时，所述sgRNA、所述crRNA、所述tracrRNA和所述编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者存在于两个或更多个核酸上。

28.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物靶向脾、淋巴组织、肺、骨、胸腺、肝、肿瘤组织、心脏组织、骨骼肌、肾、脂肪组织和/或脑。

29.根据权利要求28所述用于用途的组合物，其中所述组合物靶向脾、淋巴组织、肺和/或骨。

30.根据权利要求29所述用于用途的组合物，其中所述核酸是RNA，例如mRNA。

31.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述用途包括向受试者施用所述组合物，使得所述核酸递送至作为白细胞的细胞，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞或单核细胞；淋巴结组织细胞、髓样细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、肝细胞、星形细胞、神经元、星形胶质细胞、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞、干细胞和/或肿瘤细胞。

32.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述用途包括向受试者施用所述组合物，使得所述核酸递送至免疫细胞。

33.根据权利要求31或32所述用于用途的组合物，其中所述核酸在所述细胞中表达免疫分子或转录因子。

34.根据权利要求33所述用于用途的组合物，其中所述免疫分子是T细胞受体、嵌合抗原受体、细胞因子、诱饵受体、抗体、共刺激受体、共刺激配体、检查点抑制剂、免疫缀合物或肿瘤抗原。

35.根据权利要求31至34中任一项所述用于用途的组合物，其中所述细胞是B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞或肿瘤相关中性粒细胞。

36.根据权利要求35所述用于用途的组合物，其中所述核酸是RNA，例如mRNA。

37.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物用于治疗所述受试者的癌症的方法中。

38.根据权利要求37所述用于用途的组合物，其中所述癌症是血癌，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征；或肺癌、贲门癌、肉瘤或肝癌。

39.根据权利要求37或权利要求38所述用于用途的组合物，其中所述方法包括施用抗癌剂。

40.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物用于治疗所述受试者的肺部疾病或自身免疫性疾病的方法中。

41.根据权利要求19至28中任一项所述用于用途的组合物，其中所述方法是治疗所述受试者的庞贝病、肌肉萎缩疾病、肌病或肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症。

42.根据权利要求41所述用于用途的组合物，其中所述核酸是DNA。

43.根据权利要求1至31中任一项所述用于用途的组合物，其中所述方法是治疗所述受试者的肢体缺血，诸如糖尿病性肢体缺血，并且其中所述转基因是肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或成纤维细胞生长因子(FGF)。

44.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述两个第一肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

45.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含两个第二分支残基(例如赖氨酸)和四个第二肽基序，

其中所述第二分支残基中的一者共价键合至所述第一肽基序中的一者，并且另一第二分支残基共价键合至另一第一肽基序，并且其中每个第二分支残基共价键合至两个第二肽基序。

46.根据权利要求45所述用于用途的组合物，其中所述四个第二肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

47.根据权利要求45或46所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含四个第三分支残基(例如赖氨酸)和八个第三肽基序，

其中每个第二肽基序分别共价键合至所述第三分支残基中的一者，使得每个第三分支残基共价键合至一个第二肽基序，并且其中每个第三分支残基共价键合至两个第三肽基序。

48.根据权利要求47所述用于用途的组合物，其中所述八个第三肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

49.根据权利要求44至48中任一项所述用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有碱性侧链的氨基酸。

50.根据权利要求44至49中任一项所述用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有非极性侧链的氨基酸。

51.根据权利要求44至50中任一项所述用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有酸性侧链的氨基酸。

52.根据权利要求44至51中任一项所述用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有不带电的极性侧链的氨基酸。

53.根据权利要求44至52中任一项所述用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含亮氨酸(L)和/或精氨酸(R)残基。

54.根据权利要求44至53中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核心序列包含至少两个氨基酸。

55.根据权利要求44至54中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核心序列包含至多30个氨基酸。

56.根据权利要求44至54中任一项所述用于用途的组合物，其中所述核心序列包含可电离氨基酸，诸如组氨酸。

57.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含表2中列出的结构。

58.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含组织和/或细胞靶向基序。

59.根据权利要求58所述用于用途的组合物，其中所述组织或细胞靶向基序包括肌肉靶向基序例如GAASSLNIA(SEQ ID NO：1)、整合素靶向基序例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或化学修饰，例如包含甘露糖糖基化。

60.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含细胞穿透肽(CPP)。

61.根据权利要求60所述用于用途的组合物，其中所述细胞穿透肽包含肽序列XRXRRBRRXRRBRXB(SEQ ID NO：2)，其中X是6-氨基己酸并且B是β-丙氨酸。

62.根据权利要求60所述用于用途的组合物，其中所述细胞穿透肽包含TAT衍生序列。

63.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含烷基链、烯基链、抗体或其片段、靶向肽、糖、细胞穿透肽、内体逃逸肽、核定位基序和/或脂肪酸。

64.根据权利要求63所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链缀合至所述核心肽序列。

65.根据权利要求63或64所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链、抗体或其片段、所述靶向肽、糖、靶向肽、细胞穿透肽、内体逃逸肽、核定位基序和/或脂肪酸缀合至所述肽树枝状聚合物的C端。

66.根据权利要求63至65中任一项所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链、抗体或其片段、靶向肽、糖、靶向肽、细胞穿透肽、内体逃逸肽、核定位基序和/或脂肪酸缀合至所述肽树枝状聚合物的N端。

67.根据权利要求63至66中任一项所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链包含约5个碳至约50个碳，优选地约12至约30个碳。

68.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和/或可电离脂质。

69.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括饱和脂肪酸。

70.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括不饱和脂肪酸。

71.根据权利要求69或70所述用于用途的组合物，其中所述脂质包含1、2、3、4、5或6条脂肪酸链。

72.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。

73.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。

74.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于约0.01∶1与100∶1之间。

75.根据权利要求74所述用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于1∶1与50∶1之间。

76.根据权利要求75所述用于用途的组合物，其中在向受试者施用后，在脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的所述组合物。

77.根据权利要求75所述用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于0.01∶1与1∶1之间。

78.根据权利要求77所述用于用途的组合物，其中在向受试者施用后，在肺、脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的所述组合物。

79.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物、所述核酸和所述脂质形成带正电的颗粒。

80.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物、所述核酸和所述脂质形成带负电的颗粒或带中性电荷的颗粒。

81.根据权利要求28至32中任一项所述用于用途的组合物，其中与使用基于脂质的核酸递送系统将相同核酸递送至相同组织或细胞类型相比，所述核酸至所述靶组织或细胞的递送增加了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、75％、85％、90％、95％、100％。

82.根据权利要求81所述用于用途的组合物，其中所述靶组织是脾、淋巴结、肺、肝或骨。

83.根据权利要求81或82所述用于用途的组合物，其中所述基于脂质的核酸递送系统是DOTMA/DOPE。

84.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述施用在静脉内、肌内、肿瘤内、皮下、皮内或腹膜内进行。

85.根据前述权利要求中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物包含在液体内。

86.一种组合物，所述组合物包含肽树枝状聚合物、核酸和脂质，其中所述肽树枝状聚合物至少包含：核心肽序列、第一分支残基和两个第一肽基序，其中所述分支残基是赖氨酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸或二氨基丙酸；

其中所述核酸包括至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸的单链核酸。

87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述单链核酸是RNA。

88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述RNA选自mRNA、ssRNA、sgRNA、crRNA、tracrRNA、IncRNA和/或自扩增RNA。

89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。

90.根据权利要求86至89中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含两个或更多个RNA。

91.根据权利要求86所述的组合物，其中所述单链核酸是ssDNA。

92.根据权利要求86至91中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含RNA核酸和DNA核酸。

93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述RNA核酸和DNA核酸是单个核酸分子的一部分。

94.根据权利要求86至93中任一项所述的组合物，其中所述单链核酸包括经修饰的核酸。

95.根据权利要求86至94中任一项所述的组合物，其中所述单链核酸编码转基因并且能够在靶细胞中表达所述转基因。

96.根据权利要求86至95中任一项所述的组合物，其中所述单链核酸能够调节内源基因的表达或活性。

97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述调节是所述基因的表达的增加和/或所述基因的另外拷贝的外源表达的增加。

98.根据权利要求96所述的组合物，其中所述调节是所述基因的表达的降低。

99.根据权利要求96至98中任一项所述的组合物，其中所述内源基因被翻译成蛋白质或肽。

100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述蛋白质或肽包括抗原、激素、受体、嵌合抗原受体、转录因子和/或细胞因子，诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21和/或干扰素。

101.根据权利要求95所述的组合物，其中所述转基因包括病毒蛋白、细菌蛋白和/或寄生于哺乳动物的微生物的蛋白。

102.根据权利要求86至101中任一项所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。

103.根据权利要求108所述的组合物，其中所述单链核酸包括或编码自激活RNA。

104.根据权利要求86至100中任一项所述的组合物，其中所述用途包括治疗所述受试者的遗传性障碍。

105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述核酸表达在所述受试者中无功能、下调、失活或受损的基因的功能型式。

106.根据权利要求86至105中任一项所述的组合物，其中所述单链核酸编码和/或包含用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统的一种或多种组分。

107.根据权利要求106所述的组合物，其中所述用于编辑基因组的系统或用于改变基因表达的系统是CRISPR/Cas系统。

108.根据权利要求106或107所述的组合物，其中所述单链核酸编码Cas蛋白或肽，和/或包括sgRNA、crRNA和/或tracrRNA。

109.根据权利要求108所述的组合物，其中所述单链核酸包括编码Cas蛋白或肽的mRNA以及sgRNA。

110.根据权利要求108或109所述的组合物，其中当存在时，所述sgRNA、所述crRNA、所述tracrRNA和所述编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者是单个核酸的一部分。

111.根据权利要求108或109所述的组合物，其中当存在时，所述sgRNA、所述crRNA、所述tracrRNA和所述编码Cas蛋白的核酸中的一者或多者存在于两个或更多个核酸上。

112.根据权利要求86至111中任一项所述的组合物，其中所述组合物适于将所述核酸靶向脾、淋巴组织、肺、骨、肝、心脏组织、肿瘤组织、骨骼肌、肾、脂肪组织和/或脑。

113.根据权利要求112所述的组合物，其中所述组合物适于将所述核酸靶向脾、淋巴组织、肺和/或骨。

114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述核酸是RNA，例如mRNA。

115.根据权利要求86至114中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗受试者的癌症的方法中。

116.根据权利要求115所述用于用途的组合物，其中所述癌症是血癌，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤、贲门癌、肉瘤或肝癌。

117.根据权利要求115或权利要求116所述用于用途的组合物，其中所述方法包括施用抗癌剂。

118.根据权利要求86至114中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗受试者的肺部疾病或自身免疫性疾病的方法中。

119.根据权利要求86至114中任一项所述的组合物，所述组合物用于治疗受试者的庞贝病、肌肉萎缩疾病、肌病或肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症。

120.根据权利要求119所述用于用途的组合物，其中所述核酸是DNA。

121.根据权利要求86至120中任一项所述用于用途的组合物，其中所述组合物将所述核酸递送至所述受试者中的白细胞，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞或单核细胞；淋巴结组织细胞、髓样细胞、成纤维细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、星形细胞、神经元、星形胶质细胞、脾细胞、肺细胞、心肌细胞、肾细胞、脂肪细胞或肿瘤细胞。

122.根据权利要求86至121中任一项所述用于用途的组合物，其中所述用途包括向受试者施用所述组合物，使得所述核酸递送至免疫细胞。

123.根据权利要求121或122所述用于用途的组合物，其中所述核酸在所述细胞中表达免疫分子或转录因子。

124.根据权利要求123所述用于用途的组合物，其中所述免疫分子是T细胞受体、细胞因子、诱饵受体、抗体、共刺激受体、共刺激配体、检查点抑制剂、免疫缀合物或肿瘤抗原。

125.根据权利要求121至124中任一项所述用于用途的组合物，其中所述细胞是B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞或单核细胞。

126.根据权利要求125所述用于用途的组合物，其中所述核酸是RNA，例如mRNA。

127.根据权利要求86至97中任一项所述的组合物或根据权利要求115至126中任一项所述用于用途的组合物，其中所述两个第一肽基序独立地由单个氨基酸、二肽、三肽或四肽基序组成。

128.根据权利要求127所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含两个第二分支残基(例如赖氨酸)和四个第二肽基序，其中所述第二分支残基中的一者共价键合至所述第一肽基序中的一者，并且另一第二分支残基共价键合至另一第一肽基序，并且其中每个第二分支残基共价键合至两个第二肽基序。

129.根据权利要求128所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述四个第二肽基序独立地由单肽、二肽、三肽或四肽基序组成。

130.根据权利要求127或128所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物还包含四个第三分支残基(例如赖氨酸)和八个第三肽基序，

其中每个第二肽基序分别共价键合至所述第三分支残基中的一者，使得每个第三分支残基共价键合至一个第二肽基序，并且其中每个第三分支残基共价键合至两个第三肽基序。

131.根据权利要求130所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述八个第三肽基序独立地由单肽、二肽、三肽或四肽基序组成。

132.根据权利要求127至131中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有碱性侧链的氨基酸。

133.根据权利要求127至132中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有非极性侧链的氨基酸。

134.根据权利要求127至133中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有酸性侧链的氨基酸。

135.根据权利要求127至134中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含具有不带电的极性侧链的氨基酸。

136.根据权利要求127至135中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述第一肽基序、所述第二肽基序和/或所述第三肽基序包含亮氨酸(L)和/或精氨酸(R)残基。

137.根据权利要求86至136中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含表2中列出的结构。

138.根据权利要求86至137中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含组织和/或细胞靶向基序。

139.根据权利要求138所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述组织靶向基序包括肌肉靶向基序例如GAASSLNIA(SEQ ID NO：1)、整合素靶向基序例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或化学修饰，例如包含甘露糖糖基化。

140.根据权利要求86至139中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含细胞穿透肽。

141.根据权利要求140所述用于用途的组合物，其中所述细胞穿透肽包含TAT衍生序列。

142.根据权利要求140所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述细胞穿透肽包含肽序列XRXRRBRRXRRBRXB(SEQ ID NO：2)，其中X是6-氨基己酸并且B是β-丙氨酸。

143.根据权利要求86至142中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含烷基链、烯基链、抗体或其片段、糖和/或脂肪酸。

144.根据权利要求143所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链缀合至所述核心肽序列。

145.根据权利要求144所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链缀合至所述肽树枝状聚合物的C端。

146.根据权利要求144所述用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链缀合至所述肽树枝状聚合物的N端。

147.根据权利要求143至146中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述烷基或烯基链包含约5个碳至约50个碳，优选地约12至约30个碳。

148.根据权利要求143所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含与所述肽树枝状聚合物的C端缀合的脂肪酸。

149.根据权利要求143所述用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物包含与所述肽树枝状聚合物的N端缀合的脂肪酸。

150.根据权利要求86至149中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质和/或可电离脂质。

151.根据权利要求86至150中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括饱和脂肪酸。

152.根据权利要求86至151中任一项所述用于用途的组合物，其中所述脂质包括不饱和脂肪酸。

153.根据权利要求151或152所述用于用途的组合物，其中所述脂质包含1、2、3、4、5或6条脂肪酸链。

154.根据权利要求86至153中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或N-[1-(2，3二油烯基氧基)丙基]-N，N，N三甲基氯化铵(DOTMA)。

155.根据权利要求86至154中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述脂质包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。

156.根据权利要求86至155中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于约0.01∶1与100∶1之间。

157.根据权利要求156所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于1∶1与50∶1之间。

158.根据权利要求157所述的组合物或用于用途的组合物，其中在向受试者施用后，在脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的所述组合物。

159.根据权利要求156所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述N/P比率介于0.01∶1与1∶1之间。

160.根据权利要求159所述的组合物或用于用途的组合物，其中在向受试者施用后，在肺、脾和/或淋巴结中观察到比肝更高比例的所述组合物。

161.根据权利要求86至160中任一项所述的组合物，其中在使靶细胞与所述组合物在体外接触之后，与使用基于脂质的核酸递送系统将相同核酸递送至相同细胞类型相比，所述核酸至所述靶细胞的递送增加了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、75％、85％、90％、95％、100％。

162.根据权利要求161所述用于用途的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞或免疫细胞。

163.根据权利要求161或162所述用于用途的组合物，其中所述基于脂质的核酸递送系统是Lipofectamine 2000。

164.根据权利要求86至163中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述肽树枝状聚合物、所述核酸和所述脂质形成带正电的颗粒。

165.根据权利要求86至164中任一项所述的组合物或用于用途的组合物，其中所述组合物包含在液体内。

166.根据权利要求86至165中任一项所述的组合物，其中所述组合物是粉末组合物。

167.一种将核酸递送至需要所述递送的受试者的细胞中的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学有效量的根据权利要求1至165中任一项所述的组合物。