CN117347621B - 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用蛋白模拟抗原‑纳米抗体检测黄曲霉毒素B1的方法。所述方法为以绿色荧光蛋白作为模拟抗原用于黄曲霉毒素B1的检测。这一方法使用蛋白质替代AFB1‑BSA等偶联物作为抗原进行检测，其中eGFP作为模拟抗原的检测IC50值低，明显优于AFB1‑BSA，能够更好地满足检测要求。此外，使用的蛋白质可以通过原核表达体系进行大规模表达纯化，容易获得、成本低，能够更好地满足AFB1环保、低成本和高灵敏检测的需求。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
酶联免疫分析技术(ELISA)是一种常用于分子检测的方法，其原理是利用抗原和抗体的特异性结合识别待测分子，通过进一步的酶促反应产生的信号来定量检测溶液中特定物质。这种方法具有很强的特异性，和较高的敏感度高。酶联免疫分析技术可以用于检测大分子和小分子，包括蛋白质、抗体、激素和药物等。根据种类和变化可分为夹心法、间接法、竞争法等。
酶联免疫分析技术是目前黄曲霉毒素B1(AFB1)大规模筛查的常用手段。传统的酶联免疫分析技术检测AFB1的原理是，首先，在酶标板上包被一层特AFB1和牛血清白蛋白BSA等蛋白偶联得到的抗原(AFB1-BSA)，将待测样品或标准品加入到孔板中，允许样品或标准品中的AFB1与固定在孔板上的抗原与特异性识别AFB1的单克隆抗体竞争结合，通过洗涤，将未结合的抗体去除，加入酶标二抗识别单克隆抗体，洗涤并通过酶促反应进行检测，最后根据标准曲线和待测样品的检测数值计算样品中的AFB1含量。这一传统的方法步骤繁琐，需要使用多种商业化抗体，成本高且假阳性率较高。
为了解决传统酶联免疫分析技术的缺陷，人们研发了一步法生物发光酶联免疫分析技术，这一技术使用在原核体系中融合表达的特异性纳米抗体-纳米荧光素酶复合物替代传统的单克隆抗体和酶标二抗，步骤简单，成本低且灵敏度更高。然而，这些方法中都需要用到AFB1与其他蛋白如BSA的偶联物(AFB1-BSA)作为抗原进行包被。以AFB1-BSA为例，获得这一抗原需要首先制备高纯度的AFB1，然后通过化学试剂如碳二亚胺进行活化，并与BSA在适当的条件下进行反应而得到。这一制备过程复杂，成本高，且需要使用AFB1作为成分，AFB1本身是对环境和人类极具危害的化学品，具有强致癌性。
发明内容
针对这一缺陷，我们发明了一种基于蛋白模拟抗原-纳米抗体作为核心试剂，检测AFB1的方法。
本发明的第一个目的是提供绿色荧光蛋白在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
优选地，所述绿色荧光蛋白为sfGFP或eGFP，所述sfGFP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述eGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的方法，是以绿色荧光蛋白作为模拟抗原用于黄曲霉毒素B1的检测。
优选地，是以绿色荧光蛋白作为模拟抗原，与纳米荧光素酶-纳米抗体组合用于黄曲霉毒素B1的检测。
优选地，所述绿色荧光蛋白与纳米荧光素酶-纳米抗体特异性结合。
优选地，所述绿色荧光蛋白为sfGFP或eGFP，所述sfGFP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述eGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述纳米荧光素酶-纳米抗体为Nluc-NB28，所述Nluc-NB28的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，包括以下步骤：以绿色荧光蛋白作为检测抗原，在包被有所述检测抗原的固相载体中加入待测样品以及纳米荧光素酶-纳米抗体，充分反应后洗涤，加入荧光底物，测定生物发光强度，根据发光强度值计算黄曲霉毒素B1的含量。
本发明的第三个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其是以绿色荧光蛋白作为检测抗原，以纳米荧光素酶-纳米抗体作为检测抗体。
本发明的第四个目的是提供上述的方法或上述的试剂盒在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
本发明的优点：
这一方法使用蛋白质替代AFB1-BSA等偶联物作为抗原进行检测，其中eGFP作为模拟抗原的检测IC50值低，明显优于AFB1-BSA，能够更好地满足检测要求。此外，使用的蛋白质可以通过原核表达体系进行大规模表达纯化，容易获得、成本低，能够更好地满足AFB1环保、低成本和高灵敏检测的需求。
附图说明
图1是不同纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白酶活性测试及以GFP作为模拟抗原的结合测试。
图2是以GFP作为模拟抗原建立生物发光酶联免疫分析方法检测AFB1及其与AFB1-BSA作为抗原的比较。
具体实施方式
为实现本技术发明，本发明采用如下技术方案：
从NCBI数据库或文献查找相应的氨基酸序列，根据氨基酸设计DNA序列，交由基因合成公司进行合成。通过基因工程的方法生成绿色荧光蛋白(GFP)、纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白(Nluc-NB28)表达质粒，基于上述蛋白，建立基于GFP蛋白模拟抗原的生物发光酶联免疫分析方法用于检测AFB1。同时通过基因工程的方法生成单独纳米荧光素酶Nluc及多种纳米荧光素酶与抗AFB1纳米抗体的融合蛋白(G8-Nluc,Nluc-NB26)，并用于与Nluc-NB28的比较分析，鉴定Nluc-NB28在分析AFB1中的特异性。
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。
实施例1：表达载体的构建
上述目的片段的DNA序列如下：
绿色荧光蛋白sfGFP如SEQ ID NO.7所示，绿色荧光蛋白eGFP如SEQ ID NO.8所示，
Nluc-NB28如SEQ ID NO.9所示，Nluc-NB26如SEQ ID NO.10所示，G8-Nluc如SEQID NO.11所示，Nluc如SEQ ID NO.12所示。
上述序列均由商业公司(苏州硅基生物科技有限公司)合成，并使用BamH1和Ecor1酶切位点将基因插入PET.M.3C载体(苏州硅基生物科技有限公司，货号Pet.M.3C：G080-2)，以获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养16小时，得到生长均匀的单菌落。挑取单克隆分别在50ml培养基进行37℃过夜培养，采用Pet.M.3C载体通用引物T7和T7-ter对单克隆进行菌落PCR验证，得到阳性克隆后提取质粒，进行测序验证。经测序验证后的重组质粒用于后续实验。
实施例2：目的蛋白质表达
S1.将测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21感受态细胞。取1μL重组质粒加入感受态细胞，冰浴30分钟左右，然后于42℃热激90秒，再冰浴5分钟。
S2.加入200μL含amp(100μg/mL，下同)抗性LB培养基，220rpm、37℃培养一小时左右，将菌液涂于相应抗性的LB培养基平板，37℃恒温培养箱过夜培养。
S3.挑取抗性平板上状态较好的单菌落接种于5mL含amp抗性的LB培养基中，220rpm、37℃过夜培养。将培养后的菌液转接到1L含amp抗性的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD约为0.6-0.8。4-8℃静置一段时间将培养基冷却至16℃，加入IPTG诱导蛋白表达(LB培养基IPTG终浓度约0.3mM)，220rpm、16℃诱导表达18小时。
实施例3：目的蛋白质纯化
S1.诱导后的菌液，4000rpm离心15min，弃上清，菌体用25-30mLbinding缓冲液重悬(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM Imidazole,pH 7.9)。
S2.在重悬后的菌液中加入通用型蛋白酶抑制剂150μLPMSF(100mM溶于异丙醇)，超声波20KHz,130W，超声5s停5s，共15分钟破碎菌体。
S3.4℃，15000rpm离心破碎后的菌体30分钟，将离心后的上清和沉淀分别跑胶来确定蛋白是否可溶。
S4.将第3步得到的上清倒入置于4℃的Ni亲和柱中，充分搅拌混合均匀后，每隔10分钟再搅拌混匀使蛋白与亲和柱充分结合，总结合时间约半个小时。
S5.结合一段时间后流下上清液，用binding缓冲液冲洗亲和柱2次
S6.用5-10mL elution缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,1M Imidazole,pH7.9)洗脱10分钟并收集洗脱液。
S7.通过凝胶过滤层析(AKTA蛋白纯化仪，HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱)进一步纯化蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况。
S8.将高纯度的目的蛋白组分使用3KDa超滤管浓缩备用。
实施例4：不同纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白酶活性测试
S1.缓冲液配置
S2.底物配置：250μg的coelengterazine-H(CTZ-h)用613μL的溶剂(85％甲醇，15％甘油)溶解成终浓度1mM的母液。
S3.显色液配置(100μL)
S4.不同纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白酶活性测试
纯化得到Nluc-NB28、Nluc-NB26、G8-Nluc，将三种纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白使用PBS稀释至0.1nM、1nM、10nM、100nM以50μl/孔加入酶标板中，后加入CTZ-h底物显色液，加入50μl/孔，酶标仪测定生物发光强度随浓度的变化情况。
酶活测定结果表明由低到高浓度的蛋白荧光值具有相对应的趋势，因此判定Nluc-NB28、Nluc-NB26、G8-Nluc和Nluc蛋白具有良好的酶活性(图1)。
实施例5：以GFP作为模拟抗原包被，测定纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白的结合
(1)不同GFP变体结合比较
用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置模拟抗原0μg/mL GFP(对照组)、5μg/mL sfGFP和5μg/mL eGFP(实验组)分别包被在96孔板上，各孔100μL，放置4℃过夜结合。次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％(m/v，下同)脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h。PBST洗五次，各加入50μLPBS和50μL的4μM、1μM、0.1μM、0μM Nluc-NB28蛋白，之后将孔板放置在37℃进行结合30分钟，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号强度。
(2)不同抗体的结合比较
用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置模拟抗原5μg/mL sfGFP、5μg/mL eGFP包被在96孔板上，各孔100μL，放置4℃过夜结合。次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h。PBST洗五次，各加入50μL PBS和50μL的4μM、3μM、2μM、1.5μM、1μM、0.4μM、0.1μM、0μM的Nluc(对照组)、Nluc-NB28、G8-Nluc或Nluc-NB26蛋白(实验组)，之后将孔板放置在37℃进行结合30分钟，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号强度。
(3)结果
实验结果如图1所示，结果表明sfGFP和eGFP均能够与Nluc-NB28特异性结合，与G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc不结合。
实施例6：以GFP作为模拟抗原包被，使用纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白检测AFB1
用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置模拟抗原5μg/mL sfGFP、5μg/mL eGFP和5μg/mLAFB1-BSA(对照)分别包被96孔板，各孔100μL，放置4℃过夜结合。次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h。PBST洗五次，分别加入50μL 100ng/mL、75ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mLAFB1标准品，随后加入50μL Nluc-NB28蛋白，之后将孔板放置在37℃进行结合30分钟，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号强度随不同浓度的AFB1标准品变化情况。
结果表明两种GFP和Nluc-NB28的组合均能用于AFB1的检测，其中eGFP作为模拟抗原的检测IC50值低，为0.482ng/mL，明显优于AFB1-BSA，能够更好地满足检测要求(图2)。
SEQ ID NO.1(绿色荧光蛋白superfold GFP,sfGFP)
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSEQ ID NO.2(绿色荧光蛋白enhanced GFP,eGFP)
MTSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSEQ ID NO.3(纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白Nluc-NB28)
VFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGSGGSGGSGGSMQLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYTDSVKGRFTINRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGFWSGNYYRTPDYWGQGTQVTVSSLESEQ ID NO.4(纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白Nluc-NB26)
VFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGSGGSGGSGGSMQLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAVVNWSGRRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYNCAAGKWDGSYYGAPDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAGSEQ ID NO.5(纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白G8-Nluc)
MAQLQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTGTIYGMGWFREAPGKEREFVATLWWTVGAPYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCALDNRRSYVDYHSVSEYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDAASGAEFAAARVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAVDKLAAALESEQ ID NO.6(纳米荧光素酶Nluc)
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILASEQ ID NO.7(sfGFP核苷酸序列)
ATGTCCAAAGGTGAAGAACTGTTTACTGGCGTTGTTCCGATTCTGGTTGAACTGGACGGCGACGTTAACGGTCACAAGTTCAGCGTTCGTGGTGAAGGTGAGGGTGACGCGACCAACGGCAAACTGACTCTGAAATTCATCTGTACCACCGGTAAACTGCCGGTTCCATGGCCGACTCTGGTGACTACCCTGACCTACGGCGTACAGTGCTTCAGCCGTTATCCGGACCATATGAAACGTCACGATTTCTTCAAAAGCGCAATGCCGGAGGGTTATGTCCAGGAACGTACTATCAGCTTCAAAGATGACGGTACTTATAAAACCCGTGCGGAAGTTAAATTCGAAGGTGATACTCTGGTGAATCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTCAAAGAGGATGGCAACATCCTGGGCCACAAACTGGAATACAATTTTAACTCCCATAACGTGTACATCACCGCGGACAAACAGAAAAACGGCATCAAAGCTAACTTCAAAATCCGTCACAACGTTGAAGATGGTTCTGTGCAGCTGGCTGACCACTATCAGCAGAACACTCCTATCGGTGATGGTCCGGTTCTGCTGCCGGATAACCACTACCTGTCCACCCAGTCCGTTCTGAGCAAAGACCCTAACGAAAAACGTGACCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTAACCGCGGCTGGCATCACTCACGGTATGGATGAACTGTATAAGSEQ ID NO.8(eGFP核苷酸序列)
ATGACTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTCAAGGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAASEQ ID NO.9(Nluc-NB28核苷酸序列)
GTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGGCGGTAGCGGTGGCTCTATGCAACTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAAGCAGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGTGCTGCTTCTGGTCGCACCTTCTCCAGCTACGCAATGGGTTGGTTCCGTCAAGCACCAGGTAAAGAACGTGAGTTCGTTGCAGCTATCTCCTGGAGCGGTGGTTCCACTTATTATACTGATTCCGTTAAAGGCCGTTTCACTATCAACCGCGACAACGCTAAAAACACCGTATATCTGCAGATGAACTCCCTGAAACCGGAAGATACTGCTGTGTACTATTGCGCGGCTGGCTTCTGGTCTGGTAACTACTACCGTACCCCGGACTACTGGGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTGTCCAGCCTGGAASEQ ID NO.10(Nluc-NB26核苷酸序列)
GTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGGCGGTAGCGGTGGCTCTATGCAGCTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAAGCTGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCATCCGGTCGTACTTTCTCTTCTTACGCGATGGGCTGGTTCCGTCAGGCTCCTGGTAAAGAACGTGAATTTGTTGCGGTGGTTAACTGGAGCGGTCGTCGTACCTACTACGCAGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCTCGTGATAACGCAAAAAATACCGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCCGTTTACAACTGCGCTGCTGGCAAATGGGATGGTAGCTACTACGGCGCACCAGATTATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTTACCGTCTCCTCTGAACCTAAAACCCCGAAACCTCAGGACGGTCAGGCAGGTSEQ ID NO.11(G8-Nluc核苷酸序列)
ATGGCTCAGCTGCAGCTGGTAGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAAGCTGGCGATTCTCTGCGCCTGTCCTGTGCTGCGTCTGGTCGTACCGGCACCATTTACGGTATGGGTTGGTTCCGTGAAGCTCCGGGCAAGGAACGTGAGTTCGTGGCTACCCTGTGGTGGACCGTTGGTGCTCCGTACTACGCGGACTCCGTGAAAGGTCGTTTCACGATCTCCCGTGACAACGATAAAAACACCGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCTACCTACTACTGCGCCCTGGACAACCGCCGCAGCTACGTAGACTATCATTCCGTGTCCGAATATGACTACTGGGGTCAGGGTACTCAGGTTACCGTGTCCTCTGAACCGAAAACCCCGAAACCGCAGGATGCAGCTTCCGGTGCCGAATTTGCTGCAGCTCGTGTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGTGGATAAACTGGCAGCGGCGCTGGAASEQ ID NO.12(Nluc核苷酸序列)
ATGGTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCG
Claims (5)
1.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，以绿色荧光蛋白作为模拟抗原用于黄曲霉毒素B1的检测，绿色荧光蛋白作为模拟抗原，与纳米荧光素酶-纳米抗体组合用于黄曲霉毒素B1的检测，所述绿色荧光蛋白为sfGFP或eGFP，所述sfGFP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述eGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述纳米荧光素酶-纳米抗体为Nluc-NB28，所述Nluc-NB28的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿色荧光蛋白与纳米荧光素酶-纳米抗体特异性结合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以绿色荧光蛋白作为检测抗原，在包被有所述检测抗原的固相载体中加入待测样品以及纳米荧光素酶-纳米抗体，充分反应后洗涤，加入荧光底物，测定生物发光强度，根据发光强度值计算黄曲霉毒素B1的含量。
4.一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于，以绿色荧光蛋白作为检测抗原，以纳米荧光素酶-纳米抗体作为检测抗体，所述绿色荧光蛋白为sfGFP或eGFP，所述sfGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述eGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述纳米荧光素酶-纳米抗体为Nluc-NB28，所述Nluc-NB28的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1所述的方法或权利要求4所述的试剂盒在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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