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CN117440967A - 抗OX40L抗体、抗OX40L/抗TNFα双特异性抗体及其用途 - Google Patents

抗OX40L抗体、抗OX40L/抗TNFα双特异性抗体及其用途 Download PDF

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CN117440967A CN202080107779.0A CN202080107779A CN117440967A CN 117440967 A CN117440967 A CN 117440967A CN 202080107779 A CN202080107779 A CN 202080107779A CN 117440967 A CN117440967 A CN 117440967A
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李庭旼
李允庭
姜铉朱
郑升喜
崔种烈
赵奎恩
河敬植
金秀盈
朴范灿
朴哉垠
沈恩英
李玄美
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Inoon Ltd
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Im Biotechnology Co ltd
Inoon Ltd
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Abstract

本发明关于一种特异性结合OX40L的新颖抗体及特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，且具体而言关于特异性结合人OX40L以有效抑制OX40与OX40受体结合的抗体或双特异性抗体；编码该抗体的核酸；包含该核酸的表达载体；包含该表达载体的转化体；用于制备该抗体的方法；用于治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物组合物，其包含该抗体；用于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的组合物，其包含该抗体；通过使用该抗体诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法；通过使用该抗体提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法；以及用于提供其的试剂盒。

Description

抗OX40L抗体、抗OX40L/抗TNFα双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明是关于一种特异性结合OX40L的新颖抗体及特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，具体而言是关于特异性结合人OX40L以有效抑制OX40与OX40受体结合的抗体或双特异性抗体；编码前述抗体的核酸；包括前述核酸的表达载体；包括前述表达载体的转化体；用于制备前述抗体的方法；用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物组合物，其包括前述抗体；用于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的组合物，其包括前述抗体；通过使用前述抗体诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法；通过使用前述抗体提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法；以及用于提供其的试剂盒。
背景技术
自体免疫性疾病或炎症性疾病是由人类免疫异常活化引起。在风湿性关节炎(其是自体免疫性疾病的代表性病状)的情况下，TNFα抑制剂已占治疗市场的68％。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是由多种细胞类型(包括单核细胞及巨噬细胞)产生的细胞因子，且首先通过其诱发某些小鼠肿瘤坏死的能力而被最先鉴别[参见Old,L.(1985)Science230:630-632]。此后，发现与恶病质相关的名为恶病质素(cachectin)的因子是与TNFα相同的分子。TNFα参与介导休克[参见Beutler,B.及Cerami,A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:505-518；Beutler,B.及Cerami,A.(1989)Annu.Rev.Immunol.7:625-655]。另外，TNFα已牵涉于多种人类疾病及病症的病理生理学中，前述疾病及病症包括败血症、传染性疾病、自体免疫性疾病、移植排斥及移植物抗宿主疾病[参见Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:411-452；Tracey,K.J.及Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med.45:491-503]。
由于人TNFα(hTNFα)在多种疾病中的有害作用，因此已设计治疗策略来抑制或抵消hTNFα活性。具体而言，已使用结合且中和hTNFα的抗体作为抑制hTNFα活性的手段。前述hTNFα中和抗体包括由杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAb)，前述杂交瘤系是用hTNFα免疫的小鼠的淋巴细胞获得[参见Hahn T等人,(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82:3814-3818；Liang,C-M.等人,(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137:847-854；Hirai,M.等人,(1987)J.Immunol.Methods 96:57-62；Fendly,B.M.等人,(1987)Hybridoma 6:359-370；Muller,A.等人,L.(1990)Cytokine2:162-169；U.S专利第5,231,024号(Moeller等人)；EP专利公开案第186833B1号(Wallach,D.)；EP专利公开案第218 868Al号(Old等人.)；EP专利公开案第260 610B 1号(Moeller,A.等人)]或嵌合抗体[参见Knight,D.M等人,(1993)Mol.Immunol.30:1443-1453；PCT未经审查公开案WO 92/16553(Daddona,P.E.等人)]或人源化单克隆抗体[参见PCT未经审查公开案WO 92/11383(Adair，JR等人)]或人单克隆抗体[参见U.S.10-1142825]或其类似物。这些抗hTNFα抗体可对hTNFα具有高亲和力(例如Kd≤10-9M)且中和hTNFα活性。这些抗hTNFα抗体已用作多种自体免疫性疾病、感染、移植排斥、移植物抗宿主病及其类似疾病的治疗剂。
然而，患者组的约50％对TNFα抑制剂(诸如这些抗hTNFα抗体)难治愈(NatureReviews Rheumatology第11卷,276-289(2015)。此外，最近开发的自体免疫性疾病的标靶是CTLA-4、IL-6、JAK1、JAK2、CD20及其类似物，但自其衍生的药物未能显示与TNFα抑制剂一样的功效(Nature Reviews Rheumatology第11卷,276–289(2015)。
具体而言，诸如类风湿性关节炎等自体免疫性疾病并非简单地由一种类型的免疫细胞的异常引起，而是作为整个免疫系统的问题发生。因此，用于开发仅抑制单个标靶的治疗剂的现有方法在增强治疗剂功效方面具有局限性。因此，为了克服此类功效局限性，目前已经开发出一种双特异性或多特异性抗体，其一次性控制两个或更多个具有不同作用机制的标靶。然而，现有双特异性抗体对先天或后天性免疫系统中的特定细胞具有局限性，且因此不能改善免疫系统的整体稳态(homeostasis)。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的是提供与OX40L(OX40配体)特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段。
本发明的目的是提供识别OX40L的构象抗原决定簇(epitope)的与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体，其包括：在由SEQ ID NO：1表示的OX40L蛋白的氨基酸序列中由SEQ IDNO：3表示的第93至100号氨基酸序列，以及由SEQ ID NO：4表示的第141至151号氨基酸序列。
本发明的目的是提供一种双特异性抗体，其包括与OX40L(OX40配体)特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段；以及与肿瘤坏死因子α(TNFα)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
本发明的目的是提供编码抗OX40L抗体、其结合片段或双特异性抗体的核酸；其中引入前述核酸的表达载体；或其中引入前述表达载体的宿主细胞。
本发明的目的是提供一种通过使用宿主细胞生产抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体的方法。
本发明的目的是提供一种用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物组合物，其包括抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体。
本发明的目的是提供一种用于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的组合物，其包括抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体。
本发明的目的是提供一种用于检测上述OX40L及TNFα中的至少一者的组合物，包括抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体。
本发明的目的是提供一种用于通过使用抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体来提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法。
本发明的目的是提供一种用于提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的试剂盒，其包括抗OX40L抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体。
本发明的目的是提供一种用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法，其包括施用医药上有效量的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体。
本发明的目的是提供一种抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体的用途，其用于制造用以预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物。
本发明的目的是提供一种抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或双特异性抗体的用途，其用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病。
[技术方案]
本发明中揭示的各描述及实施例可分别应用于其他描述及实施例。换言之，本发明中揭示的各种要素的所有组合均属于本发明的范畴内。
另外，不能认为本发明的范畴限于下文描述的具体描述。
本发明可提供一种抗OX40L抗体或其结合片段，其与OX40L特异性结合且抑制OX40L与OX40受体之间的相互作用。
如本文所用，术语『抗体』可指用作特异性识别抗原的受体的蛋白分子，包括与某些抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，且此术语可包括多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗体，以及所有结合片段。另外，上述术语可包括嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、人源化抗体、人抗体及二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双抗体、三抗体或四抗体。
通常，免疫球蛋白可具有重链及轻链，且重链及轻链中的每一者可包括恒定区及可变区(此区还称为结构域)。重链及轻链的可变区可包括三个多可变区及四个框架区，其称为互补决定区(CDR)。CDR可在主要结合抗原的抗原决定簇中发挥作用。各链的CDR可依序是指CDR1、CDR2及CDR3，通常自N端开始，且还可由定位有某些CDR的链来鉴别。
整个抗体可采取具有两个全长轻链及两个全长重链的结构，其中各轻链通过二硫键与重链连接。整个抗体可包括IgA、IgD、IgE、IgM及IgG，且IgG可包括作为亚型的IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。重链恒定区可具有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)及epsilon(ε)类型，且还可具有gamma 1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma 3(γ3)、gamma 4(γ4)、alpha 1(α1)及alpha 2(α2)作为子类。轻链恒定区可具有kappa(κ)及lambda(λ)类型。
如本文所用，术语『片段』、『抗体片段』、『抗原结合片段』及『结合片段』可指具有抗原结合功能的本发明抗体的任何片段，且可以彼此互换使用，且可包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及其类似物。
Fab可具有一个抗原结合位点，其采取具有轻链及重链的可变区、轻链的恒定区及重链的第一恒定区(CH1结构域)的结构。Fab′可能与Fab有所不同，因为Fab′在重链CH1结构域的C末端具有一个铰链区，前述铰链区包括至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体可以使Fab'铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键的方式产生。可变片段(Fv)可指仅具有重链可变区及轻链可变区的最小抗体片段。在双链Fv(dsFv)的情况下，重链可变区及轻链可变区通过二硫键彼此连接。在单链Fv(scFv)的情况下，重链可变区及轻链可变区通常经肽连接子通过共价键彼此连接。结合片段可通过使用蛋白酶获得(例如Fab可通过用木瓜蛋白酶对整个抗体进行限制性消化获得，而F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶进行此举来获得)，且可例如通过基因重组技术制备。
如本文所用，术语『单克隆抗体』可指自一组实质上相同的抗体获得的具有单个分子组成的抗体分子，且此单克隆抗体可显示出对某些抗原决定簇的单一结合特异性及亲和力。在本发明的实例中，根据本发明的与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体或与OX40L及TNFα特异性结合的双特异性抗体可为单分子抗体。具体而言，抗OX40L抗体可指特异性结合OX40L的某一抗原决定簇的单一分子组成的抗体，且双特异性抗体可指同时特异性结合OX40L及TNFα的某些抗原决定簇的单一分子组成的双特异性抗体。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体及与OX40L及TNFα特异性结合的双特异性抗体可为(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
如本文所用，术语『嵌合抗体』可为通过重组小鼠抗体的可变区及人抗体的恒定区产生的抗体，且可为与小鼠抗体相比在免疫反应方面有很大改善的抗体。
如本文所用，术语『人源化抗体』可指以使得源自非人类物种的抗体的蛋白序列变得类似于自人类天然产生的抗体变异体的方式修饰的抗体。举例而言，可将小鼠来源的CDR与人抗体来源的FR重组以制备人源化可变区，且随后与所需人抗体的恒定区重组的方式制备人源化抗体。然而，若仅简单地进行CDR移植，则人源化抗体的亲和力可能变低。因此，可使用使得认为对CDR的三维结构有影响的若干重要FR氨基酸残基对小鼠抗体的那些更具亲和力的方式使此类低亲和力升高至与小鼠源抗体的亲和力相同的水平。
如本文所用，术语『人抗体』可指源自人免疫球蛋白的分子，其中形成抗体的所有氨基酸序列(包括互补决定区及框架区)均由人免疫球蛋白的氨基酸序列构成。人抗体通常用于治疗人类疾病，且可能具有三种或更多种潜在优势。首先，人抗体可以与人免疫系统更好地相互作用，且因此例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)更有效地破坏标靶细胞。其次，优点是人类免疫系统不会将那些抗体识别为异源的。第三，其优点在于，即使较不频繁地施用较少量的药物，人抗体在人类循环系统中的半衰期与天然存在的抗体的半衰期相似。在本发明的实例中，根据本发明的特异性结合OX40L的抗OX40L抗体及特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体可为人抗体。因此，本发明的人抗OX40L抗体及本发明的人双特异性抗体可显示出对OX40L的强亲和力，从而有效抑制表达OX40L的细胞(例如单核细胞)与OX40受体的结合，且由于重链及轻链的结构域均来自人类，因此显示低免疫原性，还可用于治疗诸如自体免疫性疾病或炎症性疾病的疾病。
如本文所用，术语『OX40L』可指作为受体的OX40蛋白的配体，且具体地是指与OX40受体结合的蛋白。关于OX40L的信息可自诸如国立卫生研究院的GenBank等公众已知数据库获得，且可包括例如关于OX40L的信息，其包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中登录号为Gene ID：54567，NCBI参考序列：NM_003326.5(TNFSF4 ver1)，及NM_001297562.2(TNFSF4ver2)。
OX40L可能在抗原递呈细胞(APC)中过表达，且可能会活化多个免疫细胞。像TNFα及INFγ一样，尤其观察到OX40L在患有自体免疫性疾病的患者中过量产生(Eur.J.Immunol.2000.30:2815–2823)。与分布在全身的TNFα不同，OX40L可能仅在活化的免疫细胞中产生，且可能主要分布在病变部位。OX40L可能系一种多重免疫调节蛋白，通过同时参与先天性免疫系统的抗原递呈细胞(APC)及后天性免疫系统的T辅助细胞来参与重新获得免疫系统的稳态(Nature Reviews Rheumatology第12卷,74–76(2016),(ClinicRev Allerg Immunol,2016)。
如本文所用，术语『OX40』可指介导OX40/OX40L信号传导的蛋白。上述OX40可无限制性的包括任何蛋白，只要前述蛋白介导OX40/OX40L信号传导即可。
如本文所用，术语『抑制OX40L与OX40之间的相互作用』或『抑制OX40L与OX40受体之间的相互作用』可意谓以本发明特异性结合OX40L的抗OX40L抗体或其结合片段结合OX40L的方式，抑制或抑制OX40L与OX40之间的相互作用。在抗OX40L抗体或其结合片段与OX40L结合的情况下，可以抑制或抑制OX40L的生物学功能，从而不引起OX40信号传导。换言之，可通过抗OX40L抗体或其结合片段与OX40L的结合来抑制或抑制OX40L与OX40之间的相互作用，从而可抑制或抑制OX40信号传导。
在本发明中，『与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体』可指与OX40L特异性结合从而抑制或降低OX40L的生物学活性的抗体。前述抗体可抑制或抑制OX40L的生物学活性，从而抑制或抑制OX40L与OX40受体之间的相互作用。在本说明书中，『与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体』可与『与OX40L特异性结合的抗体』或『抗OX40L抗体』互换使用。
如上所述，抗OX40L抗体的形式可包括完整抗体及其结合片段。本发明的抗OX40L抗体可与人OX40L特异性结合且抑制OX40L与OX40受体之间的相互作用，且因此可用于治疗诸如自体免疫性疾病或炎症性疾病的疾病，且还可与在自体免疫性疾病或炎症性疾病中过表达的人OX40L特异性结合，从而在使副作用降至最低的同时使治疗效果最大化。
在本发明的实例中，与OX40L特异性结合且抑制OX40L与OX40受体之间相互作用的抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以3×10-9M或更低的KD结合人OX40L。具体而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以1.5×10-9M、1.3×10-9M，具体而言1×10-9M或更低的KD结合。
如本文所用，术语『缔合常数(Kon)』可指特异性抗体-抗原相互作用中缔合的比率，而术语『解离常数(Koff)』可指特异性抗体-抗原相互作用中的解离比率。另外，如本文所用，术语『对抗原的亲和力(KD)』可指表示为摩尔浓度(M)的Koff：Kon的比率(即Koff/Kon)。抗体的KD值可通过使用本领域中成熟的方法测量。举例而言，用于测量抗体的KD值的方法可包括使用但不限于BioCoreTM系统的表面等离子共振分析。
根据本发明，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可显示出对OX40L的高结合力，从而即使在低浓度下还可抑制或抑制OX40L的活性，且因此可以显示出对自体免疫性疾病或炎症性疾病的卓越治疗效果。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可识别人OX40L的构象抗原决定簇。举例而言，根据本发明的抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以3×10-9M或更低的KD结合至由SEQ ID NO：1表示的人OX40L蛋白的氨基酸序列中的第93至100号及第141至151号氨基酸序列。具体而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以1.5×10-9M、1.3×10-9M，具体而言1×10-9M或更低的KD结合至由SEQ ID NO：1表示的人OX40L蛋白的氨基酸序列中的第93至100号及第141至151号氨基酸序列。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以高结合力，具体而言3×10-9M或更低的KD结合至由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4表示的人OX40L蛋白的氨基酸序列。具体而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可以1.5×10-9M、1.3×10-9M，具体而言1×10-9M或更低的KD结合。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段对人OX40L的KD可为通过表面等离子共振(Biacore)分析测量的KD。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段可特定地包括但不限于如下所述的序列。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括：
重链可变区，其包括由选自SEQ ID NO：12、13及14组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR1；由选自SEQ ID NO：15、16、17及18组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR2；及由选自SEQ ID NO：19、20、21及22组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包括由选自SEQ ID NO：23及24组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR1；由选自SEQ ID NO：25及26组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR2；及由选自SEQ ID NO：27、28、29及30组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR3。
如本文所用，术语『重链』可包括全长重链及其包括可变区结构域VH及三个恒定区结构域CH1、CH2及CH3的片段，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。
另外，本文所用的术语『轻链』可包括全长轻链及其包括可变区结构域VL及恒定区结构域CL的片段，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可为包括(但不限于)以下的抗体：
重链可变区，其包括由SEQ ID NO：12表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：15表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：19表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包括由SEQ ID NO：23表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：25表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：27表示的轻链CDR3。在本发明的实例中，抗体命名为02C09。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可为包括(但不限于)以下的抗体：
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：28表示的轻链CDR3。在本发明的实施例中，抗体命名为hu3F07及I3F07。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可为包括(但不限于)以下的抗体：
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：17表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：21表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：29表示的轻链CDR3。在本发明的实施例中，抗体命名为10H07。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可为包括(但不限于)以下的抗体：
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：14表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：18表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：22表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：30表示的轻链CDR3。在本发明的实例中，抗体命名为21G07。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括：
由选自SEQ ID NO：37、41、45、49及53组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及
由选自SEQ ID NO：38、42、46、50及54组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链可变区。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括：
(a)由SEQ ID NO：37表示的重链可变区及由SEQ ID NO：38表示的轻链可变区；
(b)由SEQ ID NO：41表示的重链可变区及由SEQ ID NO：42表示的轻链可变区；
(c)由SEQ ID NO：45表示的重链可变区及由SEQ ID NO：46表示的轻链可变区；
(d)由SEQ ID NO：49表示的重链可变区及由SEQ ID NO：50表示的轻链可变区；或
(e)由SEQ ID NO：53表示的重链可变区及由SEQ ID NO：54表示的轻链可变区。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括：
由选自SEQ ID NO：5、6、7及8组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及
由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其结合片段可为包括以下的抗体或其结合片段：
(a)由SEQ ID NO：37表示的重链可变区及由SEQ ID NO：38表示的轻链可变区；(b)由SEQ ID NO：41表示的重链可变区及由SEQ ID NO：42表示的轻链可变区；(c)由SEQ IDNO：45表示的重链可变区及由SEQ ID NO：46表示的轻链可变区；(d)由SEQ ID NO：49表示的重链可变区及由SEQ ID NO：50表示的轻链可变区；或(e)由SEQ ID NO：53表示的重链可变区及由SEQ ID NO：54表示的轻链可变区；及
由选自SEQ ID NO：5、6、7及8组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区。
在此情况下，包括(a)及(b)的可变区的抗体可为人源化抗体，且包括(c)至(d)的可变区的抗体可为嵌合抗体。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可具有足以在人体中显示足够作用的物理化学性质，且可具有优异的热稳定性。举例而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可在高于50℃、具体而言59℃或更高的温度下熔融，且在人体中可具有约两周或更长的半衰期。
在本发明的实例中，在本发明的抗OX40L抗体包括恒定区的情况下，此类抗体可包括源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或其杂合的恒定区。
如本文所用，术语『组合』可意谓在形成二聚体或多聚体的情况下，编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽与不同来源的单链多肽形成键。举例而言，可由选自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM的恒定区组成的群的两个或更多个恒定区形成二聚体或多聚体。
如本文所用，术语『杂合』可意谓对应于两个或更多个不同来源的免疫球蛋白重链恒定区的序列存在于单链免疫球蛋白重链恒定区中。举例而言，可存在包括选自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM的CH1、CH2、CH3及CH4组成的群的一至四个结构域的结构域杂合。
同时，可具有作为IgG亚型的IgG1、IgG2、IgG3及IgG4的重链恒定区的组合或杂合。前述组合或杂合可与上述相同。
在本发明的实例中，IgG1重链恒定区可为但不限于由SEQ ID NO：5表示的IgG1重链恒定区；IgG1 N297A重链恒定区可为由SEQ ID NO：6表示的重链恒定区；IgG4重链恒定区可为由SEQ ID NO：7表示的IgG4重链恒定区；及IgG4 S228P重链恒定区可为由SEQ ID NO：8表示的IgG4重链恒定区。
另外，在本发明的对OX40L具有特异性的抗OX40L抗体包括轻链恒定区的情况下，前述轻链恒定区可源自lambda(λ)或kappa(κ)轻链。在抗体的轻链恒定区源自kappa(κ)轻链的情况下，此轻链恒定区可为(但不限于)由SEQ ID NO：10表示的kappa(κ)轻链恒定区。
在本发明中，抗体可包括由小鼠产生的小鼠抗体及通过取代、添加及/或缺失亲本抗体的一部分氨基酸序列获得的其变异体，从而改善前述抗体的亲和力、免疫性等。变异体可包括例如(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、亲和力优化抗体等。如本文所用，术语『亲和力优化抗体』可为其中某些抗体的一部分CDR序列被取代、添加或缺失的变异体，且可指对抗原具有改善的结合亲和力同时与某些抗体结合相同抗原决定簇的抗体。
在本发明中，变异体可以广泛地指其中在包括与亲本抗体相同的CDR或靶向相同抗原决定簇的条件下，亲本抗体的一部分CDR氨基酸序列发生突变(取代、添加或缺失)的抗体。本领域技术人员可适当地调节此变异体以在保持针对同一抗原决定簇的结合能力的范围内改善抗体的亲和力、免疫性等。
根据本发明，在特异性识别OX40L的范围内，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括本文所述的抗OX40L抗体的序列以及其生物学等效物。举例而言，可进一步改变抗体的氨基酸序列，以便进一步改善抗体的结合亲和力及/或其他生物学特性。此类修饰可包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入及/或取代。可基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等进行此类氨基酸突变。根据氨基酸侧链取代基的大小、形状及类型的分析，可理解精氨酸、赖氨酸及组氨酸均为带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸的大小相似；且苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，可理解精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸是生物学功能等效物。举例而言，在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可包括由本文的SEQ ID NO表示的氨基酸序列的一或多个残基中的保守氨基酸的变化，且前述保守氨基酸的变化可包括如下表1所示的取代。
[表1]保守氨基酸的取代
根据本发明的一个实例，制备靶向OX40L的新型抗体。自使用人OX40L(hOX40L)免疫的小鼠制备的基因库及人类基因库制备对OX40L特异的抗体，例如02C09、hu3F07、10H07及21G07。证实抗体以0.2至0.7nM的高亲和力特异性结合OX40L(表32，图4)，且显示出0.2至0.9nM的活体外OX40L抑制活性，此明显比对照抗体优异(图5)。另外，抗体显示出阻断T细胞中的OX40L的免疫活性的结果(图6)。这些结果表明本发明对OX40L具有特异性的抗OX40L抗体有效地阻断与OX40受体的结合且抑制OX40/OX40L信号传导，从而在自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗方面显示出极优异的效果，藉此表明此类抗体可使副作用降至最低且选择性治疗自体免疫性疾病及炎症性疾病，同时保持免疫系统的体内平衡。
根据本发明，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可通过抑制OX40L的功能有效地用于自体免疫性疾病或炎症性疾病的治疗。
人类免疫系统可由两种类型组成：先天性免疫系统及后天性免疫系统，且当先天性及后天性免疫系统被异常活化时可能会发生自体免疫性疾病。
已知当OX40L及OX40受体彼此结合时，先天性及后天性免疫系统的免疫细胞可能过度活化而引起各种疾病。
上述OX40L可能同时参与先天性免疫系统的抗原递呈细胞(APC)及后天性免疫系统的T辅助细胞，且因此参与免疫系统的体内平衡(Nature Reviews Rheumatology第12卷,74–76(2016),(Clinic Rev Allerg Immunol,2016)。此外，由于上述OX40L密集分布于病灶部位，因此与全身分布的细胞因子不同，根据本发明的抗OX40L抗体或其结合片段具有与病变周围的OX40L结合的高度可能性。
因此，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可与密集分布于病灶周围的OX40L结合，从而使对自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗效果最大化，且减少副作用以提高安全性。
另外，与先天性免疫系统相比，后天性免疫系统可显示较慢反应速度，但持久性较高，且因此可作为治疗由免疫系统过度活性引起的自体免疫性疾病的主要因素。根据本发明的抗OX40L抗体或其抗原结合片段可具有很大优势，因为其对OX40L的抑制或抑制不仅调节先天性免疫细胞，而且还调节公知自体免疫治疗剂未能产生影响的后天性免疫细胞。
换言之，根据本发明，与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段可有效地抑制及抑制OX40L与OX40之间的相互作用，且因此可有效地用于自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗。
本发明可提供编码抗OX40L抗体或其抗原结合片段的核酸(聚核苷酸)；包括前述核酸的表达载体；及其中引入有表达载体的转化体。
如本文所用，术语『核酸』或『聚核苷酸』可具有全面包括DNA及RNA分子的含义。核苷酸是核酸分子的基本组成单元，其可包括天然核苷酸以及在其中修饰有糖或碱基位点的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,NewYork(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,(1990)90:543-584)。
根据本发明，可修饰编码轻链可变区及重链可变区的核酸分子的序列，其中所述修饰可包括核苷酸的添加、缺失、或非保守或保守取代。
本发明的核酸可解释为包括与上述核苷酸序列显示实质同一性的核苷酸序列。在本发明中，在本发明的上述核苷酸序列及任何其他序列以彼此尽可能多的对应的方式比对且比对序列通过使用本领域中通常使用的算法分析的情况下，实质同一性可指显示至少80％同源性，具体而言至少90％同源性，且更具体而言至少95％同源性的核苷酸序列。
如本文所用，用作在宿主细胞中表达标靶基因的手段的术语『载体』或『表达载体』可包括(但不限于)质体载体；黏质体载体；病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体；及其类似物，且具体而言可为质体载体。
在本发明的载体中，可将编码轻链可变区的核酸分子及编码重链可变区的核酸分子可操作地连接至启动子。
如本文所用，术语『可操作地连接』可指核酸表达调节序列(例如启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，藉此调控序列可调控上述另一核酸序列的转录及/或解碼。
可通过本领域中已知的各种方法构建本发明的重组载体系统。举例而言，其详细方法揭示于Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)中，其内容以引用的方式并入本文。
在本发明中，包括编码抗OX40L抗体或其抗原结合片段的核酸(聚核苷酸)的表达载体可为可以在真核细胞或原核细胞中复制及/或表达前述核酸的载体，前述真核细胞或原核细胞包括(但不特定限于)哺乳动物细胞(例如人、猴、家兔、大鼠、仓鼠、小鼠细胞等)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(例如大肠杆菌等)。具体而言，表达载体可为包括至少一种选择标记且与适当启动子可操作地连接的载体，使得核酸可在宿主细胞中表达，更具体而言可为其中核酸引入至噬菌体、质体、黏质体、微型染色体、病毒、逆转录病毒载体等中的载体。
包括编码抗OX40L抗体的核酸(聚核苷酸)的表达载体可为包括分别编码抗OX40L抗体的重链或轻链的核酸的表达载体，或可为包括编码全部重链或轻链的核酸的表达载体。
在本发明中，其中引入表达载体的转化体可包括(但不限于)诸如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)等细菌细胞，其通过向其中引入表达载体进行转化；酵母细胞；真菌细胞，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等；昆虫细胞，诸如果蝇、斜纹夜蛾Sf9(spodoptera Sf9)细胞等；动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、弓形黑色素瘤细胞、HT-1080、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人类胚胎肾细胞(HEK)、PERC.6(人类视网膜细胞)等；或植物细胞。在本发明的实例中，HEK细胞等用作宿主细胞。
如本文所用，术语『引入/转移』可指用于将包括编码抗OX40L抗体或其抗原结合片段的核酸(聚核苷酸)的载体递送至宿主细胞的方法。可通过本领域中已知的若干方法进行此类引入，诸如磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、聚乙烯介导的转染法、电击法、显微注射法、脂质体融合法、脂质转染胺及原生质体融合法及其类似方法。另外，转导可指通过使用病毒颗粒经感染将标靶对象转移至细胞中。另外，可通过基因轰击等将载体引入宿主细胞。在本发明中，引入可与转化互换地使用。
本发明可提供制备抗OX40L抗体或其抗原结合片段的方法。
根据本发明，可通过用于制备单克隆抗体的已知技术容易地制备抗OX40L抗体或其抗原结合片段。例如(但不限于)，制备单克隆抗体的方法可通过自获自免疫动物的B淋巴细胞制备杂交瘤进行(Koeher及Milstein,1976,Nature,256:495)，或通过噬菌体展现技术进行。
使用噬菌体展现技术的抗体基因库可为通过在不制备杂交瘤的情况下直接从B淋巴细胞获得抗体基因而在噬菌体表面表达抗体的方法。通过使用噬菌体展现技术，有可能克服与通过B细胞永生化产生单克隆抗体相关的许多现有困难。通常，噬菌体展现技术可包括以下步骤：1)将寡核苷酸的随机序列插入与噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N-末端相对应的基因位点；2)表达由寡核苷酸的随机序列以及部分天然外壳蛋白编码的多肽的融合蛋白；3)处理能够与寡核苷酸编码的多肽结合的受体材料；4)通过使用pH或结合竞争力低的分子洗脱与受体结合的肽噬菌体颗粒；5)扩增在宿主细胞中淘选洗脱的噬菌体；6)重复上述方法以获得所需量；及7)自通过淘选选择的噬菌体克隆的DNA序列确定活性肽的序列。
在本发明的实例中，根据本发明制备抗OX40L抗体或其抗原结合片段的方法可通过使用噬菌体展现技术进行。参考噬菌体展现技术，例如Barbas等人(METHODS:ACompanion to Methods in Enzymology 2:119,1991,及J.Virol.2001Jul；75(14):6692-9)；Winter等人(Ann.Rev.Immunol.12:433,1994)及其类似物中已知的方法，本领域技术人员容易执行本发明的制备方法的每个步骤。可用于构建抗体基因库的噬菌体可包括例如(但不限于)fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3噬菌体作为丝状噬菌体。另外，可用于在丝状噬菌体表面上表达异质基因的载体可包括例如(但不限于)噬菌体载体，诸如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1、fdtetDOG或其类似物，或噬菌粒载体，诸如pHEN1、pComb3、pComb8、pSEX或其类似物。另外，可用于提供成功重新感染重组噬菌体以进行扩增所需的野生型外壳蛋白的辅助噬菌体可包括例如(但不限于)M13K07、VSCM13或其类似物。
根据本发明，可以通过使用公知程序容易地分离及测序编码噬菌体展现克隆的聚核苷酸。举例而言，可使用设计成自本领域中的杂交瘤或噬菌体模板DNA特异性扩增重链及轻链编码区的寡核苷酸引物。一旦分离聚核苷酸，则可将聚核苷酸插入至表达载体中，随后可将表达载体引入至适合宿主细胞中，从而自经转化的宿主细胞(即转化体)产生所需单克隆抗体。因此，本发明的制备人单克隆抗体的方法可为制备人单克隆抗体的方法，包括(但不限于)扩增包括编码人单克隆抗体的聚核苷酸的表达载体的步骤。
根据本发明，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可通过已知重组方法或生物化学方法来制备，且可自转化体的培养液中回收抗体，其中引入了适当宿主细胞中包括编码抗体的核酸的表达载体。
在本发明的实例中，制备(产生)与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段的方法可包括以下步骤：
(a)通过培养转化体产生抗OX40L抗体或其抗原结合片段；及
(b)回收上述步骤(a)中产生的抗OX40L抗体或其抗原结合片段。
在本发明的实例中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可通过已知分离方法分离，且可例如通过公知免疫球蛋白纯化程序自培养基适当地分离，前述公知免疫球蛋白纯化程序诸如(但不限于)蛋白A-琼脂糖、凝胶电泳、透析或亲和层析法。
本发明可提供一种双特异性抗体，其包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段；以及与肿瘤坏死因子α(TNFα)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语『双特异性抗体』可指能够结合两种不同种类的抗原(标靶蛋白)的抗体。具体而言，双特异性抗体可能不存在于自然界中，但可呈通过基因工程或任何方法制备的形式。
本发明的双特异性抗体可为能够结合两个不同标靶的抗体，且双特异性抗体可结合OX40L及TNFα。
本发明的『双特异性抗体』可与『双重靶向的蛋白』、『双重抗体』或『双重抗体蛋白』互换使用。
作为本发明的双特异性抗体的组分的与OX40L特异性结合的抗体或其结合片段可包括能够与OX40L特异性结合以阻断OX40L/OX40L信号传导路径的抗体或其结合片段。在本发明的实例中，为本发明的双特异性抗体的组分的与OX40L特异性结合的抗体或其结合片段可与上文在抗OX40L抗体或其与OX40L特异性结合的结合片段中所述的抗OX40L抗体或其结合片段实质上相同，若彼此不矛盾。另外，在本发明的实例中，为本发明的双特异性抗体的组分的与OX40L特异性结合的抗体或其结合片段可为与OX40L特异性结合以阻断OX40L/OX40L信号传导路径的抗体，其包括在WO 2018083248、WO 2009141239、US 2017260279、WO2006029879或WO 2011073180中描述的抗体或其结合片段。
为本发明的双特异性抗体的组分的与OX40L特异性结合的抗体或其结合片段可与免疫细胞中过表达的OX40L特异性结合，且因此不仅可将本发明的双特异性抗体富集在表达TNFα的免疫细胞上，还结合于TNFα，由此提供降低免疫细胞本身的活性的能力。
此外，OX40L可为高层信号之一，其可能在APC中过表达，且可与T细胞上表达的OX40受体相互作用，从而诱发免疫细胞的增殖/分化/活化且诱发各种发炎性细胞因子的分泌，从而同时活化先天性免疫及后天性免疫。抗OX40L抗体或其抗原结合片段可抑制OX40/OX40L信号传导，从而减少在患有自体免疫性疾病及炎症性疾病的患者中过度活化的免疫反应。
另外，抗TNFα抗体或其结合片段还可对患有自体免疫性疾病及炎症性疾病的患者显示作用，前述患者对发炎性反应的亚信号TNFα的治疗显示出抗性。
如本文所用，术语『包括与OX40L特异性结合的抗体或其抗原结合片段及与TNFα特异性结合的抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体』可包括(但不限于)任何双特异性蛋白，只要前述双特异性蛋白能够同时抑制OX40L及TNFα的两个信号路径。特异性结合TNFα的抗体或其抗原结合片段构成双特异性抗体，且特异性结合OX40L的抗体或其抗原结合片段可包括如上文在抗OX40L抗体或其结合片段中所述的全长抗体及抗体片段的两种形式。
如本文所用，术语『抑制OX40L与OX40之间的相互作用』可意谓与本发明的OX40L特异性结合的双特异性抗体与OX40L结合，从而抑制OX40L与OX40之间的相互作用，使得OX40L与OX40之间的相互作用通过结合特异性抗体来抑制，且OX40L中的结构变化并非由OX40L与OX40的结合引起，藉此不可能引起水解及OX40信号传导。
如本文所用，术语『特异性结合TNFα的抗体』可包括任何抗体，只要前述抗体特异性结合体内广泛范围的作为抗原的TNFα。在本发明的实例中，特异性结合TNFα的抗体可为靶向TNFα的治疗性抗体，包括(但不限于)WO 1997029131、WO 2003045400、WO 2004050683、WO 1998011917、EP 1097945、WO 2001037874、US 2006024310、WO 2006125229、WO2007056540、WO 1994006476、WO 2000059530或WO 2001000229中描述的抗体或其结合片段。在本发明的实例中，与TNFα特异性结合的抗体可为称为阿达木单抗(adalimumab)(商品名Humira，abbvie)的治疗性抗体，其可如美国FDA、欧洲EMA及其类似机构所批准的那样稳定使用，但不限于此。如上所述特异性结合TNFα的抗体可为IgG抗体的形式，包括(但不限于)如上所述的全长抗体及抗体片段的两种形式。
TNFα系调节免疫细胞的细胞因子，在体内充当热原质，通过产生热量来诱发细胞凋亡，且产生发炎性细胞因子，藉此引起自体免疫性疾病及炎症性疾病。TNFα主要由活化的巨噬细胞分泌，但还由包括神经元的其他各种免疫细胞分泌。TNFα的最重要作用可为调节免疫细胞。抑制过表达的TNFα可能导致抑制自体免疫性疾病及炎症性疾病。
双特异性抗体可与TNFα结合以抑制或抑制人TNFα与TNFα受体(TNFαRc)之间的相互作用。具体而言，为双特异性抗体的组分的对TNFα具有特异性的双特异性抗体可与TNFα结合以抑制或抑制TNFα与TNFα受体之间的相互作用，但不限于此。
为了本发明的目的，TNFα受体可包括(但不限于)任何蛋白，只要前述蛋白与哺乳动物的TNFα结合即可，但可特定地指与人TNFα结合的蛋白。
通过根据本发明的对TNFα具特异性的双特异性抗体或其结合片段抑制TNFα与TNFα受体之间的相互作用，可抑制由TNFα与TNFα受体的结合引起的TNFα/TNFα受体信号传导。在TNFα及TNFα受体在免疫系统中彼此结合的情况下，TNFα/TNFα受体信号传导可在免疫细胞中被活化，且因此通过与OX40L/OX40信号传导路径的作用机制不同的机制来调节免疫细胞的分化等，藉此提供用作各种自体免疫性疾病的治疗剂的用途。
因此，根据本发明的对OX40L及TNFα具有特异性的双特异性抗体可显示出通过不同机制抑制过度活性免疫细胞的能力，且因此可用作能够更优异地治疗自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗剂。
因此，根据本发明的与OX40及TNFα特异性结合的双特异性抗体或其抗原结合片段有效抑制OX40L/OX40信号传导及TNFα/TNFα受体信号传导，其可有效治疗自体免疫性疾病及炎症性疾病且使治疗效果最大化，同时使副作用降至最低。
在本发明的实例中，与TNFα特异性结合的抗TNFα抗体或其抗原结合片段可包括：
重链可变区，其包括由SEQ ID NO：89表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：90表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：91表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包括由SEQ ID NO：92表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：93表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：94表示的轻链CDR3。
在本发明的实例中，抗TNFα抗体或其特异性结合TNFα的抗原结合片段可包括由SEQ ID NO：35的氨基酸序列表示的重链可变区及由SEQ ID NO：36的氨基酸序列表示的轻链可变区，且可特定地包括Humira的可变区。
在本发明的实例中，双特异性抗体的形式受特定限制，但可以结合片段通过连接子与IgG形式的抗体连接的方式提供。具体而言，在本发明的双特异性抗体的情况下，特异性结合OX40L的抗体或其抗原结合片段及特异性结合TNFα的抗体或其抗原结合片段可通过连接子彼此连接。
在本发明的实例中，连接子可为由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32的序列表示的肽或非肽。
如本文所用，术语『连接子』基本上是指可通过使用氢键、静电相互作用、凡得瓦力、二硫键、盐桥、疏水相互作用、共价键等将两个不同融合搭配物(例如生物学聚合物等)彼此连接的连接体，且具体而言可具有至少一个半胱氨酸，其在生理学条件或其他标准肽条件(例如肽纯化条件及肽储存条件)下可参与至少一个二硫键，且除了简单地连接每个融合搭配物的外，起在融合搭配物之间产生一定大小的间隙的作用，或充当为融合体提供柔性或刚性的铰链。连接子可为非肽连接子或肽连接子，且可包括通过肽键、二硫键等直接连接的任一者。
在本发明中，连接子可特定为能够将特异性结合OX40L的抗体及特异性结合TNFα的抗体彼此连接的多肽，且更特定地可为能够将特异性结合TNFα的抗体与特异性结合OX40L的抗体的Fc区的C末端或轻链区的C末端连接的肽连接子，且更具体而言，可为由重复GGGGS基序形式的氨基酸序列组成的肽连接子，但不特别限于此。GGGGS基序可重复1至10次，且最具体而言，肽连接子可由其中GGGGS基序重复3次的SEQ ID NO：31的氨基酸序列或其中GGGGS基序重复4次的SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成，但不限于此，且可使用本领域技术人员容易获得的范围内的各种连接子。
在本发明中，术语『非肽连接子』可指其中两个或更多个重复单元彼此键合且重复单元可通过不是肽键的任何共价键彼此连接的生物兼容性连接子。
本发明的非肽连接子可为可生物降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸或其组合，诸如聚乙二醇(PEG)均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚。具体而言，非肽连接子可为聚乙二醇均聚物，且其在本领域中已知的衍生物及以本领域技术水准容易制备的衍生物还可包括在本发明的范畴内。
更具体而言，非肽连接子可为分子量为1至5kDa的聚乙二醇均聚物，且最具体而言，可为能够在两个末端连接特异性结合OX40L的抗体及特异性结合TNFα的抗体的约为3.4kDa且呈双官能醛形式的连接子。具体而言，在两端具有反应性醛基的效应子的情况下，非肽连接子可有效地使非特异性反应降至最低。
通过连接子直接或间接连接的位点可为但不限于Fc部分、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv或其类似物。双特异性抗体可采取特异性结合OX40L的抗体的全部或一部分(片段)与特异性结合TNFα的抗体的全部或一部分(片段)连接的形式，但不特定限于此。
另外，双特异性抗体可采取以下形式：特异性结合OX40L的蛋白的全部或一部分及特异性结合TNFα的抗体的重链的全部或一部分通过肽连接子连接的形式；特异性结合OX40L的蛋白质的全部或一部分与特异性结合TNFα的抗体的轻链的全部或一部分通过肽连接子连接的形式；或其组合。
在本发明的实例中，双特异性抗体可采取以下形式：其中呈免疫球蛋白G(IgG)形式的特异性结合OX40L的抗体及呈全长抗体、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG或scFv形式的特异性结合TNFα的抗体通过连接子连接。
在本发明的实例中，双特异性抗体可采取以下形式：呈免疫球蛋白G(IgG)形式的特异性结合TNFα的抗体及呈全长抗体、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG或scFv形式的特异性结合OX40L的抗体通过连接子连接，但不限于此。
如本文所用，术语『结合片段』可包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段，例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及scFv。具体而言，前述术语可包括单链可变片段(scFv)，且可包括二价或双价抗体、三价抗体及四价抗体。
如本文所用，术语『单链可变片段(scFv)』可指具有完整抗原识别及抗原结合位点的最小抗体片段，且包括抗体的VH及VL结构域，其中结构域可存在于单个多肽链中。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中抗TNFα抗体或其特异性结合TNFα的抗原结合片段连接至抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个末端。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为其中抗TNFα抗体或其抗原结合片段与抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接的抗体。具体而言，在双特异性抗体的情况下，抗TNFα抗体或其抗原结合片段可通过连接子与抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接。举例而言，在双特异性抗体的情况下，抗TNFα抗体或其抗原结合片段可通过具有由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子连接至抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个C末端，但不特定限于此。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为其中抗OX40L抗体或其特异性结合OX40L的抗原结合片段与抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个末端连接的抗体。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为其中抗OX40L抗体或其抗原结合片段与抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接的抗体。具体而言，双特异性抗体可为其中抗OX40L抗体或其抗原结合片段通过连接子与抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接的抗体。举例而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可通过具有由SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列的连接子与抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接，但不特定限于此。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中特异性结合OX40L的抗OX40L抗体的结合片段及抗TNFα抗体的结合片段通过连接子连接。连接子可为具有由SEQID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中以下通过连接子彼此连接：
a)抗OX40L抗体或其与OX40L特异性结合的结合片段，包括：重链可变区，其包括由选自SEQ ID NO：12、13及14组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR1；由选自SEQ IDNO：15、16、17及18组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR2；及由选自SEQ ID NO：19、20、21及22组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包括由选自SEQID NO：23及24组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR1；由选自SEQ ID NO：25及26组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR2；及由选自SEQ ID NO：27、28、29及30组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR3；及
b)抗TNFα抗体或其与TNFα特异性结合的结合片段，包括：重链可变区，其包括由SEQ ID NO：89表示的氨基酸序列的重链CDR1；由SEQ ID NO：90表示的氨基酸序列的重链CDR2；及由SEQ ID NO：91表示的氨基酸序列的重链CDR3；及轻链可变区，其包括由SEQ IDNO：92表示的氨基酸序列的轻链CDR1；由SEQ ID NO：93表示的氨基酸序列的轻链CDR2；由SEQ ID NO：94表示的氨基酸序列的轻链CDR3。
连接子可为具有由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中以下通过连接子彼此连接：
a)(i)抗OX40L抗体或其结合片段，包括：重链可变区，其包括由SEQ ID NO：12表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：15表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：19表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包括由SEQ ID NO：23表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：25表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：27表示的轻链CDR3；
(ii)抗OX40L抗体或其抗原结合片段，包括：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：28表示的轻链CDR3；
(iii)抗OX40L抗体或其抗原结合片段，包括：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：17表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：21表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：29表示的轻链CDR3；或
(iv)抗OX40L抗体或其抗原结合片段，包括：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：14表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：18表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：22表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：30表示的轻链CDR3；及
b)抗TNFα抗体或其与TNFα特异性结合的结合片段，包括：重链可变区，其包括由SEQ ID NO：89表示的氨基酸序列的重链CDR1；由SEQ ID NO：90表示的氨基酸序列的重链CDR2；及由SEQ ID NO：91表示的氨基酸序列的重链CDR3；及轻链可变区，其包括由SEQ IDNO：92表示的氨基酸序列的轻链CDR1；由SEQ ID NO：93表示的氨基酸序列的轻链CDR2；由SEQ ID NO：94表示的氨基酸序列的轻链CDR3。
连接子可为具有由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中以下经连接子彼此连接：
a)抗OX40L抗体或其结合片段，包括：由选自SEQ ID NO：33、37、41、45、49及53组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及由选自SEQ ID NO：34、38、42、46、50及54组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链可变区；及
b)抗TNFα抗体或其抗原结合片段，包括由SEQ ID NO：35表示的重链可变区及由SEQ ID NO：36表示的轻链可变区。
连接子可为具有由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子。
在本发明的实例中，双特异性抗体可为如下抗体，其中以下经连接子彼此连接：
a)抗OX40L抗体或其结合片段，包括：(a)由SEQ ID NO：37表示的重链可变区及由SEQ ID NO：38表示的轻链可变区；(b)由SEQ ID NO：41表示的重链可变区及由SEQ ID NO：42表示的轻链可变区；(c)由SEQ ID NO：45表示的重链可变区及由SEQ ID NO：46表示的轻链可变区；(d)由SEQ ID NO：49表示的重链可变区及由SEQ ID NO：50表示的轻链可变区；(e)由SEQ ID NO：53表示的重链可变区及由SEQ ID NO：54表示的轻链可变区；或(f)具有由SEQ ID NO：33表示的氨基酸序列的重链可变区及具有由SEQ ID NO：34表示的氨基酸序列的轻链可变区，以及
b)抗TNFα抗体或其抗原结合片段，包括由SEQ ID NO：35表示的重链可变区及由SEQ ID NO：36表示的轻链可变区。
连接子可为具有由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列的连接子。
举例而言，双特异性抗体的结构可具有如图1所示的相同形式的结构。
作为另一实例，双特异性抗体可具有其中抗OX40L抗体的抗原结合片段及抗TNFα抗体的抗原结合片段彼此连接的结构。
在本发明的双特异性抗体包括恒定区的情况下，双特异性抗体可特定地包括(但不限于)由选自SEQ ID NO：5、6、7及8组成的群的一个氨基酸序列表示的重链恒定区；及由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链恒定区的全部或一部分。在双特异性抗体包括恒定区的情况下，意谓构成双特异性抗体的抗OX40L抗体或其特异性结合OX40L的结合片段或抗TNFα抗体或其特异性结合TNFα的结合片段包括恒定区的全部或一部分。
本发明的双特异性抗体可以具有足以在人体中展现足够作用的物理化学性质，且可具有优异的热稳定性。举例而言，双特异性抗体可在高于50℃(尤其59℃或更高)的温度下熔融，且可长时间保持其结合，且在人体中可具有约2周或更长的半衰期。
换言之，根据本发明的包括特异性结合TNFα的抗体或其抗原结合片段及特异性结合OX40的抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体可具有针对人源TNFα及OX40L的强亲和力，从而有效抑制表达OX40L的细胞(例如免疫细胞)与OX40的结合，且通过TNFα与TNF受体结合抑制发炎性反应，藉此在诸如自体免疫性疾病的疾病的治疗中提供更显著的治疗效果。
在本发明的双特异性抗体中，特异性结合TNFα的抗体或其抗原结合片段及特异性结合OX40L的抗体或其抗原结合片段可分别维持特异性结合，且具体而言，可同时抑制两个标靶(抗原)而不会降低对每个标靶的亲和力，从而同时抑制两个信号，且因此比通过结合单个标靶进行抑制更有效。
在本发明的实例中，通过将编码本发明的双特异性抗体的核酸(聚核苷酸)插入载体且将其引入动物细胞中以表达及分离结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，制备特异性结合OX40L及TNFα的OX40L及TNFα双特异性抗体。
双特异性抗体分子可具有其中OX40L IgG抗体分子及结合TNFα的scFv通过连接子连接的结构或其中TNFαIgG抗体分子及结合OX40L的scFv通过连接子连接的结构(图1)。将引入至动物细胞中且在其中表达的结合OX40L及TNFα的双特异性抗体分离，且通过SDS-PAGE确认其表达及纯度(图2)。
另外，由于通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)分析针对OX40L及TNFα的双特异性抗体对OX40L及TNFα的结合分析法，确认结合OX40L及TNFα的双特异性抗体与OX40L及TNFα特异性结合，OX40L及TNFα为前述双特异性抗体的标靶(表32)。
在本发明的实例中，双特异性抗体可以3×10-9M或更低的KD结合人OX40L。具体而言，抗OX40L抗体或其抗原结合片段可1.5×10-9M、1.3×10-9M，或1×10-9M或更低的KD结合，且可以1×10-9M或更低的KD结合人TNFα。具体而言，由于通过Biacore分析法测量作为双特异性抗体的抗原的OX40L及TNFα的平衡解离常数(KD)值，确认双特异性抗体对人OX40L的KD值为0.4至0.5nM且对人TNFα的KD值为0.2至0.5nM(表32，图4)。另外，确认活体外OX40L抑制能力为0.2至1.3nM，且显著优于对照抗体，且活体外TNFα抑制能力为0.05至0.07nM，且是优异的(表35，图5)。另外，双特异性抗体显示阻断T细胞中免疫活性的结果(图6)。
因此，本发明的双特异性抗体可通过同时结合OX40L及TNFα，同时保持对各抗原的结合力来有效治疗与标靶有关的疾病。
另外，对于能够同时结合OX40L及TNFα的本发明的双特异性抗体，通过对活体外封锁分析法进行实验证实，用前述双特异性抗体治疗，通过使免疫细胞与OX40L及人OX40结合以及TNFα与TNFα受体结合，有效抑制了每一信号传导路径(表35及图5)。这些结果显示本发明的对OX40L及TNFα具有特异性的双特异性抗体有效地阻断作为对应受体的OX40及TNFα受体的结合，从而提供减轻免疫系统过度活跃的效果，且还同时结合OX40L及TNFα从而有效地治疗与标靶相关的疾病。
本发明可提供编码与OX40L及TNFα特异性结合的双特异性抗体的核酸(聚核苷酸)、包括前述核酸(聚核苷酸)的表达载体，以及其中引入前述表达载体的转化体。
在本发明中，当彼此不矛盾时，与特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体相关的核酸(聚核苷酸)、表达载体、转化体及引入与上文所述相同。
本发明可提供制备特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的方法。
具体而言，前述制备方法可提供与OX40L及TNFα双特异性结合的抗体，前述方法包括以下步骤：(a)通过培养其中引入有表达载体的转化体产生双特异性抗体，前述表达载体包括编码与OX40L及TNFα特异性结合的双特异性抗体的核酸(聚核苷酸)；及(b)回收上述步骤(a)中产生的双特异性抗体。
当彼此不矛盾时，用于制备本发明的特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的方法可与抗OX40L抗体或其抗原结合片段中所描述的制备方法实质上相同。
本发明可提供用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物组合物，包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体。
前述药物组合物可进一步包括医药上可接受的载剂。
如本文所用，术语『医药上可接受的载剂』可指既不刺激生物体也不抑制注射化合物的生物学活性及特性的载剂或稀释剂。在调配成液体溶液的组合物中，所使用的医药上可接受的载剂可包括适于灭菌及活体的生理盐水溶液、无菌水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、缓冲生理盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇，及其至少一种组分的混合物，且需要时可向其中添加其他公知添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂溶液、抑菌剂等。同样，可以向其中另外添加稀释剂、分散剂、界面活性剂、黏合剂及润滑剂的方式将此类药物组合物调配成可注射剂型，诸如水溶液、悬浮液、乳液等、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体可与OX40L结合，从而抑制与OX40L受体的结合，且因此可参与抑制过度活跃的免疫细胞。OX40L/OX40受体与上文所述相同。
此外，双特异性抗体除了结合OX40L的外可结合TNFα，抑制TNFα与TNFα受体之间的相互作用，藉此经与OX40L/OX40信号传导路径的作用机制不同的机制调节免疫细胞的分化等，且还可参与抑制各种自体免疫性疾病。
因此，本发明的药物组合物可显著且有效地预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病，且可在使副作用降至最低的同时提高安全性。
在本发明中，自体免疫性疾病或炎症性疾病可包括类风湿性关节炎。类风湿性关节炎可分类为炎症性疾病或自体免疫性疾病的疾病。如本文所用，术语『自体免疫性疾病』、『炎症性疾病』或『自体免疫性疾病及炎症性疾病』可包括类风湿性关节炎。
如本文所用，术语『预防』可指抑制或延迟疾病发生，且抑制或延迟疾病已被治疗的个体中疾病的复发。
如本文所用，术语『治疗』可指通过施用前述组合物使自体免疫性疾病的症状变好或好转的所有行为。
本发明可提供一种通过使用抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法。
本发明可提供一种通过使用包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的药物组合物预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法。
预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法可包括将抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体施用个体的步骤。
预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法可包括将包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的药物组合物施用个体的步骤。
该个体可为已经发展或怀疑正在发展自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体，且具体而言，可包括(但不特定)限于哺乳动物、鸟类等，诸如牛、猪、绵羊、鸡、犬、人等。
药物组合物可为各种口服或非经肠剂型。在调配制剂的情况下，可通过使用通常使用的稀释剂或赋形剂，诸如填充剂、增量剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等来制备制剂。用于口服施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊等，且此固体制剂可通过在至少一种化合物中混合至少一种赋形剂来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。另外，除简单的赋形剂外，还可使用润滑剂，诸如硬脂酸镁、滑石粉等。用于口服施用的液体制剂可包括悬浮液、内部使用的液体、乳液、糖浆等，但除了水及液体石蜡的外，还可包括各种赋形剂，例如保湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等，其为常用的简单稀释剂。非经肠施用的制剂可包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干制剂及栓剂。非水溶剂及悬浮剂可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯等)。栓剂的基质可包括Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂油、甘油明胶等。
药物组合物可具有选自由以下组成的群的任一种制剂：片剂，丸剂、粉末、颗粒剂、胶囊、悬浮液、内用液体、乳液、糖浆、无菌溶液、非水溶剂、助悬剂、冻干制剂及栓剂。
根据本发明，抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，或药物组合物可以医药上有效量施用。如本文所用，术语『医药上有效量』可指足以以适用于医学治疗的合理的利益/风险比来治疗疾病的量，且可根据包括以下的因素来确定有效剂量水平：个体类型、严重程度、年龄、性别、癌症类型、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径及排泄率、治疗时间及同时使用的药物，以及在医疗领域众所周知的其他因素。本发明的组合物可作为个别治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，且可与公知治疗剂依序或同时施用。且该组合物可以单一方式或多种方式施用。考虑到所有上述因素，重要的是以一定量进行施用，其中可通过最小量获得最大效果而不具有副作用，且该量可由本领域技术人员确定。
在此情况下，可以医药上有效量以单一方式或多种方式施用组合物。在此情况下，组合物可以液体、粉末、气雾剂、胶囊、肠溶包衣片剂或胶囊或栓剂的形式施用。施用途径可包括但不限于腹膜内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、内皮施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠施用等。然而，口服时，肽被消化。因此，在口服组合物的情况下，需要对其活性剂进行包衣或调配以防止其在胃中降解。另外，可通过能够将活性物质移动至标靶细胞的任何装置来施用药物组合物。
此外，本发明可提供抗OX40L抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的用途，其用于制造用以预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物。
本发明可提供包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的药物组合物的用途，其用于制备用以预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物。
本发明可提供抗OX40L抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的用途，其用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病。
本发明可提供包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的药物组合物的用途，其用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体、药物组合物、自体免疫性疾病或炎症性疾病、预防或治疗可与上述相同，只要彼此不矛盾。
本发明可提供一种诊断组合物，其包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，且通过抗原-抗体反应在自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体分离的生物样品中检测OX40L蛋白。
在本发明的实例中，诊断组合物可诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的发生。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体、自体免疫性疾病及炎症性疾病可与上述相同，只要彼此不矛盾。
如本文所用，术语『诊断』可指识别病理状况的存在或特性。为了本发明的目的，诊断是确认是否已发生自体免疫性疾病或炎症性疾病。
根据本发明，在用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法中，抗OX40L抗体或其抗原结合片段或诊断组合物可用于通过根据本发明的抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体测量自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体中分离出的样品中的OX40L蛋白含量，且将所测量的OX40L蛋白含量与正常人或患者的对照样品进行比较来确定自体免疫性疾病或炎症性疾病。
为此目的，测量蛋白质含量的方法可包括但不限于蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(otA：badioimmunoassay)、放射免疫扩散(badioimmunodiffusion)、双向免疫扩散(Ouchterlony immunodiiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、FACS及蛋白质芯片等。通过上述分析方法，可将怀疑患有自体免疫性疾病的个体中的OX40L蛋白含量与正常对照组的含量进行比较，藉此诊断出疑似患者中自体免疫性疾病的发生。
根据本发明，用于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的组合物除了本发明的抗体的外，还可包括(但不限于)本领域已知的用于执行测量蛋白含量的方法所必需的那些。
在本发明的诊断组合物包括特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的情况下，诊断组合物可为用于通过抗原-抗体反应检测自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体中分离出的生物样品中的TNFα蛋白的组合物。具体而言，在本发明的诊断组合物包括特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的情况下，诊断组合物可为用于通过抗原-抗体反应检测自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体分离出的生物样品中的OX40L蛋白及TNFα蛋白中的至少一种的组合物。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体，或诊断组合物可用于通过测量自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体分离出的样品中OX40L蛋白及TNFα蛋白的至少一种含量来确定自体免疫性疾病或炎症性疾病。
用于测量蛋白质含量的方法可与上述相同，只要彼此不矛盾。
本发明可提供通过使用抗OX40L抗体或其抗原结合片段、特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体或包括其的诊断组合物来诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法或提供诊断信息的方法。具体而言，本发明可提供诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法或提供有关诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法，前述方法包括以下步骤：(a)通过使用抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体测量自怀疑患有自体免疫性疾病或炎症性疾病的个体分离的样品中OX40L蛋白的含量；及(b)通过使用在上述步骤(a)中测量的OX40L蛋白的含量来确定自体免疫性疾病或炎症性疾病。
举例而言，通过使用所测量的OX40L蛋白含测量定自体免疫性疾病或炎症性疾病的步骤可通过将所测量的OX40L蛋白含量与正常人及/或患者的含量比较。
本发明可提供诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法或提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法，前述方法包括以下步骤：(a)通过使用特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体来测量自怀疑患有自体免疫性疾病的个体分离出的样品中的OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者的含量；及(b)通过使用在上述步骤(a)中测量的OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者的含量来确定自体免疫性疾病或炎症性疾病。
举例而言，通过使用OX40L蛋白及TNFα蛋白中的至少一者的测量含量确定自体免疫性疾病或炎症性疾病的步骤可通过将OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者的所测量含量与正常人及/或患者中OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者的含量比较来进行。
本发明可提供用于提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的试剂盒，包括抗OX40L抗体或其抗原结合片段，或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体。
抗OX40L抗体或其抗原结合片段或特异性结合OX40L及TNFα的双特异性抗体、自体免疫性疾病、炎症性疾病、个体、诊断及蛋白含量的测量步骤(方法)可与上述相同，只要彼此不矛盾。
如本文所用，术语『样品』可包括(但不限于)诸如全血、血清、血液、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴液、脑脊髓液及细胞间液的样品，其在患有自体免疫性疾病的患者中的OX40L表达水平中显示出差异。
[有利作用]
根据本发明，抗OX40L抗体或其抗原结合片段与OX40L特异性结合，从而有效地抑制受体的结合，且还具有优异的免疫抑制能力，藉此提供针对自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗及诊断领域的显著优异效果。
此外，与上述OX40L及TNFα特异性结合的双特异性抗体不仅对OX40L显示出强亲和力，而且对TNFα还显示出强亲和力，在体内长时间保持结合，且因此免疫抑制能力优异，藉此显示出针对自体免疫性疾病及炎症性疾病的治疗及诊断领域的显著优异效果。
附图说明
图1显示抗OX40L抗体及能够同时结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的结构。在图1中，CH1、CH2及CH3表示重链的恒定区，CL表示轻链的恒定区，且标记有条纹(或阴影线)的部分表示各链的可变区(CDR区(白色)及框架区(有色))。
图2显示在产生抗OX40L抗体及能够同时结合OX40L及TNFα的双特异性抗体之后用SDS-PAGE对其进行确认的结果。
图3显示通过用HDX-MS分析，抗OX40L抗体的OX40L抗原的抗原决定簇定位图的结果。
图4显示通过Biacore分析方法测量双特异性抗体是否可同时结合诸如OX40L及TNFα的抗原的结果。图4显示其中水平轴是时间(0＝捕获_水平)且垂直轴是反应(0＝捕获_水平)的图。
图5显示抗OX40L抗体及能够同时结合OX40L及TNFα的双特异性抗体的活体外封锁分析法的结果。
图6显示确认抗OX40L抗体及能够同时结合OX40L及TNFα的双特异性抗体对T细胞的IL-2分泌的作用的结果。
具体实施方式
在下文中，将参考实例描述本发明。然而，仅出于说明本发明的目的提供以下例示性实施例，且因此本发明不限于此。
[实施例1：OX40L特异性抗体克隆的选择]
[实施例1-1：OX40L抗原的制备]
通过获得由Acro Biosystems提供的人OX40L蛋白(Cat#OXL-H52Q8)来使用人OX40L的抗原，其通过使用暴露于细胞外的结构域将组氨酸标签融合至登录号NP_003317的人OX40L的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列第51号至第183号(Q51至L183)的N端制备。
上文由Acro Biosystems提供的人OX04L蛋白(抗原)的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中指定。上文提供的抗原在HEK293细胞中产生且大小为16.9kDa。
[表2]OX40L抗原蛋白
[实施例1-2：人基因库噬菌体的制备]
在37℃下在2X YT-葡萄糖-Mgcl2-氯霉素(CM)培养基中培养具有多样性的7.5*1010个人来源的scFv基因库细胞，直至培养液的吸光度变为OD600＝0.5-0.7。
用辅助噬菌体感染细胞，且在37℃下培养约1小时。将培养的细胞离心(5000rpm，4℃，10分钟)后，添加2xYT-IPTG-Mgcl2-卡那霉素(KM)-CM培养基，且将细胞重新混合且在30℃振荡培育器中培养16小时。将培养的细胞离心(5000rpm，4℃，10分钟)，随后添加4％ PEG(Sigma，81253)及3％ NaCl(Junsei，1905-0350)且充分溶解于上清液中，且在冰中反应约1小时。再次离心(7500rpm，4℃，30分钟)后，将DPBS(Wellgene，LB001-02)添加至沉淀物中，溶解且离心(10000rpm，4℃，10分钟)，从而获得含有基因库噬菌体的上清液，随后置入新试管中且在5±3℃下储存。
[实施例1-3：免疫基因库噬菌体的制备]
通过使用Balb/C小鼠及SD大鼠以及实施例1-1的人OX40L抗原(SEQ ID NO：2)制备免疫基因库噬菌体。
使十只Balb/C小鼠(七周大)及四只雄性SD大鼠(八周大)适应环境，且随后在第0、21、42及63天用人OX40L抗原免疫，随后在第84天自其摘除脾脏，以便从中洗脱RNA。通过使用洗脱的RNA合成cDNA，且扩增重链可变区及轻链可变区。将重链可变区及轻链可变区混合以scFv形式扩增DNA，随后将DNA插入噬菌体载体(pYG100)中以制备大鼠来源的免疫scFv基因库细胞。将所制备的细胞在37℃下在2X YT-葡萄糖-Mgcl2-氯霉素(CM)培养基中培养，直至培养液的吸光度变为OD600＝0.5-0.7。
用辅助噬菌体感染培养的细胞，且在37℃下培养约1小时。在将培养的细胞离心(5000rpm，4℃，10分钟)后，添加2xYT-IPTG-Mgcl2-卡那霉素(KM)-CM培养基，且将细胞重新混合且在30℃振荡培育器中培养16小时。将培养的细胞离心(5000rpm，4℃，10分钟)，随后添加4％ PEG(Sigma，81253)及3％ NaCl(Junsei，1905-0350)且充分溶解于上清液中，且在冰中反应约1小时。再次离心(7500rpm，4℃，30分钟)后，将DPBS(Wellgene，LB001-02)添加至沉淀物中且溶解，随后离心(10000rpm，4℃，10分钟)，获得含有基因库噬菌体的上清液，随后置入新试管中且在5±3℃下储存。
[实施例1-4：通过噬菌体展现淘选]
为了筛选与人OX40L结合的OX40L抗体，将含有实施例1-1的人OX40L蛋白的溶液以1至10μg/mL的浓度添加至免疫试管中，以使OX40L蛋白在5±3℃下吸附至免疫试管的表面上过夜，随后向试管中添加1％牛血清白蛋白溶液以保护未吸附OX40L的表面。排空试管后，将分散在1％牛血清白蛋白溶液中的1012CFU人抗体噬菌体基因库(实施例1-2)或免疫噬菌体基因库(实施例1-3)置入试管中且与抗原结合。非特异性结合的噬菌体用PBS-T(磷酸盐缓冲生理盐水-0.05％Tween 20)溶液洗涤5至20次，且再用DPBS洗涤1至5次，从而通过使用0.1MTAE溶液回收剩余的抗原特异性噬菌体抗体。
用1M Tris缓冲液(pH 7.5)中和所回收的噬菌体，且在37℃下用XL1Blue大肠杆菌感染1小时，随后通过使用玻璃珠将感染的大肠杆菌涂抹在SOBCG板上且在37℃培育器中培养约16小时。第二天，将培养的大肠杆菌悬浮在4ml超级肉汤(SB)-羧苄青霉素培养液中，随后添加15％甘油，从而将其一部分储存在-80℃下且50μl残余物在37℃下培养，向20ml SB-羧苄青霉素培养液中添加2％葡萄糖溶液。当培养液在600nm处的吸光度达到0.6时，通过离心移除培养液，且将其再次悬浮在20ml SB-羧苄青霉素培养液中，随后添加1012PFU的M13辅助噬菌体，缓慢搅拌且在37℃下培育。第二天，将培养液离心，随后仅取出培养液，且添加聚乙二醇及氯化钠(NaCl)，使所得溶液在4℃下沉淀30分钟且离心。移除上清液，且将沉淀的噬菌体悬浮在1ml PBS中，随后将所得悬浮液用作基因库，重复上述淘选过程3至5次，由此扩增/浓缩抗原特异性克隆。
[实施例1-5：噬菌体淘选后筛选特异性克隆]
为了筛选与人OX40L蛋白结合的抗体(scFv)，使用以下两种方法之一筛选抗原特异性克隆。
首先，淘洗后，通过在琼脂培养基上涂片培养物获得单个菌落，且接种至1至1.5mL培养液中且培养，随后用IPTG诱导在大肠杆菌中表达scFv型蛋白。离心大肠杆菌培养液以获得上清液，随后将上清液用于通过ELISA技术来确认重组人OX40L抗原与scFv的结合(Steinberger.Rader及Barbas III.2000.Phage display vectors.In:Phage DisplayLaboratory Manual.1sted.ColdSpringHarborLaboratoryPress.NY.USA.第11.9页-第11.12页)。通过使用辣根过氧化物酶(HRP)-抗His抗体及四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合的scFv。
其次，淘洗后，自SOBCG板获得单个噬菌体，接种至分别分配有1mL培养基的深孔板中，且在37℃振荡下培养16小时。将扩增的细胞稀释10倍，再次接种在深孔板中，且在37℃的振荡培育器中培养直至OD600为0.5。在OD600达到0.5时，将M13辅助噬菌体以109CFU含量铺设，且在37℃静态培育器中感染30分钟，且在37℃振荡培育器中感染30分钟。感染完成后，通过离心沉淀细胞且获得上清液，以通过使用ELISA技术确认scFv与人OX40L抗原的结合。通过使用辣根过氧化物酶(HRP)-抗M13抗体及四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合的scFv。
通过测序技术分析自以上鉴别的抗原特异性抗体(scFv)克隆。
[实施例2：抗OX40L抗体的制备]
基于在以上实施例1-5中获得的抗体的可变区(scFv)的序列，重链可变区连接至重链恒定区(SEQ ID NO：8)，且轻链可变区连接至轻链恒定区(SEQ ID NO：10)，从而制得抗体。抗体命名为02C09、Hu3F07、10H07、21G07及I3F07。
[表3]重链及轻链恒定区
[(1)抗OX40L抗体02C09]
02C09抗体包括由SEQ ID NO：12表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：15表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：19表示的重链CDR3；由SEQ ID NO：23表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：25表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：27表示的轻链CDR3。
抗OX40L抗体02C09通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备。
使用PEI(一种增强细胞内基因转移效率的聚合物)用含有编码抗OX40L抗体02C09的基因的表达载体转染的漂浮FreeStyleTM293-F动物细胞以每瓶200mL在500mL培养物锥形瓶(Corning)中培养且必要时进行大量培养。
将转染的FreeStyleTM293-F细胞在37℃及8％ CO2的条件下在悬浮液中培养，且使用FreeStyleTM293表达培养基AGTTM(Invitrogen，AG1000D9P1)培养前述培养基。在过表达时，将500μg PEI(Polysciences，23966-2)及125μg待过表达的DNA在5mL培养基中混合。添加DNA-PEI后约24小时，添加10mL 10％大豆蛋白(BD，212488)且进一步培养约5天，接着仅获得上清液且用于纯化抗体。
为了纯化抗体，首先通过使用重组Protein-A Sepharose层析管柱自培养液纯化抗体。若需要提高纯度，则使用第一纯化产物进行第二纯化。在此情况下，通过使用Superdex200凝胶过滤层析法或羟基磷灰石层析法进行纯化。
[表4]02C09抗体的CDR序列
[表5]02C09抗体的可变区序列
[(2)抗OX40L抗体Hu3F07]
Hu3F07抗体包括由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：28表示的轻链CDR3。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备抗OX40L抗体Hu3F07。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行特定的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表6]Hu3F07抗体的CDR序列
[表7]Hu3F07抗体的可变区序列
[(3)抗OX40L抗体10H07]
10H07抗体包括由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：17表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：21表示的重链CDR3；由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：29表示的轻链CDR3。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备抗OX40L抗体10H07。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表8]10H07抗体的CDR序列
[表9]10H07抗体的可变区序列
[(4)抗OX40L抗体21G07]
21G07抗体包括由SEQ ID NO：14表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：18表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：22表示的重链CDR3；由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：30表示的轻链CDR3。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备抗OX40L抗体21G07。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表10]21G07抗体的CDR序列
[表11]21G07抗体的可变区序列
[(5)抗OX40L抗体I3F07]
I3F07抗体包括由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：28表示的轻链CDR3。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备抗OX40L抗体I3F07。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表12]I3F07抗体的CDR序列
[表13]I3F07抗体的可变区序列
[实施例3：靶向OX40L及TNFα的双特异性抗体的制备]
通过将实施例2中制备的与人OX40L结合的抗体(02C09、Hu3F07、I3FO7)或其片段(scFv)与抗TNFα抗体(TNFαi抗体(Humira))或其片段(scFv)经连接子连接来制备能够甚至与人TNFα结合的双特异性抗体(参见图1)。
具体而言，制备以下形式的双特异性抗体：(i)在抗OX40L抗体的重链恒定区的C末端处经连接子连接抗TNFα抗体的重链可变区及轻链可变区；(ii)经连接子在抗OX40L抗体的轻链恒定区的C-末端连接抗TNFα抗体的重链可变区及轻链可变区；(iii)经连接子在抗TNFα抗体的重链恒定区的C-末端连接抗OX40L抗体的重链可变区及轻链可变区；及(iv)经连接子在抗TNFα抗体的轻链恒定区的C末端连接抗OX40L抗体的重链可变区及轻链可变区，且按IgG-scFv结合位点的顺序分别命名为02C09-TNFαi HC、02C09-TNFαi LC、hu3F07-TNFαi HC、hu3F07-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC、TNFαi-02C09 LC、TNFαi-hu3F07 HC、TNFαi-hu3F07 LC、I3F07-TNFαi HC、I3F07-TNFαi LC、TNFαi-I3F07 HC及TNFαi-I3F07 LC。
所用连接子为由SEQ ID NO：31表示的GGGGSGGGGSGGGGS。
[表14]抗TNFα抗体的CDR
[表15]抗TNFα抗体的可变区序列
通过与上文实施例2的抗OX40L抗体的制造(制备)方法实质上相同的方法，以使TNFα抗体的重链可变区与重链恒定区(SEQ ID NO：8)连接，且轻链可变区与轻链恒定区(SEQ ID NO：10)连接的方式制备TNFαi抗体。
[(1)双特异性抗体02C09-TNFαi HC]
在双特异性抗体02C09-TNFαi HC的情况下，其中TNFαi抗体(Humira)的重链可变区(SEQ ID NO：35)及轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体02C09的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备双特异性抗体02C09-TNFαi HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。[表16]02C09-TNFαi HC的重链
[(2)双特异性抗体02C09-TNFαi LC]
在02C09-TNFαi LC的情况下，其中Humira的重链可变区(SEQ ID NO：35)及Humira的轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体02C09的轻链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备双特异性抗体02C09-TNFαi LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表17]02C09-TNFαi LC的轻链
[(3)双特异性抗体Hu3F07-TNFαi HC]
在Hu3F07-TNFαi HC的情况下，其中TNFαi抗体的重链可变区(SEQ ID NO：35)及TNFαi的轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体hu3F07的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备双特异性抗体Hu3F07-TNFαi HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表18]Hu3F07-TNFαi HC的重链
[(4)双特异性抗体Hu3F07-TNFαi LC]
在Hu3F07-TNFαi LC的情况下，其中TNFαi抗体的重链可变区(SEQ ID NO：35)及TNFαi的轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体hu3F07的轻链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F动物细胞系制备双特异性抗体Hu3F07-TNFαi LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表19]Hu3F07-TNFαi LC的轻链
[(5)双特异性抗体TNFαi-02C09 HC]
在TNFαi-02C09 HC的情况下，其中抗OX40L抗体02C09的重链可变区(SEQ ID NO：37)及抗OX40L抗体02C09的轻链可变区(SEQ ID NO：38)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体02C09的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在TNFαi抗体(Humira)的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-02C09 HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表20]TNFαi-02C09 HC的重链
[(6)双特异性抗体TNFαi-02C09 LC]
在TNFαi-02C09LC的情况下，其中抗OX40L抗体02C09的重链可变区(SEQ ID NO：37)及抗OX40L抗体02C09的轻链可变区(SEQ ID NO：38)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体02C09的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在TNFαi抗体的轻链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-02C09 LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表21]TNFαi-02C09 LC的轻链
[(7)双特异性抗体TNFαi-hu3F07 HC]
在TNFαi-hu3F07 HC的情况下，其中抗OX40L抗体hu3F07的重链可变区(SEQ IDNO：41)及抗OX40L抗体hu3F07的轻链可变区(SEQ ID NO：42)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体hu3F07的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在TNFαi抗体的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-hu3F07 HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表22]TNFαi-hu3F07 HC的重链
[(8)双特异性抗体TNFαi-hu3F07 LC]
在TNFαi-hu3F07 LC的情况下，其中抗OX40L抗体hu3F07的重链可变区(SEQ IDNO：41)及抗OX40L抗体hu3F07的轻链可变区(SEQ ID NO：42)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体hu3F07的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在TNFαi抗体的轻链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-02C09 LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表23]TNFαi-hu3F07 LC的轻链
[(9)双特异性抗体I3F07-TNFαi HC]
在上述双特异性抗体I3F07-TNFαi HC的情况下，其中TNFαi抗体(Humira)的重链可变区(SEQ ID NO：35)及TNFαi抗体(Humira)的轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体I3F07的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备双特异性抗体I3F07-TNFαi HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。[表24]I3F07-TNFαi HC的重链
[(10)双特异性抗体I3F07-TNFαi LC]
在I3F07-TNFαi LC的情况下，其中Humira的重链可变区(SEQ ID NO：35)及Humira的轻链可变区(SEQ ID NO：36)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的TNFαi抗体的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在抗OX40L抗体I3F07的轻链恒定区的C-末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系(Invitrogen)制备双特异性抗体I3F07-TNFαi LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。
[表25]I3F07-TNFαi LC的轻链
[(11)双特异性抗体TNFαi-I3F07 HC]
在TNFα1-I3F07 HC的情况下，其中抗OX40L抗体I3F07的重链可变区(SEQ ID NO：53)及抗OX40L抗体I3F07的轻链可变区(SEQ ID NO：54)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体I3F07的结合片段(ScFv)经连接子(SEQ ID NO：31)在TNFαi抗体的重链恒定区的C末端处连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-I3F07 HC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。[表26]TNFαi-I3F07 HC的重链
[(12)双特异性抗体TNFαi-I3F07 LC]
在TNFαi-I3F07 LC的情况下，其中抗OX40L抗体I3F07的重链可变区(SEQ ID NO：53)及抗OX40L抗体I3F07的轻链可变区(SEQ ID NO：54)经连接子(SEQ ID NO：32)连接的抗OX40L抗体I3F07的结合片段(ScFv)在TNFαi抗体的轻链恒定区的C末端经连接子(SEQ IDNO：31)连接。
通过使用表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)及FreeStyleTM293-F的动物细胞系制备双特异性抗体TNFαi-I3F07 LC。以与上述(1)抗OX40L抗体02C09实质上相同的方式进行详细的培养条件、培养方法及纯化方法。[表27]TNFαi-I3F07 LC的轻链
另外，根据与上述实施例2的抗OX40L抗体的制造(制备)方法实质上相同的方法，将作为参照抗体的抗OX40L抗体(下文称为Ref.Ab或O4L)通过使用作为抗OX40L抗体的奥昔单抗的VH及VL的序列(SEQ ID NO：33及34)制备，且作为参照抗体的抗TNFα抗体(下文称为Ref.TNFαi或Humira)通过使用作为抗TNFα抗体的Humira的VH及VL的序列(SEQ ID NO：35及36)制备。
[表28]O4L的重链及轻链序列
[表29]Ref.TNFαi的重链及轻链序列
根据与上述实施例3的双特异性抗体的制造(制备)方法实质上相同的方法，通过使用所制备的抗体O4L及上文的Ref.TNFαi制备抗OX40L-TNFαi HC及LC抗体(下文分别称为O4L-TNFαi HC及O4L-TNFαi LC)。
[表30]O4L-TNFαi HC的重链序列
[表31]O4L-TNFαi LC的轻链
[测试例1：抗体分析]
通过SDS-PAGE分析实施例2中获得的抗OX40L抗体及实施例3中获得的双特异性抗体，且其结果示于图2中。
[测试例2：针对抗OX40L抗体的OX40L抗原的抗原决定簇]
通过使用HDX-MS技术分析针对抗OX40L抗体的OX40L抗原的抗原决定簇。使用0.12-2.00M脲、0.12-1.00M TCEP(pH 2.6)淬灭缓冲液及胃蛋白酶管柱，且使用基于D2O的缓冲溶液标记，以在五个时间点进行分析。通过使用PLGS及DynamX对资料进行处理，以获得如图3所示的结果。
[测试例3：抗体特性]
[测试例3-1.抗OX40L抗体及双特异性抗体的抗原对平衡解离常数(KD)分析]
如下分析关于抗OX40L抗体及同时控制OX40L及TNFα的双特异性抗体的抗原亲和力，前述抗体在上文实施例2及3中分离及纯化。
在上述抗体中，确认抗OX40L抗体对人OX40L(SEQ ID NO：2)的结合力，且分别确认OX40L及TNFα双特异性抗体对人OX40L(SEQ ID NO：2)及人TNFα(Acro Biosystems的TNF-H5228)的结合力(表32)。
通过使用Bicore T200进行表面等离子共振(SPR)分析，且所用操作缓冲液为HBS-EP(10mM HEPES，pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.15％界面活性剂P20)。通过胺偶联法将人抗体捕获试剂盒(抗hFc抗体)固定在CM5芯片的表面上。用操作缓冲液将人OX40L或人TNFα稀释至10nM，随后连续1/2倍稀释，以五个浓度间隔进行分析。通过将抗体灭菌且经0.2μm过滤器过滤且测量吸光度(A280)来确认抗体的浓度。制备具有高纯度/高浓度的分析样品，以使最小稀释因子可为100或更大，藉此使缓冲作用降至最低。在所有分析间隔之间提供一个再生步骤，以便可使实验的基线保持恒定，且Biacore分析结果如表32及图4所示。
在图4中，Ag1表示人OX40L，Ag2表示人TNFα。
[表32]
(上表中，aE+b表示a X 10b，aE-b表示a X 10-b。)
如自上表32确认，可确认实施例2的抗OX40L抗体与OX40L牢固结合，而实施例3的双特异性抗体与OX40L及TNFα均牢固结合。具体而言，确认抗OX40L抗体及双特异性抗体均在nM水平下显示出对OX40L的结合力，且具体而言，双特异性抗体还显示nM水平下的对TNFα的结合力。上述结果表明，双特异性抗体对每种抗原保持高水平的结合能力而不间断。
[测试例3-2.抗OX40L抗体及双特异性抗体的热稳定性测试]
进行测试以确认关于实施例3的双特异性抗体及实施例2的抗OX40L抗体的热稳定性质(表33)。
将抗体在DPBS中稀释至3μM/45μL，与5μL 200x sypro橙色染料(#S6650，Thermo)混合，却以50μL分配至qPCR管(#B77009，B57651，生物塑料)中。使用Biorad CFX96实时PCR装置进行qPCR。通过在25℃下反应30秒，随后在各温度下反应1分钟，且最终在25℃下反应10秒，同时将温度升高1℃至99℃，从而完成qPCR条件。使用熔融温度(Tm)作为抗体结构展开的速率常数，且其结果如下表33所示。
[表33]
如自上表确认，发现抗OX40L抗体及双特异性抗体的熔融温度在59至65℃之间，表明前述双特异性抗体还具有与抗OX40L抗体相似的热稳定性。
[测试例3-3.抗OX40L抗体及双特异性抗体的药物代谢动力学(PK)分析]
进行分析以确认施用实施例3的双特异性抗体及实施例2的抗OX40L抗体时的药物代谢动力学(表34)。
使用的实验动物是Sprague-Dawley品系的雄性大鼠，其由于恒定的药物反应及稳定的供应系统已广泛用于药物代谢动力学测试。分别使用三只未禁食的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(七周龄)，且以5mpk(2.5-2.4mg/ml)施用单次静脉内推注。施用后，在3分钟、3、8、24、48、72、96、120、144、168小时，通过颈静脉以约150μl/时间点收集血液共10次，且通过使用抗凝剂肝素钠分离，且在通过离心(12,000rpm，3分钟)获得约70μ血浆后，立即将样品储存在低温冷冻机中。在实验期间，每天至少观察一次一般症状。在最后一次采血后，通过吸入CO2对实验动物实施安乐死。
通过称为Gyrolab(目录号P0020300，GYROS PROTEIN)及Gyrolab PK试剂盒(目录号P0020499，GYROS PROTEIN)分析自PK测试获得的血浆。自通过Gyrolab获得的结果值，通过使用BA Calc 2007 1.0.0或PK Solver 2.0程序获得诸如AUC(last)、AUC(inf)、Cmax、Tmax、半衰期等参数值，且其结果如表34中所示。
[表34]
观测到实施例2的抗OX40L抗体的半衰期分别为3.6及4.0天，且实施例3的双特异性抗体的半衰期为3.6至6.0天。
因此，可理解的是，人类中的半衰期还可为约两周或更久。
[测试例4：抗体功效]
[测试例4-1.评估抗体的信号抑制能力(1)]
使用OX40L/OX40封锁生物分析试剂盒(Promega CS197706)及TNFα/TNFαRc封锁生物分析试剂盒(Promega CS177503)进行实施例2的抗OX40L抗体及实施例3的双特异性抗体(Hu3F07-TNFαi HC、02C09-TNFαi HC、O4L-TNFαi HC)的活性评估实验(表35，图5)。
(1)通过使用OX40L/OX40封锁生物分析试剂盒评估实施例2的抗OX40L抗体及实施例3的双特异性抗体的活性。
将NFκB-luc2/OX40 Jurkat细胞置于RPMI1640(10％ FBS)培养液中，且在37℃，5％ CO2培育器中静置培养过夜。第二天，制备与细胞反应的抗原及抗体。当将OX40L抗原添加至RPMI1640(10％ FBS)培养液中的细胞中时，使得最终浓度可达到15ng/mL。首先将抗OX40L抗体、双特异性抗体及对照抗体稀释至最终浓度33μg/mL，接着分九步骤连续1/3倍稀释。第十次浓度为0，且用培养液置换，从而获得总共10步骤的浓度梯度。将每种制备的抗原稀释溶液及抗体稀释溶液分别分配25μL至细胞中。分配各样品重复三次。分配后，细胞、抗原稀释溶液及抗体稀释溶液总共制成100μL，且在CO2培育器中反应约5小时。
分配75μL Bio-Glo且反应约10分钟，随后在微板读取器上通过发光分析样品，随后通过4参数(X轴log(浓度))进行分析。
通过将IC50分析结果在μg/mL下转化为nM(抗体的浓度单位)来计算最终IC50，使得抗OX40L抗体可用150kDa表示，且双特异性抗体可用200kDa表示。
(2)通过使用TNFα/TNFαRc封锁生物分析试剂盒评估双特异性抗体活性。
将NFκB-RE HEK293细胞DMEM(10％ FBS)置于培养液中，且在37℃，5％CO2培育器中静置培养。制备待与细胞反应的抗原及抗体。TNFα抗体在DMEM(10％ FBS)培养液中稀释，使得与细胞反应时最终浓度可达到3ng/mL。将双特异性抗体及作为对照抗体的Humira(Ref.TNFαi)稀释至DMEM(10％ FBS)培养液中，初始浓度为10nM，随后分八个步骤依序1/2倍稀释，藉此获得最终浓度，其中当与细胞反应时，初始浓度达到0.8nM。
将制备的抗原稀释溶液及抗体稀释溶液以3：2的比率混合，且以20μL分配至细胞中。分配各样品重复两次，且在分配后在CO2培育器中反应约4小时。
分配100μL Bio-Glo且反应，随后在微板读取器上通过发光分析，随后通过4参数(X轴log(浓度))进行分析以计算IC50。
上述IC50值如下表35及图5所示。
[表35]
如自上表35及图5可理解，可发现根据实施例2及3的双特异性抗体及抗OX40L抗体在1.3×10-9M(nM)或更低的水平显示OX40L阻断能力，且具体而言，抗OX40L抗体在0.9×10-9M(nM)或更低的水平下显示OX40L阻断能力，且双特异性抗体在1×10-9M(nM)或更低的水平下显示TNFα阻断能力，藉此提供显著优异的阻断能力。换言之，可理解，本发明的抗OX40L抗体显示优异的OX40L阻断能力，且使用前述抗体制备的双特异性抗体还显示不仅对OX40L而且对TNFα的优异阻断能力。
[测试例4-2.评估抗体的信号抑制能力(2)]
通过使用TNFα/TNFαRc封锁生物分析试剂盒(Promega CS177503)评估实施例3的双特异性抗体(02C09-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC、TNFαi 02C09 LC)的活性(表36)。评估的详细条件及方法与上文在测试例4-1中的抗体(1)的信号抑制能力的评估中所述实质上相同。
[表36]
如自上表36可理解，可发现实施例3的双特异性抗体02C09-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC及TNFαi 02C09 LC在1×10-9M(nM)或更低的水平下显示TNFα阻断能力，藉此提供优异阻断能力。
[测试例4-3.评估抗体的信号抑制能力(3)]
通过使用OX40L/OX40封锁生物分析试剂盒(Promega CS197706)及TNFα/TNFαRc封锁生物分析试剂盒(Promega CS177503)评估实施例3的双特异性抗体(I3F07-TNFαi HC、I3F07-TNFαi LC、TNFαi-I3F07 HC、TNFαi-I3F07 LC)的活性(表37)。评估的详细条件及方法与上文在测试例4-1中的抗体(1)的信号抑制能力的评估中所述实质上相同。
[表37]
如自上表37可理解，可发现实施例3的双特异性抗体显示在1×10-9M(nM)或更低的水平下的OX40L阻断能力及在1×10-9M(nM)或更低水平下的TNFα阻断能力，藉此提供优异阻断能力。
[测试例4-4.评估免疫细胞活性的抗体抑制能力]
为了评估实施例2的抗OX40L抗体及实施例3的双特异性抗体的功效，通过使用正常人及患有类风湿性关节炎(RA)的患者的外周血单个核细胞(PBMC)来确认抑制免疫细胞活性的能力(图6)。
通过上述方法，自正常人及RA患者的PBMC分离T细胞，且对活化T细胞时降低的细胞因子IL-2的分泌水平进行分析。
为了分别在正常及患者PBMC中分裂T细胞，将抗CD3(R&D系统，MAB100)以100ng/孔稀释，且附着至96孔持续约16小时(5±3)。移除附着的溶液后，将细胞用PBS洗涤。在LGM-3(10％ FBS，1％ P/S)中稀释DNase I达到20U/mL后，添加正常PBMC以制备混合溶液，离心(200g，15分钟)以移除上清液，稀释且分配，使得使用LGM-3(10％ FBS，1％ P/S)可使正常PBMC达到1×106个细胞/mL。将人OX40L(ACROBIOSYSTEMS，OXL-H52Q8)及人TNFα(SINOBIOLOGICAL，10602-HNA)在LGM-3(10％ FBS，1％ P/S)中稀释，且以50μL添加至分配的正常PBMC中。用LGM-3(10％ FBS，1％ P/S)以800ng/mL制备抗OX40L抗体及双特异性抗体，随后稀释至1nM。将稀释的抗体以50μL分配至含有自PBMC分离的T细胞、人OX40L及人TNFα的板中，且混合。在约24至72小时后，仅收集上清液且测量IL-2，且结果显示于图6中。
在图6中，A表示正常PBMC来源的T细胞分析的结果，而B表示患者PBMC来源的T细胞分析的结果。
如自图6可知，确认当施用本发明的双特异性抗体时，IL-2显示出降低的趋势。具体而言，自RA患者中PBMC来源的T细胞的结果可确认，与Humira(Ref.TNFαi)相比，本发明的双特异性抗体显著降低RA患者中PBMC来源的T细胞中的IL-2表达。此可能意谓本发明的双特异性抗体充当RA的有效治疗性抗体，且具体而言，在Humira难治愈RA患者中有效地起作用。
因此，可理解本发明的抗OX40L抗体及双特异性抗体缓解过度活化的免疫系统，且显示出对自体免疫性疾病的优异治疗效果。
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Y生物股份有限公司
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<130> P20-099-HKI
<160> 94
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> OX40L序列
<400> 1
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L-his
<400> 2
His His His His His His Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln
1 5 10 15
Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile
20 25 30
Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser
35 40 45
Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr
50 55 60
Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu
65 70 75 80
Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp
100 105 110
Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu
115 120 125
Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
130 135
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原决定簇93-100
<400> 3
Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原决定簇141-151
<400> 4
Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 HC
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 6
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 HC N297A
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 7
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 HC
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 8
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 HC S228P
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 9
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 HC S228P
<400> 9
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG LC
<400> 10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG LC
<400> 11
cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR1
<400> 12
Tyr Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR1
<400> 13
Asp Tyr Trp Met His
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR1
<400> 14
Asn Tyr Trp Met Gln
1 5
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR2
<400> 15
Arg Ile Lys Gly Glu Pro Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR2
<400> 16
Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR2
<400> 17
Glu Ile Asp Pro Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR2
<400> 18
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR3
<400> 19
Arg Arg Gly Leu Asp Val
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR3
<400> 20
Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR3
<400> 21
Glu Gly Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VH CDR3
<400> 22
Glu Val Ser Leu Arg Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR1
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR1
<400> 24
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR2
<400> 25
Lys Ala Thr Ile Leu Glu Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR2
<400> 26
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR3
<400> 27
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR3
<400> 28
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR3
<400> 29
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗OX40L抗体VL CDR3
<400> 30
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子1
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子2
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Oxelumab VH
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Oxelumab VL
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VH
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VL
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09 VH
<400> 37
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Gly Glu Pro Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ser Arg Arg Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09 VL
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Thr Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09 VH
<400> 39
caaatgcagc ttgttcaatc cggcggaggc ctggttaagc ctggcggatc tctgagagtg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaat tacgcctgga tgagctgggt ccgacaggcc 120
cctggaaaag gactggaatg ggtcggaaga atcaagggcg agcctgatgg cggaaccaca 180
gagtacgccg atagcgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc gaggacacag ccgtgtacta ctgtgtgtct 300
agaagaggcc tggatgtgtg gggccaggga acaacagtga cagtttcttc t 351
<210> 40
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09 VL
<400> 40
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctctgggcga tagagtgacc 60
atcacatgtc gggccagcca gtctattgga cggtggctgg cctggtatca gcaaaagcct 120
ggaaacgccc ctaagctgct gatctacaag gccaccatcc tggaaagcgg agtgccttct 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgag tttgccctga caattagctc cctgcagcct 240
gacgacttca gcgcctacta ctgccagcag tacaacagct acccctacac cttcggccag 300
ggcacaaagc tggaaatcaa g 321
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu3F07 VH
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu3F07 VL
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu3F07 VH
<400> 43
caagttcaac tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctctggctt cacattcccc gactactgga tgcactgggt tcgacaggct 120
ccaggacagg gactcgaatg gatgggcgag atcgatcctc ctaacggccg gaccaactac 180
aacgagaagt tcaagagcag agtgaccatg accagagaca ccagcatcag caccgcctac 240
atggaactga gcagactgag aagcgacgac accgccgtgt actactgtgc cagaggcatc 300
tactacgtgg actactgggg ccagggcacc acagtgacag ttagctct 348
<210> 44
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu3F07 VL
<400> 44
gatatcgtga tgacacagag ccctctgagc ctgcctgtga cactgggaga acctgccagc 60
atcagctgta gaagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggaca gtctccccag ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggcgtgc ccgatagatt ttctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatt 240
agcagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgta gccagtctac ccacgtgcca 300
cctacctttg gcggcggaac aaagctggaa atcaag 336
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10H07 VH
<400> 45
Gln Val Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Gly Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Glu Gly Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 10H07 VL
<400> 46
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 47
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10H07 VH
<400> 47
caggtttatc tacagcagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc gactactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggagag attgatcctg gcaacggtcg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg agtgtagaca aatcctccaa tacagcctac 240
atgcaattca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct tttactgtgc aagcgaggga 300
gctggacgtg gatttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc cgca 354
<210> 48
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10H07 VL
<400> 48
gatgttgtgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21G07 VH
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Ser Leu Arg Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21G07 VL
<400> 50
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 51
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21G07 VH
<400> 51
caggtccaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tgcaatgggt gaaacagagg 120
cccggacaag gccttgagtg gattggagag attgatccta gcgacggtcg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca gatcctccag cacagcctac 240
ataaaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagaggtt 300
tcactacggt caatggacta ctggggccaa gggacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 52
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 21G07 VL
<400> 52
gacattgttc tcacccagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcca 300
ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336
<210> 53
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07 VH
<400> 53
Gln Ile Gln Leu Ala Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07 VL
<400> 54
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07 VH
<400> 55
cagattcagc tggctcagtc tggcgccgaa cttgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
agctgcaagg ccagcggctt cacctttcct gactactgga tgcactgggt caagcagagg 120
cctggacagg gactcgaatg gatcggcgag atcgatcctc ctaacggccg gaccaactac 180
aacgagaagt tcaagagcaa ggccacactg accgtggaca gcagcagcaa taccgcctac 240
atgcagctga gcagactgac ctctgaggac agcgccgtgt actactgtgc cagaggcatc 300
tactacgtgg actactgggg ccagggcaca accctgacag tttcttct 348
<210> 56
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07 VL
<400> 56
gatatcgtgc tgacacagag ccctctgagc ctgcctgttt ctctgggaga tcaggccagc 60
atcagctgca gatcctctca gagcctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgatagatt ttctggctct ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatt 240
tctagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tacttctgtt ctcagtctac ccacgtgcca 300
cctacctttg gcggcggaag caagctggaa atcaag 336
<210> 57
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09-TNFai HC重链
<400> 57
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Gly Glu Pro Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ser Arg Arg Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
450 455 460
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp
500 505 510
Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr
515 520 525
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
530 535 540
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
565 570 575
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
595 600 605
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
610 615 620
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
625 630 635 640
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
645 650 655
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
660 665 670
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
675 680 685
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
690 695 700
Glu Ile Lys
705
<210> 58
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09-TNFai HC重链
<400> 58
caaatgcagc ttgttcaatc cggcggaggc ctggttaagc ctggcggatc tctgagagtg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaat tacgcctgga tgagctgggt ccgacaggcc 120
cctggaaaag gactggaatg ggtcggaaga atcaagggcg agcctgatgg cggaaccaca 180
gagtacgccg atagcgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc gaggacacag ccgtgtacta ctgtgtgtct 300
agaagaggcc tggatgtgtg gggccaggga acaacagtga cagtttcttc tgcttccacc 360
aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320
tctctgggta aaggtggtgg cggatctggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgaa 1380
gtgcaactgg ttgaatctgg cggaggactg gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct 1440
tgtgccgcca gcggcttcac cttcgatgat tatgccatgc actgggtccg acaggcccct 1500
ggaaaaggac ttgaatgggt gtccgccatc acctggaaca gcggccacat cgattacgcc 1560
gatagcgtgg aaggccggtt caccatcagc agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg 1620
cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa agtgtcttac 1680
ctgagcaccg cctccagcct ggattattgg ggacagggca cactggtcac agtgtcctct 1740
ggtggcggag gttctggcgg aggtggtagt ggtggcggtg gaagtggtgg cggcggatct 1800
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga tagagtgacc 1860
atcacctgta gagccagcca gggcatcaga aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 1920
ggaaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gcctctacac tgcagagcgg cgtgccatct 1980
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatttctag cctgcagcct 2040
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagaga tacaacagag ccccttacac cttcggccag 2100
ggcaccaagg tggaaatcaa g 2121
<210> 59
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09-TNFai LC轻链
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Thr Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
290 295 300
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser
325 330 335
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
370 375 380
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg
385 390 395 400
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
405 410 415
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
420 425 430
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
435 440 445
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala
450 455 460
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
465 470 475
<210> 60
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 02C09-TNFai LC轻链
<400> 60
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctctgggcga tagagtgacc 60
atcacatgtc gggccagcca gtctattgga cggtggctgg cctggtatca gcaaaagcct 120
ggaaacgccc ctaagctgct gatctacaag gccaccatcc tggaaagcgg agtgccttct 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgag tttgccctga caattagctc cctgcagcct 240
gacgacttca gcgcctacta ctgccagcag tacaacagct acccctacac cttcggccag 300
ggcacaaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggtggtgg cggatctggc 660
ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgaa gtgcaactgg ttgaatctgg cggaggactg 720
gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcgatgat 780
tatgccatgc actgggtccg acaggcccct ggaaaaggac ttgaatgggt gtccgccatc 840
acctggaaca gcggccacat cgattacgcc gatagcgtgg aaggccggtt caccatcagc 900
agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc 960
gccgtgtact actgtgccaa agtgtcttac ctgagcaccg cctccagcct ggattattgg 1020
ggacagggca cactggtcac agtgtcctct ggtggcggag gttctggcgg aggtggtagt 1080
ggtggcggtg gaagtggtgg cggcggatct gatatccaga tgacacagag ccctagcagc 1140
ctgtctgcct ctgtgggcga tagagtgacc atcacctgta gagccagcca gggcatcaga 1200
aactacctgg cctggtatca gcagaagccc ggaaaggccc ctaagctgct gatctatgcc 1260
gcctctacac tgcagagcgg cgtgccatct agattttctg gcagcggctc tggcaccgac 1320
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tacaacagag ccccttacac cttcggccag ggcaccaagg tggaaatcaa g 1431
<210> 61
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu3F07-TNFai HC重链
<400> 61
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
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260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> Hu3F07-TNFai HC重链
<400> 62
caagttcaac tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Hu3F07-TNFai LC轻链
<400> 63
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
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<223> TNFai-02C09 HC重链
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
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ggcacaaagc tggaaatcaa g 2121
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<213> 人工序列
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<223> TNFai-02C09 LC轻链
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
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225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Asn Tyr Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Gly Glu Pro Asp Gly Gly Thr
275 280 285
Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ser Arg Arg Gly Leu Asp Val Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
355 360 365
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg
370 375 380
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Trp Leu Ala
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
405 410 415
Ala Thr Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
420 425 430
Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp
435 440 445
Phe Ser Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe
450 455 460
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
465 470
<210> 68
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai-02C09 LC轻链
<400> 68
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ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
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gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggtggtgg cggatctggc 660
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gcctggatga gctgggtccg acaggcccct ggaaaaggac tggaatgggt cggaagaatc 840
aagggcgagc ctgatggcgg aaccacagag tacgccgata gcgtgaaggg cagattcacc 900
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<210> 69
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai-hu3F07 HC重链
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
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Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
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Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asp Tyr Trp
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Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
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Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met
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Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu
595 600 605
Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
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Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai-hu3F07 HC重链
<400> 70
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gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
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acctttggcg gcggaacaaa gctggaaatc aag 2133
<210> 71
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- hu3F07 LC轻链
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn
275 280 285
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Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly
325 330 335
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
355 360 365
Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Glu Pro Ala
370 375 380
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn
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Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
420 425 430
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
435 440 445
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val
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Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
465 470 475
<210> 72
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- hu3F07 LC轻链
<400> 72
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60
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<212> PRT
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<220>
<223> I3F07-TNFai HC重链
<400> 73
Gln Ile Gln Leu Ala Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
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245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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405 410 415
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435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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485 490 495
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn
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515 520 525
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Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu
545 550 555 560
Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
565 570 575
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580 585 590
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
595 600 605
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
610 615 620
Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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660 665 670
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Ile Lys
705
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<213> 人工序列
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<223> I3F07-TNFai HC重链
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cagattcagc tggctcagtc tggcgccgaa cttgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
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aacgagaagt tcaagagcaa ggccacactg accgtggaca gcagcagcaa taccgcctac 240
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gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 660
ccatgcccac catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 720
ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780
gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960
aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020
gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200
ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1260
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320
ctgggtaaag gtggtggcgg atctggcggc ggaggaagcg gaggcggagg atccgaagtg 1380
caactggttg aatctggcgg aggactggtg cagcctggaa gaagcctgag actgtcttgt 1440
gccgccagcg gcttcacctt cgatgattat gccatgcact gggtccgaca ggcccctgga 1500
aaaggacttg aatgggtgtc cgccatcacc tggaacagcg gccacatcga ttacgccgat 1560
agcgtggaag gccggttcac catcagcaga gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 1620
atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactact gtgccaaagt gtcttacctg 1680
agcaccgcct ccagcctgga ttattgggga cagggcacac tggtcacagt gtcctctggt 1740
ggcggaggtt ctggcggagg tggtagtggt ggcggtggaa gtggtggcgg cggatctgat 1800
atccagatga cacagagccc tagcagcctg tctgcctctg tgggcgatag agtgaccatc 1860
acctgtagag ccagccaggg catcagaaac tacctggcct ggtatcagca gaagcccgga 1920
aaggccccta agctgctgat ctatgccgcc tctacactgc agagcggcgt gccatctaga 1980
ttttctggca gcggctctgg caccgacttc accctgacaa tttctagcct gcagcctgag 2040
gacgtggcca cctactactg ccagagatac aacagagccc cttacacctt cggccagggc 2100
accaaggtgg aaatcaag 2118
<210> 75
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07-TNFai LC轻链
<400> 75
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn
275 280 285
Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile
290 295 300
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
305 310 315 320
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu
325 330 335
Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
340 345 350
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
370 375 380
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
385 390 395 400
Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
405 410 415
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly
420 425 430
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
435 440 445
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
450 455 460
Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
465 470 475 480
Ile Lys
<210> 76
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> I3F07-TNFai LC轻链
<400> 76
gatatcgtgc tgacacagag ccctctgagc ctgcctgttt ctctgggaga tcaggccagc 60
atcagctgca gatcctctca gagcctggtg cacagcaacg gcaataccta cctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtctcctaag ctgctgatct acaaggtgtc caacaggttc 180
agcggcgtgc ccgatagatt ttctggctct ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatt 240
tctagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tacttctgtt ctcagtctac ccacgtgcca 300
cctacctttg gcggcggaag caagctggaa atcaagcgta cggtggcggc gccatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgtggt 660
ggtggcggat ctggcggcgg aggaagcgga ggcggaggat ccgaagtgca actggttgaa 720
tctggcggag gactggtgca gcctggaaga agcctgagac tgtcttgtgc cgccagcggc 780
ttcaccttcg atgattatgc catgcactgg gtccgacagg cccctggaaa aggacttgaa 840
tgggtgtccg ccatcacctg gaacagcggc cacatcgatt acgccgatag cgtggaaggc 900
cggttcacca tcagcagaga caacgccaag aacagcctgt acctgcagat gaactccctg 960
agagccgagg acaccgccgt gtactactgt gccaaagtgt cttacctgag caccgcctcc 1020
agcctggatt attggggaca gggcacactg gtcacagtgt cctctggtgg cggaggttct 1080
ggcggaggtg gtagtggtgg cggtggaagt ggtggcggcg gatctgatat ccagatgaca 1140
cagagcccta gcagcctgtc tgcctctgtg ggcgatagag tgaccatcac ctgtagagcc 1200
agccagggca tcagaaacta cctggcctgg tatcagcaga agcccggaaa ggcccctaag 1260
ctgctgatct atgccgcctc tacactgcag agcggcgtgc catctagatt ttctggcagc 1320
ggctctggca ccgacttcac cctgacaatt tctagcctgc agcctgagga cgtggccacc 1380
tactactgcc agagatacaa cagagcccct tacaccttcg gccagggcac caaggtggaa 1440
atcaag 1446
<210> 77
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- I3F07 HC重链
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
450 455 460
Ile Gln Leu Ala Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
465 470 475 480
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asp Tyr Trp
485 490 495
Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
500 505 510
Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
515 520 525
Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met
530 535 540
Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
545 550 555 560
Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
565 570 575
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu
595 600 605
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
610 615 620
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
625 630 635 640
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
645 650 655
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
660 665 670
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
675 680 685
Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly
690 695 700
Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
705 710
<210> 78
<211> 2133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- I3F07 HC重链
<400> 78
gaagtgcaac tggttgaatc tggcggagga ctggtgcagc ctggaagaag cctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcgat gattatgcca tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggaaaag gacttgaatg ggtgtccgcc atcacctgga acagcggcca catcgattac 180
gccgatagcg tggaaggccg gttcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaagtgtct 300
tacctgagca ccgcctccag cctggattat tggggacagg gcacactggt cacagtgtcc 360
tctgcttcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 420
gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600
acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660
tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca 720
gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840
gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260
gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320
agcctctccc tgtctctggg taaaggtggt ggcggatctg gcggcggagg aagcggaggc 1380
ggaggatccc agattcagct ggctcagtct ggcgccgaac ttgtgaaacc tggcgcctct 1440
gtgaagctga gctgcaaggc cagcggcttc acctttcctg actactggat gcactgggtc 1500
aagcagaggc ctggacaggg actcgaatgg atcggcgaga tcgatcctcc taacggccgg 1560
accaactaca acgagaagtt caagagcaag gccacactga ccgtggacag cagcagcaat 1620
accgcctaca tgcagctgag cagactgacc tctgaggaca gcgccgtgta ctactgtgcc 1680
agaggcatct actacgtgga ctactggggc cagggcacaa ccctgacagt ttcttctggt 1740
ggcggaggtt ctggcggagg tggtagtggt ggcggtggaa gtggtggcgg cggatctgat 1800
atcgtgctga cacagagccc tctgagcctg cctgtttctc tgggagatca ggccagcatc 1860
agctgcagat cctctcagag cctggtgcac agcaacggca atacctacct gcactggtat 1920
ctgcagaagc ccggccagtc tcctaagctg ctgatctaca aggtgtccaa caggttcagc 1980
ggcgtgcccg atagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gaagatttct 2040
agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac ttctgttctc agtctaccca cgtgccacct 2100
acctttggcg gcggaagcaa gctggaaatc aag 2133
<210> 79
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- I3F07 LC轻链
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ala Gln Ser Gly Ala Glu Leu
225 230 235 240
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Pro Asp Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Pro Asn Gly Arg Thr Asn
275 280 285
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser
290 295 300
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Val Asp Tyr Trp Gly
325 330 335
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
355 360 365
Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala
370 375 380
Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn
385 390 395 400
Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
405 410 415
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
420 425 430
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val
435 440 445
Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val
450 455 460
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys
465 470 475
<210> 80
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFai- I3F07 LC轻链
<400> 80
gatatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gggcatcaga aactacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggaaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gcctctacac tgcagagcgg cgtgccatct 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatttctag cctgcagcct 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagaga tacaacagag ccccttacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggtggtgg cggatctggc 660
ggcggaggaa gcggaggcgg aggatcccag attcagctgg ctcagtctgg cgccgaactt 720
gtgaaacctg gcgcctctgt gaagctgagc tgcaaggcca gcggcttcac ctttcctgac 780
tactggatgc actgggtcaa gcagaggcct ggacagggac tcgaatggat cggcgagatc 840
gatcctccta acggccggac caactacaac gagaagttca agagcaaggc cacactgacc 900
gtggacagca gcagcaatac cgcctacatg cagctgagca gactgacctc tgaggacagc 960
gccgtgtact actgtgccag aggcatctac tacgtggact actggggcca gggcacaacc 1020
ctgacagttt cttctggtgg cggaggttct ggcggaggtg gtagtggtgg cggtggaagt 1080
ggtggcggcg gatctgatat cgtgctgaca cagagccctc tgagcctgcc tgtttctctg 1140
ggagatcagg ccagcatcag ctgcagatcc tctcagagcc tggtgcacag caacggcaat 1200
acctacctgc actggtatct gcagaagccc ggccagtctc ctaagctgct gatctacaag 1260
gtgtccaaca ggttcagcgg cgtgcccgat agattttctg gctctggcag cggcaccgac 1320
ttcaccctga agatttctag agtggaagcc gaggacctgg gcgtgtactt ctgttctcag 1380
tctacccacg tgccacctac ctttggcggc ggaagcaagc tggaaatcaa g 1431
<210> 81
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ref. Ab重链
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ref. Ab轻链
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ref. TNFai重链
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ref. TNFai轻链
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 85
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> O4L-TNFai HC重链
<400> 85
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
450 455 460
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
465 470 475 480
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
485 490 495
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
500 505 510
Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
515 520 525
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
530 535 540
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
545 550 555 560
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
565 570 575
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
595 600 605
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
610 615 620
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
625 630 635 640
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr
645 650 655
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
660 665 670
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr
675 680 685
Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
690 695 700
Thr Lys Val Glu Ile Lys
705 710
<210> 86
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> O4L-TNFai HC重链
<400> 86
gaggtgcagc tgctggaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcaac agctacgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccatc atcagcggca gcggcggctt tacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagccggac caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacaga 300
ctggtggccc caggcacctt cgactattgg ggacagggcg ccctcgtgac cgtgtcctct 360
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggtaa aggtggtggc ggatctggcg gcggaggaag cggaggcgga 1380
ggatccgaag tgcaactggt tgaatctggc ggaggactgg tgcagcctgg aagaagcctg 1440
agactgtctt gtgccgccag cggcttcacc ttcgatgatt atgccatgca ctgggtccga 1500
caggcccctg gaaaaggact tgaatgggtg tccgccatca cctggaacag cggccacatc 1560
gattacgccg atagcgtgga aggccggttc accatcagca gagacaacgc caagaacagc 1620
ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgccaaa 1680
gtgtcttacc tgagcaccgc ctccagcctg gattattggg gacagggcac actggtcaca 1740
gtgtcctctg gtggcggagg ttctggcgga ggtggtagtg gtggcggtgg aagtggtggc 1800
ggcggatctg atatccagat gacacagagc cctagcagcc tgtctgcctc tgtgggcgat 1860
agagtgacca tcacctgtag agccagccag ggcatcagaa actacctggc ctggtatcag 1920
cagaagcccg gaaaggcccc taagctgctg atctatgccg cctctacact gcagagcggc 1980
gtgccatcta gattttctgg cagcggctct ggcaccgact tcaccctgac aatttctagc 2040
ctgcagcctg aggacgtggc cacctactac tgccagagat acaacagagc cccttacacc 2100
ttcggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag 2130
<210> 87
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> O4L-TNFai LC轻链
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
245 250 255
Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
290 295 300
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser
325 330 335
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
370 375 380
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg
385 390 395 400
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
405 410 415
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
420 425 430
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
435 440 445
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala
450 455 460
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
465 470 475
<210> 88
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> O4L-TNFai LC轻链
<400> 88
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatcagc agctggctgg cctggtatca gcagaagccc 120
gagaaggccc ccaagagcct gatctacgcc gccagctctc tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagct acccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggtggtgg cggatctggc 660
ggcggaggaa gcggaggcgg aggatccgaa gtgcaactgg ttgaatctgg cggaggactg 720
gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcgatgat 780
tatgccatgc actgggtccg acaggcccct ggaaaaggac ttgaatgggt gtccgccatc 840
acctggaaca gcggccacat cgattacgcc gatagcgtgg aaggccggtt caccatcagc 900
agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc 960
gccgtgtact actgtgccaa agtgtcttac ctgagcaccg cctccagcct ggattattgg 1020
ggacagggca cactggtcac agtgtcctct ggtggcggag gttctggcgg aggtggtagt 1080
ggtggcggtg gaagtggtgg cggcggatct gatatccaga tgacacagag ccctagcagc 1140
ctgtctgcct ctgtgggcga tagagtgacc atcacctgta gagccagcca gggcatcaga 1200
aactacctgg cctggtatca gcagaagccc ggaaaggccc ctaagctgct gatctatgcc 1260
gcctctacac tgcagagcgg cgtgccatct agattttctg gcagcggctc tggcaccgac 1320
ttcaccctga caatttctag cctgcagcct gaggacgtgg ccacctacta ctgccagaga 1380
tacaacagag ccccttacac cttcggccag ggcaccaagg tggaaatcaa g 1431
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VH CDR 1
<400> 89
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VH CDR 2
<400> 90
Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VH CDR 3
<400> 91
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VL CDR 1
<400> 92
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VL CDR 2
<400> 93
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Humira VL CDR 3
<400> 94
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr
1 5

Claims (35)

1.一种抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其与OX40L(OX40配体)特异性结合且抑制OX40L与OX40受体之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段与由选自SEQ ID NO：3及4组成的群的氨基酸序列表示的至少一个抗原决定簇结合。
3.根据权利要求1或2所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段以1×10-9M或更低的KD与人OX40L结合，且其中所述KD通过表面等离子共振(Biacore)分析来测量。
4.根据权利要求1或2所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含由选自SEQ ID NO：12、13及14组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR1；由选自SEQ ID NO：15、16、17及18组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR2；及由选自SEQ ID NO：19、20、21及22组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由选自SEQ ID NO：23及24组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR1；由选自SEQ ID NO：25及26组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR2；及由选自SEQID NO：27、28、29及30组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR3。
5.根据权利要求1或2所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：12表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：15表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：19表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：23表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：25表示的重链CDR2；及由SEQ IDNO：27表示的轻链CDR3；
(ii)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：28表示的轻链CDR3；
(iii)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：17表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：21表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：29表示的轻链CDR3；及
(iv)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：14表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：18表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：22表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：30表示的轻链CDR3。
6.根据权利要求1或2所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
由选自SEQ ID NO：37、41、45、49及53组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及
由选自SEQ ID NO：38、42、46、50及54组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链可变区。
7.根据权利要求1或2所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
(a)由SEQ ID NO：37表示的重链可变区及由SEQ ID NO：38表示的轻链可变区；
(b)由SEQ ID NO：41表示的重链可变区及由SEQ ID NO：42表示的轻链可变区；
(c)由SEQ ID NO：45表示的重链可变区及由SEQ ID NO：46表示的轻链可变区；
(d)由SEQ ID NO：49表示的重链可变区及由SEQ ID NO：50表示的轻链可变区；或
(e)由SEQ ID NO：53表示的重链可变区及由SEQ ID NO：54表示的轻链可变区。
8.根据权利要求7所述的抗OX40L抗体或其抗原结合片段，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
由选自SEQ ID NO：5、6、7及8组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及
由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区。
9.一种双特异性抗体，其包含：与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段；及与TNFα特异性结合的抗TNFα抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段与所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段彼此连接的双特异性抗体。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段与由选自SEQ ID NO：3及4组成的群的氨基酸序列表示的至少一个抗原决定簇结合。
12.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含由选自SEQ ID NO：12、13及14组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR1；由选自SEQ ID NO：15、16、17及18组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR2；及由选自SEQ ID NO：19、20、21及22组成的群的一个氨基酸序列表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由选自SEQ ID NO：23及24组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR1；由选自SEQ ID NO：25及26组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR2；及由选自SEQID NO：27、28、29及30组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链CDR3。
13.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
(i)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：12表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：15表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：19表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：23表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：25表示的重链CDR2；及由SEQ IDNO：27表示的轻链CDR3；
(ii)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：16表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：20表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：28表示的轻链CDR3；
(iii)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：13表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：17表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：21表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：29表示的轻链CDR3；或
(iv)抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区，其包含由SEQ ID NO：14表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：18表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：22表示的重链CDR3；及轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：24表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：26表示的轻链CDR2；及由SEQ IDNO：30表示的轻链CDR3。
14.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
由选自SEQ ID NO：33、37、41、45、49及53组成的群的一个氨基酸序列表示的重链可变区；及
由选自SEQ ID NO：34、38、42、46、50及54组成的群的一个氨基酸序列表示的轻链可变区。
15.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段包含：
(a)由SEQ ID NO：37表示的重链可变区及由SEQ ID NO：38表示的轻链可变区；
(b)由SEQ ID NO：41表示的重链可变区及由SEQ ID NO：42表示的轻链可变区；
(c)由SEQ ID NO：45表示的重链可变区及由SEQ ID NO：46表示的轻链可变区；
(d)由SEQ ID NO：49表示的重链可变区及由SEQ ID NO：50表示的轻链可变区；
(e)由SEQ ID NO：53表示的重链可变区及由SEQ ID NO：54表示的轻链可变区；或
(f)具有由SEQ ID NO：33表示的氨基酸序列的重链可变区及具有由SEQ ID NO：34表示的氨基酸序列的轻链可变区。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的双特异性抗体，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：89表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：90表示的重链CDR2；及由SEQ ID NO：91表示的重链CDR3；及
轻链可变区，其包含由SEQ ID NO：92表示的轻链CDR1；由SEQ ID NO：93表示的轻链CDR2；及由SEQ ID NO：94表示的轻链CDR3。
17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：35表示的重链可变区及由SEQ ID NO：36表示的轻链可变区。
18.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1.5×10-9M或更低的KD与人OX40L结合，且以1×10-9M或更低的KD与人TNFα结合，且其中所述KD通过表面等离子共振(Biacore)分析来测量。
19.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是其中与TNFα特异性结合的抗TNFα抗体或其抗原结合片段与所述抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个末端连接的双特异性抗体。
20.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段与所述抗OX40L抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接的双特异性抗体。
21.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是其中与OX40L特异性结合的抗OX40L抗体或其抗原结合片段与所述抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个末端连接的双特异性抗体。
22.根据权利要求21所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段与所述抗TNFα抗体的轻链及重链的至少一个C末端连接。
23.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述抗OX40L抗体或其抗原结合片段及所述抗TNFα抗体或其抗原结合片段通过连接子连接。
24.根据权利要求23所述的双特异性抗体，其中所述连接子由SEQ ID NO：31或SEQ IDNO：32表示。
25.一种核酸，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体。
26.一种表达载体，其包含根据权利要求25所述的核酸。
27.一种转化体，其包含引入其中的根据权利要求26所述的表达载体。
28.一种通过使用根据权利要求27所述的转化体生产抗体或其抗原片段或双特异性抗体的方法。
29.一种药物组合物，其用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述药物组合物预防或治疗类风湿性关节炎。
31.一种用于通过使用根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体来提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的方法。
32.一种用于提供关于诊断自体免疫性疾病或炎症性疾病的信息的试剂盒，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体。
33.一种预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的方法，所述方法包含：施用医药上有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体。
34.权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体用于制造用以预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的药物的用途。
35.权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求9至24中任一项所述的双特异性抗体用于预防或治疗自体免疫性疾病或炎症性疾病的用途。
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