CN117368498B - 一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。本发明的校准品的稳定性较好，能够长期贮存，并且不存在EDTA配制的校准品与已上市的IMA试剂定标时的基质效应，检测结果更为准确，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用。

背景技术

缺血修饰白蛋白(Ischemia Modified Albumin，IMA)是人血清白蛋白(humanserum albumin，HSA)在心肌缺血的情况下转化而来的心肌缺血标志物之一。人血清白蛋白的氨基末端序列为人类所特有，是钴、铜和镍等过渡金属离子的结合位点。正常白蛋白与过渡金属的结合能力较强。在心肌缺血时，血流减少导致组织供氧不足并且pH值降低，形成超氧自由基和过氧化氢。在铜或铁等金属的存在下，过氧化氢会发生芬顿反应(Fentonreaction)，形成羟基自由基。羟基自由基具有高活性，能够改变白蛋白分子氨基末端的氨基酸。氨基末端改变后的白蛋白不能与金属离子结合。这种在缺血过程中产生的不能与金属离子结合的白蛋白被称为缺血修饰白蛋白。

心血管疾病是全球一大死亡原因，每年夺走约1790万人的生命。急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是临床上常见的心血管疾病，其是指冠状动脉内不稳定的粥样斑块破裂或糜烂引起血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征。心肌缺血的表现是多种多样的，如胸痛、上腹不适、呼吸困难、恶心呕吐等。然而，这些症状可能是微妙且不容易识别。由于症状表现多样，发病急且死亡率高，因此对急性心肌梗死患者的早期诊断至关重要。

近年来，缺血标志物有了快速的发展。传统的心肌缺血标志物，如肌红蛋白(Myo)、肌钙蛋白(cTn)和肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的特异性和敏感性较好，但它们在心肌细胞损伤发生约3-6小时后才显示出明显的上升，这时患者已受到了不可逆的病理损伤。缺血修饰白蛋白是美国食品药品监督管理局(FDA)认可的第一个检测心肌缺血的生化标志物，其对ACS患者心肌缺血检出灵敏度是心电图(ECG)的2倍、肌钙蛋白(cTn)的4倍。与传统心肌缺血标志物不同，IMA在心肌缺血发作5-10分钟后血中浓度即可升高，于2-6小时达峰值，12-24小时基本恢复正常。因此IMA可用于评价早期可逆性心肌缺血并对ACS的早期诊断、指导治疗、改善患者的预后和减少死亡率等方面具有重要的临床意义。

目前，IMA的检测方法主要为白蛋白钴结合试验(Albumin Cobalt Binding Test，简称ACB法)间接法。利用IMA结合过渡金属Co²⁺能力减弱的性质进行定量测定。血清样本中白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，Co²⁺即可与白蛋白结合，而溶液中剩余的游离Co²⁺与二硫苏糖醇反应生成红褐色产物。由于IMA含量与颜色程度呈正比，在505nm处检测吸光度，可间接对IMA进行定量测定，通过特殊配制的校准品定标后，并直接以IMA形式报告结果。

ACB间接法测定IMA的结果受人血清白蛋白和缺血修饰白蛋白的稳定性影响较大。传统方法利用血清基质和缺血修饰白蛋白作为制备校准品的原料，但经证明，人血清白蛋白和缺血修饰白蛋白在血清基质中都非常不稳定，在2-8℃环境存储条件下，放置一个月，测值降低20％左右，因此也给存储和冷链运输方面带来很大的压力。公开号为CN109557322A的中国专利公开了一种利用EDTA螯合剂来配制校准品的方法，相较于传统方法的血清校准品更高效稳定且简易，同时降低了成本。但这种利用EDTA配制的校准品与已上市的IMA试剂定标时会存在基质效应，严重影响测试结果。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用，对现有技术中的校准品的配方进行改进，获得的校准品的稳定性较好，能够长期贮存，并且不存在EDTA配制的校准品与已上市的IMA试剂定标时的基质效应，检测结果更为准确，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

进一步的，所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、Emulgen 1118s-70、聚苯乙烯交联二乙烯苯、聚氧乙烯月桂醚、Triton X-405、吐温80、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种。

进一步的，所述稳定剂为亚麻酸乙酯、油酸甲酯、硫酸钠、氯化钙、甲基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、牛血清白蛋白、二甲基亚砜、甘油中的任意一种或多种。

进一步的，所述缓冲液为哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)缓冲液、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙烷磺酸)缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液中的任意一种，所述缓冲液的pH值为7.0-9.0。

进一步的，所述防腐剂为叠氮化钠、对羟基苯甲酸钠、Proclin 200、Proclin300、Proclin 950、山梨酸钾中的任意一种或多种。

进一步的，所述校准品的原料包括1-500mM缓冲液、0.05-50mM螯合剂、0.01-2％表面活性剂、0.1％-10％稳定剂和0.05％-1％防腐剂。

进一步的，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠。

进一步的，所述校准品为水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3，所述水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3具有不同的螯合剂的浓度。

本发明还提供一种检测缺血修饰白蛋白的方法，所述方法采用螯合剂作为校准品的主要原料，所述螯合剂为为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的标准品；

优选的，所述试剂盒还包括试剂R1和试剂R2；

其中，所述试剂R1的组分包括氯化钴；

所述试剂R2的组分包括二硫苏糖醇。

本发明还提供一种如上述的校准品和/或上述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，其中的螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种，并添加了表面活性剂和稳定剂，得到的校准品一方面相较于传统血清基质校准品的稳定性更好，其能够在长途冷链运输中稳定储存，另一方面相较于EDTA螯合剂校准品，其不存在基质效应，避免了基质效应对测试结果的影响，使用该校准品检测缺血修饰白蛋白，其检测灵敏度高、特异性强、成本低，可实现对缺血修饰白蛋白(IMA)的准确检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为对比例1和20份新鲜临床样本的检测结果的直线回归图；

图2为实施例1和20份新鲜临床样本的检测结果的直线回归图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

本发明实施例提供一种缺血修饰白蛋白校准品，所述校准品的原料包括缓冲液、螯合剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

其中，校准品中的螯合剂为上述的物质，并添加了表面活性剂和稳定剂，得到的校准品一方面相较于传统血清基质校准品的稳定性更好，其能够在长途冷链运输中稳定储存，另一方面相较于EDTA螯合剂校准品，其不存在基质效应，避免了基质效应对测试结果的影响，使用该校准品检测缺血修饰白蛋白，其检测灵敏度高、特异性强、成本低，可实现对缺血修饰白蛋白(IMA)的准确检测。

具体的，所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、Emulgen 1118s-70、聚苯乙烯交联二乙烯苯、聚氧乙烯月桂醚、Triton X-405、吐温80、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的任意一种或多种。

具体的，所述稳定剂为亚麻酸乙酯、油酸甲酯、硫酸钠、氯化钙、甲基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、牛血清白蛋白、二甲基亚砜、甘油中的任意一种或多种。

具体的，所述缓冲液为哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)缓冲液、哌嗪-N,N'-双(2-羟基丙烷磺酸)缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液中的任意一种，所述缓冲液的pH值为7.0-9.0。

具体的，所述防腐剂为叠氮化钠、对羟基苯甲酸钠、Proclin 200、Proclin 300、Proclin 950、山梨酸钾中的任意一种或多种。

具体的，所述校准品的原料包括1-500mM缓冲液、0.05-50mM螯合剂、0.01-2％表面活性剂、0.1％-10％稳定剂和0.05％-1％防腐剂。

优选的，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠。

具体的，所述校准品为水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3，所述水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3具有不同的螯合剂的浓度。

本发明实施例还提供一种检测缺血修饰白蛋白的方法，所述方法采用螯合剂作为校准品的主要原料，所述螯合剂为为二乙烯三胺五乙酸五钠、羟乙基乙二胺三乙酸三钠盐、酒石酸钠和柠檬酸钙中的任意一种和多种。

本发明实施例还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的标准品；

优选的，所述试剂盒还包括试剂R1和试剂R2；

其中，所述试剂R1的组分包括氯化钴；

所述试剂R2的组分包括二硫苏糖醇。

本发明实施例还提供一种如上述的校准品和/或上述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。

以下结合具体实施例说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。

实施例1

校准品水平试剂1的配方如表1。

表1

序号	校准品水平试剂1	浓度
			1	3-吗啉丙磺酸	5mM
2	二乙烯三胺五乙酸五钠	2mM
			3	硫酸钠	2mM
4	亚麻酸乙酯	0.50％
			5	叠氮化钠	0.5％
6	壬基酚聚氧乙烯醚	0.35％

校准品水平试剂2的配方如表2：

表2

校准品水平试剂3的配方如表3：

表3

序号	校准品水平试剂3	浓度
			1	3-吗啉丙磺酸	5mM
2	二乙烯三胺五乙酸五钠	2.7mM
			3	硫酸钠	2mM
4	亚麻酸乙酯	0.50％
			5	叠氮化钠	0.5％
6	壬基酚聚氧乙烯醚	0.35％

实施例1校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3的配制方法为按表1、表2和表3中配方中各原料的浓度对应量取缓冲液(3-吗啉丙磺酸)、称取各原料，将原料依次加入缓冲液中，混合后加入纯化水，调节pH值到8.5，从而得到实施例1校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3。

对比例1

校准品水平试剂1的配方如表4：

表4

序号	校准品水平试剂1	浓度
			1	3-吗啉丙磺酸	5mM
2	乙二胺四乙酸二钠·2H2O	3.6mM
			3	NaCl	2mM
4	甘油	0.50％
			5	叠氮化钠(防腐剂)	0.5％

校准品水平试剂2的配方如表5：

表5

序号	校准品水平试剂2	浓度
			1	3-吗啉丙磺酸	5mM
2	乙二胺四乙酸二钠·2H2O	11.5mM
			3	NaCl	2mM
4	甘油	0.50％
			5	叠氮化钠(防腐剂)	0.5％

校准品水平试剂3的配方如表6：

表6

序号	校准品水平试剂3	浓度
			1	3-吗啉丙磺酸	5mM
2	乙二胺四乙酸二钠·2H2O	4.8mM
			3	NaCl	2mM
4	甘油	0.50％
			5	叠氮化钠(防腐剂)	0.5％

对比例1校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3的配制方法为按表4、表5和表6中配方中各原料的浓度对应量取缓冲液(3-吗啉丙磺酸)、称取各原料，将原料依次加入缓冲液中，混合后加入纯化水，调节pH值到8.5，从而得到对比例1校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3。

基质效应评估：

利用两家不同的上市公司IMA试剂盒和配套校准质控组成的检测系统，分别命名为评估方法和比对方法。将实施例1的校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3、对比例的校准品水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3以及20份新鲜临床样本随机穿插排列，分别使用评估方法和比对方法测定所有样品，重复测定3次，每批每个样本测定1次，每批测定都校准。评估方法与比对方法同步进行。

计算方法：

利用以上方程，将比对方法测定均值作为x值，计算每个制备样本的y值的95％置信区间，如果评估方法的测定均值落在该区间内，说明该制备样本对评估方法无基质效应；如果评估方法的测定均值在该95％置信区间外，说明该制备样本对评估方法有基质效应。

其中对比例1和20份新鲜临床样本的检测结果如表7：

表7

表7中的结果进行直线回归，见图1。

按上述方法进行基质效应评估，结果见表8：

表8

实施例1和20份新鲜临床样本的检测结果如表9：

表9

表9中的结果进行直线回归，见图2。

按上述方法进行基质效应评估，结果见表10：

表10

从上述表格和图1-2的实验结果进行分析得出，对比例1的三个水平试剂均有基质效应存在，而实施例1配制的三个水平试剂均无基质效应，说明采用本发明方法配制的校准品解决了IMA检测试剂与EDTA螯合剂校准品在测试过程中存在的基质效应的问题。

稳定性评估：

利用某上市公司IMA试剂盒和配套校准质控组成的检测系统对三批实施例1制备的校准品进行测定，校准品分别在2-8℃和-20℃环境保存，然后在第1天、3天、7天、14天、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月的时候分别用该上市公司IMA试剂盒检测系统测定一次浓度，结果如表11和表12。

表11

表12

从表11和表12可看出，实施例制备的校准品在2-8℃和-20℃的存储条件下均可保存至少一年，稳定性强，解决了冷链运输过程中稳定保持以及实际应用中校准品的准确性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品的原料包括5mM缓冲液、0.05-50mM螯合剂、0.35％表面活性剂、0.5％稳定剂和0.5％防腐剂，

所述缓冲液为pH值7.0-9.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液，所述螯合剂为二乙烯三胺五乙酸五钠，所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚，所述稳定剂为亚麻酸乙酯，所述防腐剂为叠氮化钠。

2.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品为水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3，所述水平试剂1、水平试剂2和水平试剂3具有不同的螯合剂的浓度。

3.一种利用如权利要求1所述的校准品检测缺血修饰白蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用螯合剂作为校准品的主要原料，所述螯合剂为为二乙烯三胺五乙酸五钠。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-2中任一项所述的校准品；

所述试剂盒还包括试剂R1和试剂R2；

其中，所述试剂R1的组分包括氯化钴；

所述试剂R2的组分包括二硫苏糖醇。

5.一种如权利要求1-2中任一项所述的校准品和/或权利要求4所述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。