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CN117402889A - 水稻种子活力调控基因sv3、编码蛋白及应用 - Google Patents

水稻种子活力调控基因sv3、编码蛋白及应用 Download PDF

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CN117402889A
CN117402889A CN202311174275.2A CN202311174275A CN117402889A CN 117402889 A CN117402889 A CN 117402889A CN 202311174275 A CN202311174275 A CN 202311174275A CN 117402889 A CN117402889 A CN 117402889A
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CN
China
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gene
rice
vigor
seq
seeds
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Application number
CN202311174275.2A
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English (en)
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贺记外
闫蕴韬
张海清
祝小雅
龚成云
朱裕敬
曾哲
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Hunan Agricultural University
Original Assignee
Hunan Agricultural University
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Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University filed Critical Hunan Agricultural University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明提供了水稻种子活力调控基因SV3，属于植物分子生物学与植物育种技术领域，所述基因SV3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。该基因可调控水稻种子的活力，为作物育种提供了新的基因资源，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。本发明还提供了水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白及应用。

Description

水稻种子活力调控基因SV3、编码蛋白及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学与植物育种技术领域，特别涉及水稻种子活力调控基因SV3、编码蛋白及应用。
背景技术
种子萌发是指具有活力的种子在外部合适的条件下，遇水膨胀，解除种子自身休眠至胚芽突破种皮的过程，是植物生命周期的关键。农作物种子活力的差异会影响出苗的一致性和幼苗整齐度，种子活力是一个由多基因控制的复杂数量性状。目前定位到了多个水稻种子活力相关的QTL，并且对一些种子活力相关的基因进行了克隆，但是种子内部调节种子活力的机制尚不明确，目前主要研究的方向是ABA、GA等激素途径对种子萌发具有直接的调控，ABA可以抑制种子萌发，GA促进种子萌发，种子在生长发育过程中体内会有一定量的ABA积累，从而在一定程度上抑制水稻种子的萌发防止发生穗萌现象。QSD7-1通过调节ABA生物合成途径来控制水稻种子萌发，qSD1-2为GA合成基因，通风GA调节的脱水机制来抑制种子萌发，降低种子活力。最近储成才课题组研究发现的G基因可以通过参与ABA的生物合成来影响种子萌发，并成功鉴定到了一个水稻种子活力的QTL位点SD6。但是水稻种子活力是否受其他基因或蛋白的调节尚不可知。
进一步挖掘控制水稻种子萌发速率的相关基因，探索种子萌发速率的调控途径对未来水稻直播具有十分重要的意义，对水稻分子育种具有十分重要的应用价值。
发明内容
为了获得更多与控制水稻种子萌发速率相关的基因，本发明提供了水稻种子活力调控基因SV3，该基因可调控水稻种子的活力，为作物育种提供了新的基因资源，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。
本发明还提供了水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白及应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供水稻种子活力调控基因SV3，所述基因SV3的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
或者，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明水稻种子活力调控基因SV3，该基因位于3号染色体上，水稻基因数据库的基因编号是LOC_Os03g04110(Os03g0133400)。
进一步的，本发明提供上述水稻种子活力调控基因SV3在调控水稻种子活力中的应用。
进一步的，本发明提供上述水稻种子活力调控基因SV3在水稻遗传育种中的应用。
本发明还提供水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，本发明提供上述水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用。
进一步的，本发明提供上述水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白在水稻遗传育种中的应用。
基于同一发明构思，本发明提供一种提高水稻种子活力的方法，所述方法包括：
构建基因SV3敲除载体；
以所述基因SV3敲除载体对水稻进行遗传转化，获取纯合SV3突变体株系；
其中，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述水稻品种为日本晴。
基于同一发明构思，本发明还提供一种降低水稻种子活力的方法，所述方法包括：
构建基因SV3过表达载体；
以所述基因SV3过表达载体对水稻进行遗传转化，获取纯合SV3过表达株系；
其中，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述水稻品种为日本晴。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1.本发明水稻种子活力调控基因SV3，该基因位于3号染色体上，水稻基因数据库的基因编号是LOC_Os03g04110(Os03g0133400)，该基因能够负向调控水稻种子活力，为作物育种提供了新的基因资源，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。
2.本发明水稻种子活力调控基因SV3在调控水稻种子活力中的应用，通过构建SV3敲除载体，以水稻品种日本晴为背景材料，使SV3基因发生突变，敲除SV3后的突变体水稻种子的发芽率显著提高，种子活力指数与发芽指数上升，发芽并且有更长的根长与芽长；通过构建SV3过量表达重组载体，同样以水稻品种日本晴为背景材料进行遗传转化，提高SV3的表达量，过量表达SV3基因后的水稻植株的种子的种子发芽率下降，活力指数与发芽指数降低，并且有更短的根长与芽长；本发明为水稻分子育种提供了基因资源，可根据实际育种需求调节基因SV3表达量，对植物育种与应用具有重要的理论指导与意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为SV3基因结构。
图2为SV3基因组扩增胶图。
图3为SV3基因组测序比对序列(Seq1，SV3基因组测序序列；Seq2，SV3基因组序列)。
图4为pYLCRISPR/Cas9载体构建图：A:PCR构建gRNA表达盒；B:扩增gRNA表达盒。
图5为RIF2过表达株系潮霉素标记鉴定胶图。
图6为敲除突变体CRSV3-1突变情况：A,野生型与CRSV3-1突变体靶点1突变体株系次序峰图；B,野生型与CRSV3-1突变体靶点序列比对情况；C:野生型与CRSV3-1株系SV3编码区氨基酸序列比对。
图7为敲除突变体CRSV3-2突变情况：A,野生型与CRSV3-2突变体靶点2突变体株系次序峰图；B,野生型与CRSV3-2突变体靶点序列比对情况；C:野生型与CRSV3-2株系SV3编码区氨基酸序列比对。
图8为SV3过表达载体构建：A,SV3 CDS扩增胶图；B,pHF611载体酶切胶图。
图9为过表达株系OESV3-1.OESV3-2种子胚表达量。
图10为SV3敲除株系连续七天发芽率动态折线图。
图11为SV3敲除株系活力指数统计图。
图12为SV3敲除株系发芽指数统计图。
图13为同天发芽的野生型NPB,敲除株系CRSV3-1,CRSV3-2种子连续七天发芽动态考察图；(Bar＝1cm)。
图14为SV3敲除株系七天芽长折线图。
图15为SV3敲除株系七天根长折线图。
图16为SV3过表达株系七天发芽率动态折线图。
图17为SV3过表达株系活力指数统计图。
图18为SV3过表达株系发芽指数统计图。
图19为同天发芽的野生型NPB,过表达株系OESV3-1,OESV3-2种子连续七天发芽动态考察图；(Bar＝1cm)。
图20为SV3过表达株系七天根长折线图。
图21为SV3过表达株系七天芽长折线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请水稻种子活力调控基因SV3、编码蛋白及应用进行详细说明。
实施例1
本实施例一种提高水稻种子活力的方法，通过Crispr-Ca9技术对SV3进行基因编辑，获取SV3敲除株系(以靶点1为例)，具体如下：
1、SV3基因的克隆
根据NCBI提供的关于SV3基因(位于3号染色体上，其在水稻中的基因位点编号为LOC_Os03g04110)的cDNA序列(SEQ ID NO：2)；该编码区含有1071个碱基对，编码一个含有357个氨基酸的几丁质蛋白(SEQ ID NO：3)；基因结构如图1所示。根据编码区的基因序列设计SV3扩增引物F(5’-3’):ATGGCGTCGCTCACCGCCGC(SEQ ID NO.4)；R(5’-3’):TCAAAGGAAACAGATAATGATC(SEQ ID NO.5)。扩增使用的酶为：T6Super PCRMix(1.1×)金牌Mix(Green)(目录号：TSE101)，以水稻品种ZHUN SDNA作为模板；扩增体系为25μL：模板1μL，前后引物F/R各1μL，酶22μL；PCR扩增体系为：98℃2min；98℃10S，55℃30S，72℃10S，循环35圈，终延伸72℃5min。
PCR结束后得到PCR原液进行琼脂糖凝胶电泳，称取4g的琼脂粉使用1％的TAE溶液加热溶解，加入2.5μL的核酸染料配置琼脂糖凝胶，使用北京君意的水平凝胶电泳槽进行凝胶电泳(电压150伏特，时间20min)，电泳结束后使用莫纳的凝胶成像仪器进行观察，扩增条带如图2所示，说明条带大小与公布的序列长度一致，说明扩增的是所需要的基因SV3。
2、序列对比
在国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/gene/)获取SV3基因公布的基因组序列，下载基因组序列后与扩增的PCR原液的测序结果序列(测序由生工生物有限公司完成)使用生物信息学软件BioXM2.7.1进行序列比对，序列比对结果如图3所示。
3、SgRNA的设计与合成
设计敲除目的基因SV3所需的接头引物，PAM序列选择NGG，snoRNA promoter选择Μ6，Gμide Seqμence Length选择20bp，Target Genome选择Oryza sative(MSΜ)，LocμsTag选择对应基因的登录号。选择GC含量在45％-70％，脱靶估值等于或大于0.7(或0.6)，Offtarget＜100，TSL为2或3；GSL＜＝6；CBP＜＝7；TBP＜＝12；IBP＜＝6的敲除引物，前引F为GCCG+靶点序列，后引R为AAAC+靶点序列的反向互补序列，引物序列如下：
靶点1前引物CRF-1(5’-3’):GCCG GGAGGAGCATCAGATTGTGA(SEQ ID NO.6)；
靶点1后引物CRR-1(5’-3’)：AAAC TCACAATCTGATGCTCCTCC(SEQ ID NO.7)。
靶点2前引物CRF-1(5’-3’):GCCG TTCACCTGCGCGGTGGCTTC(SEQ ID NO.8)；
靶点2后引物CRR-1(5’-3’)：AAAC GAAGCCACCGCGCAGGTGAA(SEQ ID NO.9)。
M-F/gR-R，Pps-GGL/Pgs-GGR引物序列为构建Crispr-Ca9通用引物；
M-F:CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID NO.10)；
gR-R:CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID NO.11)；
Pps-GGL(5’-3’)：TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ IDNO.12)；
Pgs-GGR(5’-3’)：AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ IDNO.13)；
之后将引物序列送至长沙擎科生物公司进行引物合成。
4、敲除载体构建
本实施例使用的载体是pYLCRISPR/Cas9双元载体系统，sgRNA中间载体pYLgRNA-OsΜ6a。采用靶点接头连接扩增法进行sgRNA表达盒构建，此详细过程如下：
(1)靶点双链接头的制备
将接头前引CRF-1(SEQ ID NO.6)和后引CRR-1(SEQ ID NO.7)在0.5×TE buffer中混合成0.5μmol/L。金属水浴锅温度为90℃，时间为30s，移至室温冷却完成退火备用。
(2)SgRNA表达盒的构建
构建体系下：
将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR程序为：
(3)第一轮PCR：sgRNA扩增
第一轮PCR的反应体系如下：
将上述反应液各组分混合均匀后，进行PCR扩增，PCR温度体系为：
通过凝胶电泳进行跑胶验证(如图4-A)，凝胶电泳方法参考SV3基因的克隆所使用的的凝胶电泳步骤；扩增条带位置为一低一高，扩增条带大小分别为284bp，629bp(产物Μ-F)(产物gRR)，即证明连接成功。确认连接成功后，取第一轮PCR产物进行第二轮PCR。
(4)第二轮PCR
取第一轮PCR产物进行第二轮PCR反应，反应体系为50μl，反应体系如下：
将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR程序为
(5)PCR产物纯化
将第二轮PCR原液使用1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳迁移实验，之后在凝胶成像仪上观察目的条带位置(如图4-B)，目的条带大小为800bp，确认条带位置正确后，将含有目的条带的凝胶回收到2.0EP管，之后使用胶回收试剂盒(NA:omega,REF:D2500-02)进行纯化回收。具体回收步骤如下：
<1>加入没过DNA片段的XP2 Binding Buffer，于50-60℃烘箱中至凝胶完全融化，每2-3min振荡混合物。
<2>取一个DNA Mini结合柱装在一个2mL收集管内。将第3步获得的DNA/熔胶液全部转移至DNA Mini结合柱中，室温下10,000xg离心1min，弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管；
<3>转移300μl XP2 Binding Buffer至结合柱，室温下12000xg离心1min，弃滤液；
<4>将DNA Mini结合柱套回2mL收集管内收集管。转移700μl SPW Buffer(已用无水乙醇稀释的)至DNA Mini结合柱中。室温下10,000xg离心1min，弃滤液；
<5>重复步骤4；
<6>将DNA Mini结合柱套回2mL收集管内收集管。室温下12000xg离心2min以甩干DNA Mini结合柱基质残余的液体。
<7>将DNA Mini结合柱装在一个干净的1.5mL离心管上，加入18μlElutionBμffer到DNA Mini结合柱的基质上，室温放置1min,12000xg离心1min以洗脱DNA。
<8>将10μl洗脱液从1.5ml离心管吸出到DNA Mini结合柱的基质上，12000xg离心1min得到所需目的条带的DNA片段。得到含有目的片段的DNA产物后备用。
(6)连接sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体
此步骤使用BsaⅠ(No.Thermo；LOT:00882417)酶切和连接的“金门”克隆方法(Gibson等开发了一种“isothermal in vitro recombination reaction”，也称为“GibsonAssembly”可进行多个PCR片段的连接(Gibson,et al.,2009；Gibson,et al.,2010；Gibson,2011))，通过“边切边连”的方法将sgRNA表达盒与双元载体pYLCRISPR/Cas9进行连接，反应体系为15μl，连接的反应体系如下：
将上述反应液混合均匀后，进行PCR扩增，PCR温度体系为
(7)连接产物转化
使用擎科大肠感受态Trelief.5α,在-80℃取出感受态细胞加入连接产物10μl，轻轻混匀(轻柔吹打或轻弹管壁数下)，冰上静置5min；42℃水浴热激45～60s，迅速转移至冰浴中，静置2min(冰上静置过程中请勿晃动样品，否则会降低转化效率)；向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌液体LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏20min(复苏时间每增加5min转化效率提高3～5倍)；取合适体积的复苏液均匀涂布到含卡纳抗生素培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。第二天挑取单菌落，加入含有卡纳抗生素的液体LB培养基进行摇菌培养，之后使用质粒提取试剂盒(NO.omega；REF:D6943-02)提取菌落质粒。质粒提取具体实验步骤如下：将带有质粒的E.coli接种于5mL LB/抗生素培养液中，37℃摇床培养12～16h；将4ml菌液分次移入2ml的离心管中，室温下10000xg离心1min收集细菌；弃滤液，加入250μlSolution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；往重悬混和液中加入250μlSolution II，轻轻颠倒混匀4-6次。(避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5min)加入350μl Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀。室温下12000xg离心10min；转移上清液至套有2mL收集管的Miniprep DNA结合柱中，室温下12000xg离心1min，弃滤液；把柱子重新装回收集管，加入500μl HBC Buffer(已加入异丙醇稀释)，室温下12000离心1min，弃滤液；将结合柱重新装回收集管，加入700μl DNA Wash Buffer(已加入无水乙醇稀释)，室温下12000xg离心1min，弃滤液；弃滤液，重复上一步；弃滤液，将结合柱重新装回收集管，12000xg离心空柱2min以甩干柱子残留液体；将结合柱装在干净的1.5mL离心管上，加入30μl Elution Buffer到柱子基质中，静置1min，13000xg离心1min洗脱出DNA；将洗脱的DNA保存在-20℃，并取10μl质粒送至湖南长沙擎科生物公司进行测序，获取正确的敲除质粒载体；
(8)载体遗传转化
以水稻日本晴为遗传受体材料，将构建好的敲除载体送至武汉伯远生物公司进行遗传转化(使用农杆菌体外浸染植物愈伤组织的方法获取转基因株系)，得到转基因阳性植株,潮霉素标记鉴定结果如图5所示，阳性率达91％。
(9)设计特异性引物鉴定突变体植株的突变类型
F(SEQ ID NO:14)：AAGCCTCTCATTCCCACCTCTC；
R(SEQ ID NO:15)：CGGCTGCACGACGTAGATG；
通过普通PCR对靶点位置进行扩增。扩增体系：扩增使用的酶为：GolT6Super PCR Mix(1.1×)金牌Mix(Green)(目录号：TSE101)，以水稻品种日本晴DNA作为模板；扩增体系为25μL：模板(突变体植株DNA)1μL，前后引物F/R各1μL，酶22μL；PCR扩增程序为：(1)98℃2min；(2)98℃10S，55℃30S，72℃10S，循环35圈；(3)终延伸72℃5min。
(10)将扩增后的PCR原液进行测序(由长沙擎科生物有限公司完成),序列比对结果发现CRSV3-1单碱基插入“A”，测序峰图以及突变后编码氨基酸序列比对结果如(图6A-C)所示；CRSV3-2单碱基插入“T”，测序峰图以及突变后编码氨基酸序列比对结果如(图7A-C)所示,两种突变类型的单碱基插入都导致SV3基因编码区蛋白翻译提前终止。
将SV3两种突变体株系种植到湖南农业大学耘园基地，正常大田土肥管理，转基因水稻种子黄熟后，收种，之后进行表型鉴定。
实施例2
本实施例一种降低水稻种子活力的方法，通过构建SV3过表达载体并转化至水稻，获得SV3过表达株系，具体如下：
1、SV3过表达引物设计合成
设计带有重组接头的引物。首先在CDS序列前后分别选择18-24bp作为基因CDS序列扩增引物，其次在过表达载体pHF611(PEXP1002锐博生物)的MCN(多克隆位点区域)选择两个酶切位点(SamΙ和BamHΙ)，在酶切位点Sam1前选择12-15bp作为前引(F)重组接头，在酶切位点BamHI后选择12-15bp反向互补后作为后引(R)重组接头，此时获得过表达引物序列，F：重组接头序列+酶切位点序列(酶切位点：SmaΙ)+CDS序列扩增引物F；R：重组接头序列反向互补序列+酶切位点序列(酶切位点：BamHI)+CDS序列扩增引物R。
过表达连接引物，OE-F:TACGCTGGATC CCCGGG ATGGCGTCGCTCACCGCCGC(SEQ IDNO.16)；OE-R:GGCCGCACTAGT AAGCTT TCAAAGGAAACAGATAATGATC(SEQ ID NO.17)。
将设计完毕的引物序列在擎科生物公司合成引物。
2、SV3过表达载体构建
本实验使用的载体是pHF611(PEXP1002锐博生物)载体，载体图谱如图7所示，使用同源重组方法构建SV3融合载体。
对日本晴的叶片组织进行取样，取样大小为3cm叶片，迅速将样品放入液氮中保存，使用Trizol提取样本RNA，RNA提取及反转录步骤如下：
<1>取水稻叶于2mL RNase-free离心管中，放入液氮速冻，用高速磨样机磨至粉末状，加入1mL Trizol提取液漩涡震荡，冰浴静置10min；
<2>向提取液中加入300μL氯仿(国药)，震荡混匀，室温静置5min，12,000g 4℃离心15min；
<3>小心吸取上清液(约400μL)至新的1.5mL RNase-free离心管中，向上清液中加入等体积预冷的异丙醇(国药)，颠倒混匀，冰上静置10min；
<4>12,000g 4℃离心10min；弃上清，加入1mL75％乙醇(国药)，颠倒数次，4℃10000g离心20S，弃上清；
<5>加入1mL75％乙醇(国药)，颠倒数次，10000g 4℃离心20S,室温晾干,去除残留乙醇；
<6>加30-40μl DEPC处理水，充分溶解RNA，核酸浓度检测仪测定总RNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后置于-80℃保存备用。
获取日本晴RNA后，将提取的RNA使用全式金EasyScript One-Step gRNA Removaland cNDA Synthesis SμperMix(REF:AE311)的试剂盒进行逆转录，得到近等基因系NILTAC8总cDNA。逆转录体系如下所示：
PCR程序设定体系，50℃15-30min，85℃5s。
(3)目的基因扩增
将逆转录获得的cDNA作为模板，使用高保真酶KOD(NO.TOYOBO；REF:KFX-101),以反转录的cDNA作为模板，无缝克隆引物OE-F:TACGCTGGATC CCCGGG ATGGCGTCGCTCACCGCCGC(SEQ ID NO.16)；OE-R:GGCCGCACTAGT AAGCTT TCAAAGGAAACAGATAATGATC(SEQ ID NO.17)为前后引，扩增SV3编码区，PCR扩增体系50μl，扩增体系如下：
将上述反应液混合后，进行PCR扩增(ETC811Plus PCR仪)，PCR程序为：
(4)过表达载体pHF611线性化
将pHF611载体使用限制性内切酶BamHl和HindⅢ(NO.NEB；REF:R0141L,R0136L)进行双酶切，酶切反应体系：限制性内切酶BamHl 1μl，HindⅢ1μl，ddH2O 39μl，PhF611质粒载体4μl，10×buffer 5μl(随酶附带)，酶切温度为37℃，酶切时间为2h 40min。
(5)线性化载体产物以及扩增片段PCR产物纯化
将扩增出来的SV3 CDS序列与酶切后的线性化载体片段的原液进行1％的琼脂糖凝胶电泳(NO.擎科生物；REF.TSJ001)，之后在凝胶成像仪(Monad凝胶成像系统QuickGel6100)上观察目的条带位置(图8A、B)，图A代表为扩增出来的SV3 CDS序列大小为1071bp；图B代表酶切后线性化的载体序列大小为8756bp；将目的位置分别位于1071bp与8756bp的条带所在胶块切下，使用胶回收试剂盒进行回收。(胶回收步骤同敲除载体构建)
(6)产物连接与转化
将目的基因片段与线性化载体按照浓度比1：3连接，连接的反应体系为20μl。连接体系如下：
将上述反应液混合，进行连接反应，连接温度体系为50℃，连接时间为1h。
产物连接完毕后，进行大肠杆菌转化，涂布LB固体平板，培养箱37℃过夜培养。(载体转化步骤同敲除载体转化)
(7)挑菌测序
挑取部分菌落至含有卡纳抗生素的LB液体培养基，摇床转速220rpm，温度为37℃，培养16h，摇至菌液浑浊后，使用质粒小提回收试剂盒提取菌液质粒(提取步骤同敲除质粒提取)，之后将质粒送至擎科测序部进行测序，筛选得到含有目的基因SV3的过表达载体。
(8)载体转化
载体构建成功后将质粒载体送至武汉伯远公司进行遗传转化，转化受体材料为日本晴。
(9)转基因植株筛选
提取成熟种子胚的RNA后反转录获得cDNA(方法同上)。设计SV3定量引物，F(SEQID NO.18):TTCATCAATCAGCGATACCTCA；R(SEQ ID NO.19)：CTGGTTTGTATGATGAGCGATG。通过qRT-PCR方法(两步法)，检测转基因株系SV3的表达量。
qRT-PCR体系：模板cDNA(稀释10倍)1μl，F(SEQ ID NO:18)0.5μl，R(SEQ ID NO:19)0.5μl，2×RealStar Fast SYBR MIX 10μl(北京康润生物公司),ddH2O 8μl。
每个样本设置三个生物学重复进行扩增。荧光定量采集的数据结果依照2-ΔΔCt法计算SV3在突变体水稻组织中的相对表达量。
选取SV3表达量显著升高的两个株系OESV3-1、OESV3-2(如图9)进行后续种子活力表型验证。
将SV3两个过表达株系种植到湖南农业大学耘园基地，正常大田土肥管理，转基因水稻种子黄熟后，收种，之后进行表型鉴定。
实施例3
本实施例对实施例1、2选取的株系进行表型鉴定。
1、SV3敲除株系种子发芽表型鉴定
1)取同一时期收获的黄熟的水稻种子，使用40℃烘箱将种子烘干，破除种子休眠后，选取50粒健康饱满的种子，在蒸馏水中浸泡24h后(每隔12h换一次水)均匀排列于已浸湿的两层发芽纸上，种子间间距约2cm，盖上一层发芽纸,卷成宽松纸卷,两端用皮筋扣住，套上半封口的透明塑料袋,置于光照培养箱(温度30℃，16h光照、8h黑暗)中，设置3次重复。
2)以胚根超过整粒种子长且胚芽超过半粒种子长为标准，在放入培养箱后，每隔24小时统计种子发芽数，连续七天考察。发芽率为第七天的发芽数除以总数的百分值。发芽指数是衡量种子萌发速度和能力的重要指标，与种子活力正相关，计算方式为每天的发芽数除以相应的天数后的总和；活力指数计算方式为种子发芽率与发芽指数的乘积。根长与芽长代表种子生物量，根长与芽长越长种子整体苗长越长，种子活力越高。
3)选取合适的时间进行拍照：
通过对野生型日本晴与SV3敲除株系CRSV3-1、CRSV3-2株系的种子进行发芽实验并观察。连续7天动态考察种子发芽表型，结果发现，CRSV3-1、CRSV3-2的种子发芽率、活力指数与发芽指数显著高于野生型(图10-12)；连续七天对同一时间萌发的突变体与野生型种子的萌发状态进行考察，根据根长与芽长的动态折线图发现：相比于野生型日本晴的种子的根长与芽长，突变体株系的种子萌发七天后有更长的根长与芽长(如图13-15)。
2、SV3过表达株系种子发芽表型鉴定
1)取同一时期收获的野生型日本晴与SV3过表达株系黄熟的水稻种子，使用40℃烘箱将种子烘干，高温破除种子休眠后，选取50粒康饱满的种子，在蒸馏水中浸泡24h(每隔12h换一次水)，之后均匀排列于已用蒸馏水浸湿的两层发芽纸上，种子间距约2cm，盖上一层发芽纸,卷成宽松纸卷,两端用皮筋扣住，套上半封口的透明塑料袋,竖直置于光照培养箱(温度30℃，16h光照、8h黑暗)中，设置3次重复。
2)以胚根超过整粒种子长且胚芽超过半粒种子长为标准，放入种子发芽培养箱后，每隔24小时统计种子发芽数，连续七天记录。
3)选取合适的时间进行拍照：通过对野生型日本晴种子与SV3过表达株系OESV3-1、OESV3-2株系的种子进行连续七天发芽实验。连续7天动态考察种子发芽表型，结果发现，OESV3-1、OESV3-2的种子发芽率、活力指数与发芽指数显著低于野生型(图16-18)；连续七天对同一时间萌发的SV3过表达株系与野生型种子的萌发状态进行考察，根据根长与芽长的动态折线图发现：相比于野生型日本晴的种子的根长与芽长，过表达株系的种子萌发七天后有更短的根长与芽长(如图19-21)。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.水稻种子活力调控基因SV3，其特征在于，所述基因SV3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
或者，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的水稻种子活力调控基因SV3在调控水稻种子活力中的应用。
3.如权利要求1所述的水稻种子活力调控基因SV3在水稻遗传育种中的应用。
4.如权利要求1所述的水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求4所述的水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用。
6.如权利要求4所述的水稻种子活力调控基因SV3的编码蛋白在水稻遗传育种中的应用。
7.一种提高水稻种子活力的方法，其特征在于，所述方法包括：
构建基因SV3敲除载体；
以所述基因SV3敲除载体对水稻进行遗传转化，获取纯合SV3突变体株系；
其中，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的一种提高水稻种子活力的方法，其特征在于，所述水稻品种为日本晴。
9.一种降低水稻种子活力的方法，其特征在于，所述方法包括：
构建基因SV3过表达载体；
以所述基因SV3过表达载体对水稻进行遗传转化，获取纯合SV3过表达株系；
其中，所述基因SV3的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求9所述的一种降低水稻种子活力的方法，其特征在于，所述水稻品种为日本晴。
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