CN1173735C - 抗-gp39抗体在狼疮及相关肾病的治疗和/或逆转中的应用 - Google Patents
抗-gp39抗体在狼疮及相关肾病的治疗和/或逆转中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
提供一种用抗-gp39抗体或片段治疗狼疮的方法。这种治疗方法已显示可逆转疾病，特别是逆转为狼疮患者主要致死原因的狼疮性肾病。
Description
相关申请
本发明涉及B细胞抗原CD40的反-受体，文献中选择性称为CD40CR、gp39或最新的CD154，以及这类受体的可溶性配体，包括至少含有一部分CD40蛋白的融合分子。这是基于，至少是部分基于对可溶性CD40/免疫球蛋白的融合蛋白可通过与辅助性T细胞膜上新的39kD的蛋白受体结合而抑制辅助性T细胞介导的B细胞的活化的发现。本发明提供大致纯的CD40CR受体；提供CD40CR的可溶性配体，包括抗-gp39抗体及其片段和至少含有一部分CD40蛋白的融合分子；并提供控制B细胞激活的方法，该方法在治疗变态反应或自身免疫性疾病中特别有用。更准确地说，本发明涉及抗-gp39抗体在系统性红斑狼疮(SLE)或药物引起的狼疮的治疗中的应用。
发明背景
Mitchison、Benacerraf和Raff的研究首次提出Th和B细胞间相互的物理性相互作用是体液免疫应答发生的基础。随后的研究证实Th与II类主要组织相容性复合体(MHC)相容性抗原-提呈B细胞形成物理缀合物(Vitetta等，Immunol.Rev.，99：193-239(1987))，在这些缀合物中B细胞应答Th(Barrett等，J.Immunol.，143：1745-1754(1989))。因为发现Th-衍生淋巴因子对B细胞的生长和分化发挥有效的影响，提出活化的Th附近释放的可溶性因子介导相互作用的B细胞的激活。然而，没有任何一种分子克隆的淋巴因子，无论是单独或结合，表现出诱导进入B细胞周期的能力。与可溶性因子不同，活化Th的浆膜部分可诱导B细胞周期进入(Hodgkin等，J.Immunol.，145：2025-2034(1990)；Noelle等，J.Immunol.，146：1118-1124(1991))。应用活化Th的纯化浆膜部分的研究提示，在活化的Th的膜上表达的一种蛋白始动体液免疫(Noelle等，J.Immunol.，146：1118-1124(1991)；Bartlett等，J.Immunol.，145：3956-3962(1990))。
已将活化Th细胞膜的纯化浆膜(PMACT)用于研究这种效应因子功能的性质(Hodgkin等，J.Immunol.，145：2025-2034(1990)；Noelle等，J.Immunol.，146：1118-1124(1991))。活化Th的PMACT而不是静息Th(PMREST)表现出以抗原非特异性、II类-非限制性方式中诱导B细胞周期进入的活性。此外，证实这种由PMACT表达的活性需要活化4-6小时、从新合成RNA，而且在本质上是蛋白质(Bartlett等，J.Immunol.，1145：3956-3962(1990))。
发明概述
本发明涉及命名为CD40CR的B细胞抗原CD40的反-受体和这一受体的可溶性配体，包括至少含有一部分CD40蛋白的融合分子。这是基于，至少是部分基于对可溶性CD40/免疫球蛋白的融合蛋白可通过与辅助性T细胞膜上新的39kD的蛋白受体(CD40的反-受体命名为“CD40CR”)结合而抑制辅助性T细胞介导的B细胞的活化的发现，以及基于命名为MR1的直接针对该39kD受体的单克隆抗体能够抑制辅助性T细胞介导的B细胞的激活的发现。
本发明提供CD40CR的可溶性配体(包括抗体)的大致纯CD40CR受体，和至少含有一部分CD40蛋白的融合分子；并提供控制B细胞激活的方法。
在本发明具体的实施方案中，通过将治疗有效量可溶性配体或CD40CR与受试者的辅助性T细胞接触而抑制受试者的B细胞的激活。对B细胞激活的这种抑制或许在变态反应或自身免疫性疾病的治疗中特别有用。
更具体地说，本发明为需要这种治疗的狼疮病受试者，如进行性系统性红斑狼疮或药物性狼疮，甚至处于疾病过程的晚期阶段(此时常观察到肾脏损害)的患者，提供治疗方法，该治疗方法为给予治疗有效剂量的抗-gp39抗体，例如公开于普通转让的美国第08/475,847号(1995年6月7日申请)中、现在已允许使用的抗-人gp39抗体或其片段。
本发明的一个优点是它可以介入抗原非特异性的免疫应答的一个方面。目前变态反应的许多疗法包括对特定抗原的脱敏疗法，都需要对每个患者进行检测以便于鉴定与过敏性有关的抗原。实际问题是，将患者对每个和每种潜在变应原作详尽分析事实上是不可能的。而且，大多数自身免疫性疾病中，病因性抗原通常是未知的甚或与疾病进程无关。涉及抗原非特异性CD40/CD40CR相互作用的本发明避免了对变态反应或自身免疫性有关的抗原的特征鉴定的需要。因此，本发明在那些免疫原未知或具有多组分免疫原的变态反应和自身免疫性疾病如枯草热、普鲁卡因酰胺所致的狼疮或系统性红斑狼疮(SLE)的治疗应用中特别具有优势。也可将其应用于急性治疗免疫激活，如过敏反应的治疗。
缩略语
Ig 免疫球蛋白
Mab 单克隆抗体
PMACT 由活化的辅助性T细胞制备的浆膜
PMREST 由静息辅助性T细胞制备的浆膜
PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
rIL4 重组白细胞介素-4
rIL5 重组白细胞介素-5
SN 上清液
Th 辅助性T细胞
Th1 指D1.6，为I-Ad-限制性兔免疫球蛋白特异性克隆
插图说明
图1.单克隆抗体和CD40-Ig通过PMACT对引导B细胞RNA合成的影响。
A组.将静息B细胞与Th1的Pmtest或PMACT一起培养。向含有PMACT的各孔中加入25μg/ml抗-CD4、抗-LFA-1或抗-ICAM-1或这些物质的复合物(每种25μg/ml)，并通过[3H]-尿嘧啶核苷的掺入测定B细胞的RNA合成。培养42-48小时后评估B细胞的RNA合成。所给出的结果为三个复孔培养物的算术平均数+/-标准差，并且代表5个这样的实验。
B组.将静息B细胞与Th1(●，▲)或Th2(□)的PMACT一起培养。向含有Th1PMACT的培养物(●，▲)的孔中加入逐渐增量的CD40-IG(▲)或对照蛋白质CD7E-Ig(φ)。向含有培养物Th2PMACT(□)的孔中加入逐渐增量的CD40-Ig。培养42-48小时后评估B细胞的RNA合成。所述结果为三个复孔培养物的算术平均数+/-标准差，并且代表3个这样的实验。
C组.将静息B细胞与LPS(50μg/ml)或PMACT一起培养。向培养物的孔中加入CD40-Ig(25μg/ml；孵化)或CD7E-Ig(25μg/ml；固体)。按A组中所述测定RNA合成。所示结果为三个复孔培养物的算术平均数+/-标准差，并且代表3个这样的实验。
图2.CD40-Ig抑制B细胞的分化和增殖
A组.将静息B细胞与PMACT、rIL4(10ng/ml)以及rIL5(5ng/ml)一起培养。在培养开始时或在培养开始后第一、第二或第三天时，加入CD40-Ig或CD7E-Ig(25μg/ml)。在培养第六天时，收集各孔SN并按Noelle等(J.Immunol.，146：1118-1124(1991))所述，用抗-同种型特异性的ELISA定量IgM(■)和IgG1(●)。在PMACT、IL4和IL5存在下(未加入CD40-Ig)，IgM和IgG1的浓度分别是IgM为4.6μg/ml和IgG1为126ng/ml。在IL4和IL5缺乏时，未测到IgM或IgG1。结果代表3个这样的实验。
B组.用抗-CD3静息或活化Th116小时，辐射后在IL4(10ng/ml)存在下，以1×104/孔与静息B细胞(4×104/培养物)一起培养。向培养物中加入从0-25μg/ml的CD40-Ig(▲)或CD7E-Ig(●)。在培养后66-72小时，用1.0μCi的[3H]-胸腺嘧啶核苷对各孔施以脉冲并收集该培养物。所述虚线表示B细胞对静息Th细胞的应答。所示结果为三个复孔培养物的算术平均数+/-标准差，并且代表2个这样的实验。
图3.CD40-Ig测定在活化Th而不是静息Th上表达的分子。收获静息和活化Th，并与融合蛋白一起于4℃孵育20分钟后，加入FITC-偶合的羊抗-hIgG(25μg/ml)。通过分析至少5000细胞/样品，测定百分率阳性细胞和MFI。结果代表6个这样的实验。CD40-Ig以实心分布图表示。
图4.CD40-Ig免疫沉淀活化Th1溶解物的39kD蛋白。用不溶性的抗-CD3静息或活化Th116小时。用纯化抗体或融合蛋白(1-10μ)免疫沉淀静息或活化Th的[35S]-标记的蛋白。所述凝胶分布图代表3个这样的实验。
图5.诱导的39kD Th膜蛋白特异性单克隆抗体抑制PMACT诱导的B细胞RNA合成。将静息B细胞和PMACT分别与各10μg/ml的抗-α/β抗-CD3、CD40-Ig或MR1一起培养。按图1所述测定RNA合成。结果以三个复孔培养物的算术平均数+/-标准差表示，并且代表3个这样的实验。
图6.MR1和CD40-Ig识别活化Th上表达的相同分子。
A组.将活化Th用MR1或对照Ig荧光染色。为评估CD40-Ig和MR1是否竞争性结合活化Th，将不同浓度梯度的MR1或对照仓鼠Ig(抗-α/βTCR)与抗-CD40(20μg/ml)一起加入到其中。于4℃孵育20分钟之后，洗涤样品品并与FITC-偶合的、抗人IgG1的单克隆抗体一起孵育。结果代表3个这样的实验。
B组.用MR1(10μg/样品)或CD40-Ig(10μg/样品)免疫沉淀[35S]-蛋氨酸-标记的活化Th的蛋白并通过PAGE和荧光自显影分离该蛋白。结果代表2个这样的实验。
图7.CD40-Ig与人细胞系的结合。将多种人T-细胞系暴露于生物素-标记的CD40-Ig，并通过流式细胞法评估其结合。
图8.
A组.Stamenkovic等的CD40 cDNA的核苷酸序列(EMBO J.，8：1403-1410(1989))。下划线为跨膜区。
B组.可用于表达CD40-Ig的质粒示意图。ΔCD40融合位点的氨基酸序列标示于以下的CD40蛋白的图解部分。
图9.
不同治疗组NZB/NZW F1小鼠所产生的抗-(ss)DNA抗体的滴度。空心环(---○---)代表用MR-1治疗的4-10月龄小鼠；空心三角(---△---)代表在发生蛋白尿后接受MR-1不发生反应的小鼠；实心方块(---■---)代表在发生蛋白尿后接受MR1发生反应的小鼠，而实心环(---●---)代表未接受治疗的小鼠。得出的数值是每组三个滴度的平均值+/-SEM。
图10.
不同治疗组的NZB/NZW F1小鼠的存活率。空心环(---○---)代表用MR1治疗的4-10月龄小鼠；空心三角(---△---)代表在发生蛋白尿后接受MR1不发生反应的小鼠；实心方块(---■---)代表在发生蛋白尿后接受MR1发生反应的小鼠，而实心环(---●---)代表未接受治疗的小鼠。
发明详述
本发明提供大致纯CD40CR受体；提供CD40CR的可溶性配体，包括抗-gp39的抗体及其片段和含有CD40的融合分子；并提供应用可溶性配体控制B细胞激活的方法。
为了公开清楚而不是限制本发明，将本发明的详细说明分成下述部分：
(i)结合CD40CR的配体；
(ii)用于鉴定CD40CR的方法；
(iii)纯化的CD40CR的制备；
(iv)结合CD40CR的配体的用途；和
(v)CD40CR的用途。
(iii)纯化CD40CR的制备；(尤其是治疗进行性狼疮，如系统性红斑狼疮或药物性狼疮)。
本发明提供CD40CR的可溶性配体，包括(i)至少含有一部分CD40蛋白的融合分子和(ii)与CD40CR特异性结合的抗体或抗体片段、或gp39、或已知所述抗原的CD154。
本文所用术语“可溶性”，表示本发明的配体并非总是与细胞浆膜结合。然而，本发明的可溶性配体可固定在非细胞性固体支持物上，包括脂质、蛋白质、或碳水化合物分子、圆珠、囊泡、磁性颗粒、纤维等，或可包埋于植入物或囊泡中。
这样的配体与CD40CR结合的能力可通过证明所述配体与CD40-Ig(如下)或MR1(如下)相同的蛋白结合、或结合CD40CR的另一种抗体(如普通转让的美国第08/475,847号中所公开的抗体)而证实。
本发明的配体可与合适的载体一起组成药用组合物。
本发明提供为CD40CR配体的可溶性融合分子。这类融合分子含有至少与第二个分子连接的一部分CD40蛋白。所述CD40部分优选缺乏CD40跨膜区。可根据本发明使用的CD40蛋白的一部分定义为能与CD40CR结合的任何部分，如显示与相同蛋白如MR1或CD40-Ig结合的部分。
可使用的第二分子包括肽类和蛋白质、脂质和碳水化合物，在本发明优选实施方案中，可以为免疫球蛋白分子或其部分(如Fv、Fab、F(ab’)2或Fab’片段)、或CD8、或其它粘附分子如B7。第二分子可得自非人类来源或人类来源，或可以是嵌合体。第二分子也可以是一种酶、毒素、生长因子、淋巴因子、抗增殖剂、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、长春花生物碱、铂配位配合物、放射性同位素或荧光化合物。
可通过化学合成或优选通过DNA重组技术生产本发明的融合分子。
例如，可将至少编码一部分CD40蛋白的核酸序列与编码第二个分子的核酸序列在合适的表达载体中组合，然后在原核或优选真核表达系统如酵母、杆状病毒或哺乳动物表达系统(包括转基因动物)中表达。
或者，至少一部分CD40蛋白可通过电泳技术或用与CD40或第二个分子结合的配体作亲和层析表达。与CD40结合的配体包括(但不局限于)抗-CD40抗体如由杂交瘤产生的G28-5(该杂交瘤保藏号为HB9110并保藏于美国典型培养物保藏中心)和CD40CR，下文将作详细说明。如果第二个分子是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，可应用含有抗-免疫球蛋白抗体的亲和层析柱；如果第二个分子含有Fc片段，可应用蛋白A柱。
根据本发明的优选实施方案，可用编码CD40蛋白(该蛋白从跨膜区域上游截断)的核酸序列生产CD40的一部分。可通过消化含有编码CD40抗原的cDNA的质粒来制备这种核酸序列，如按Stamenkovic等(EMBO J.，8：1403-1410(1989))所述，用
Pst I(P)和
Sau 3A-(S3)限制性酶消化。将所得到的P/S3片段亚克隆入用P和
Bam H I(B)消化的相同质粒中，以生产截短的CD40基因(见图8)。
在本发明非限性具体实施方案中，用于生产含有至少一部分CD40以及免疫球蛋白序列的表达载体可优选由病毒性复制起点、细菌性复制起点、细菌性选择标记、以及通过限制性内切酶位点从编码免疫球蛋白恒定区的DNA序列中分离的真核启动子和增强子序列组成，后接多聚腺苷酸信号序列，所述限制性内切酶位点可允许亚克隆编码至少一部分CD40的DNA序列(见图8.b)。
在本发明特定实施方案中，可将截短的CD40基因亚克隆到免疫球蛋白的融合质粒中，如Aruffo等所述(Cell，61：1303-1313(1990))，用
MIu I和B消化，构建pCD40-Ig质粒，该质粒编码融合分子CD40-Ig(见图8)。然后可通过将pCD40-Ig质粒转染至COS细胞，形成瞬时表达系统而产生CD40-Ig融合蛋白。自COS细胞上清液收集所产生的CD40-Ig，并按Aruffo等，Cell，161：1303-1313(1990)所述经蛋白A柱层析进行纯化。
本发明的可溶性配体优选包括抗体分子、单克隆抗体分子、或含有与CD40CR(gp39)(优选人gp39)结合的抗原结合位点的这些抗体分子的片段。这类配体还可含有第二个分子，该分子可是蛋白质、脂质、碳水化合物、酶、毒素、生长因子、淋巴因子、抗增殖剂、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、长春花生物碱、铂配位配合物、放射性同位素或荧光化合物并且可与所述抗体分子或片段连接。
当所述配体是单克隆抗体或其片段时，可应用任何能提供由细胞系连续培养而产生抗体分子的技术制备抗CD40CR(gp39)的单克隆抗体。例如，由Kohler和Milstein首先研制的杂交瘤技术(1975，Nature，256：495-497)以及近来可用的其它技术，如人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，1983，Immunology Today，4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症的治疗，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)第均在本发明范围内。通常优选人源化或嵌合型抗-gp39抗体，因为它们在给药后不易引起免疫原性应答(HAMA应答)。
可通过已知技术产生含有独特型所述分子的抗体片段。例如，这类片段包括但不局限于：F(ab’)2片段，它可通过应用胃蛋白酶处理所述抗体分子产生；Fab’片段，它可通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生；F(ab’)2片段，它可通过应用木瓜蛋白酶处理所述抗体分子产生；以及2Fab或Fab片段，它们可通过应用木瓜蛋白酶和还原二硫键的还原剂处理所述抗体分子产生。
如上所述，本发明也提供通过本领域已知的技术产生的嵌合体或人的抗体，如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：6851-6855(1984)或欧洲专利申请第85305604.2号、公布第0173494号(Morrison等，1986年3月5日公布)中所述的技术。
用于产生抗体的免疫原可以是含CD40CR的任何来源。例如，活化的Th，如可将活化的人Th细胞用作免疫原。此外，可应用按下述5.3部分所述制备的大致纯CD40CR。如果将活化的Th用作免疫原，可测试抗血清的抗活化Th细胞而不是静息Th细胞的反应性。
所述免疫原也可包括重组gp39或其片段。在这点上，已用重组方法克隆并表达编码鼠和人gp39的DNA。这些蛋白质为抗-gp39抗体的产生提供潜在的免疫原。
在本发明的优选实施方案中，所述可溶性配体是抗-人gp39单克隆抗体，更优选人源化或嵌合型抗-人gp39抗体。将下述方法用于产生MR1单克隆抗体，该抗体特异性地与鼠gp39结合，并可用来产生针对CD40CR的其它抗体。
将5-106活化的Th1细胞(D1.6)每隔一周腹腔注射，持续6周免疫仓鼠。当抗鼠Th1的血清滴度大于1∶10,000时，采用免疫仓鼠的脾细胞和NSI，用聚乙二醇进行细胞融合。用流式细胞仪在静息和活化Th1上从含有生长的杂交瘤的孔中筛选上清液。进一步测试一种产生选择性识别活化Th的单克隆抗体的具体杂交瘤，并将其亚克隆以衍生出MR1。在腹水中产生MR1并通过离子交换高压液相层析纯化。
此外，更优选根据美国第08/475,847号制备抗-人gp39抗体，该文献通过引用整体结合到此处。
本发明也提供包括单克隆抗体或其片段的配体，该单抗或其片段能够竞争性抑制MR1与其靶抗原或CD40-Ig与其受体的结合。
可通过(i)CD40CR结合CD40、至少含有一部分CD40的融合分子和诸如MR1的抗体的能力；(ii)CD40CR能够刺激B细胞进入细胞周期、增殖和分化的功能特性；以及(iii)CD40CR的细胞分布来鉴定CD40CR。
可通过CD40CR结合诸如CD40、含有CD40的融合分子以及针对CD40CR的抗体的配体的能力鉴定CD40CR。
如下文更详细的讨论，将几种技术用于鉴定CD40CR。例如，证实CD40-Ig和MR1能识别同样的39kD分子。发现CD40-Ig和MR1二者均可从放射性标记的Th溶解物中免疫沉淀39kD蛋白质(图5b)。此外，39kD蛋白质与CD40-Ig的免疫沉淀去除了由MR1从Th溶解物中识别的抗原。
还可用CD40CR刺激B进入细胞周期、增殖和分化能力鉴定CD40CR。
例如，发现活化的(PMACT)而不是静息的(PMREST)Th细胞浆膜(PM)可诱导B细胞的RNA合成(图1a)；指示B细胞的活化的该诱导作用不受抗体如抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1的影响。然而，如图1b和图6所示，发现CD40-Ig或MR1能够抑制PMACT-诱导的B细胞活化。
可通过诸如[3H]-尿嘧啶核苷掺入RNA(如B细胞分化，RNA合成增加)或通过[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入(测定与细胞增殖有关的DNA合成)技术测定B细胞活化的诱导作用。为获得CD40CR对B细胞增殖的影响的最佳测定，可以约10ng/ml浓度将白细胞介素-4(IL4)加入到培养基中。
此外，可根据免疫球蛋白分泌的功能测定B细胞的活化。例如，可将CD40CR(大致纯形式，或存在PM中，或反之)与IL4(10ng/ml)和IL5(5ng/ml)一起加入到静息B细胞中。培养3天后，可加入额外体积的培养基。在培养的第6天时，收集各培养物的上清液(SN)并按照Noelle等所述(J.Immunol.，146：1118-1124(1991))测定IgM和Ig1的量。
也可通过CD40CR的细胞分布鉴定CD40CR。例如，根据流式细胞仪测定，观察到CD40-Ig与活化而非静息Th1结合(图3)。而且，观察到CD40-Ig与Jurkat细胞、HSB2细胞和人外周血中的活化T细胞的结合，但未表现出明显的与CEM细胞、HPBALL细胞、或鼠thyoma细胞的结合。
例如，并不是限制，可如下通过流式细胞仪评价存在于特定细胞类型(“测试细胞”)上的CD40CR。可用静息(阴性对照)和活化(阳性对照)Th细胞平行测试受试细胞。所有细胞以约1×105细胞/50μl的浓度与配体(如CD40-Ig或MR1)在4℃培养20分钟，然后加入FITC-偶合的抗-配体的抗体。可在所有样品中加入终浓度为2μg/ml的碘化丙锭。然后在例如BD FACSCAN上进行流式细胞仪分析。在正向门控细胞前向散射与侧向散射后，红色为阴性(因为碘化丙锭排阻)，可确定活细胞的绿色荧光对数。
本发明提供大致纯CD40CR。可通过下述方法，由携带CD40CR的细胞如活化的辅助性T细胞、Jurkat和HSB2细胞制备这种CD40CR。
可按照Noelle等所述(J.Immunol.，146：1118-1124(1991))，通过不连续蔗糖梯度的沉降作用，从合适的细胞如活化的Th1细胞，制备细胞浆膜。然后可通过以下方法分离CD40CR：用温和去污剂抽分离膜粗提取物，之后进行尺寸排阻层析，再后用结合到固体支持物上合适配体(如MR1或CD40-Ig)进行亲和层析、免疫沉淀(如用CD40-Ig或MR1)和/或凝胶电泳。
可以预期所产生的蛋白质的分子量约为39kD。
本发明提供可溶性CD40CR(即无细胞)，该可溶性CD40CR可包含在与合适的载体一起组成的药用组合物中。它更进一步提供与第二个分子结合的CD40CR，所述第二个分子可以是肽、蛋白质、脂类、碳水化合物、酶、毒素、生长因子、淋巴因子、抗增殖剂、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、长春花生物碱、铂配位配合物、放射性同位素或荧光化合物。
本发明进一步提供通过化学合成或DNA重组技术制备的大致纯CD40CR。例如，可通过将从活化的辅助性T细胞制备的cDNA插入到λgt10表达系统中，然后用MR1或CD40-Ig结合筛选，以鉴定CD40CR-表达克隆，从而分离出CD40CR的基因。或者，可将从活化的辅助性T细胞制备的cDNA转染到COS细胞中，用MR1或CD40-Ig筛选转染细胞的上清液，鉴定CD40CR产物。然后可应用本领域已知的表达系统将CD40CR的基因用于表达CD40CR。
本发明提供利用与CD40CR结合的配体控制B细胞激活的方法。具体地讲，它提供抑制B细胞激活的方法，包括将B细胞和Th细胞的混合物暴露于与CD40CR结合的有效浓度配体。在前面5.1部分对可应用的配体已有说明。可以在体外或体内实施本发明的方法。有效浓度指能抑制B细胞激活的配体的浓度，可用本领域已知的任何技术(包括前述5.2部分所述技术)测定，至少约30％，优选约75％。根据本发明优选的、特定的非-限制性实施方案，可将CD40-Ig用作配体，在此情况下有效浓度可以至少是约10μg/ml。在本发明的另一个具体的非-限制性实施方案中，可应用MR1单克隆抗体，在该情况下有效浓度可以至少是约10μg/ml。如果在体内实施所述方法，配体的有效浓度指配体的血浆浓度或局部浓度。例如，最好是在局部区域抑制B细胞的激活，以便于限制对整个免疫系统的影响。
在具体的实施方案中，本发明提供治疗患有与B细胞激活有关的疾患的受治疗者的方法，包括对受试者给予治疗量的与CD40CR结合的配体。受试者可以不是人类或优选人类。
与B细胞激活有关的疾患包括但不局限于变态反应(包括过敏症)；自身免疫性疾病，包括药物性狼疮、系统性红斑狼疮、成人类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、硬皮病、Sjogren氏综合征等；以及涉及B细胞的病毒性疾病，包括EB病毒(Epstein-Barr)感染和包括人类免疫缺陷病毒感染的逆转录病毒感染。
由于已提出B细胞激活与诱发潜伏期人类免疫缺陷病毒复制有关，最好是将本发明的所述配体给予那些还未发展为艾滋病(AIDS)或ARC的人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性个体。
如上所述，及在下述实施例中，特别优选使用抗-gp39抗体或其片段，包括其在药物性狼疮或系统性红斑狼疮中的应用。如下述实施例的基本数据和实验所证实，已发现所述抗-gp39抗体的治疗减少了自身抗体的产生和减轻肾病，并使NZB/NZW(公认的人类SLE的动物模型)存活期延长。
此外，在蛋白尿2-3+的小鼠(活动性狼疮状态)中进一步证实，给予抗-gp39抗体竟然逆转病情(证据是给予抗体后生存期延长和无蛋白尿)。因此，在公认的人类狼疮的动物模型发生肾病后，用抗-gp39抗体治疗显示，逆转狼疮病进程。这证实在治疗狼疮和其它自身免疫性疾病中，抗-gp39抗体用于人类的治疗用途的可能性。特别是它证实了可将这类抗体用于治疗活动性进行性疾病、甚至处于疾病晚期阶段的患者。这种治疗将有效地治疗甚至可能逆转疾病进程如狼疮患者常见的肾损害。
在合适的药用载体中，可通过本领域已知的任何方法给予配体，包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射、鞘内注射、关节内注射或肌肉注射，以及口腔、鼻内、眼内和直肠给药，并且其可微球体、脂质体和/或缓释植入物中。
将配体的治疗量定义为可显著减轻B细胞激活或T细胞活化的临床有害影响的量，并且可随所用的配体和所治疗而变化。如果应用CD40-Ig，则无论是系统(血浆浓度)或局部治疗浓度可以为约10μg/ml。如果应用MR1或其它抗-gp39抗体，如人源化或嵌合型抗-人gp39抗体或其片段，则无论是系统(血浆浓度)或局部治疗浓度可以是约10μg/ml。
在本发明的进一步的实施方案中，上述方法可利用含有毒素或抗代谢剂的配体，这样将杀死Th细胞或使其受损，因为破坏Th细胞使得增加B细胞激活。
也可用本发明的配体来标记活化的T细胞，是一种可用于T细胞疾病的诊断的技术。为此，可将含有酶、放射性同位素、荧光化合物或其它可检测标记的配体体外或体内暴露于T细胞，测定所述结合量。
也可将本发明的配体用于传递活化T细胞的物质如生长因子。
本发明提供利用CD40CR或含CD40CR的分子控制B细胞激活的方法，所述CD40CR或含CD40CR的分子是按照前述方法制备。具体地说，提供促进B细胞激活的方法，包括将B细胞暴露于有效浓度的CD40CR。可在体内或体外实施该方法。有效浓度指诱导B细胞激活的受体的浓度，可通过本领域已知的任何技术测定，至少约30％。在本发明特定的、非限制性实施方案中，局部或系统的CD40CR浓度可为约10μg/ml。
在具体的实施方案中，本发明给患有与体液免疫减弱有关的免疫缺陷疾病的受试者提供治疗方法，包括给予受试者治疗量的CD40CR。受试者可以不是人类，但是优选人类。
与体液免疫减弱有关的免疫缺陷疾病包括获得性免疫缺陷，如由化疗或放射治疗导致的，以及涉及到体液免疫的遗传性疾病。
在合适的药用载体中，可通过本领域已知的任何方法给予CD40CR，包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射、鞘内注射、关节内注射或肌肉注射，以及口腔、鼻内、眼内和直肠给药，并且它可包含在微球体、脂质体、和/或缓释植入物中。
CD40的CD40CR治疗量定义为可至少增加产生约30％免疫球蛋白的量。
在进一步的实施方案中，可将CD40CR偶合到毒素上，给予处于优选破坏表达CD40的B细胞的情况下的受试者。这种情况的实例包括接受器官移植或患有多发性骨髓瘤或其它B细胞恶性肿瘤或自身免疫病的患者。
也可将CD40CR用于标记表达CD40的B细胞，为一种可用于B细胞疾病的诊断的技术。为此，将与酶、放射性同位素、荧光化合物或其它可检测标记结合的受体体外或体内暴露于B细胞，并测定所述结合的量。
也可用CD40CR将与其结合的分子传递给B细胞。
实施例1
活化的辅助性T细胞上的新型受体CD40CR结合CD40并转导B细
胞关联性激活信号
材料和方法
动物
将雌性DBA/2J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)用于制备填料细胞(filler cell)以支持Th克隆的生长，并用于制备静息B细胞。
D 1.6为一种I-Ad-限制性的兔免疫球蛋白-特异性Th1克隆(Kurt-Jones等，J.Exp.Med.，166：1774-1787(1987))，得自David Parker博士(University of Massachusetts，Worcester)。D 1.6在本文称为Th1。
按照Noelle等(J.Immuno.，146：1118-1124(1991))所述，将Th1(8×106/孔)于簇集孔(6孔板，Corning，NY)中培养，该板各孔已用抗-CD340μg/4ml PBS包被16小时。
按照Noelle等(同上)所述，通过不连续蔗糖梯度沉降制备细胞浆膜。
按照Defranco等(J.Exp.Med.，155：1523(1982))所述，通过在不连续珀可(Percoll)梯度沉降制备静息脾B细胞。从70-75％(密度为1.087-1.097)珀可的界面分离的细胞通常＞95％mIg+，具有均匀、低度接近前向的光散射并且对Con A不应答。
用离子交换HPLC从小鼠(该小鼠经过辐射并且骨髓业已重建)腹水中纯化下述单克隆抗体：抗-CD3：145-2C11(Leo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：1374-1378(1987))；抗-α，β：H57-597；抗-CD4：GK1.5(Wilde等，J.Immunol.，131：2178-2183(1983))；抗-ICAM：YN1/1.7.4(Prieto等，Eur.J.Immunol.，19：1551-1557(1989))；抗-LFA-1：FD441.8(Sarmiento等，Immunol.Rev.，68：135(1982))；以及抗-大鼠/仓鼠κ链：RG-7(Springer，Hybrid.，1：257-273(1982))。
通过用限制性酶
Pst I(P)和
Sau 3A(S3)消化质粒制备CD40的融合蛋白，该质粒含有编码CD40抗原的cDNA(Stamenkovic Seed，EMBO J.，8：1403-1410(1989))。将这一P/S3片段亚克隆到同样的质粒中，该质粒用P和
Bam
H1(B)消化。允许制备编码从跨膜结构域上游截断的CD40蛋白质的CD40Δ。然后将编码CD40Δ的DNA片段亚克隆到该免疫球蛋白融合质粒中(Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990))，用
MIu I和B消化。按照Aruffo等所述(Cell，61：1303-1313(1990))，通过瞬时转染到COS细胞中产生所述CD40-Ig融合蛋白并将其在蛋白A柱上纯化。
白细胞介素4(IL4)：重组鼠IL4由C.Maliszewski和K.Grabstein博士慷慨提供(Immunex Corporation，Seattle，WA.)。
白细胞介素5(IL5)：重组鼠IL5购自R&D研究所(Sarrento，CA.)。
将3×104静息B细胞在A/2微量滴定板孔(Costar，Cambridge，MA)中培养于50μl cRPMI中。向这些孔中，加入0.5μg Th1或Th2膜蛋白。在42-48小时，各孔用2.5μCi 3H-尿嘧啶核苷(New England Nuclear，Boston，MA)施以脉冲，收集各孔，并通过液体闪烁分光术测定放射活性。所述结果以cpm/培养物+/-标准差表示。
如上所述培养静息B细胞。向培养孔中，加入0.5μg Th1膜蛋白、IL4(10ng/ml)和IL5(5ng/ml)。培养第三天，加入另外的50μl cRPMI。培养第六天，收集各孔的上清液并按Noelle等(J.Immunol.，146：1118-1124(1991))所述，测定IgM和IgG1的量。
将4×104静息B细胞在A/2微量滴定板孔(Costar，Cambridge，MA)中培养于50μl cRPMI中。向这些孔中，加入1×104静息或活化、辐射的(500拉德(rad))Th1和IL4(10ng/ml)。培养第三天，按照Noelle等在J.Immunol.，
146：1118-1124(1991)中所述，各孔用1μCi 3H-胸腺嘧啶核苷脉冲处理。
将5-10×104活化的Th1(D1.6)隔周腹腔注射，持续免疫仓鼠6周。当抗鼠Th1的血清滴度大于1∶10,000时，采用免疫仓鼠的脾细胞和NSI，用聚乙二醇进行细胞融合。用流式细胞仪在静息和活化Th1上筛选含有生长的杂交瘤的孔的上清液。进一步测试一种能产生选择性识别活化Th的单克隆抗体的特定杂交瘤，并将其亚克隆以衍生MR1。在腹水中产生MR1并通过离子交换HPLC纯化。
收集静息和活化Th(与抗-CD3一起16小时)并以1×105细胞/50μl与融合蛋白在4℃培养20分钟，然后加入FITC-偶合的羊抗-人(h)IgG(25μg/ml；Southern Biotechnology，Birmingham，AL)。在所有样品中加入碘化丙锭至终浓度为2μg/ml。在BD FACSCAN上进行流式细胞分析。在正向门控细胞前向散射与侧向散射后，红色为阴性(因为碘化丙锭排阻)，可确定活细胞的绿色荧光对数。
阳性细胞百分率和MFI的测定至少要分析5,000存活细胞。用MR1染色利用FITC-偶合的RG7，为小鼠抗-大鼠/仓鼠κ链的单克隆抗体。
用不溶性抗-CD3静息或活化Th1 16小时。用1mCi[35S]-甲硫氨酸/半胱氨酸标记静息和活化Th(20×106/ml)的蛋白质1小时，此时如所述(Noelle等，(1986)J.Immunol.，
137：1718-1726)，将其用含10％胎牛血清的RPMI洗涤两次并在抽提缓冲液中溶解所述细胞沉淀。向500μl的溶解物(相当于5×106细胞)中加入纯化的抗体或融合蛋白(1-10μg)于4℃作用16小时。此时，将溶解物移至含有50μl填充蛋白A-琼脂糖的试管中。将沉淀蛋白A-琼脂糖重新悬浮并将试管于4℃振荡孵育1小时。然后用3×高严格性洗涤缓冲液洗涤样品。将沉淀的蛋白A-琼脂糖重新悬浮于30μl的SDS样品缓冲液中，并在10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。在电泳凝胶后，固定所述凝胶并进行荧光自显影。
为确定所述细胞表面分子，该分子介导由PMACT诱导进入B细胞周期，向PMACT和B细胞的培养物中加入针对Th膜蛋白的单克隆抗体。PMACT诱导B细胞的RNA合成是用PMREST观测的8倍(图1a)。单独或以结合形式加入抗-LFA-1、抗-CD4、抗-ICAM-1，都不能抑制由PMACT引起的B细胞RNA合成。
在人类体系中，已证实抗-CD40的单克隆抗体诱导B细胞增殖(Clark和Lane，(1991)Ann.Rev.Immunol.9：97-127)，因此暗示CD40是B细胞的重要触发分子。为测定CD40是否参与由PMACT引起的B细胞RNA的合成，将人CD40的细胞外结构域和人IgG1(CD40-Ig)的Fc结构域的可溶性融合蛋白加入到PMACT和B细胞的培养物中。制备从Th1和Th2衍生的PMACT并将其用于刺激B细胞RNA的合成。CD40-Ig加入培养物导致对B细胞RNA合成的剂量依赖性的抑制，由Th1和Th2衍生的PMACT引起，而CD40-Ig约为5μg/ml。而CD7E-Ig融合蛋白(Damle和Aruffo，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88：6403-6407(1991))甚至当应用25μg/ml时仍无作用。
为研究CD40-Ig是否抑制由T-非依赖性活化剂引起的B细胞的激活，在有LPS和CD40-Ig存在下培养B细胞。第二天，评定RNA合成(图1c)。CD40-Ig对由LPS引起的B细胞激活无抑制作用，但抑制B细胞对PMACT的应答。
在PMACT、IL4和IL5存在时，B细胞多克隆性分化产生Ig(Hodgkin等，(1990)J.Immunol.
145：2025-2034；Noelle等，(1991)J.Immunol.146：1118-1124)。为评价这一过程中对CD40信号的需要，在培养初始、或在培养的随后数天加入CD40-Ig。在培养初始CD40-Ig的加入(图2a)与其缺乏时的对照水平相比，其对产生多克隆IgM和IgG1的抑制大于95％。与此相反，在培养的第一天和第二天CD40-Ig的加入则表明，其对IgM和IgG1的产生的抑制作用即使有的话，也是极微小的。这些数据表明24小时后，通过CD40发出的信号对于B细胞的分化分泌Ig不再是必需的。
因此，数据进一步提示了CD40参与了PMACT引起的B细胞的激活。为证实CD40也和由完整、存活、活化的Th引起的B细胞的激活有关，进行了研究。用不溶性抗-CD3激活Th1 16小时，收集并辐射所述Th1。在IL4存在下，将该辐射过的Th1与B细胞一起培养并在培养第三天检测B细胞的增殖。用Th1达到B细胞增殖时需要外源性的IL4，因为Th1不产生IL4(Noelle等，(1989)J.Immunol.143：1807-1814)。与用PMACT的观察相同，CD40-Ig以剂量依赖性方式抑制由辐射过的Th引起的B细胞的增殖(图2b)。其阴性对照，CD7E-Ig未显示明显作用。
为观察活化的Th1是否表达对CD40的结合蛋白，将静息和活化的Th1(16小时)用CD40-Ig或CD7E-Ig染色，随后用FITC-抗-HigG。通过流式细胞仪法评估CD40-Ig的结合(图3)。将用抗-CD3激活16小时的Th1，而非静息Th1，用CD40-Ig而不用对照的CD7E-Ig染色，阳性率56％。为鉴定该CD40-Ig结合蛋白，将Th1蛋白质用[35S]-甲硫氨酸/半胱氨酸生物合成性标记并用CD40-Ig或CD7E-Ig免疫沉淀蛋白质。将该免疫沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分离并荧光自显影(图4)。一条显著带的表观分子量为39kD和一条低分子量的带是β2微球蛋白。在缺少单克隆抗体时，则看不到显著的带。也可从用125I向量(vectorially)标记的活化Th中免疫沉淀39kD带，证实所述39kD蛋白质是膜蛋白。
研制了针对在活化Th上而不在静息Th上选择性表达的抗原的特异性单克隆抗体，用以鉴定引起Th效应阶段活性的Th分子。一种这样的单克隆抗体MR1，识别在活化Th1上选择性表达的抗原。为研究MR1和CD40-Ig是否识别相同的分子，进行了流式细胞学和阻断研究。活化的而不是静息的Th细胞，其CD40-Ig和MR1的染色分别大约为56％和61％(图5a)。MR1，但不是另一仓鼠抗-T细胞单克隆抗体抗α/βTCR，以剂量依赖性方式阻断活化Th细胞与CD40-Ig的染色。这些数据提示CD40-Ig和MR1识别39kDTh蛋白上的重叠或同一表位。为进一步证实CD40-Ig和MR1识别相同的分子，通过从放射标记的Th溶解物中免疫沉淀蛋白质，鉴定结合MR1的所述抗原。CD40-Ig和MR1两者均免疫沉淀39kD的蛋白质(图1.5b)。最后，39kD蛋白质与CD40-Ig的免疫沉淀去除了由来自活化Th的放射标记的溶解物中的MR1识别的抗原，支持所述MR1抗原和CD40结合蛋白质是相同的这一原则。
用MR1进行功能性研究，以阐明这一单克隆抗体是否中和由PMACT表达的活性。将PMACT和B细胞单独、或在仓鼠单克隆抗体或CD40-Ig存在下培养。两种仓鼠单克隆抗体，抗α/βTCR和α-CD3不能抑制由PMACT引起的静息B细胞的激活。与此相反，MR1或CD40-Ig抑制B细胞激活(图6)。
所述数据显示用单克隆抗体阻断突出的Th表面分子(LFA-1、CD4、ICAM-1、CD3、α/βTCR)不妨碍活化Th诱导进入B细胞周期的能力。与此相反，特异性针对CD40结合蛋白的CD40-Ig或单克隆抗体，以剂量依赖性方式阻断T-依赖性B细胞的激活。而且，所述CD40结合蛋白被鉴定为是在活化而非静息的Th膜上选择性表达的39kD的蛋白质。特异性针对所述39kD CD40结合蛋白的CD40-Ig和单克隆抗体二者均阻断由PMACT引起的B细胞的激活。
尽管许多膜蛋白与Th-依赖性B细胞发送信号有关，但此处提供的证据排除了某些分子(LFA-1、CD4、CD3、α/βTCR、ICAM-1)的作用，暗示CD40作为B细胞受体用于由Th关联发送信号。数据显示特异性针对CD40结合蛋白的CD40-Ig和单克隆抗体抑制Th-依赖性B细胞的激活。
CD40的配体是表达于活化的、而非静息的Th上的39kD的蛋白质。生化研究指出，该39kD蛋白质是一单链分子，因为电泳的迁移不受还原剂的影响。根据在该研究中提供的功能性研究，活化的Th1和Th2二者均表达所述39kD CD40结合蛋白。这与所述功能性研究是一致的，所述研究显示Th1和Th2二者均诱导B进入细胞周期。在试图进一步鉴定所述39kD蛋白质的特征时，将编码分子量范围为39kD的CD蛋白质(Cd53、CD27和CD69)的cDNA瞬时转染到COS细胞中并测试所述细胞的CD40-Ig的结合。没有一个转染细胞表达结合CD40-Ig的蛋白质。因此猜测该39kD蛋白质不是这类CD蛋白质中的一种。
在Th和B细胞间传导信号的生化基础是令人难以捉摸的。对作为辅助性T细胞传导信号的分子的CD40的鉴别，引起对已知偶合于CD40分子的特异性生化途径的关注。借助于其胞外区域的4个富含半胱氨酸的基元的存在，CD40成为神经生长因子受体(NGFR)家族的一员。已表明单克隆抗体通过CD40发送信号(Uckun等，J.Biol.Chem.266：17478-17485(1991))参与酪氨酸激酶的激活，结果增加了肌醇三磷酸的产生和至少4个独特的丝氨酸/苏氨酸激酶的激活。基于从所述NGF受体家族其它成员发送信号中获得的信息，预期活化Th和B细胞间的相互作用将在同一生化过程许多环节中产生作用。
关于免疫荧光结合研究，用生物素-琥珀酰亚胺(Sigma)将CD40 Ig融合蛋白与生物素偶合。然后通过用藻红蛋白(PE)-链霉亲和素(Becton-Dickinson)的二步染色法和Coulter Epics C仪器进行流式细胞学分析。筛选多个T细胞系的代表结果在下面提呈。发现Jurkat和HSB2细胞系特异性地结合，而其它T细胞系包括CEM、HPBALL和小鼠thyoma则不与CD40 Ig融合蛋白结合(图7)。
实施例2
用于治疗或预防狼疮的抗gp39抗体的应用
系统性红斑狼疮(SLE)是一种特征为产生多种致病性自身抗体(Boumpas，Ann Int Med，1995)的疾病。这些抗体直接通过识别正常细胞上的抗原决定簇或间接通过免疫复合物的形成而引起损害，所述免疫复合物可沉积于正常组织中并激活补体级联系统。
如同正常的抗体应答一样，目前从对近亲交配的小鼠品系的SLE和类-狼疮病的研究中已了解清楚，狼疮B细胞自身抗体的产生依赖于CD4+的辅助性T(Th)细胞的协同作用。实施例来自于传统的SLE小鼠模型的研究，该模型为在许多方面(包括自身抗体的产生和免疫复合物性肾小球肾炎的发生)与人SLE相似的NZB/NZW的雌性后代病鼠。用给小鼠减少抗-CD4抗体的治疗方法阻止并确实逆转了肾炎。不幸的是，从治疗的角度来说，对人类自身免疫性疾病甚至是抗-CD4抗体的短暂性治疗试验，也可在某些病例中引起该重要的淋巴细胞的亚群的长期衰竭。而且抗-CD4抗体在诸如类风湿性关节炎的疾病中的小规模临床试验中的功效令人失望。
更特异性的免疫抑制是切实可行的，因为鉴定了参与Th细胞辅助的数种分子相互作用，使得可以仅靶向提供积极参与为抗体产生提供帮助的Th细胞。一个实例是通过Th细胞上的CD28/CTLA4和B细胞上的B7.1/B7.2之间的相互作用传递第二信号。针对此二者的任何一个参与者的阻断抗体可在体外使T细胞低应答。当给予NZB/NZW小鼠甚至疾病晚期病鼠时，目前含有小鼠细胞外结构域CTLA-4与小鼠Ig Cg2a链结合的融合蛋白显示出可阻断自身抗体的产生，据推测是在所治疗小鼠中通过竞争性抑制B7.2与内源性CTLA-4的结合发挥作用。
实验结果
我们在NZB/NZW鼠中研究了给予抗-CD40L抗体对4到10月龄SLE小鼠的效应。抗-CD40L抗体的治疗显著减少了这些小鼠的抗-DNA自身抗体的产生，缓解了肾病并延长了生存期，在治疗小鼠中未引发抗-抗体应答或容易引起明显的体液免疫系统的损害。这些数据包含于图6中。在11月龄时，60％的抗-CD40L抗体治疗的小鼠仍然存活，而不是未治疗或Hig治疗的小鼠(图9)。对抗-CD40L抗体治疗后的长期存活者的肾组织学检查显示微不足道的病理变化并且在肾小球没有明显的免疫沉积。
获得的数据也提示，抗-CD40L抗体疗法可避免两个主要的使用抗-淋巴细胞的细胞表面分子的抗体的免疫疗法顾虑：发生抗-抗体应答和治疗后长期免疫抑制。在我们的一组实验(cohort)中，对抗-CD40L抗体治疗有效、在11个月时存活的小鼠未发生抗-抗体应答，在接受另一种属来源抗体的动物中几乎是一固定现象。我们推测这是由于抗-CD40L抗体防止了针对自身的抗体的产生。在用相同的抗-CD40L抗体MR-1处理的正常小鼠研究中，未观察到抗-MR-1的应答，提示我们在NZB/NZW小鼠上观察到的应答可能代表一种局限于自身免疫性小鼠的特别的超敏反应。总之，这个观察对于抗-人CD40L抗体的治疗性应用具有重要意义，因为用抗-CD40L抗体特别是用“人源化”型抗体治疗避免抗体治疗的严重并发症。在我们的研究中，发生抗-抗-CD40L抗体应答的小鼠在其抗-DNA抗体的产生或生存方面并不比对照小鼠好，提示无论如何，抗-CD40L抗体不能防止该类小鼠的产生抗体防。抗-抗-CD40L抗体的产生可导致快速清除随后给予的抗-CD40L抗体，并因此失去治疗疗效。为支持该观点，当用非特异性仓鼠IgG处理小鼠时，在抗-CD40L抗体处理无反应小鼠亚群的肾小球中鉴定发现仓鼠抗体沉积，而抗-CD40L抗体应答者则无此现象。这一观察与抗-抗-CD40L抗体免疫复合物在连续给予抗-CD40L抗体的肾脏中的形成和沉积是一致的，这可能使肾小球肾炎恶化而非预防。
最后，证实随着用抗-CD40L抗体治疗的停止，至多4个月后抗-KLH抗体应答能力恢复，确立所述抗体对体液免疫系统的免疫抑制作用是潜在可逆的，因此抗-CD40L抗体的治疗法适用于人类治疗的应用。
在这些实验中，将200μg的MR-1每周两次腹腔注射给予4-10月龄NZB/NZW小鼠。同样，通过将MR-1剂量增加到250μg，每周三次，腹腔注射4到10月龄小鼠的治疗方案，实现治疗。将这个剂量用于胶原蛋白-引起的类风湿性关节炎模型，导致治疗小鼠100％存活(Durie，Science，1993)。应用这一方案，现在所述NZB/NZW小鼠在11月龄时都100％存活(图10)，而小鼠的两个对照组在10月龄时全部死亡。
确定狼疮疾病的治疗
尽管目的是用抗-gp39抗体防止NZB/NXW F1小鼠的SLE，但是并没有预示可将这一抗体用于介入活动性进展性疾病状态。为测定是否可用抗体治疗而逆转所确立的疾病，使一组小鼠发展到用尿测验片测定有2-3+蛋白尿(相当与100mg/天到500mg/天)。此时，将小鼠随机分组为继续不治疗组或接受MR1(100μg/天)组。所述10只未治疗小鼠在10月龄时全部死亡。与此相对照，10只MR-1治疗小鼠中的5只存活至11月龄。其中3只小鼠健康且无蛋白尿。然而，有趣的是，这些小鼠中有1只未出现高-滴度的抗-DNA抗体(表1)。5只存活鼠中有2只表现出疾患并具高滴度的抗-DNA抗体和4+蛋白尿。
因此，发现在肾病发生后用MR1治疗可逆转部分小鼠的疾病。在1只应答小鼠中发现用MR1治疗逆转了蛋白尿，但未逆转抗-DNA抗体的产生，进一步增加了MR1发挥着不同于消除T-依赖性抗体产生的其它机理的可能性。
同样，用肿瘤坏死因子(TNF-α)治疗NZB/NZW小鼠也显示能显著延缓肾炎的发展(Jacob，Science，1988；Gordon，1989)。令人感兴趣的是，在NZB/NZW F1小鼠中观察到的重型肾炎，部分是由于自NZW亲代获得的定位于H-2复合体上的显性基因。所述NZW小鼠具有降低的TNF-α水平，该水平与位于H-2复合体中的TNF-α基因的多态性有关。所述NZB/NZW F1小鼠也具有显著降低的TNF-α的水平。此外，用抗-IL-10抗体治疗的NZB/NZW F1小鼠基本上延迟了肾炎的发生并延长了存活期。当与抗-TNF-α抗体联合治疗时，在治疗小鼠中出现由IL-10-诱导的TNF-α水平上调介导的有益作用，消除了抗-IL-10应答。
在初步实验中，我们也用ELISA测定了小鼠TNF-α的水平，该小鼠分别为给予前和给予后MR-1的4个治疗组。所述水平示于表2。根据蛋白尿和抗-DNA抗体产生的降低，仅有对MR-1治疗应答的小鼠证实了TNF-α从治疗前的2.16pg/ml增加到治疗后的35.01pg/ml。这些数据提示所述MR-1效应至少可部分通过NZB/NZW F1小鼠的TNF-α的增加介导。
此外，这些结果都证实利用抗-gp39抗体和其活性片段用于治疗人类狼疮病即系统性红斑狼疮或药物引起的狼疮。特别是，可将这些抗体用于特征常表现为肾炎的活动性、进行性狼疮的治疗介入中。这类抗体应抑制所述疾病的进程，甚至有逆转病程的可能性。
表1
年龄 MR1治疗 治疗后 缓解 用MR1 持续时间 治疗后
(月) (周) 蛋白尿 (周) 再治疗 (周) 蛋白尿
7 13 +4 N/A N/A - -
9 6 0 0 无 - -
6 6 0 12 无 - -
5 6 0 11 有 6(0) 0
8 1 死亡 - - - -
6 18 死亡 - - - -
6 6 0 9 有 3(+4) +4
6 6 死亡 - - - -
7 5 死亡 - - -
6 2 死亡 - - -
表2.
| 小鼠* | 所采样品的年龄(mos.) | TNF-α(pg/ml)# |
| 未治疗 | 2 | 5.5 |
| 9 | 3.1 | |
| MR-1存活 | 2 | 2.2 |
| 9 | 35.0 | |
| MR-1死亡 | 2 | 0.0 |
| 8 | 4.3 |
*每一治疗组的1只小鼠。
#值表示用TNF-αELISA试剂盒(Genzyme，Cambridge，MA)测定的复份的平均值。
本文引述的多种公开出版物通过引用整体结合到本文中。
Claims (10)
1.有效量的至少一种特异性结合CD40L的抗体或其片段在生产用于使患有表现为蛋白尿的狼疮患者的蛋白尿减轻的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述药物也用于使肾炎缓解。
3.权利要求2的用途，其中所述药物也用于逆转肾脏病。
4.权利要求1的用途，其中所述抗体或其片段的剂量范围为10μg/ml-1000μg/ml。
5.权利要求1的用途，其中所述患者处于表现为肾脏损害的狼疮晚期阶段。
6.权利要求1的用途，其中所述抗体或其片段结合人CD40L。
7.权利要求1的用途，其中所述药物与可溶性CD40或可溶性CD40融合蛋白共同给予。
8.权利要求1的用途，其中所述抗体为抗人CD40L抗体。
9.权利要求1的用途，其中所述药物用于缓解或减轻与狼疮相关的肾脏病，但是不会阻断抗DNA抗体的产生。
10.权利要求1的用途，其中所述药物用于使TNF-α产生增加。
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