CN117448350B - 一种利用桑黄Pb-bHLH9基因提高酿酒酵母多重胁迫抗性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用桑黄Pb‑bHLH9基因提高酿酒酵母多重胁迫抗性的应用，属于基因工程技术领域，其编码基因序列如SEQ ID NO.1所示，本发明采用PEG/LiAc法，将过表达重组载体转入酿酒酵母中。本发明通过超表达桑黄Pb‑bHLH9的转基因酿酒酵母菌株p816‑Pb‑bHLH9与对照p816相比，在抗高温、抗低温、抗氧化胁迫等方面具有明显的作用，说明所获得的转录因子Pb‑bHLH9参与抗逆境胁迫的调控，在实际生产中应用有助于提高酿酒酵母的抗胁迫能力。

Description

一种利用桑黄Pb-bHLH9基因提高酿酒酵母多重胁迫抗性的 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用桑黄Pb-bHLH9基因提高酿酒酵母多重胁迫抗性的应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是人类了解最早的一种酵母，因其生长周期短、发酵能力强、规模化生产性能好等优点，成为微生物发酵生产的主要底盘细胞之一。目前在发酵食品、饮料、药物、生物酶等食品和化学品生产中应用广泛。但在工业生产过程中，受环境的变化或工艺操作的影响，酿酒酵母会受到多种胁迫因素的影响，导致生产效率下降。这些胁迫主要包括啤酒、葡萄酒和白酒工业生产所带来的氧化应激、食醋酿造生产中高温糖化所带来的温度冲击等。因此，提高这些耐受性对于酿酒酵母的工业应用至关重要。近年来，许多研究专注于探究酿酒酵母耐受机制与相关调控网络，并利用基因工程等技术开发出耐受性更强的酿酒酵母工业菌株，为酿酒酵母在恶劣工业条件下的应用奠定了基础。

Basic helix-loop-helix(bHLH)类转录因子广泛存在于动植物中，是植物中转录因子数量最多的家族之一。近年来，已有学者对诸如胡杨(Populus euphratica)、沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等植物中鉴定到bHLH家族转录因子，并发现bHLH转录因子在干旱、低温胁迫中起到十分重要作用。通过鉴定毛竹(Phyllostachys edulis)bHLH基因家族成员，分别有14和13个PebHLHs在干旱和盐胁迫处理后的表达量上调，表达量下调分别有2和3个，初步揭示PebHLHs功能的多样性和复杂性。对马铃薯(Solanum tuberosum)bHLH转录因子家族的全基因组进行鉴定和分析发现，StbHLH45主要参与高温胁迫响应。通过上述研究表明，bHLH转录因子在提高非生物胁迫方面具有较大的应用前景，然而目前将bHLH转录因子应用于酵母中，以提高酵母抗胁迫能力的研究非常有限，尤其是将大型真菌中的bHLH基因应用于酿酒酵母中更是罕见报道。因此，将桑黄bHLH转录因子通过基因工程技术应用于酿酒酵母中，对提高酿酒酵母对各种胁迫的耐受性具有重大意义。

发明内容

基于上述不足，本发明的目的是提供一种利用桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9在调控酿酒酵母在多重胁迫下抗性中的用途，所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，用于提高酿酒酵母多重胁迫抗性。

进一步，所述的用途，将所述编码基因转入酿酒酵母中，并在转基因菌株中超量表达，使得酿酒酵母的抗高温、抗低温和抗氧化胁迫的能力提高。

本发明的另一目的是提供一种转基因菌株的构建方法，采用PEG/LiAc法，将过表达重组载体转入酿酒酵母中，所述的过表达重组载体包含桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的cDNA全长核苷酸序列，所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，筛选获得酿酒酵母转基因菌株，所述的酿酒酵母转基因菌株与对照相比，抗高温、抗低温和抗氧化胁迫的能力提高。

本发明的优点及有益效果：本发明过表达桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9的酿酒酵母菌株可以显著提高抗高温、低温和抗氧化胁迫的能力，在实际生产中应用有助于提高酿酒酵母对多种胁迫的耐受性，该基因可作为重要的基因资源，在酿酒酵母工业生产中得到应用。

附图说明

图1是桑黄Pb-bHLH9基因的PCR扩增电泳图，1：Pb-bHLH9基因cDNA全长扩增结果；M：DL2000 DNA marker；

图2是桑黄Pb-bHLH9蛋白三级结构预测图；

图3是转桑黄Pb-bHLH9基因的酿酒酵母菌株菌液PCR检测图，M：DL5000 DNAmarker；1-3：酿酒酵母转化子检测；4：阳性对照；5：阴性对照；

图4是转基因酿酒酵母菌株与对照菌株在高温50℃下胁迫2h后的生长情况图；

图5是转基因酿酒酵母菌株与对照菌株在低温-20℃下胁迫48h后的生长情况图；

图6是转基因酿酒酵母菌株与对照菌株在20mM过氧化氢胁迫24h后的生长情况图。

具体实施方式

本发明提供了一种桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9，以桑黄DL101菌株RNA反转录的cDNA为模版，通过设计引物、基因扩增、序列测定，获得了Pb-bHLH9基因全长序列，并确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列；进一步将Pb-bHLH9基因构建到表达载体pY816中，并转化酿酒酵母感受态，鉴定Pb-bHLH9的功能。下面举例对本发明做进一步的说明：

1、桑黄Pb-bHLH9基因的克隆

对桑黄(Phellinus igniarius)采用PDA培养基进行活化，25℃培养5～8d，收集桑黄菌丝体，并使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒对桑黄菌丝体总RNA进行提取，经检测合格的RNA样品，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)试剂盒说明书将RNA样品反转录为cDNA，置于-20℃保存备用。

根据本实验室测得的桑黄转录组数据库分析、筛选得到Pb-bHLH9基因，根据基因全长序列设计一对克隆引物：正向引物序列F1为：5ˊ-ATGGCTACCCACATTGAATCACAG-3ˊ；反向引物序列R1为：5ˊ-TCAGAAGGCGGCCTGTTG-3ˊ。以上述-20℃保存的桑黄cDNA为模板，采用100μL体系进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物如图1所示，与预测大小相符，PCR产物经胶回收纯化后分别与pMD18-T载体(TaKaRa，大连)连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，进行测序。结果表明，Pb-bHLH9含有一个906bp的开放阅读框(ORF)，编码301个氨基酸。

2、桑黄Pb-bHLH9转录因子的生物信息学分析

采用ExPASy服务器上的ProtParam tool软件对Pb-bHLH9基因编码的氨基酸序列进行分子量大小、等电点等理化性质分析，结果显示其分子量为33.5kDa，等电点为7.91；对该蛋白的保守结构域预测显示Pb-bHLH9蛋白属于basic Helix Loop Helix(bHLH)domainsuperfamily；采用PSORT对Pb-bHLH9的亚细胞定位进行分析，结果表明该基因主要定位于细胞核；分别使用在线工具TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0server对蛋白的跨膜区和信号肽进行分析，结果表明Pb-bHLH9蛋白不具跨膜结构，不含信号肽；通过ExPASy服务器上的GOR在线软件对Pb-bHLH9蛋白进行二级结构预测，表明Pb-bHLH9蛋白的主要组成部分包括32.89％的α-螺旋、0.66％的β-转角、5.32％的延伸链和61.13％的无规卷曲组成；通过生物信息软件Expasy对桑黄Pb-bHLH9蛋白进行三级结构预测，使用SWISS-MODEL数据库预测构建桑黄Pb-bHLH9转录因子蛋白的三级结构模型(图2)。将得到的cDNA序列进行Blastx比对，结果表明，该序列与地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)相似性最高，为89.47％。

3、桑黄Pb-bHLH9转录因子提高酿酒酵母多重胁迫的功能验证

(1)含有Pb-bHLH9基因的重组载体构建

对Pb-bHLH9基因编码区进行克隆，以桑黄cDNA为模板，根据Pb-bHLH9编码区设计引物并引入pY816载体同源臂，

Sb-bH9pY-F：5’-AGGGAATATTAAGCTATGGCTACCCACATTGAATCACAG-3’

Sb-bH9pY-R：5’-CCCCCATGGTAAGCTTCAGAAGGCGGCCTGTTG-3’

其中划横线的字母为引入的载体同源臂。

将pY816质粒(实验室保存)用限制性核酸内切酶HindⅢ进行单酶切后切胶回收，与经PCR扩增得到的带有载体同源臂的Pb-bHLH9纯化产物采用试剂盒进行同源重组，转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒进行测序，测序结果正确，即获得了重组载体，标记为pY816-Pb-bHLH9。

(2)重组载体pY816-Pb-bHLH9转化酿酒酵母

将重组载体pY816-Pb-bHLH9，采用PEG/LiAc法转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，主要步骤为：取100μl冰上融化的INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-2μg，Carrier DNA(95℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(每15min翻转6-8次混匀)；再放入42℃水浴15min(每7.5min翻转6-8次混匀)；5000rpm离心2min弃上清，用100μl无菌ddH₂O重悬，涂布于尿嘧啶缺陷培养基SD-Ura板上，30℃避光倒置培养48-96h。同时将空pY816载体转入INVSC1，作为对照，标记为INVSC1(pY816)。随机挑取转化的酿酒酵母单菌落(含重组质粒pY816-Po-MADS1)扩大培养，提取酵母DNA，以引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和引物Ter：5’-GTGACATAACTAATTACATGATG-3’进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，扩增片段大小与预期相符，表明目的基因已成功转入酿酒酵母INVSc1中。

(3)酿酒酵母胁迫处理

挑取酿酒酵母(pY816-Pb-bHLH9)和酿酒酵母(含有空载pY816，作为对照)单克隆细胞在SD-Ura液体培养基(含有2％葡萄糖)中，30℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5，离心收集菌体，用含有2％半乳糖的SC-Ura液体培养基(诱导培养基)调整OD₆₀₀＝0.4，30℃诱导表达24h。测量并调整OD₆₀₀，使酿酒酵母(pY816-Pb-bHLH9)和酿酒酵母(pY816)OD₆₀₀都为1.0，分别离心收集菌体用于高温胁迫(50℃，2h)、低温胁迫(-20℃，48h)、氧胁迫(过氧化氢20mM，24h)处理，每个处理重复三次，其中高温和低温胁迫后，在30℃条件下恢复生长9h。将处理后的菌液作10×稀释，取2μL点在SD-Ura固体培养基上，30℃培养48h后观察酿酒酵母生长情况(图4、图5、图6)。因此，通过超表达桑黄Pb-bHLH9的转基因酿酒酵母菌株(pY816-Pb-bHLH9)与对照(pY816)相比，在抗高温、抗低温和抗氧化胁迫方面具有明显的作用，说明所获得的转录因子Pb-bHLH9参与抗逆境胁迫的调控，在实际生产中应用有助于提高酿酒酵母的抗胁迫能力。

Claims (3)

1.一种利用桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9提高酿酒酵母多重胁迫抗性的用途，所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的多重胁迫抗性为抗高温、抗低温或/和抗氧化胁迫。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将所述编码基因转入酿酒酵母中，并在转基因菌株中超量表达，能使酿酒酵母抗高温、抗低温和抗氧化胁迫的能力提高。

3.一种转基因菌株的构建方法，采用PEG/LiAc法，将过表达重组载体转入酿酒酵母中，所述的过表达重组载体包含桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的cDNA全长核苷酸序列，所述的桑黄bHLH类转录因子Pb-bHLH9编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，筛选获得酿酒酵母转基因菌株，其特征在于，所述的酿酒酵母转基因菌株与对照相比，抗高温、抗低温和抗氧化胁迫的能力提高。