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CN117337304A - 抗pd1抗体和抗ctla4抗体的联合 - Google Patents

抗pd1抗体和抗ctla4抗体的联合 Download PDF

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CN117337304A
CN117337304A CN202280029409.9A CN202280029409A CN117337304A CN 117337304 A CN117337304 A CN 117337304A CN 202280029409 A CN202280029409 A CN 202280029409A CN 117337304 A CN117337304 A CN 117337304A
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CN
China
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hctla4
mixture
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CN202280029409.9A
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刘智
威廉·C·范斯洛
阎炜
大卫·L·特雷伯
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Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corp
Original Assignee
Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corp
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Abstract

本发明提供了包含抗hCTLA4抗体和抗hPD1抗体的抗体混合物，编码此类混合物的多核苷酸和含有所述多核苷酸的宿主细胞，制备和使用此类混合物的方法，以及包含这种抗体混合物或编码所述混合物的多核苷酸的药物组合物。

Description

抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的联合
技术领域
本发明描述了治疗性重组抗体领域内的组合物和方法。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，其整体通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2022年2月15日，名为126861-0003WO01_SL.txt，大小为47,915个字节。
背景技术
单克隆抗体技术逐渐变得更加成熟，许多成功的单克隆抗体产品已获得批准。然而，适用于开发单一有效抗体药物的充分验证的靶点的数量越来越少。为了实现全面的治疗效果，通常需要将两种或多种单独的抗体联合。例如，帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的联合可以使乳腺癌患者的生存期延长15个月以上，其效果远大于曲妥珠单抗单一疗法1。最近，阿替利珠单抗与贝伐珠单抗的联合治疗已被证明可以显著延长转移性肝细胞癌患者的生存期，突出了抗体联合疗法在免疫检查点抑制剂和血管生成抑制剂协同治疗肝癌方面的力量2。
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，其整体通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2022年2月15日，名为126861-0003WO01_SL.txt，大小为47,915个字节。
尽管目前正在对许多抗体进行联合临床评估，但批准抗体联合疗法的监管途径往往漫长而昂贵。通常，抗体联合需要在随机试验中针对单独的单个抗体进行测试，并且通常在抗体联合疗法获得批准之前单个抗体应该是已经获批的产品。这一过程对联合产品提出了巨大挑战，其中每种单个抗体本身几乎没有疗效。因此，开发人员需要投入大量资源将单一抗体开发到超过1期试验之后，才可以进行联合研究。由于这个原因，开发双特异性抗体通常是实现抗体联合相同目标的选择，所述双特异性抗体是具有简单调节途径，但仍然可以作用于两个不同的靶点的单个实体。然而，由于设计的限制，双特异性抗体不具有抗体联合的完全灵活性，特别是在控制每个靶点的两个抗体臂的比例方面。具有双特异性抗体的单一产品只能选择一种类型的Fc骨架，而抗体联合允许为两种抗体中的每一者灵活地选择具有适合的效应功能和药代动力学(PK)的Fc骨架。对开发抗体联合疗法的新方法存在着迫切需求。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)3和程序性细胞死亡因子-1(PD-1)4是T细胞免疫应答的关键免疫检查点抑制剂(ICI)。在免疫应答的早期阶段CTLA-4信号传导限制了淋巴结中T细胞增殖的启动，而PD-1在所述过程中的后期阶段限制了在肿瘤微环境中的T细胞活性5。CTLA-4对调节性T细胞(Treg)的功能至关重要，Treg对抑制自身免疫和维持自身耐受性是必不可少的，而且在维持抑制性肿瘤环境中也发挥关键作用6。CTLA-4和PD-1检查点通常被肿瘤利用，通过癌细胞或肿瘤浸润性免疫细胞上这些抑制性受体的配体的上调来逃避和/或抑制免疫系统7,8。CTLA-4或PD-1的阻断引起癌症患者中肿瘤负担的急剧降低，这导致监管部门批准了用于多种适应症的多种产品9,10。此外，PD-1阻断抗体如纳武单抗和CTLA-4阻断抗体如伊匹单抗已被证明通过不同但互补的作用机制发挥作用11-13。
抗PD-1(aPD-1)和抗CTLA-4(aCTLA-4)抗体的联合已在临床试验中在多种肿瘤类型中进行了广泛测试14,15。联合研究的主要驱动因素是与PD-1单一疗法相比提高总体应答率和应答持续时间，PD-1单一疗法通常在约20-30％的患者和具有高水平PD1配体1(PD-L1)表达的肿瘤中起作用。在几乎所有情况下，在PD-1阻断的基础上添加抗CTLA-4抗体在数值上提高了总体应答率，这通常可以转化为更长的应答持续时间和生存期16。纳武单抗和伊匹单抗的联合被批准用于治疗黑素瘤、肾癌、MSI-H CRC、NSCLC、MPM和肝癌。然而，对于所述联合的应答提高的确切机制仍不清楚。在最近发表的多臂3期研究中，测试了两种不同抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体或PD-L1抗体联合用于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗17,18。与化疗相比，伊匹单抗这种IgG1抗CTLA-4抗体与纳武单抗(一种抗PD-1抗体)的联合提高了总生存率，并已在美国被批准用于表达PD-L1≥1％的肿瘤患者17。相反，与化疗相比，曲美木单抗这种IgG2抗CTLA-4抗体在与德瓦鲁单抗(一种抗PD-L1抗体)联合时不提高无进展生存率或总生存率18。这两项试验之间的结果差异仍然无法解释。亚组分析表明，无论PD-L1水平(>1％或<1％)或肿瘤突变负荷(TMB)阈值如何，添加伊匹单抗都可以提供优于PD-1单一疗法的益处。然而，曲美木单抗只能为bTMB高于20mut/Mb的患者提供益处。抗CTLA-4抗体提供益处可能存在多种机制。选择IgG1同型对于某些CTLA-4抗体的体内活性可能是重要的。例如，尽管在人类中没有得到证实，但在小鼠中的多项临床前研究表明，耗尽肿瘤内Treg或改变肿瘤内Treg与CD8细胞的相对比例的能力对于抗CTLA-4抗体的抗肿瘤应答至关重要。这种能力依赖于Fc介导的抗体效应功能19-21。
与抗PD-1单一疗法相比，PD-1和CTLA-4联合阻断也会导致免疫相关不良事件(irAE)的增加22。最常见的irAE包括瘙痒、恶心、皮疹、腹泻和乏力。在联合用药中使用不同比例的纳武单抗和伊匹单抗的研究表明，irAE的水平更有可能与伊匹单抗的剂量而不是纳武单抗的剂量有关。目前控制联合疗法的毒性升高的策略是，减少伊匹单抗与纳武单抗联合用药时的剂量和频率23。常用的方案是每6周1mg/kg的伊匹单抗再加上每2或3周3mg/kg或240mg的纳武单抗固定剂量，可以显著降低患者因严重AE造成的退出率。然而，使用联合疗法时3级或4级AE的频率仍远高于使用PD-1单一疗法17。有趣的是，在最近一项关于抗CTLA-4IgG1分子quavonlimab与帕博利珠单抗(一种抗PD-1抗体)联合治疗NSCLC患者的研究中，低剂量的CTLA-4抗体(每6周25mg)表现出与其他更高剂量方案相等的疗效和更好的安全性，并被选为用于与常规剂量的帕博利珠单抗(每3周200mg)进行进一步联合研究的推荐2期剂量(RP2D)24。这些发现需要进一步提高联合疗法的安全性和耐受性。
如上所述，需要进一步提高疗效。此外，在某些研究中，与单独使用抗PD1或抗CTLA4抗体的治疗相比，此类联合治疗伴有更多的不良事件，包括3级和4级不良事件(见下文定义和不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria forAdverse Events)(CTCAE)5.0版，2010年，其可以在/ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic_ applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_8.5x11.pdf获得，其通过引用并入本文)。此外，单独生产两种不同的抗体是繁重、昂贵和复杂的。因此，在本领域中需要更高效生产的抗PD1和抗CTLA4抗体的组合，以及比现有组合更安全且更有效的组合。
发明内容
本发明提供了一种可以递送PD-1和CTLA-4免疫检查点途径的双重阻断的组合产品。在一个实施方式中，提供了本发明的PSB205(QL1706)，其使用新的技术平台产生，所述技术平台能够从单一宿主细胞系生产两种接近其天然形式的抗体，并作为单一产品制备。本文设想了新的PSB205产品维持双阻断剂增强的抗肿瘤活性，但不诱导irAE发生率的提高。与双特异性抗体相比，PS205的抗PD-1和抗CTLA-4组分是单独设计的，以实现每种抗体以及在联合治疗情况下的最佳靶覆盖和生物活性。所述PSB205的抗CTLA-4组分被工程化改造成具有比其他CTLA-4抗体更快的清除率，从而减少在每个治疗周期内暴露。本发明设想了这种在存在稳定持续时间的抗PD-1暴露的情况下减少抗CTLA-4暴露的独特特征，以提高耐受性并因此使患者能够在更长时间段内接受PSB205，而不会因CTLA-4抗体介导的irAE而停药。来自我们的1期研究的初步数据显示，PSB205(QL1607)在鼻咽癌和肺癌患者、包括对PD-1抑制剂具有耐药性的患者中耐受良好并表现出良好的抗肿瘤应答。
本发明还提供了包含抗hCTLA4抗体和抗hPD1抗体的抗体混合物、编码此类混合物的多核苷酸和含有这些多核苷酸的宿主细胞、制备和使用此类混合物和编码其的多核苷酸的方法，以及包含这种抗体混合物或编码所述混合物的多核苷酸的药物组合物。下面的编号项目描述了这些组合物和方法的各个方面，并且不意味着限制本发明描述的范围。
在具体实施方式中，PSB205(QL1706)含有两种工程化单克隆抗体(抗PD-1IgG4和抗CTLA-4IgG1)，二者以固定比例从同一单细胞表达，并作为一种产品一起制备(MabPair)。为了实现最佳疗效和安全性，PSB205被设计成在单个产品中为PD-1和CTLA-4带来不同水平的靶覆盖。在具体实施方式中，所述抗CTLA-4抗体被工程化改造成具有较短的半衰期，以减少其暴露并降低irAE的风险。在临床前实验和1期临床试验两者中发现PSB205表现出抗肿瘤活性，并具有对PD-1和CTLA-4两个途径的功能性双重阻断的证据，包括KI67+CD8 T细胞和ICOS+CD4 T细胞的增加。来自I期试验的初步数据还显示，PSB205(QL1607)在实体瘤患者、包括对PD1抑制剂具有耐药性的患者中具有良好的耐受性并具有良好的抗肿瘤效果。
所述MabPair平台能够在单个双功能产品中提供抗体联合疗法。MabPair分子例如PSB205(QL1706)可以被特异工程化改造，以实现两种不同分子例如抗PD-1和抗CTLA-4单克隆抗体的最佳靶覆盖水平，这可以转化为具有良好耐受性的改善疗效。
本发明还提供了如编号的方面所述的具体实施方式，例如方面1，其对应于一种抗体混合物，所述混合物包含：
(a)抗人程序性死亡蛋白1(抗hPD1)抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中(1)所述抗hPD1抗体的HC由编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸序列编码，并且(2)所述抗hPD1抗体的LC由编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的核酸序列编码；和
(b)抗人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗hCTLA4)抗体，其包含HC和LC，其中(1)所述抗hCTLA4抗体的HC由编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列编码，并且(2)所述抗hCTLA4抗体的LC由编码SEQ ID NO：17的氨基酸序列的核酸序列编码；
(c)其中所述混合物中抗hCTLA4抗体的量与所述混合物中抗hPD1抗体的量的重量比(w/w)(抗hCTLA4:抗hPD1比例)在1:1至1:4的范围内，
其中所述抗hPD1抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有220至380小时的体内半衰期(t1/2)，和/或所述抗hPD1抗体在施用到以前未给药过所述抗hPD1抗体的人时具有135至300小时的体内t1/2，并且
(d)其中所述抗hCTLA4抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有40至150小时的体内t1/2，和/或所述抗hCTLA4抗体在施用到以前未给药过所述抗hCTLA4抗体的人时具有90至210小时的体内t1/2。
方面2.根据方面1所述的混合物，
其中所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ ID NO：10的氨基酸序列，
其中所述编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列，
其中所述编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ ID NO：22的氨基酸序列，并且
其中所述编码SEQ ID NO：17的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
方面3.根据方面1或2所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1至1:3的范围内。
方面4.根据方面3所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.2至1:2.5的范围内。
5.根据方面4所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.5至1:2.5的范围内。
6.根据方面5所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.7至1:2.3的范围内。
方面7.根据方面1至6中任一方面所述的混合物，其中：
所述抗hPD1抗体的HC和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：2和6的核酸序列编码；并且
所述抗hCTLA4抗体的HC和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：14和18的核酸序列编码。
方面8.根据方面1至7中任一方面所述的混合物，
其中所述抗hPD1抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有250至350小时的体内t1/2，和/或所述抗hPD1抗体在施用到以前未给药过所述抗hPD1抗体的人时具有140至250小时的体内t1/2，并且
其中所述抗hCTLA4抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有70至130小时的体内t1/2，和/或所述抗hCTLA4抗体在施用到以前未给药过所述抗hCTLA4抗体的人时具有90至140小时的体内t1/2。
方面9.根据方面1至8中任一方面所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过15％、14％、13％、12％或11％的所述患者经历3级或4级不良事件(AE)。
方面10.根据方面9所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过10％、9％或8％的所述患者经历3级或4级AE。
方面11.根据方面10所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过7％、6％或5％的所述患者经历3级或4级AE。
方面12.一种药物组合物，其包含根据方面1至11中任一方面所述的混合物。
方面13.根据方面12所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为pH 4.5至pH5.5。
方面14.根据方面12或13所述的药物组合物，其中所述组合物中的总蛋白浓度为20mg/mL至30mg/mL。
方面15.根据方面12至14中任一方面所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有250至380mOsm/kg的渗透浓度。
方面16.一种或多种多核苷酸，其编码根据方面1至11中任一方面所述的混合物。
方面17.根据方面16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：2、6、14和18的核酸序列。
方面18.一种或多种载体，其包含根据方面16或17所述的多核苷酸。
方面19.根据方面18所述的载体，其是病毒载体。
方面20.根据方面19所述的载体，其是溶瘤病毒载体。
方面21.根据方面19或20所述的载体，其是反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)、疱疹病毒、慢病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒或痘病毒载体。
方面22.一种宿主细胞，其包含根据方面16或17所述的多核苷酸和/或根据方面18所述的载体，其中所述宿主细胞能够产生根据方面1至11中任一方面所述的混合物。
方面23.根据方面22所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.2至1:3的范围内。
方面24.根据方面23所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.5至1:2.5的范围内。
方面25.根据方面24所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.7至1:2.3的范围内。
方面26.根据方面22至25中任一方面所述的宿主细胞，其是CHO细胞或小鼠骨髓瘤细胞。
方面27.一种制备抗体混合物的方法，其包括下述步骤：
培养根据方面22至26中任一方面所述的宿主细胞；和
从培养上清液或宿主细胞团中回收所述抗体混合物。
方面28.一种治疗患有癌症、免疫缺陷病症或感染的患者的方法，其包括：
(a)向所述患者施用一定剂量的根据方面1至11中任一方面所述的混合物或根据方面12至15中任一方面所述的药物组合物，或
(b)向所述患者施用一定剂量的根据方面16或17所述的多核苷酸或根据方面18至21中任一方面所述的载体。
方面29.根据方面28(a)所述的方法，其中所述剂量的混合物或药物组合物以约每周两次、每周一次或每2、3、4、5、6、7或8周一次施用，并且其中所述混合物或药物组合物的剂量由下述一者或多者描述：
(1)所述剂量为至少约0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0mg/kg；
(2)所述剂量为至多约9、8、7、6、5、4或3mg/kg；
(3)所述剂量为约1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0mg/kg；
(4)所述剂量为约200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500mg；
(5)所述剂量为至少约75、100、125、150、200、225或250mg；和
(6)所述剂量为至多约600、500、400或300mg。
方面30.根据方面29所述的方法，其中
所述剂量为至少3mg/kg且不超过5mg/kg，和/或
所述剂量为至少180mg且不超过400mg，
其中所述剂量约每3周一次施用。
方面31.根据方面30所述的方法，其中所述剂量为约5mg/kg。
方面32.根据方面30所述的方法，其中所述剂量为300至400mg。
方面33.根据方面29至32中任一方面所述的方法，
其中所述患者患有癌症，
其中所述混合物或药物组合物被施用到至少10位患者，并且
其中客观应答率(ORR)为至少5、10、15、20、25、30或35％，和/或疾病控制率(DCR)为至少25、30、35、40、45、50、55或60％。
方面34.根据方面28(b)所述的方法，其中所述剂量的多核苷酸或载体以约每周两次、每周一次或每2、3、4、5、6、7或8周一次施用，并且其中所述多核苷酸或载体的剂量由下述一者或多者描述：
(1)所述剂量为每公斤患者体重至少约5x 109个拷贝的所述多核苷酸或载体(拷贝/kg)；
(2)所述剂量为至多约1015个拷贝/kg；
(3)所述剂量为约1010个拷贝/kg至约1014个拷贝/kg；和
(4)所述剂量为约1010、1011、1012、1013、5x 1013、1014、2x 1014、3x 1014、4x 1014、5x1014、6x 1014、7x 1014、8x 1014、9x 1014或1015个拷贝。
方面35.根据方面28至34中任一方面所述的方法，其中所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体通过包括输注或推注的静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射施用。
方面36.根据方面28至35中任一方面所述的方法，其中所述患者患有黑素瘤、包括鳞状非小细胞肺癌和小细胞肺癌的肺癌、鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌或胃食管癌、透明细胞或非透明细胞肾细胞癌、尿路上皮癌、软组织或骨肉瘤、间皮瘤、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、梅克尔细胞癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肝细胞癌、卵巢癌或微卫星高度不稳定性(MSI-H)或DNA错配修复缺陷型(dMMR)成人和儿童实体瘤。
方面37.根据方面28至36中任一方面所述的方法，其中在使用所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体之前、之后或同时使用化学治疗剂或放射治疗所述患者。
方面38.根据方面28至37中任一方面所述的方法，其中将所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体施用到至少10位患者，其中已施用所述剂量的患者不同时使用放射或化学治疗剂治疗，并且其中不超过15％、14％、13％、12％或11％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
方面39.根据方面38所述的方法，其中不超过10％、9％或8％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
方面40.根据方面39所述的方法，其中不超过7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
附图说明
图1：编码抗hPD1 IgG4抗体PSB103的载体的质粒图谱。质粒中的各种遗传元件标记如下：Pro PGK，磷酸甘油酸激酶的启动子；DHFR，二氢叶酸还原酶基因；SV40 pA，SV40多腺苷酸化信号；Pro EF2/CMV，延伸因子2和巨细胞病毒(CMV)的杂合启动子；anti-PD-1IgG4HC，编码PSB103抗-hPD1 HC的序列；CMV pA，来自CMV的多腺苷酸化信号；Pro CMV/EF1，CMV和延伸因子1的杂合启动子；anti-PD-1LC，编码PSB103 anti-hPD1抗体的LC的序列，其为κLC；Puro Resis，嘌呤霉素抗性基因；pMB1 ori，pMB1的DNA复制原点；Kana Resis，卡那霉素抗性基因；NruI，限制性内切酶NruI的识别位点。
图2：用于获得表达PSB103的CHO细胞系的选择方案。该过程在实施例1中进行了解释。左侧标记为“转染”的框表示用图1中所示的质粒转染CHO细胞。将转染的细胞分成两个池，对其进行两种不同的第1阶段选择方案，如两个中间的框中所示。然后，将两个第1阶段的池各自分为两个池，对其进行两种不同的第2阶段选择方案，如右侧的四个框中所示。
图3：编码抗hCTLA4抗体PSB105的HC的载体的质粒图谱。质粒中的各种遗传元件标记如下：启动子PGK Mm，来自小鼠(Mus musculus)的磷酸甘油酸激酶的启动子；启动子EF1aHs，来自智人(Homo sapiens)的延伸因子1-α的启动子；内含子EF1a Hs，来自智人(H.sapiens)的延伸因子1-α的内含子；anti-CTLA-4IgG1-HC，编码抗hCTLA4抗体PSB105的IgG1 HC的DNA；EES，Atum(Newark,California)特有的表达增强序列；HPRE，乙型肝炎病毒转录后调控元件；Ocrabbit，兔β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化(poly(A))信号；HS4绝缘子，来自鸡β-珠蛋白基因的HS4绝缘子元件；Ori pUC，用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中复制的DNA复制原点；卡那霉素抗性，卡那霉素抗性基因；NruI，限制性内切酶NruI的识别位点；pA Globin Hs，智人(H.sapiens)β-珠蛋白基因的poly(A)信号；和潮霉素抗性，潮霉素抗性基因。
图4：编码抗hCTLA4抗体PSB105的LC的载体的质粒图谱。质粒中的各种遗传元件标记如下：P-EF1a Hs，来自智人(H.sapiens)的延伸因子1-α的启动子；EF1-Hs外显子1，来自智人(H.sapiens)的延伸因子-α的外显子1；内含子EF1a Hs，来自智人(H.sapiens)的延伸因子1-α的内含子；内含子受体Mm IgH，来自小鼠(Mus musculus)的IgH内含子受体；抗CTLA-4LC，编码抗hCTLA4抗体PSB105的LC的DNA；EES，Atum(Newark,California)特有的表达增强序列；HPRE，乙型肝炎病毒转录后调控元件；Ocrabbit，兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号；HS4绝缘子，来自鸡β-珠蛋白基因的HS4绝缘子元件；Ori pUC，用于在大肠杆菌(E.coli)中复制的DNA复制原点；卡那霉素抗性，卡那霉素抗性基因；NruI，限制性内切酶NruI的识别位点；pA Globin Hs，智人(H.sapiens)β-珠蛋白基因的poly(A)信号；Mm谷氨酰胺合成酶，来自小鼠(M.musculus)的谷氨酰胺合成酶；和P-PGK Mm，来自小鼠(M.musculus)的磷酸甘油酸激酶的启动子。
图5A-B：PSB103和PSB105的结合特异性。实验描述在实施例2中。图5A和图5B分别示出了抗hPD1抗体PSB103和抗hCTLA4抗体PSB105的结果。在图A和B两者中，测试与这些抗体结合的配体在x轴下从左到右表示如下：huPD1，与Fc片段融合的人PD1的细胞外结构域；muPD1，与组氨酸-亲和素标签(其能够有效纯化蛋白质(组氨酸标签)并用生物素标记蛋白质(亲和素标签))融合的鼠PD1的细胞外结构域；huPDL1，与组氨酸-亲和素标签融合的人PDL1的细胞外区域；huCD28，与Fc片段融合的人CD28的细胞外结构域；以及huCTLA4，与Fc片段融合的人CTLA4的细胞外结构域。带有斜条纹、不连续短水平线条纹或粗连续水平线的条形分别表示含有100ng/mL、33ng/mL或0ng/mL的测试配体的样品的数据。y轴显示在450nm处的光密度(OD450)，其反映了该测定中结合的量。
图6A-B：PSB103和不相关的IgG4抗体在食蟹猴(Macacafascicularis)中的单剂量药代动力学。该实验描述在实施例3中。图6A和图6B分别示出了来自用PSB103和不相关的IgG4抗体注射的猴的数据。x轴和y轴分别显示了注射测试抗体后的时间(小时)和在血清中检测到的抗体浓度(μg/mL)。符号表示如下：空心和实心圆圈分别表示来自第一和第二等分试样的数据，这两个等分试样均来自雌性猴的样品；空心和实心三角形分别表示来自第一和第二等分试样的数据，这两个等分试样均来自雄性猴的样品。
图7：PSB105(不相关的IgG1抗体)和伊匹单抗在食蟹猴中的单剂量药代动力学。该实验描述在实施例3中。x轴和y轴分别显示了注射测试抗体后的时间(小时)和在血清中检测到的抗体的量(μg/mL)。符号表示如下：空心和实心正方形分别表示来自施用PSB105的雄性和雌性猴的数据；空心和实心圆圈分别表示来自施用不相关的IgG1抗体的雄性和雌性猴的数据；空心和实心三角形分别表示来自施用伊匹单抗的雄性和雌性猴的数据。
图8A-B：用于产生表达PSB103(抗hPD1抗体)和PSB105(抗hCTLA4抗体)两者的宿主细胞的一般选择方案。图8A示出了表达抗hPD1抗体PSB103的宿主细胞的产生，其描述在实施例1中。细胞内的“Y”符号代表抗体。图8B示出了表达PSB103和抗hCTLA4抗体PSB105两者的细胞的产生，其描述在实施例4中。
图9：用于选择表达PSB103和PSB105的细胞的药物选择方案的图。该过程描述在在实施例4中。最左边的框表示用编码PSB105的重链和轻链的载体转染G19G4-4B4细胞(表达PSB103)。48小时后，将该培养物细分成三种培养物，对其进行不同的药物选择(如图9中间的三个框所示)。将这三种培养物接种到96孔板中(如图9右侧的九个框所示)。正如所示，将在选择下表现出生长的48个孔在12孔微量滴定板中扩增，并测定它们产生的抗hPD1和抗hCTLA4抗体的相对量。
图10A-C：转染细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析。如实施例4中所解释的，使用FACS筛选用编码PSB103和PSB105两者的载体转染的细胞系，以找到细胞系中大多数个体细胞表达PSB103(IgG4抗hPD1抗体)和PSB105(IgG1抗hCTLA4抗体)两者的细胞系。图10A示出了FACS数据图中预期出现仅表达PSB103、仅表达PSB105或表达两者的细胞的部分。如图所示，用于检测PSB105的抗IgG1抗体用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，用于检测PSB103的抗IgG4抗体用别藻蓝蛋白(APC)标记。图10B示出了来自细胞系的数据，其中细胞系中的大多数个体细胞表达PSB103和PSB105两者而极少数细胞仅表达PSB102或PSB105。图10C示出了来自细胞系的数据，其中明显可检测数量的细胞仅表达PSB103或PSB105，而大多数个体细胞表达两者。
图11A-B：克隆细胞系的总抗体滴度和抗hPD1抗体百分比的筛选。如实施例4中所解释的，测定了总抗体滴度(在图11A中示出)和抗hPD1抗体PSB103的抗体的百分比(在图12B中示出)。如图所示，克隆细胞系通过x轴下的克隆编号来鉴定，其后的括号中是收获抗体时细胞已培养的天数。
图12A-C：克隆细胞系20F5的生产率和生长特征。方法在实施例4中解释。在图12A中，x轴表示用于启动补料分批生产培养(图12A和图12B中的数据来自于此)的培养物的群体倍增水平(PDL，即在从研究细胞库(RCB)解冻后的细胞倍增次数)，其由每个条形下方的数字表示。在用于启动补料分批培养的培养物的培养基中是否存在潮霉素B(HGB)和甲氨蝶呤(MTX)指示在PDL下方。所有补料分批培养均在缺乏MTX和HGB的培养基(-MTX/-HGB培养基)中进行。最左边的四个条形表示的培养物在开始补料分批培养之前，在缺乏MTX和HGB(-MTX/-HGB)的培养基中进行九到十次细胞倍增，所述补料分批培养也在-MTX/-HGB培养基中进行。在此之前，细胞是在含有MTX并缺乏HGB的培养基(+MTX/-HGB培养基)中培养。因此，当从最左边的条形表示的培养物开始补料分批培养时，该培养物在其繁殖的整个过程中处于-MTX/-HGB培养基中，直至PDL为9.2。左侧第五个和第六个条形表示的培养分别在+MTX/-HGB和+MTX/+HGB培养基中进行，其PDL指示了细胞倍增次数。从这些在-MTX/-HGB培养基中的培养物开始补料分批培养(图12A和图12B中的数据来自这些培养物)。y轴表示补料分批培养的总抗体生产率(克/升)，其从各补料分批培养开始后11天(第11天)采集的样品测定。在图12B中，三组条形中的每一组中的各个条形以与图12A中相同的顺序表示来自相同补料分批培养的数据。采集分析样品的补料分批培养日在x轴下方的三组条形中的每一组的下方指示。y轴表示抗hPD1抗体即PSB103占产生的总抗体的百分比。图12C表示细胞系20F5的细胞倍增时间作为在+MTX/+HGB培养基(虚线)或+MTX/-HGB培养基(实线)中的PDL的函数。如图所示，x轴表示PDL，y轴表示细胞倍增时间。
图13A-C：通过液相色谱-质谱法(LC-MS)分析从PSB205制备物分离的PSB103和PSB105(被称为PSB103-S和PSB105-S)。该实验描述在实施例5中。图13A、图13B和图13C分别显示了来自PSB103-S、PSB105-S和从其中分离这些抗体的PSB205制备物的数据。在最大峰附近注明了以道尔顿为单位的峰的大小。不同种类的HC残基N297的糖基化状态(根据Edelmann等，完整γG免疫球蛋白分子的共价结构(The covalent structure ofan entireγG immunoglobulin molecule)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63:78-85的编号方案编号，其通过引用并入本文；N297分别对应于SEQ ID NO：1和13中的位置N296和N298)由下述标记表示：G0F/G0F，在每个HC的N297上包括三个甘露糖(Man3)残基、四个N-乙酰葡糖胺残基((glcNAc)4)和一个岩藻糖残基((Fuc)1)的聚糖(Man3(glcNAc)4(Fuc)1)；G0F/G0F-GlcNAc，一个HC的N297上的Man3(glcNAc)4(Fuc)1聚糖和另一个HC的N297上的Man3(glcNAc)3(Fuc)1聚糖；和G0F/G1F，一个HC的N297上的Man3(glcNAc)4(Fuc)1聚糖和另一个HC的N297上包括一个半乳糖残基((Gal)1)、三个甘露糖残基、四个N-乙酰葡糖胺残基和一个岩藻糖残基的聚糖((Gal)1Man3(glcNAc)4(Fuc)1)。关于这些化学结构的描述，参见例如Yang等，(2016)，单克隆抗体的超快和高通量N-聚糖分析(Ultrafast and high-throughputN-glycan analysis formonoclonal antibodies)，MAbs 8(4):706-717以及聚糖的符号命名法(SNFG)，可以在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/glycans/snfg.html处获得，其通过引用并入本文。x轴显示检测到的抗体种类的质量(以道尔顿为单位)，y轴显示反映在分析样品中的丰度百分比的百分比强度。
图14A-B：通过LC-MS进行的不同批次的PSB205的分析。如实施例5中所述，通过LC-MS分析了两个不同批次的PSB205。图14A和图14B分别示出了来自PSB205-Tox批次和PSB205-GMP批次的数据。x轴显示检测到的抗体种类的质量(以道尔顿为单位)，y轴显示反映在分析样品中的丰度百分比的百分比强度。抗体的糖基化状态如图13中所示。
图15：PSB205的GMP批次的热容量图。该实验在实施例7中描述。x轴表示温度(℃)，y轴表示摩尔热容量(kcal/mole/℃)。
图16A-D：用CMV感染的细胞裂解物和抗体刺激并用抗CD8抗体和HLA-CMVdextramer标记的细胞的流式细胞术分析。该实验在实施例8中描述。所有图的x轴显示来自FITC标记的抗CD8抗体的荧光，y轴显示来自藻红蛋白(PE)标记的HLA-CMV dextramer的荧光。每个图中的方框区域表示CD8+CMV+细胞，方框区域左侧的数字表示CD8+CMV+细胞占所有细胞的百分率。图16A显示来自用IgG1同型对照抗体和CMV感染的细胞裂解物刺激的细胞的数据。图16B显示来自用PSB103和CMV感染的细胞裂解物刺激的细胞的数据。图16C显示来自用PSB105和CMV感染的细胞裂解物刺激的细胞的数据。图16D显示来自用PSB205和CMV感染的细胞裂解物刺激的细胞的数据。
图17A-B：用CMV感染的细胞裂解物和抗体刺激的细胞中CD8+CMV+细胞的百分率和绝对数的定量。该实验在实施例8中描述。图17A显示CD8+CMV+细胞占所有细胞的百分率。x轴表示用于刺激样品的抗体，y轴表示CD8+CMV+细胞占所有细胞的百分率。图17B中的图表在其y轴上显示检测到的CD8+CMV+细胞的绝对数量，并在其x轴上显示用于刺激样品的抗体。在两个图中，误差条表示标准偏差。为简单起见，只显示了一半的误差条。
图18：PSB205与其组分抗体在肿瘤模型系统中的效果的比较。实验在实施例9中详细描述。x轴显示实验过程中的天数，y轴显示以mm3为单位的肿瘤体积。肿瘤的测试抗体治疗用下述符号表示：实心圆圈，IgG阴性对照抗体；实心正方形，PSB103(抗hPD1抗体)；实心向上指向的三角形，PSB105(抗hCTLA4抗体)；实心向下指向的三角形，PSB205(PSB103和PSB105的混合物)。星号表示IgG对照抗体数据与PSB205数据之差的统计学显著性水平的下述p值：*，p＝0.03；**，p＝0.01；和***，p＝0.0006。
图19：个体患者中肿瘤直径相对于基线的变化。方法描述在实施例10中。条形显示了表12中列出的32位可评估患者中的每个个体人类患者的肿瘤直径相对于基线的变化，包括13位肺癌(LC)患者(蓝色条形)和19位鼻咽癌(NPC)患者(棕色条形)。y轴表示肿瘤直径的变化，单位为mm。直径的变化也指示在每个条形的上方(表示增加)或下方(表示减小)。每位患者施用的PSB205的剂量直接显示在x轴下方。在上方用星号标记的三个条形表示除了原有肿瘤的直径发生变化之外还患有新肿瘤的患者。
图20A-F：PSB205的产生和表征。(图20A)：用于从单个哺乳动物细胞系产生两种正确组装的抗体的MabPair技术的原理。独特设计的HC配对键和HC/LC配对键可用于控制同源HC和LC配对并消除不需要的副产物。(图20B)：分别通过hu IgG4和hu IgG1特异性试剂的细胞内染色检测生产细胞系中PSB103和PSB105的共表达。(图20C)：通过尺寸排阻HPLC分析PSB205尺寸变体。色谱图显示了PSB205中两种mAb的单体重叠的主峰、高分子量(HMW)种类的前副峰和低分子量(LMW)种类(未检测到)的后副峰。结果，对于不同批次来说，由单体(主峰)定义的PSB205纯度通常被测定为97-99％。(图20D)通过疏水相互作用HPLC方法实现了PSB205中两种mAb的基线分离。因此，它被用作确定两种mAb的浓度比[抗PD-1]:[抗CTLA-4](w/w)的工具。
(图20E)通过液相色谱-质谱法(LC-MS)进行的PSB205的完整糖型质量分布的分析。解卷积质谱中位于149,320Da和147,610Da处的两个主峰分别与抗PD-1和抗CTLA-4的G0F/G0F糖型紧密匹配。(图20F)：通过LC-MS/MS肽图谱表征PSB205中的两种mAb。为了区分从任一mAb鉴定到的肽，纯化的单独抗PD-1和抗CTLA-4也与PSB205样品一起进行了分析。抗PD-1和抗CTLA-4的大多数胰蛋白酶肽使用在两个图谱中指定的峰进行鉴定。中间的图含有PSB205(其含有抗PD-1和抗CTLA-4两者)的肽图谱，其表示两个单独mAb肽图谱的组合肽图谱。蛋白质序列以高置信度得到确认，因为鉴定抗PD-1的序列覆盖率为98.2％，抗CTLA-4的序列覆盖率为95.8％。
图21A-E：PSB205的临床前评估。(图21A)：在存在各种抗体的10倍连续稀释液(10μg/ml至0.001μg/ml)的情况下，将来自健康供体的单核细胞衍生的未成熟树突状细胞与来自不同供体的纯化的T细胞以1:10和1:3的比例混合。在第6天，通过ELISA评估上清液中IFNγ的水平。(图21B)：在以不同比例(5:1至0.2:1)混合的各种浓度的PSB103(0.5μg/ml至20μg/ml)和PSB105(0.05μg/ml至4μg/ml)存在下，将来自健康供体的PBMC用SEB(100ng/ml)刺激96小时。通过ELISA测定上清液中IL-2的水平。等值线图显示了在不同浓度、不同比例下IL-2的增加倍数。每个数据点由图上的红点表示。右边的条形描绘了增加倍数的彩色表示：白色(最高)和绿色(最低)。所述结果代表了来自不同供体的三个实验。(图21C)：将来自HLA-CMV pp65阳性供体的PBMC在多种抗体存在下用CMV(3μg/mL)裂解物刺激7天，进行两份平行试验：IgG1(5μg/mL)，PSB103(5μg/mL)，PSB105(2.5μg/mL)和PSB205(5μg/mL)。通过流式细胞术计数培养物中CMVpp65阳性CD8 T细胞的数量。(图21D)：将HCC827移植到NCG小鼠上。当肿瘤尺寸达到60-80mm3时，如方法和材料中所述使用来自健康供体的人PBMC重建NCG小鼠。将对照人IgG1(7.5mg/kg n＝5)，PSB103(5mg/kg n＝5)、PSB105(2.5mg/kg n＝5)以及PSB103与PSB105以2:1的比例混合(7.5mg/kg n＝5)每周两次i.p.注射共3周。(图21E)：在分别以5mg/kg和3mg/kg单次静脉注射施用到食蟹猴后，PSB103(左)、PSB105和伊匹单抗(右)的血清浓度随时间变化的曲线。
图22A-E：aCTLA-4(图22A)和aPD-1(图22B)的平均(+SD)血浆浓度与第1周期给药后和稳态(第6周期)下的时间的函数关系，在0.3mg/kg至10mg/kg Q3W的剂量水平，以μg/mL为单位在log10标度上显示。当在单个时间点超过一半(>50％)的值为BQL时，平均值被报告为0。对于那些BQL值来说，它们在半对数比例图中被省略。当在单个时间点只有2个样品时不显示误差线。(图22C)：PSB205治疗后循环CD3T细胞中PD-1受体的占有率。对PSB205治疗前后的各个时间点PD1受体占有的平均百分率进行作图。(图22D)PSB205治疗后CD4和CD8 T细胞的增殖。比较每个患者治疗前或治疗后168小时Ki67+CD4 T细胞(左图)和CD8 T细胞(右图)的百分率，并用线连接。平均值：比较治疗前或治疗后168小时ICOS+CD4 T细胞的百分率，并用线连接。(图22D)和(图22E)中所示的p值使用Wilcoxon符号秩检验来计算。
图23A-F：肿瘤应答。靶病变与相对于基线的最佳客观应答(图23A)。一位患者仅获得一个基线后肿瘤评估结果，其中一个靶病变无法测定。在先前未接受过免疫治疗的患者(图23B)和先前接受过抗PD-1/PD-L1免疫治疗的患者(图23C)中肿瘤缩小相对于基线的变化百分率。-30％处的虚线表示PR的阈值。个体患者的治疗持续时间(图23D)。图23E显示了在5mg/kg剂量下鼻咽癌患者的代表性部分肿瘤应答，其对先前的PD-L1/TGFβ双特异性抑制剂疗法来说是难治的。所有靶病变的直径总和在基线时为101mm，在第7周时为47mm(-53.5％)。图23F显示了在10mg/kg剂量下非小细胞肺癌患者的代表性部分肿瘤应答，该患者对先前的纳武单抗和4-1BB抑制剂疗法来说是难治的。所有靶病变的直径总和在基线时为77mm，在第13周时为49mm(-36.4％)。
图24A-B：图24A和图24B两者均显示了抗PD-1IgG4(命名为PSB103)在Allo-MLR中增强的T细胞活化。Ab＝抗体；IFNγ＝干扰素γ；MLR＝混合淋巴细胞反应；Nivo＝纳武单抗；Pembro＝帕博利珠单抗。
图25A-B：示出了在双细胞报告细胞测定中PSB205和PSB103抑制PD-1结合和功能活性(图25A)，并且PSB205与PSB105抑制CTLA4介导的抑制活性(图25B)。
图26：示出了PSB205协同增强由SEB超抗原诱导的T细胞活化。
图27：示出了将来自HLA-CMVpp65阳性供体的PBMC在各种抗体存在下用CMV(3ug/ml)裂解物刺激7天，进行了两份平行实验：IgG1(5ug/ml)、PSB103(5ug/ml)、PSB105(2.5ug/ml)和PSB205(5ug/ml)。通过流式细胞术计数培养物中CMVpp65阳性CD8 T细胞的数量。
图28：将Jeko-1移植到NCG小鼠上。当肿瘤尺寸达到80-100mm^3时，如方法和材料中所述使用来自健康供体的人PBMC重建NCG小鼠。将对照人IgG1(7.5mg/kg n＝5)、PSB103(5mg/kg n＝5)、PSB105(2.5mg/kg n＝5)以及PSB103与PSB105以2:1的比例混合(7.5mg/kgn＝5)每周两次腹腔注射共3周。
图29：显示了PSB205治疗提高了食蟹猴中循环CD4+/CD278+T细胞的水平。将第16天(第2次给药后24hrs)的估计血清浓度与第16天时PSB205治疗的猴的血液中循环CD4+/CD278+T细胞的百分比作图。
图30A-D：示出了CTLA-4(图30A)和aPD-1(图30C)的根据实际剂量归一化的个体Cmax；并且aCTLA-4(图30B)和aPD-1(图30D)的根据实际剂量归一化的个体AUC0-t显示为剂量水平的函数。
图31：PSB205治疗后ICOS+CD4+CD8-T细胞的扩增。比较了在不同时间点(给药前、治疗后168小时和336小时)每个剂量组中ICOS+CD4T细胞的平均百分率，并用实线连接。
图32：PSB205治疗后ICOS+CD4+CD8-T细胞的扩增。比较了在不同时间点(给药前、治疗后168小时和336小时)每个剂量组中ICOS+CD4T细胞的平均百分率，并用实线连接。
序列表简述
具体实施方式
本文描述了可以在单个细胞系中生产的抗体的混合物或组合，所述混合物中的抗体是各自具有特定序列和性质的抗hPD1抗体和抗hCTLA4抗体。所述抗体以特定比例存在于所述混合物中。本文提供的数据表明，所述混合物与单独的抗体、在两个独立的细胞系中产生的抗体混合物和/或抗hPD1和抗hCTLA4抗体的其他混合物相比具有有利的性质。
定义
本文所指的“不良事件”(AE)是与医学治疗或程序的使用在时间上相关的任何不利和意外迹象(包括异常的实验室发现)、症状或疾病，其可能被认为或可能不被认为与所述医学治疗或程序相关。AE分为下述1-5级：1级，轻度AE，无症状或包括临床或诊断测试中观察到的轻度症状，不需要进行任何干预；2级，中度AE，包括可能限制适合年龄的工具性日常生活活动(ADL)的轻微症状，需要进行局部或非侵入性干预；3级，重度或具有医学意义的AE，不会立即危及生命，可能致残或限制日常生活自理能力的ADL，需要住院治疗或延长住院时间；4级，危及生命的AE，需要紧急干预；5级，涉及死亡的AE。免疫相关不良事件(irAE)包括在本文中AE的含义范围之内。irAE在时间上与药物治疗有关，并且可以包括身体任何器官系统的炎症，最常见的是胃肠道、内分泌腺、皮肤和肝脏。参见例如Postow等，(2018)，“与免疫检查点阻断相关的免疫相关不良事件”(Immune-related adverse eventsassociated with immune checkpoint blockade)，New Engl.J.Med.378:158-168，可在DOI:10.1056/NEJMra1703481处获得，其通过引用并入本文。中枢神经系统或心血管、肺、肌肉骨骼和血液系统的炎症也可能是irAE的一部分。同上(Id)。
本文所指的“改变”是指氨基酸序列的变化。改变可以是插入、缺失或取代。“改变”是单个氨基酸的插入、缺失或取代。例如，如果缺失从氨基酸序列中移除了三个氨基酸，则发生了三个改变(在这种情况下是缺失)。作为取代的改变可以通过陈述原始序列中存在的氨基酸，然后是所述氨基酸在原始序列中的位置，然后是取代所述原始氨基酸的氨基酸来指称。例如，G133M意味着原始序列中第133位的甘氨酸被甲硫氨酸取代。此外，133M意味着第133位处的氨基酸是甲硫氨酸，但没有指定原始氨基酸的身份，其可以是包括甲硫氨酸在内的任何氨基酸。最后，G133意味着甘氨酸是原始序列中第133位处的氨基酸。
本文所指的“抗体”是含有至少一个重链(HC)可变结构域(VH)或轻链(LC)可变结构域(VL)的蛋白质。抗体通常含有VH和VL两者。VH和VL被详细地描述在例如Kabat等，《具有免疫学意义的蛋白质序列》(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,NIH Publication No.91-3242,1991,pp.xvi-xix和pp.103-533中，其通过引用并入本文。“抗体”包括具有不同形式的分子，例如单链Fv抗体(scFv，其含有通过接头连接的VH和VL)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv:Fc抗体(如Carayannopoulos和Capra，《基础免疫学》(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY)第三版，Paul主编，Raven Press,New York，1993，第9章，pp.284-286中所描述的，其通过引用并入本文)和如下所定义的IgG抗体，以及许多其他可能的形式。
本文所指的“双特异性T细胞衔接器(BiTE)”描述在例如Huehls等，(2015)，“用于癌症免疫疗法的双特异性T细胞衔接器”(Bispecific T cell engagers for canerimmunotherapy)，Immunol.Cell Biol.93(3):290-296中，其通过引用并入本文。
“化学治疗剂”靶向分裂的细胞，并干扰与细胞分裂相关的过程(例如DNA复制、RNA合成、蛋白质合成、有丝分裂纺锤体的组装、解体或功能)和/或在这些过程中发挥作用的分子(例如核苷酸或氨基酸)的合成或稳定性。因此，化学治疗剂可以杀死癌细胞和其他分裂的细胞。化学治疗剂在本领域是公知的。包括例如下述试剂：烷化剂(例如白消安、替莫唑胺、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、链脲佐菌素、甲基洛莫司丁、顺-二氨二氯铂、噻替哌和氮丙啶基苯醌)；无机离子(例如顺铂和卡铂)；氮芥类(例如盐酸美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和盐酸氮芥)；亚硝基脲类(例如卡莫司汀(BCNU))；抗肿瘤抗生素(例如阿霉素(多柔比星)、道诺霉素、光神霉素、柔红霉素、伊达比星、丝裂霉素C和博来霉素)；植物衍生物(例如长春新碱、长春地辛、长春花碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、VP-16和VM-26)；抗代谢药物(例如含或不含甲酰四氢叶酸的甲氨蝶呤、含或不含甲酰四氢叶酸的5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素和氟达拉滨)；鬼臼毒素类(例如依托泊苷、伊立替康和拓扑替康)；以及放线菌素D、达卡巴嗪(DTIC)、mAMSA、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、L-天冬酰胺酶和米托蒽醌。参见例如《癌症：肿瘤学原理与实践》(Cancer:Principles and Practice of Oncology)，第4版，DeVita等主编，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa(1993)，其相关部分通过引用并入本文。
其他化学治疗剂包括那些通过与上面列出的相同的通用机制起作用的化学治疗剂。例如，通过烷基化DNA起作用的药剂，例如烷化剂和氮芥，被认为是化学治疗剂。干扰核苷酸合成的药剂，例如甲氨蝶呤、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶和吉西他滨，被认为是化学治疗剂。有丝分裂纺锤体毒素，例如紫杉醇和长春花碱，被认为是化学治疗剂。干扰DNA复制的拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼毒素类)被认为是化学治疗剂。通过各种机制干扰DNA合成的抗生素例如多柔比星、博来霉素和丝裂霉素，被认为是化学治疗剂。将氨基酸氨基甲酰化(例如洛莫司汀、卡莫司汀)或消耗天冬酰胺库(例如天冬酰胺酶)的药剂也被认为是化学治疗剂。《默克诊断和治疗手册》(Merck Manual ofDiagnosis and Therapy)，第17版，第11节，血液学和肿瘤学(Hematology and Oncology)，144，癌症治疗原理(PrinciplesofCancer Therapy)，表144-2(1999)。在化学治疗剂中特别包括那些直接影响受上述化学治疗剂影响的相同细胞过程的化学治疗剂。
在抗体混合物的上下文中，本文所指的“同源”HC是已知与特定LC配对以形成特定抗原的结合位点的HC。例如，如果已知全长IgG抗体X与抗原X结合，则抗体X的HC是抗体X的LC的同源HC，反之亦然。此外，如果抗体混合物包含抗体X和与抗原Y结合的抗体Y两者，则抗体Y的HC相对于抗体X的LC是“非同源的”，反之亦然，并且抗体Y的LC相对于抗体X的HC是“非同源的”，反之亦然。
“互补决定区”(CDR)是VH或VL内的高变区。每个VH和VL含有三个CDR，被称为CDR1、CDR2和CDR3。CDR在抗体表面上形成环，并主要负责确定抗体的结合特异性。CDR散布在四个更保守的构架区(被称为FR1、FR2、FR3和FR4)之间，如下所述：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。Kabat等人将VH CDR定位如下：CDR1位于第31-35位处(可能的插入编号为35A和35B)；CDR2位于第50-65位处(可能的插入编号为52A-52C)；CDR3位于第95-102位处(可能的插入编号为100A-100K)。Kabat等，同上，第xvii节。在本文中除了认为VH CDR1包括第26-35位之外，本文中使用重链CDR的这些位置。Kabat等人将VL CDR定位如下：CDR1位于第24-34位处(可能的插入编号为27A-27F)；CDR2位于第50-56位处；CDR3位于第89-97位处(可能的插入编号为95A-95F)。Kabat等，同上，第xvii节，其通过引用并入本文。本文中使用VL的CDR的这些位置。上面直接使用的编号方案是由Kabat等人使用的方案，并且在Kabat等，同上，第103-539页中举例说明。
如果两种治疗/药物在同一个短的时间范围内例如在同一天或同一更长时间范围内施用，则一种治疗或药物被认为与另一种治疗或药物“同时”施用。这种更长时间范围可以包括下述情况，即例如一种治疗/药物每周施用一次，另一种每4天施用。尽管这两种治疗/药物可能从不或很少在同一天施用，但这两种疗法/药物在几周、几个月或更长的共同时段内持续施用。同样，如果一种药物每年施用一次，另一种药物每周施用一次，如果每周施用的药物是在每年施用一次的药物施用的前一年和/或后一年期间施用，则它们被视为“同时”施用。因此，正如本文所指，两种治疗/药物的“同时”施用包括在共同时间段内使用两种不同治疗/药物进行的持续治疗。
当与正经历治疗的癌症患者相结合使用时，“完全应答”(CR)如RECIST指南(1.1版)中所述进行评估。Eisenhauer等，(2009)，实体瘤的反应评估新标准：修订的RECIST指南(New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline)(1.1版)，Eur.J.Cancer 45:228-247，其整体并入本文。这些指南描述了通过在基线时测定所有可测定肿瘤(最多可达五个肿瘤)的直径来评估总体肿瘤负荷。将这些直径相加以确定总和。这些测定的肿瘤被称为“靶病变”。在CR中，所有靶病变在研究过程中都已变得无法检测到。
当与正经历治疗的癌症患者相结合使用时，“部分应答”(PR)也如RECIST指南(1.1版)中所述进行评估。在被评定为具有PR的患者中，靶病变的直径总和与基线时这些直径的总和相比，在治疗过程中减小了至少30％。
当与正经历治疗的癌症患者相结合使用时，“疾病进展”(PD)也如RECIST指南(1.1版)中所述进行评估。在被评为具有PD的患者中，靶病变的直径总和与研究过程中检测到的最小直径总和相比增加了至少20％。这个最小的总和可以是在基线时检测到的总和，或者是在研究中晚些时候检测到的总和。此外，增加至少20％的总和也必须显示出至少5mm的绝对增加。一个或多个新肿瘤的出现也被认为是PD。
当与正经历治疗的癌症患者相结合使用时，“疾病稳定”(SD)也如RECIST指南(1.1版)中所述进行评估。SD意味着与研究过程中检测到的最小直径总和相比，靶病变的直径总和既没有缩小到足以符合PR的条件，也没有增加到足以符合PD的条件。这个最小的总和可以是在基线时检测到的总和，或者是在研究中晚些时候检测到的总和。
“客观应答率”(ORR)是指实现PR的患者的百分比和实现CR的患者的百分比之和。
“疾病控制率”(DCR)是指实现PR的患者的百分比、实现CR的患者的百分比和实现SD的患者的百分比之和。
正如本文中所指的，当第一核酸序列在转录和翻译时可以根据遗传密码提供用于产生包含氨基酸序列的蛋白质的蓝图时，所述第一核酸序列“编码”所述氨基酸序列。所述第一核酸序列还“编码”由已引入包含所述第一核酸序列的多核苷酸的宿主细胞生产，但不由不含包含所述第一核酸序列的多核苷酸的相同宿主细胞生产的蛋白质所包含的氨基酸序列。这样的氨基酸序列将在很大程度上如遗传密码所预测的那样，但可能(也可能不)包含改变氨基酸序列的翻译后修饰。这种轻微改变的氨基酸序列事实上由所述第一核酸序列编码，并且在本文中被认为由所述第一核酸序列编码，所述第一核酸序列实际上充当其生产的蓝图，即使它与预测的氨基酸序列相比可能包含少量变化。
本文所指的“Fc片段”、“Fc区”或“Fc部分”基本上由HC的铰链结构域(铰链)、第二HC恒定结构域(CH2)和第三HC恒定结构区(CH3)组成，尽管在某些同型例如IgA或IgM中它可能进一步包含CH3下游的区域例如第四HC恒定结构域(CH4)。
本文所指的“重链(HC)”至少包含VH、第一HC恒定结构域(CH1)、铰链、CH2和CH3。包含所有这些结构域的HC也可以被称为“全长HC”或“IgG HC”(在HC为IgG同型的情况下)。某些同型例如IgA或IgM可以含有额外的序列，例如IgM CH4结构域。
“人”核苷酸或氨基酸序列、蛋白质或抗体是指在人体中天然存在的序列或蛋白质，或除了如下所解释的少量改变之外与这种序列或蛋白质相同的序列或蛋白质。许多人核苷酸和氨基酸序列已报道在例如Kabat等，同上，其说明了“人”一词在本领域中的使用。本文所指的“人”氨基酸序列或抗体相对于天然存在的序列可以含有一个或多个插入、缺失或取代，前提是“人”氨基酸序列在天然存在的序列中的每100个氨基酸中不包含超过10个单氨基酸的插入、缺失和/或取代。类似地，人核苷酸序列在天然存在的序列中的每300个核苷酸中不包含超过30个单核苷酸的插入、缺失和/或取代。在VH或VL序列的特定情况下，CDR预期是极易可变的，并且为了确定特定VH或VH氨基酸序列(或编码它的核苷酸序列)是否是“人”序列的目的，CDR(或编码它们的核苷酸)不被视为所述序列的一部分。
本文所指的“人源化”抗体是非人类起源的，但已被尽可能多地工程化改造为人的，从而有望降低在人中的免疫原性，同时保持抗体的稳定性和结合特性的抗体。一般来说，这意味着大部分或全部恒定结构域和可变结构域的框架区是人序列或接近人的序列，而CDR源自不同的生物体。然而，仅仅将来自例如小鼠抗体的CDR嫁接到人框架中可能不能产生具有所需性质的抗体，并且可能需要进一步的修饰。近年来，已经开发了各种方法来简化和改进人源化的结果。参见例如Choi等，(2015)，mAbs 7(6):1045-1057和其中引用的参考文献。
本文所指的“IgG抗体”包括(1)两个HC，其各自包含VH、CH1、铰链、CH2和CH3，以及(2)两个LC，其各自包含VL和LC恒定结构域(CL)。IgG抗体的重链是IgG同型的，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。这些结构域描述在例如Kabat等，同上，第xv-xix和647-699页，这些页通过引用并入本文。所述CL可以是κ(CLκ)或λ(CLλ)结构域。
本文所指的“免疫调节分子”是与可以介导免疫系统的活性的组分(例如蛋白质)相互作用，从而调节免疫系统的活性的分子。免疫系统的活性可以在下文实施例8中描述的巨细胞病毒(CMV)回忆应答测定中进行评估，并且免疫调节分子可以在所述测定中相对于阴性对照分子提高或降低活性。例如，本文所述的抗hPD1 PSB103抗体和PSB205抗体混合物是符合该定义的免疫调节分子。
本文所指的“轻链(LC)”包括VL和CL，所述CL可以是CLκ或CLλ。这些结构域(包括其示例性氨基酸序列)描述在例如Kabat等，同上，第xiii-lix、103-309和647-660页中，其通过引用并入本文。
在抗体混合物的上下文中，本文所指的抗体的“主要种类”是占所述混合物中抗体总量的至少10％的特定抗体。为了确定抗体混合物中存在多少主要种类，可以进行如美国临时申请62/342167的实施例5中所述和图14中所示的低pH阳离子交换(CEX)色谱(美国临时申请62/142167的所述部分通过引用并入本文)。这种方法由Chen等，(2010)，ProteinScience,19:1191-1204描述，其整体并入本文。简单来说，它利用Thermo PROPACTM WCX-10弱CEX柱，4x 250mm，前面添加50mm保护柱(PROPACTM WCX-10G)，并使用Waters Alliance2695高效液相色谱(HPLC)系统。色谱可以在30分钟内从100％缓冲液A(20mM乙酸钠，pH5.2)到100％缓冲液B(20mM乙酸钠和250mM氯化钠，pH 5.2)的线性梯度来进行。柱可以用高盐(1M氯化钠)清洗，并重新平衡到缓冲液A的起始条件。可以通过214nm处的吸光度在柱流出液中检测抗体。检测到的峰的相对量可以使用EMPOWERTM软件(Waters Corp.,Milford,MA,USA)来确定。低pH CEX可以区分不同的全长抗体种类，并且可以用于定量混合物中特定抗体种类的相对量。
本文所指的抗体混合物中的抗体“次要种类”占所述混合物中抗体总量的10％以下。这可以通过如“主要种类”的定义中所述的低pH CEX色谱来确定。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。
本文所指的“溶瘤病毒”是一种与正常细胞相比优先裂解癌细胞的病毒。溶瘤病毒可以是天然存在的，也可以在实验室中构建。溶瘤病毒的实例包括腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯性疱疹病毒、新城疫病毒和痘苗病毒。
本文所指的“PSB103”是指由编码SEQ ID NO：1和5的氨基酸序列的DNA编码的抗hPD1 IgG4抗体。
本文所指的“PSB105是指由编码SEQ ID NO：13和17的氨基酸序列的DNA编码的抗hCTLA4 IgG1抗体。
本文所指的“PSB205”是如上所定义的PSB105和PSB103的抗体混合物，其中所述混合物中PSB105:PSB103的重量/重量(w/w/)比例分别为1:1至1:4，并且其中所述混合物不含PSB105和PSB103之外的抗体的主要种类。
本文所指的“放射”用于治疗癌症。本文所指的放射治疗可以包括使用例如光子、质子或电子束的外部束放射和/或内部放射。外部放射有很多种，包括3-D构象放射疗法、调强放射疗法(IMRT)、图像引导放射疗法(IGRT)、立体定向放射外科和立体定向身体放射疗法。内部放射方法包括例如使用放射活性物质例如放射活性碘的近距离放射疗法或全身施用。
本文所指的食蟹猴中的“单剂量研究”是仅向猴施用一剂量待测试药物的药代动力学研究。这种研究基本上如实施例3中所述进行，但应理解与实施例3中所述方法相比的少量变化，例如施用药物的剂量或施用药物的猴的数量的变化，仍被认为在本文所指的“单剂量研究”范围之内。
本文所指的“食蟹猴中单剂量研究中的体内半衰期(t1/2)”基本上如下文实施例3中所述确定。由与实施例3中描述的方案相比具有少量变化的方案(例如测试不同剂量和/或测试不同数量的猴)得到的体内t1/2，也被认为是本文所指的“食蟹猴中单剂量研究中的体内t1/2”。
本文所指的“靶向生物制剂”是可以通过其与另一种特定分子(可以是蛋白质)的相互作用影响细胞生物学状态的某个方面的蛋白质。例如，“靶向生物制剂”可能影响细胞生存、增殖、产生特定细胞因子或蛋白质等的能力。例如，本文所述的抗hPD1抗体是“靶向生物制剂”，因为它们与PD1相互作用，这在T细胞中引起许多生物学效应，包括提高增殖和提高IFNγ生产。
本文所指的“靶向抑制剂”是可以通过其与特定细胞分子(可以是蛋白质)的相互作用影响细胞生物学状态的某个方面的小分子。例如，“酪氨酸激酶抑制剂”是一种通过其与酪氨酸激酶的相互作用影响酪氨酸激酶的活性(影响多种细胞功能)的小分子。
本文所指的对特定疾病或病症的“治疗”是指一个作用过程，其可以包括施用一种或多种抗体或编码一种或多种抗体的多核苷酸，导致在被认为反映了疾病或病症的人类患者或动物模型系统中一种或多种症状的减轻、或者减少或中断。可选地或此外，治疗可以改变被认为反映了所述疾病或病症的体外基于细胞测定的结果。这些差异可以通过对人类或动物中的症状的客观测定或通过对基于细胞的测定中的各种参数(例如一种或多种细胞因子例如IFNγ的产生、细胞增殖、细胞死亡、细胞毒性免疫细胞例如T细胞的增殖等)的测定来确定。例如，对于癌症“治疗”来说，治疗可能导致肿瘤体积减小，在人类或动物模型系统中没有预期的肿瘤转移，生存时间增加，或患有癌症的人类或动物的无进展或无病生存时间增加。癌症治疗可能导致在基于细胞的测定中指示免疫系统激活的指数增加，例如抗原特异性T细胞的数量增加和/或T细胞的细胞因子例如IFNγ和/或IL-2的生产增加。
抗hPD1抗体
本文所述的抗hPD1抗体可以是人或人源化IgG抗体。本文所述的抗hPD1抗体的HC可以是人或人源化IgG HC，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4HC。在一些实施方式中，该HC是IgG4HC。一方面，该HC可以由SEQ ID NO：2的核酸序列编码。由SEQ ID NO：2编码的示例性氨基酸序列包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：10或相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10包含4、3、2或1个改变的氨基酸序列。由多核苷酸编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如通过遗传密码预测的氨基酸序列发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：10，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hPD1抗体的HC中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HC的抗hPD1抗体，可以在含有编码包含SEQID NO：1的氨基酸序列的HC的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hPD1抗体的HC的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10可以包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个改变，与编码所述HC的氨基酸序列的核酸序列无关。
混合物中的抗hPD1的VH可以由编码氨基酸序列例如SEQ ID NO：3和/或SEQ IDNO：9的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：9包含4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：4。由SEQ ID NO：4编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：3发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ IDNO：9，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hPD1抗体的VH中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VH的抗hPD1抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hPD1抗体的VH的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述VH的氨基酸序列的核酸序列无关。
另一方面，本文所述的抗hPD1抗体可以包含由编码SEQ ID NO：3的核酸序列编码的VH，并且可以包含具有SEQ ID NO：1中包括的氨基酸序列之外的其他氨基酸序列的恒定结构域，例如来自IgG1、IgG2或IgG3抗体的恒定结构域，其可以是也可以不是人类抗体或人源化抗体。
本文所述的抗hPD1抗体的LC可以是包含CLκ或CLλ的人或人源化IgG LC。在一些实施方式中，所述CL包含CLκ。本文所述的抗hPD1抗体的LC可以由编码SEQ ID NO：5和/或SEQID NO：12的氨基酸序列的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：5包含4、3、2、或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：6。由SEQ ID NO：6编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：5发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ IDNO：12，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hPD1抗体的LC中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的LC的抗hPD1抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的LC的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hPD1抗体的LC的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述LC的氨基酸序列的核酸序列无关。
本文所述的抗hPD1抗体的VL可以由编码SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：11的氨基酸序列的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：7包含4、3、2、或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：8。由SEQ ID NO：8编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：7发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：11，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hPD1抗体的VL中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL的抗hPD1抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VL的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hPD1抗体的VL的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述VL的氨基酸序列的核酸序列无关。
另一方面，本文所述的抗hPD1抗体可以包含由编码SEQ ID NO：7的核酸序列编码的VL，并且可以包含具有SEQ ID NO：5中包括的氨基酸序列之外的其他氨基酸序列的恒定结构域。例如，这种CL可以是λ或κCL，其可以来自也可以不来自人类抗体或人源化抗体。
此外，本文所述的抗hPD1抗体可以具有各种功能属性。一方面，此类抗hPD1抗体可以与人和食蟹猴PD1结合，但不与鼠PD1、人PDL1、人CD28或人CTLA4结合。这些功能方面在实施例2和7以及图5中得到证实。因此，本文所述的抗hPD1抗体可以表现出与人PD1和密切相关的抗原食蟹猴PD1的特异性结合。尽管不是所有可能的相关抗原都已测试，但实施例2和7和图5中提供的测试结果定义了本文所指的与人PD1“特异性”结合的含义。
另一方面，本文所述的抗hPD1抗体可以阻断人PDL1(hPDL1)与hPD1的结合。这种性质通过WO 2018/089293的实施例7以及图13和14中所示的数据得到证实，其通过引用并入本文。
另一方面，本文所述的抗hPD1抗体可以以不超过1x 10-51/s、7x 10-41/s、5x 10- 41/s、3x 10-41/s或2x 10-41/s的kd和/或不超过30nM、20nM、10nM、7nM、5nM或4nM的KD结合包含人PD1的细胞外结构域的单体分析物。另一方面，本文所述的抗hPD1抗体可以以不超过2x10-51/s、1x 10-51/s、9x 10-41/s、8x 10-41/s、7x 10-41/s或6x 10-41/s的kd和/或不超过30nM、20nM、10nM、8nM、7nM或6nM的KD结合包含食蟹猴PD1的细胞外结构域的单体分析物。这种动力学测定可以如实施例7中所述使用Biacore光学生物传感器来确定。此类单体分析物包括例如与组氨酸标签(his标签)和/或谷胱甘肽S-转移酶标签(GST标签)融合的hPD1或食蟹猴PD1(cPD1)的细胞外结构域。相反，与抗体的Fc区融合的hPD1或cPD1的细胞外结构域不是本文所指的单体分析物，因为它将二聚化。
另一方面，本文所述的抗hPD1抗体在食蟹猴中的单剂量研究中可以具有约100-400、120-350、200-350、250-350或275-350小时范围内的体内半衰期(t1/2)。
此外，本文所述的抗hPD1抗体在以前未给药过所述抗hPD1抗体的人类受试者中可以具有135-300、135-275或140-250小时的体内t1/2。
此外，本文所述的抗hPD1抗体可以在其HC的氨基酸序列中包含228P。本讨论中使用的编号系统是Edelman等人的编号系统。Edelmann等，同上。这种编号可能并不完全对应于特定抗体的编号，因为抗体的各个部分的长度可以存在一些可变性。为避免疑问，该HC位置(228)对应于SEQ ID NO：1中的第227位。
抗hCTLA4抗体
本文所述的抗hCTLA4抗体可以是人或人源化IgG抗体。本文所述的抗hCTLA4抗体的HC可以是人或人源化IgG HC，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 HC。在一些实施方式中，该HC是IgG1 HC。一方面，该HC可以由SEQ ID NO：14的核酸序列编码。由SEQ ID NO：14编码的示例性氨基酸序列包括SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：22或相对于SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：22包含10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸序列。由SEQ ID NO：14编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：13发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：22，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hCTLA4抗体的HC中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HC的抗hCTLA4抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HC的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体的HC的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：22可以包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个改变，与编码所述HC的氨基酸序列的核酸序列无关。
混合物中的抗hCTLA4的VH可以由编码氨基酸序列例如SEQ ID NO：15和/或SEQ IDNO：21的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：21包含4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：16。由SEQ ID NO：16编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：15发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：21，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hCTLA4抗体的VH中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH的抗hCTLA4抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体的VH的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：21可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述VH的氨基酸序列的核酸序列无关。
本文所述的抗hCTLA4抗体的LC可以是包含CLκ或CLλ的人或人源化LC。在一些实施方式中，该LC可以包含CLκ。本文所述的抗hCTLA4抗体的LC可以由编码SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：24的氨基酸序列的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：17包含4、3、2、或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：18。由SEQ ID NO：18编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：17发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：24，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hCTLA4抗体的LC中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的LC的抗hCTLA4抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的LC的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体的LC的氨基酸序列相对于SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：24可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述LC的氨基酸序列的核酸序列无关。
本文所述的抗hCTLA4抗体的VL可以由编码SEQ ID NO：19和/或SEQ ID NO：23的氨基酸序列的核酸序列或编码相对于SEQ ID NO：19包含4、3、2、或1个改变的氨基酸序列的核酸序列编码。其中一个这种核酸序列是SEQ ID NO：20。由SEQ ID NO：20编码的氨基酸序列可以包含翻译后改变，使其序列相对于例如SEQ ID NO：19发生改变。此类翻译后修饰的确切性质可能取决于产生抗体的宿主细胞的性质。这种氨基酸序列的实例是SEQ ID NO：23，其反映了在CHO宿主细胞中制备的抗hCTLA4抗体的VL中发现的实际翻译后修饰。参见下面的实施例6。为了清楚起见，包含具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL的抗hCTLA4抗体，可以在含有编码包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL的核酸的宿主细胞例如CHO细胞中生产。另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体的VL的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：23可以包含4、3、2、1或0个改变，与编码所述VL的氨基酸序列的核酸序列无关。
此外，本文所述的抗hCTLA4抗体可以具有各种功能属性。一方面，此类抗hCTLA4抗体可以与人和食蟹猴CTLA4结合，但不与人PD1、鼠PD1、人PDL1或人CD28结合。这些功能方面在实施例2和7以及图5中得到证实。因此，本文所述的抗hCTLA4抗体可以表现出与人CTLA4和密切相关的抗原食蟹猴CTLA4的特异性结合。尽管不是所有可能的相关抗原都已测试，但实施例2和7以及图5中提供的测试结果定义了本文所指的与人CTLA4“特异性”结合的含义。
另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体可以阻断hCTLA4与其配体人B7-1和/或B7-1(hB7-1和/或hB7-2)的结合，并且可以阻断CTLA4对靶细胞的功能性效应。这些属性通过WO2018/089293的实施例4中所示的数据得到证实，该专利通过引用并入本文。
另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体可以以不超过5x 10-31/s、2x10-31/s、8x 10- 41/s、5x 10-41/s、1x 10-41/s或8x 10-51/s的kd和/或不超过30nM、20nM、10nM、7nM、5nM、4nM、3nM或2nM的KD结合包含人CTLA4的细胞外结构域的单体分析物。另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体可以以不超过5x 10-31/s、2x 10-31/s、8x 10-41/s、5x 10-41/s或4x 10-41/s的kd和/或不超过30nM、20nM、10nM、7nM、5nM、4nM或3nM的KD结合包含食蟹猴CTLA4的细胞外结构域的单体分析物。这种生物动力学测定可以如实施例7中所述使用Biacore光学生物传感器来确定。此类单体分析物的实例包括与his标签和/或GST标签融合的hCTLA4或cCTLA4的细胞外结构域。另一方面，与抗体的Fc区融合的hCTLA4或cCTLA4的细胞外结构域将不被认为是单体分析物，因为它将二聚化。
另一方面，本文所述的抗hCTLA4抗体在食蟹猴中可以具有约25-200、50-150或75-125小时范围内的单剂量血清半衰期。
此外，本文所述的抗hCTLA4抗体在以前未给药过所述抗hCTLA4抗体的人类受试者中可以具有90-210、100-195、100-140或140-250小时的体内t1/2。
此外，本文所述的抗hCTLA4抗体可以在其恒定结构域中的特定位点处包含特定氨基酸。它们可以包括下述一者或多者(或所有)：HC中的147D；HC中的170C；HC中的173C；HC中的220G；HC中的255K；HC中的399R；HC中的409E；LC中的131K；LC中的160C；LC中的162C；和LC中的214S。在本讨论中使用上文Edelmann等的编号系统。正如上文提到的，这种编号可能并不完全对应于特定抗体的氨基酸序列中的实际位置，因为抗体的各个部分的长度存在可变性。为避免疑问，这些HC位置(以与上述相同的顺序)对应于SEQ ID NO：13中的下述位置：第148、171、174、221、256、400和410位。这些LC位置(以与上述相同的顺序)对应于SEQ ID NO：17中的下述位置：第131、160、162和214位。本文所述的抗hCTLA4抗体可以包括由SEQ IDNO：16和20编码的可变结构域和序列未包括在SEQ ID NO：13、17、22和/或24中的恒定结构域，前提是这些恒定结构域在本段中提到的特定位置处含有所述特定氨基酸中的一者或多者(或所有)。此类抗体可以是具有κ或λLC的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，并且可以是人类抗体或非人类抗体。
抗体混合物
本文描述了一种包含两种主要种类的抗体的抗体混合物，包括上述的抗hPD1抗体和抗hCTLA4抗体。包含这两种抗体的混合物在本文中被称为PSB205。在一些实施方式中，PSB205不包含这两种主要种类的抗体之外的其他主要种类的抗体。在一些实施方式中，这种混合物可以在含有编码所述抗hPD1和抗hCTLA4抗体的核酸的宿主细胞中制备。在一些实施方式中，这些宿主细胞可以产生不含除所述抗hPD1和抗hCTLA4抗体之外的其他主要种类的抗体的混合物。因此，将这两种抗体与可能由宿主细胞产生的其他抗体种类分离可能是不必要的。或者，PSB205中的所述抗hPD1和抗hCTLA4抗体可以在单独的宿主细胞系中产生并以所需比例组合，以制备混合物PSB205。PSB205具有如下所述和下面的实施例中举例说明的特定性质。
一方面，PSB205可以包含本文所述的抗hCTLA4抗体和抗hPD1抗体，其重量/重量(w/w)比例(抗hCTLA4:抗hPD1比例)分别为约3:1至约1:4、约2:1至1:4、约1:1至约1:3、约1:1.5至约1:2.5或约1:1.7至约1:2.3。在一些实施方式中，该抗hCTLA4:抗hPD1比例可以分别是约3:1、2:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9或1:4。因此，PSB205可以包含与抗hCTLA4抗体的量相比更大数量的抗hPD1抗体或者与抗hPD1抗体的数量相比更大数量的抗hCTLA4抗体。该比例与PSB205中抗hCTLA4和抗hPD1抗体的性质例如其结合和药代动力学性质相结合，可以影响PSB205的功能性质。
一方面，在食蟹猴中的单剂量研究中作为PSB205的一部分的抗hPD1抗体的体内t1/2比PSB205中的抗hCTLA4抗体的体内t1/2更长。在食蟹猴中的单剂量研究中抗hCTLA4抗体与抗hPD1抗体相比，体内t1/2的比例(t1/2(CTLA4):t1/2(PD1))可以分别是约1:4至约1:1。更特别地，这种比例可以是约1:4、1:3.8、1:3.7、1:3.6、1:3.5、1:3.4、1:3.3、1:3.2、1:3.1、1:3、1:2.9、1:2.8、1:2.7、1:2.6、1:2.5、1:2.4、1:2.3、1:2.2、1:2.1、1:2、1:1.9、1:1.8、1:1.7、1:1.6、1:1.5、1:1.4、1:1.3、1:1.2、1:1.1或1:1。这些不同的t1/2与PSB205中两种抗体的w/w比例可以确保抗体混合物PSB205的给药递送的抗hPD1抗体的剂量高于抗hCTLA4抗体的剂量和/或慢于抗hCTLA4抗体的剂量的体内清除。
同样地，在以前未给药过所述抗hCTLA4抗体或抗hPD1抗体的人类患者中，t1/2(CTLA4):t1/2(PD1)可以为约1:3、1:2.75、1:2.5、1:2.25、1:2、1:1.75、1:1.5或1:1.25。
更具体而言，在食蟹猴中的单剂量研究中，包含在PSB205中的本文所述的抗hPD1抗体可以具有约150小时至约350小时的体内t1/2。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约275小时至约350小时、约280小时至约340小时、约290小时至约330小时或约290小时至约310小时。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约292、293、294、295、296、297、298、299、300、301或302小时。
在另一种情况下，在以前未给药过本文所述的抗hPD1抗体的人类患者中，作为PSB205抗体混合物的一部分的本文所述的抗hPD1抗体的t1/2可以是约120至约300小时、约135至约300小时或约140至约250小时。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约135、140、145、147、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、227、230、240、250或275小时。
在食蟹猴中的单剂量研究中，包含在PSB205中的本文所述的抗hCTLA4抗体可以具有约30小时至约130小时的体内t1/2。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约40小时至约200小时、约40小时至约150小时、约70小时至约130小时、约50小时至约120小时、约60小时至约110小时或约80小时至约110小时。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120小时。
另一方面，在以前未给药过本文所述的抗hCTLA4抗体的人类患者中，作为PSB205抗体混合物的一部分的本文所述的抗hCTLA4抗体的t1/2可以是约80至约250小时、约90至约210小时、约100至约195小时或约90至约140小时。在一些实施方式中，这种t1/2可以是约90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180或190小时。
另一方面，与抗hPD1抗体PSB103或抗hCTLA4抗体PSB105相比，PSB205在体内可以表现出协同功能性效应。例如，在肿瘤模型系统例如人类肿瘤的鼠类异种移植模型系统中，PSB205可以比单独的抗hPD1抗体PSB103或抗hCTLA4抗体PSB105更大的程度减小肿瘤体积和/或肿瘤直径。参见例如实施例9。另一方面，与单独的抗hPD1抗体或抗hCTLA4抗体相比，PSB205可以增加在CMV回忆应答测定中产生的巨细胞病毒(CMV)特异性T细胞的数量。实施例8。另一方面，将PSB205施用到人类癌症患者可以引起本文所定义的部分应答(PR)或完全应答(CR)。又一方面，与安慰剂施用相比，将PSB205施用到人类癌症患者可以导致更长的无进展生存期。此外，与单独施用本文描述的抗hPD1抗体或抗hCTLA4抗体相比，将PSB205施用到人类癌症患者可以导致更长的无进展生存期。
又一方面，PSB205的施用可以在人类患者中产生低水平的不良事件(AE)。如上所定义并且在本领域的标准出版物中(参见例如https://ctep.cancer.gov/ protocoldevelopment/electronic_applications/docs/ctca e_v5_quick_reference_ 5x7.pdf)，3级或4级AE是需要干预的严重事件。当然，AE的发生可能与药物剂量有关。一方面，剂量不超过约0.3mg/kg或不超过约24、21、18、15或12mg的PSB205可能不产生3级或4级AE。另一方面，剂量不超过约1.0mg/kg或不超过约90、80、70、60、50或40mg的PSB205可能不产生3级或4级AE。又一方面，剂量不超过约3.0mg/kg或不超过约270、240、210、180、150或120mg的PSB205可能在不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的给药患者中产生3级或4级AE，或者在一些实施方式中不在给药患者中产生3级或4级AE。又一方面，剂量不超过约5.0mg/kg或不超过约450、425、400、375、350、325、300、275、250、225或200mg的PSB205可能在不超过15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的给药患者中产生3级或4级AE，或者在一些实施方式中不在给药患者中产生3级或4级AE。
编码抗hPD1和/或抗hCTLA4抗体的多核苷酸
编码本文所述的抗hPD1或抗hCTLA4抗体或含有两种抗体的混合物即PSB205的核酸，可以如下文实施例1和4中所述或利用本文提供的序列和其他公开内容使用其他适合的方法制备。例如，鉴于本文的公开内容，可以合成编码本文所述的抗hPD1和抗hCTLA4抗体的DNA序列。另一方面，如本文所述的编码来自抗hPD1抗体和抗hCTLA4抗体的HC和LC的载体可以如实施例1所述来制备。
包含编码本文描述的抗hPD1抗体的HC、LC、VH和VL的特定核苷酸序列的多核苷酸分别包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的多核苷酸。这些序列分别编码下述氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。由于遗传密码的简并性，其他核苷酸序列也可编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。包含这些核苷酸序列的多核苷酸也在本文设想的多核苷酸的范围内。还设想了包含编码相对于SEQ ID NO：1具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含编码相对于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：7具有4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
包含编码本文描述的抗hCTLA4抗体的HC、LC、VH和VL的特定核苷酸序列的多核苷酸分别包括包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：20的多核苷酸。这些序列分别编码下述氨基酸序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：19。由于遗传密码的简并性，其他核苷酸序列也可编码SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19。包含这些核苷酸序列的多核苷酸也在本文设想的多核苷酸的范围内。还设想了包含编码相对于SEQ ID NO：13具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含编码相对于SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：19具有4、3、2或1个改变的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
包含编码本文描述的抗hPD1和/或抗hCTLA4抗体的多核苷酸的一个或多个载体可以制成各种载体中的任一者。所述载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞和/或用于在宿主细胞中维持和/或扩增载体的选择标记物。此类标记物包括例如(1)为原核宿主细胞提供对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性的基因，(2)补充细胞的营养缺陷型缺陷的基因，或(3)其操作提供从复杂或确定培养基中不能获得的关键营养物的基因。具体的选择标记物包括例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。博来霉素抗性或新霉素抗性基因也可用于在原核和真核宿主细胞两者中选择。正如本领域已知的，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和/或无启动子胸苷激酶基因可用于哺乳动物细胞。参见例如Kingston等，2002，使用CHO细胞表达载体的扩增(Amplificationusing CHO cell expression vectors)，《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols inMolecularBiology)，第16章，Unit 16.23,Wiley2002。
此外，载体可以含有维持载体和/或表达编码本文描述的抗体或抗体混合物的插入序列所需的一种或多种其他序列元件。此类元件包括例如复制原点、启动子、一种或多种增强子、转录终止子、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、外源序列(例如编码本文描述的抗体或抗体混合物的DNA)的多接头插入位点以及两个插入序列(例如编码HC和LC的DNA)之间的间插序列。可以选择这些序列元件以在所需宿主细胞中发挥作用，从而促进载体的复制和/或扩增以及插入到载体中的异源序列的表达。此类序列元件在本领域中是公知的，并且可以在大量可商购的载体中获得。
在一些实施方式中，编码本文所述的抗hCTLA4或抗hPD1抗体或本文所述的这些抗体的混合物即PSB205的多核苷酸，可以被携带在一种或多种病毒载体、任选为溶瘤病毒载体上。此类病毒载体的实例包括腺病毒、腺相关病毒(AAV)、反转录病毒、痘苗病毒、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)、疱疹病毒、慢病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒和痘病毒载体。在此类实施方式中，可以将这些含有编码本文描述的抗体或抗体混合物的多核苷酸的病毒载体施用到患者以治疗疾病。
例如，在癌症患者中，可以将此类含有编码抗体或抗体混合物的多核苷酸的病毒载体直接施用到患者体内的肿瘤或癌细胞的主要位点，例如通过注射、吸入(用于例如肺癌)、局部施用(用于例如皮肤癌)和/或施用到黏膜(核酸可以通过黏膜被吸收)以及其他许多可能性。或者，此类病毒载体可以系统性施用，例如口服、局部、通过黏膜或通过皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或腹膜注射，正如本文所描述的。
类似地，编码本文所述的抗hCTLA4或抗hPD1抗体的多核苷酸或这些抗体的混合物可以被包裹在载体结构例如脂质体中，其可以被施用到患有疾病的患者。本文设想的多核苷酸包括RNA和DNA，以及例如比天然存在的DNA和/或RNA更稳定和/或更有效的化学修饰的多核苷酸。参见例如Burnett和Rossi，(2012)，基于RNA的治疗剂—当前进展和未来前景(RNA-based therapeutics-current progress and future prospects)，Chem.Biol.19(21):60-71。这些被包裹的多核苷酸可以直接施用到患者体内的肿瘤或癌细胞的主要部位，例如通过注射、吸入(用于例如肺癌)、局部施用(用于例如皮肤癌)和/或施用到黏膜(核酸可以通过黏膜被吸收)以及其他许多可能性。或者，此类被包裹的多核苷酸可以系统性施用，例如口服、局部、通过黏膜或通过皮下、静脉内、动脉内、肌肉内或腹膜注射，正如本文所描述的。
药物组合物
本文描述的抗体、抗体混合物、多核苷酸和/或载体可以在药学上可接受的制剂中施用。对于抗体混合物来说，每种抗体可以单独地或一起配制并施用。许多药物制剂在本领域中是已知的。许多此类制剂描述在《REMINGTON药物学科学与实践》(REMINGTON:THESCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY)第21版，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005中，其相关部分通过引用并入本文。这种药学上可接受的制剂可以是例如液体如溶液或悬液、固体如丸剂、胶囊、糊剂或凝胶。液体制剂可以含有例如下述组分中的一者或多者：缓冲剂、赋形剂、盐、糖、去污剂和螯合剂。可以对它进行设计以保留所述抗体、抗体混合物、多核苷酸或载体的功能并被患者良好耐受。
对于抗体或抗体混合物来说，药物组合物可以具有约4.5至约7.5、约4.5至约7.0、约4.5至约6.5、约4.5至约6.0或4.5至约5.5的pH。这种制剂中的抗体浓度可以是约5mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约35mg/mL、约15mg/mL至约30mg/mL或约20mg/mL至约30mg/mL。这种组合物的渗透浓度可以在约250mOsm/kg至约380mOsm/kg、约260mOsm/kg至约350mOsm/kg、约275至约295mOsm/kg和/或约280mOsm/kg至约290mOsm/kg的范围内。此类组合物可以包含糖，例如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇，以及许多其他可能性。此类组合物可以包含盐，例如钠盐、盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐或磷酸盐，以及许多其他可能性。此类组合物可以包含表面活性剂，例如聚山梨酸酯-20以及许多其他可能性。
多核苷酸和蛋白质(例如抗体)通常肠胃外而不是口服施用。取决于制剂，口服施用可以使所述蛋白质或多核苷酸经历胃的酸性环境，这可能失活所述蛋白质或多核苷酸，例如通过水解蛋白质。在一些实施方式中，特定制剂可能允许特定蛋白质或多核苷酸的口服施用，其中所述蛋白质或多核苷酸对胃酸不敏感或被充分保护以免受酸性环境影响，例如通过丸剂或胶囊上的特定包衣。制剂也可以通过黏膜施用，包括例如鼻内、阴道、直肠或口服施用，或作为吸入剂施用。在一些实施方式中，制剂也可以局部施用。通常，抗体和多核苷酸通过液体制剂的胃肠外注射施用，例如通过皮下、静脉内、动脉内、病变内(例如肿瘤内)、肌肉内或腹膜注射。
作为小分子的靶向抑制剂可以口服或通过如上所述的其他方法施用。用于口服施用的适合制剂可以包括例如液体如溶液或悬液、糊剂、凝胶、胶囊或固体如丸剂。
含有编码抗hCTLA4和/或抗hPD1抗体的核酸的宿主细胞
编码本文所描述的抗hCTLA4或抗hPD1抗体或其混合物的核酸或携带此类核酸的载体可以被单独、同时或依次导入(例如通过转染、转导、脂质转染、转化、用微弹轰击、显微注射或电穿孔)宿主细胞中。在一些实施方式中，它们可以如实施例4中所述依次导入。此类含有编码本文所述的抗hPD1和/或抗hCTLA4抗体的核酸的宿主细胞可以含有编码本文所述的抗hPD1和抗hCTLA4抗体两者的核酸。
这些宿主细胞可以是哺乳动物、原生动物、真菌、植物或细菌细胞。更具体来说，革兰氏阴性或革兰氏阳性原核生物例如细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)可以用作宿主细胞。在其他实施方式中，宿主细胞可以是真核细胞，包括诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的物种或克鲁维酵母菌属、假丝酵母属、夜蛾属(Spodotera)的真核生物或能够表达异源多肽的任何细胞。
在其他实施方式中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。许多适合于表达异源多肽的哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并且可以从包括例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)在内的多个供应商获得。适合的哺乳动物宿主细胞系包括例如COS-7细胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或它们的衍生物例如VeggieCHO及相关细胞系(它们在无血清培养基中生长)(Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)、CHO-K1和CHO pro-3细胞系和它们的衍生物例如DUKX-X11和DG44细胞系(它们缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性)、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞(例如ATCC CRL 10)、源自非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系(如McMahan等，1991,EMBO J.10:2821所述)、人胚胎肾(HEK)细胞例如293、293EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞、HepG2/3B细胞、KB细胞、NIH 3T3细胞、S49细胞和小鼠骨髓瘤细胞(包括NS0和Sp2/0细胞)。也可以使用能够表达异源多肽的其他原核、真核或哺乳动物细胞类型。
更详细来说，含有编码本文所述的抗hCTLA4抗体和抗hPD1抗体的混合物即PSB205的核酸的宿主细胞系例如CHO细胞系，可以以例如约1:2(抗hCTLA4:抗hPD1)的稳定比例产生这两种抗体。在一些实施方式中，由宿主细胞产生的抗体的抗hCTLA4:抗hPD1比例可以是约3:1至约1:4、约2:1至1:4、约1:1至约1:3、约1:1.5至约1:2.5或约1:1.7至约1:2.3。在其他实施方式中，由宿主细胞产生的抗体混合物中的抗hCTLA4:抗hPD1比例可以是约3:1、2:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9或1:4。在其他实施方式中，由宿主细胞产生的抗hCTLA4:抗hPD1比例可以是约1:1.8至约2.2。细胞的群体倍增水平(PDL)为至少约30、35、40、45、50、60、70、80、90或100时，可以维持这种比例。
另一方面，本文所描述的宿主细胞例如CHO细胞系可以在其细胞上清液中产生总量为至少约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5或3克/升(g/L)的抗体。在其他实施方式中，宿主细胞的抗体产量可以在一个或多个下述范围内：1.0-4.0g/L、1.0-3.0g/L、1.0-2.0g/L、2.0-4.0g/L、0.5-2.0g/L、0.5-1.5g/L、0.6-1.4g/L、0.7-1.3g/L、0.8-1.2g/L或0.9-1.2g/L。
另一方面，可以产生PSB205的CHO宿主细胞系的细胞倍增时间可以是约18-32、18-30、19-28或20-25小时。此外，这种宿主细胞系可以在10-200、20-200、10-175、20-150、20-100、20-60或10-60的群体倍增水平(PDL)下将其倍增时间维持在这个范围内。本文所指的PDL是群体中的细胞自其从冷冻细胞库解冻后倍增的次数。
制备抗体或抗体混合物的方法
本文描述的抗体和抗体混合物可以通过各种方法制备。本文所描述的抗hPD1和/或抗hCTLA4抗体可以如下制备：将编码一种或多种所述抗体的多核苷酸导入宿主细胞中，培养所述宿主细胞，从细胞团或细胞上清液回收一种或多种所述抗体，和任选地纯化所述抗体。
在一些实施方式中，本文所描述的抗体混合物可以在两个独立的宿主细胞系中制备，其中一者产生抗hPD1抗体，另一者产生抗hCTLA4抗体。在这样的实施方式中，所述两个宿主细胞系可以单独或一起培养，并且可以从细胞上清液或细胞团纯化它们产生的一种或多种抗体。在一些实施方式中，将宿主细胞系单独培养，并将细胞上清液或细胞团合并，然后纯化抗体。在其他实施方式中，将所述两个细胞系单独培养，并分别从两种细胞上清液或细胞团纯化抗体。在其他实施方式中，将所述两个宿主细胞系一起培养，并从细胞上清液或细胞团纯化抗体。当两个细胞系单独培养时，抗体可以以任何所需比例组合。可以根据需要进行纯化，包括可能的步骤例如蛋白A柱层析、阴离子或阳离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水相互作用层析、通过沉淀策略的各种纯化等。
在另一个实施方式中，本文所描述的抗体混合物可以在单个宿主细胞系中制备，例如实施例4中所描述的克隆CHO细胞系，其含有编码抗hPD1和抗hCTLA4抗体两者的多核苷酸。在这种情况下，培养所述宿主细胞系，并从细胞上清液或细胞团分离由所述宿主细胞产生的抗体。产生本文所描述的抗体混合物的宿主细胞系产生至多三种或两种主要种类的抗体。可以根据需要进行进一步纯化，包括可能的步骤例如蛋白A柱层析、阴离子或阳离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水相互作用层析、通过沉淀策略的各种纯化等。在一些实施方式中，所述宿主细胞系只产生两种主要种类的抗体，即本文所描述的抗hPD1抗体PSB103和抗hCTLA4抗体PSB105。在这种情况下，可能不必将这些种类从在某些情况下可能存在于所述宿主细胞产生的抗体种类中的其他抗体种类中纯化出来。在这种情况下，抗体混合物PSB205可以使用单一生产和纯化过程来生产。
治疗方法
可以将抗hCTLA4或抗hPD1抗体或其混合物即PSB205或编码任何这些治疗剂的多核苷酸或载体施用到人类患者，以治疗各种病症。任选地，此类疗法可以肠胃外施用，但如果所述治疗剂被特别配制以使口服施用成为可能而不在胃的酸性环境中破坏所述治疗剂的情况下，则口服途径也是可能的。在一些实施方式中，此类治疗剂可以通过注射施用，任选地例如通过肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、皮内或肿瘤内注射。在一些实施方式中，治疗剂的施用可以通过黏膜进行。此类施用途径包括例如鼻、直肠或阴道施用或在眼睑或舌下(不吞咽)施用或通过吸入施用。
PSB205的剂量可以是至少0.1mg/kg且不超过5、10或15mg/kg。在一些实施方式中，所述剂量可以小于或等于10、8、5、3、2或1mg/kg和/或至少0.1、0.3、1、2或3mg/kg。在一些实施方式中，所述剂量可以是约0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg或9mg/kg。此外，剂量可以被定义为具体的量而不依赖于患者的体重。这种剂量可以在约5mg至约800mg的范围内。在特定实施方式中，这种剂量可以是不超过800、700、600、550、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、100、75或50mg和/或至少约60、80、100、150、200、250或300mg。此外，剂量可以是约125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或450mg。或者，剂量可以相对于患者皮肤的表面积来定义。例如在一些实施方式中，剂量可以是至少3.5mg/mm2并且不超过180mg/mm2。在一些实施方式中，剂量可以是不超过400、350、300、350、200、180、150、110、75、50、40、30、25、12、10、7.5或5mg/mm2和/或至少0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、50、75或100mg/mm2。
抗hCTLA4或抗hPD1抗体的剂量可以是至少0.033mg/kg且不超过3.35、6.7或10mg/kg。在一些实施方式中，剂量可以小于或等于10、6.7、4.8、3.35、2或0.67mg/kg和/或至少0.033、0.1、0.33、0.67或1mg/kg。在一些实施方式中，剂量可以是约0.033mg/kg、0.1mg/kg、0.67mg/kg、1.0mg/kg、1.67mg/kg、3.0mg/kg、3.33mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg或10mg/kg。此外，剂量可以被定义为具体的量而不依赖于患者的体重。这种剂量可以在约60mg至约700mg的范围内。在特定实施方式中，这种剂量可以是不超过700、600、500、450、400、350、300、250、215、170、130、100或70mg和/或至少约0.033、0.1、0.7、1.5、2、2.7、3.5、5、7、10、15、17、20、25、35、45、55、65、100或150mg。或者，剂量可以相对于患者皮肤的表面积来定义。例如，剂量可以是至少0.1、0.5或1.1mg/mm2并且不超过350、300、250、200或130mg/mm2。在一些实施方式中，剂量可以是不超过300、200、130、120、100、75、50、35、30、20、15、10、7.5、5或3mg/mm2和/或至少0.18、0.3、1、2、3、6、10、17、25、33、66或80mg/mm2。
编码PSB205或单独的抗hCTLA4或抗hPD1抗体的多核苷酸或含有此类多核苷酸的载体的剂量可以是至少约109、1010、1011、1012、1013个拷贝的多核苷酸或载体/千克患者体重(拷贝/kg)。另一方面，这种剂量可以是至多约6x 1014、7x 1014、8x 1014、9x 1014或1015个拷贝/kg。又一方面，这种剂量可以是约1010个拷贝/kg至约1014个拷贝/kg。或者，剂量可以是约109、1010、1011、1012、1013、5x 1013、1014、2x 1014、3x 1014、4x 1014、5x 1014、6x 1014、7x1014、8x 1014、9x 1014、1015或1016个拷贝的多核苷酸，与患者体重无关。
以上文讨论的量施用的频率可以进行调整。在一些实施方式中，抗hCTLA4或抗hPD1抗体、PSB205或编码这些治疗剂中的任一者的多核苷酸可以每三周施用一次。在其他实施方式中，此类治疗剂可以每周两次、每周一次、每10天一次、每两周一次或每3、4、5、6、7、8、9或10周一次施用。在其他实施方式中，此类治疗剂可以每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月施用一次。
抗hCTLA4或抗hPD1抗体、PSB205或编码它们中的任一者的多核苷酸可用于治疗患有各种病症的人类患者。由于此类治疗剂可以增强免疫应答的某些方面，它们通常可用于的病症包括免疫应答增强是有帮助的病症。本文所指的免疫应答是否被特定治疗剂增强，可以通过实施例8中所描述的CMV回忆应答测定来评估。可以使用上述治疗剂治疗的病症包括感染、免疫缺陷病症和各种癌症，包括但不限于黑素瘤、肺癌(包括鳞状非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌或胃食管癌、透明细胞或非透明细胞肾细胞癌、尿路上皮癌、软组织或骨肉瘤、间皮瘤、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、梅克尔细胞癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肝细胞癌、卵巢癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)或DNA错配修复缺陷型(dMMR)成人和儿童实体瘤、肾透明细胞肉瘤、结肠直肠癌、食管癌(包括食管鳞状细胞癌)、子宫内膜癌、高肿瘤突变负荷癌和皮肤鳞状细胞癌。
一方面，使用PSB205治疗可能导致一定百分率的患者发生某些不良事件(AE)，这可能取决于施用剂量和/或给药频率。它也可能取决于可能与PSB205同时施用的其他药物的存在。为了确定与PSB205相关的AE，同时接受已知会导致重大AE的其他药物或治疗例如化疗或放疗的患者被排除。在某些情况下，AE可以包括严重AE，如3级或4级AE。为了确定在特定剂量和给药频率下经历3级或4级AE的患者的百分率，可以对至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100位或更多患者给药。在一些实施方式中，当对十位或更多患者每三周一次给药不超过3mg/kg的PSB205时，不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的给药患者经历3级或4级AE。在其他实施方式中，这些患者都不经历3级或4级AE。在对十位或更多患者每三周一次给药不超过5mg/kg的PSB205的实施方式中，不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的所述患者经历3级或4级AE。
另一方面，使用PSB205治疗可以有效地治疗各种病症，例如上述的各种癌症。为了确定疗效率例如客观应答率(ORR)或疾病控制率(DCR)，可以对至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100位或更多患者给药。在一些实施方式中，当对10位或更多癌症患者约每两周、三周或四周一次给药至少约3mg/kg且不超过5mg/kg的PSB205时，ORR可为至少约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或60％。在一些实施方式中，当对10位或更多癌症患者给药约每两周、三周或四周一次用至少约3mg/kg且不超过5mg/kg的PSB205时，DCR可以为至少约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或60％。在一些实施方式中，所述治疗的患者可以患有肺癌或鼻咽癌。
抗hCTLA4或抗hPD1抗体、PSB205或编码它们中的任一者的多核苷酸可以与其他疗法一起施用，所述其他疗法在所述抗体、抗体混合物或多核苷酸之前、之后和/或同时施用。所述其他疗法可以选自由免疫调节分子、放射、化学治疗剂、靶向生物制剂、靶向抑制剂和/或溶瘤病毒组成的组。
在一些实施方式中，所述其他疗法可以是PDL1、TIGIT、CCR4、CCR8、CSFR1a、B7H3、B7H4、CD96或CD73的拮抗剂，GITR、41BB、OX40或CD40的激动剂，溶瘤病毒例如talimogenelaherparepvec(IMLYGICTM)，双特异性T细胞衔接器(BiTE)例如博纳吐单抗，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，抗血管生成药剂例如贝伐珠单抗，抗体-药物偶联物或酪氨酸激酶抑制剂。
如果所述其他疗法是化学治疗剂，它可以是例如白消安、替莫唑胺、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、链脲佐菌素、甲基洛莫司丁、顺-二氨二氯铂、噻替哌和氮丙啶基苯醌、顺铂、卡铂、盐酸美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、盐酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、阿霉素(多柔比星)、道诺霉素、光神霉素、柔红霉素、伊达比星、丝裂霉素C、博来霉素、长春新碱、长春地辛、长春花碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、VP-16、VM-26、含或不含甲酰四氢叶酸的甲氨蝶呤、含或不含甲酰四氢叶酸的5-氟尿嘧啶，5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、氟达拉滨、依托泊苷、伊立替康、拓扑替康、放线菌素D、达卡巴嗪(DTIC)、mAMSA、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、L-天冬酰胺酶、米托蒽醌。参见例如《癌症：肿瘤学原理与实践》(Cancer:Principles and Practice ofOncology)，第4版，DeVita等主编，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa(1993)，其相关部分通过引用并入本文。
上文已概括描述了本发明，下述的特定实施例是来举例说明本发明，但不限制其范围。应当理解，可以对本发明进行各种改变和修改，这些改变和修改符合本文描述的本发明的精神，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类改变和修改在本文(包括随附的权利要求书)中描述的本发明的范围之内。
实施例
实施例1：制备单独的抗hPD1和抗hCTLA4抗体
包含编码抗hPD1抗体PSB103的HC和LC的序列的单个载体产生过程如下。使用GeneOptimizerTM在线软件(GeneArt,ThermoFisher Scientfic)对编码SEQ ID NO：1和SEQID NO：5的氨基酸序列的DNA片段的序列进行优化，以备在仓鼠(Cricetulus griseus)细胞中表达。化学合成得到的优化后DNA序列即SEQ ID NO：2和6。将所述编码HC和LC的DNA序列分别亚克隆在瞬时表达载体中，并导入到大肠杆菌细胞中。该抗体的HC含有改变S228P(其中第228位如上文Edelmann等所示；其对应于SEQ ID NO：1中的第227位)。这个改变可以防止IgG4抗体中的Fab臂交换。Silva等，(2015)，S228P突变可防止体内和体外IgG4 Fab臂交换，如组合使用新的定量免疫测定法和生理基质制备方法所证明的(The S228P mutationprevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using acombination of novel quantitative immunoassays and physiological matrixpreparation)，J.Biol.Chem.290(9):5462-5469。
对来自大肠杆菌细胞的质粒DNA的插入片段进行测序，以确认序列正确。所述序列与设计的序列具有100％同一性。将这些质粒DNA用作模板，使用包括AvrII和BstZ17I位点(HC)或EcoRV和PacI位点(LC)的引物通过聚合酶链反应(PCR)分别扩增HC和LC编码序列。通过从琼脂糖凝胶切下条带并从这些凝胶条带中纯化DNA片段，纯化了得到的PCR产物。将编码HC的条带用AvrII和BstZ17I消化，并连接到用同样的这些酶消化的pCHO 1.0载体(ThermoFisher Scientific)中，然后将其导入到大肠杆菌细胞中。对来自单个菌落的质粒DNA进行测序，并鉴定到一个菌落含有包括所设计的DNA序列的质粒DNA，所述DNA序列编码PSB103的HC的准确氨基酸序列。将这个菌落扩增并纯化其质粒DNA。
将纯化的编码LC的条带用EcoRV和PacI消化，并连接到用相同的酶消化的上述含有编码PSB103的HC的插入DNA的pCHO 1.0载体中。将该DNA导入到大肠杆菌细胞中。在卡那霉素上选择单个菌落，并对来自选出的菌落的质粒DNA进行测序。将含有带有与编码抗hPD1抗体的HC和LC的序列匹配的插入片段的质粒DNA的菌落重新划线两次。挑取单菌落，并对其质粒DNA的两条链进行测序。序列与载体序列匹配，并且质粒中的插入片段与编码抗hPD1抗体PSB103的HC和LC的序列100％匹配。图1示出了这个带有插入片段的载体的图解。
作为生产PSB103的克隆细胞系的初始步骤，CHO-STM细胞(ThermoFisherScientific)的研究细胞库(RCB)制备如下。按照现行良好生产规范(cGMP)下生产的CHO-STM细胞的主细胞库(MCB)瓶在37℃水浴中解冻，并接种在29mL补充有8mM L-谷氨酰胺的CDFortiCHOTM培养基(ThermoFisher Scientific)中。当获得足够的细胞数量时，将细胞离心，将细胞沉积物以107个细胞/mL的浓度重悬浮在补充有8mM L-谷氨酰胺和10％二甲基亚砜(DMSO)的FortiCHOTM培养基中，并将这些细胞的1mL等分试样分配到小瓶中。将细胞小瓶冷冻，转移到-70℃冰箱过夜，然后转移到液氮冷冻机的气相中。
然后将所述含有编码抗hPD1抗体PSB103的HC和LC的插入片段的pCHO1.0载体导入来自RCB的CHO细胞中。如下文中详细描述的，建立了稳定表达抗hPD1抗体PSB103的克隆细胞系(被称为G19G4-4B4)。将G19G4-4B4培养，从细胞上清液回收PSB103并纯化，用于下文描述的实验中。
更详细来说，通过用限制性内切酶NruI切割，将所述编码抗hPD1抗体PSB103的HC和LC的载体(其图示在图1中)线性化，并使用FreeStyleTM MAX试剂(ThermoFisher)按照制造商的说明书对CHO-STM细胞进行三个平行转染。参见FreedomTM CHO-STM试剂盒(目录号A1369601)用户指南，出版号MAN0003505，修订版C.0，ThermoFisher Scientific，其相关部分通过引用并入本文。如图2所示，在转染后三天，将三个转染中的每一者分为两个池，一个池含有分别为10μg/mL和100nM的嘌呤霉素和甲氨蝶呤(MTX)，另一个池含有分别为20μg/mL和200nM的嘌呤霉素和MTX。通过台盼蓝染色测定，当池恢复至少85％的生存率后，开始第二阶段的筛选。在该第二阶段中，将每个阶段1的池分成两个池，一个池含有分别为30μg/mL和500nM的嘌呤霉素和MTX，另一个池含有分别为50μg/mL和1μM的嘌呤霉素和MTX。通过台盼蓝染色测定，当阶段2筛选的池达到90％的生存率后，在培养10天的补料分批生产中评估它们的抗hPD1抗体滴度。基于在抗体滴度选择池3-2-5。如上所述将这些细胞冷冻在含有DMSO的CD FortiCHOTM培养基的小瓶中，以制备RCB。
为了获得克隆细胞系，将一小瓶来自上文描述的RCB的冷冻细胞在含有8mM谷氨酰胺、1μM MTX和1％防结块剂(ThermoFisher，目录号0010057AE)的CD FortiCHOTM培养基中解冻。在生长三天后，将细胞离心并重悬浮在补充有8mM谷氨酰胺、1μM MTX和1％防结块剂的化学成分确定的培养基中。将细胞再次传代培养两次，在每次转移之间允许生长三天。
然后将细胞在补充有谷氨酰胺、1μM MTX和0.5％CloneDetect(MolecularDevices)的半固体CloneMedia(Molecular Devices,San Jose,California)中稀释至终浓度为300个细胞/mL。参见Molecular Devices，应用说明，使用CloneSelect Imager对在半固体培养基中生长的单克隆CHO-S细胞进行可信鉴定(Confident identification ofmonoclonal CHO-S cells grown in semi-solid media using the CloneSelectImager)，可以在https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/reagents/ confident-i dentification-of-monoclonal-cho-s-cells-grown-in-semi-solid- media-using-cloneselect#gref处获得，其通过引用并入本文。将细胞接种在6孔板中，每个孔2mL，并在36.5℃、5％CO2和90％相对湿度(RH)下温育。静置培养10天后，使用ClonePixTM 2系统(Molecular Devices)对孔板进行荧光筛选。ClonePixTM 2系统将356个具有高荧光菌落转移到96孔板的含有100μL化学成分确定的培养基的各个孔中。静置培养4至5天后，小心地吸出每个孔中的培养基并更换50μL新鲜培养基。随后每3至4天以这种方式更换培养基，直至菌落达到80％汇合。再次更换培养基，并将菌落再温育三天。
然后评估菌落的抗hPD1抗体表达和生长特征。将上述356个扩增的菌落从96孔板转移到离心管进一步扩增。如上所述，将这些离心管培养物在小瓶中冷冻，以产生将用于单细胞克隆的RCB。在所述扩增过程中，在补料分批生产中评估细胞系的表达和生长特征。第一次生产在24孔微孔板中进行。基于使用ForteBio系统蛋白A定量测定法(Sartorius,Goettingen,Germany)测定的抗体表达水平上，将185个具有高抗体表达和可接受的生长特征的细胞系在离心管中扩增并进行第二次补料分批生产。基于该评估，选择了G19G4细胞系用于如下所述通过有限稀释法进行的克隆，并如上所述产生G19G4的RCB。
将一小瓶G19G4 RCB在化学成分确定的培养基中解冻并培养。几次传代后，将细胞在CD FortiCHOTM培养基中稀释，并铺板于96孔板中通过有限稀释法进行克隆。在铺板后3小时(T＝0)和第1、3、9和13天对孔进行成像。将来自单细胞的克隆(基于成像)扩增，筛选生长特征，然后在补料分批培养中评估抗体生产性能。基于生长特征和抗体生产性能选择克隆G19G4-4B4作为先导克隆，并在1L摇瓶中扩增，如上所述在补充有DMSO的化学成分确定的培养基中冷冻，以产生RCB。
为了制备表达抗hCTLA4抗体PSB105的细胞系，如下所述制备了两个载体，一个编码PSB105的HC，另一个编码其LC。为了构建编码抗hCTLA4抗体PSB105的HC的载体，使用GeneOptimizer TM在线软件(GeneArt,ThermoFisher Scientfic)对编码SEQ ID NO：13(hCTLA4抗体的HC的氨基酸序列)的DNA片段的序列进行优化，以备在仓鼠细胞(C.griseus)中表达。化学合成所述优化的DNA片段(其序列提供在SEQ ID NO：14中)。该DNA片段编码在下述位置(如上述Edelman等所定义)处具有下述氨基酸改变的HC：K147D、F170C、V173C、C220G、R255K、D399R和K409E(对应于SEQ ID NO：13中的第148、171、174、221、256、400和410位)。其中的一些改变(K147D、F170C、V173C、C220G，与抗hCTLA4 LC的改变S131K、Q160C、S162C和C214S一起)确保同源HC/LC配对。其他改变(D399R和K409E)确保同二聚体HC/HC对的形成。一个改变(R255K)引起体内清除率提高和/或体内半衰期(t1/2)减小。将该合成的DNA片段通过PCR进行扩增，并如上所述在琼脂糖凝胶上纯化得到的片段。将纯化的片段用SapI消化并连接到已用SapI消化的M268-c载体(Atum,Newark,California)中。将连接的混合物导入到大肠杆菌细胞中，挑取菌落，并对来自这些菌落的质粒插入片段进行测序。将与编码抗hCTLA4抗体的HC的序列100％匹配的菌落再划线两次，并对来自第二次划线的菌落的质粒DNA中的插入片段进行测序。它与编码抗hCTLA4抗体的HC的序列匹配。
在第二步中，使用Electra试剂盒(参见https://www.atum.bio/catalog/ reagents/electra)，按照制造商的方案将所述插入片段转移到适合在哺乳动物细胞中稳定表达的载体即pD2537(Atum)中。在室温下温育15分钟后，将Electra反应通过电穿孔导入到大肠杆菌中。将细胞在含有30μg/mL卡那霉素(由此选择pD2537载体)和10mM对氯苯丙氨酸(其针对pM268-c质粒进行反选择)的酵母提取物葡萄糖(YEG)琼脂板上铺板。筛选菌落中编码抗hCTLA4 HC的DNA的存在，并对阳性菌落中的质粒中的插入片段进行测序。然后将含有与编码抗hCTLA4抗体的HC的DNA序列匹配的质粒的菌落再划线两次，并测定来自第二次划线的菌落的完整质粒的两条链的序列。它与载体序列和编码抗hCTLA4 HC的氨基酸序列的DNA序列匹配。含有编码抗hCTLA4抗体的HC的DNA的质粒pD2537的图谱示出在图3中。
如下所述构建编码抗hCTLA4 PSB105抗体的LC的载体。如上所述对编码抗hCTLA4抗体的LC的DNA序列进行优化以备在仓鼠(C.griseus)细胞中表达，将其化学合成，并使用包括SapI位点的引物通过PCR进行扩增。将该PCR片段用SapI消化，连接到SapI消化的pM268-c(Atum)中，并导入到大肠杆菌细胞中。测定来自所选菌落的质粒插入片段的DNA序列，并鉴定到含有编码抗hCTLA4抗体PSB105的LC的序列的菌落。将该菌落扩增，并用于制备质粒DNA以备第二步使用。
在第二步中，使用带有编码PSB105的LC的插入DNA(上述)的pM268-c载体和pD2531-EFM载体(Atum)(其是用于在哺乳动物细胞中稳定表达的载体)进行Electra反应(以将插入片段从一个载体高效转移到另一个载体)。所述反应进行15分钟，然后导入到大肠杆菌细胞中，将其在30μg/mL卡那霉素(由此选择pD2531-EFM载体)加10mM对氯苯丙氨酸(以针对pM268-c质粒进行选择)上铺板。对来自所选菌落的质粒DNA进行测序，并鉴定到含有编码的PSB105的LC的插入片段的菌落。然后将该菌落划线两次，并对来自第二次划线的菌落的质粒DNA进行测序。所述序列与载体序列和编码PSB105的LC的插入序列匹配。从这个菌落制备质粒DNA。这个载体的图谱示出在图4中。
通过同时导入上述编码PSB105的HC和LC的哺乳动物表达质粒，制备了表达PSB105的CHO细胞系，如图3和4中所示。更详细来说，将所述两个载体用(New EnglandBiolabs,Ipswich,Massachusetts)线性化，并使用FreeStyleTM MAX试剂(Thermo Fisher)按照制造商的说明书转染CHO-STM细胞。参见FreedomTM CHO-STM试剂盒(目录号A1369601)用户指南，出版号MAN0003505，修订版C.0，ThermoFisher Scientific，其通过引用并入本文。转染两天后，通过将培养基完全更换为补充有25μM甲硫氨酸亚砜酰亚胺(MSX)和200μg/mL潮霉素B(HGB)的40mL CD-FortiCHO培养基中开始进行选择。将转染培养物分成三个独立的池，每个池以3x 105、5x 105或8x 105个细胞/mL接种在T-150摇瓶中。6天后，将所有池离心，并小心地吸出培养基。将细胞沉积物各自以3x 105个细胞/mL重悬浮在含有25μM MSX和200μg/mL HGB的新鲜培养基中，并在125mL通气摇瓶中培养。然后将池如上文所述进行传代，直至活力全都>90％(通过台盼蓝染色测定)，此时在11天补料分批生产中评估它们的抗体表达。基于表达水平，选择在T-150摇瓶中以3x 105细胞/mL初始接种产生的池(其被称为PSB105池2.03)用于在5L搅拌罐生物反应器中生产PSB105。
最后，通过分别单独培养G19G4-4B4细胞系和PSB105池2.03，从这些培养物的细胞上清液回收抗体，并在蛋白A柱上使用单步洗脱而不是梯度洗脱纯化所述抗体，平行地制备了PSB103和PSB105抗体。
实施例2：评估抗hPD1和抗hCTLA4抗体的结合特异性
通过固相酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定与hPD1、hCTLA4和CD28家族的其他成员的结合，评估了抗hPD1和抗hCTLA4抗体即PSB103和PSB105的结合特异性。
简单来说，将96孔平底微孔板的孔用1μg/mL捕获分子包被，所述捕获分子是(1)与Fc片段融合的人PD1的细胞外结构域(hPD1.Fc)；(2)与Fc片段融合的人CTLA4的细胞外结构域(hCTLA4.Fc)；(3)与组氨酸-亲和素标签(其能够高效纯化蛋白质(组氨酸标签)并用生物素标记蛋白质(亲和素标签))融合的人PDL1的细胞外区域(hPDL1-his-avi)；(4)与组氨酸-亲和素标签融合的鼠PD1的细胞外结构域(mPD1-his-avi)或(5)与Fc片段融合的人CD28的细胞外结构域(hCD28.Fc；R&D Systems目录号342-CD)。将板用黏合胶条密封并在18-24℃下温育过夜。将板在含有0.05％Tween-20的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗。通过向每个孔添加300μL封闭缓冲液(含有1％牛血清白蛋白(BSA)的1X Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS))并在室温下温育1小时来封闭板。如上所述对板进行清洗。
向每个孔添加体积为100μL的一抗(PSB103或PSB105)。测试了含有一系列连续稀释的相同一抗的多个孔。将板用黏合胶条密封，在室温下温育1小时，并如上所述进行清洗。然后向每个孔添加100μL在试剂稀释剂(含有0.05％Tween-20和0.1％BSA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS))中以1:10000稀释的偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的多克隆山羊抗人κ轻链抗体(Sigma目录号A7164)。将板再次用黏合胶条密封，在室温下温育1小时，并如上所述进行清洗。然后向每个孔添加100μL TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物溶液(来自PierceTM TMB底物试剂盒，ThermoFisher目录号34021)，并将板在室温下温育20分钟，避免将板放置在直接光照下。最后，向每个孔添加50μL来自PierceTM TMB底物试剂盒的终止溶液，并使用设置在450nm的微孔板读板器确定每个孔的光密度。
结果示出在图5的A和B中。PSB103显示出与hPD1结合，但不与mPD1、hPDL1、hCD28或hCTLA4结合。类似地，PSB105显示出与hCTLA4结合，但不与hPD1、mPD1、hPDL1或hCD28结合。因此，PSB103和PSB105两者均表现出与其抗原的特异性结合。
实施例3：PSB103和PSB105在食蟹猴中的单剂量药代动力学
PSB103在食蟹猴中的单剂量药代动力学性质评估如下所述。将两只雄性和两只雌性未经过蛋白质处理的柬埔寨来源的食蟹猴(即以前未给药过人类抗体的猴)(4.129至5.971kg，5至7岁)分为两个研究组(n＝2，一只雄性和一只雌性/组)，并在给药开始前适应研究房7天。一组中的猴接受PSB103，另一组中的猴接受不相关的IgG4抗体。在研究的第1天通过一次缓慢静脉内(IV)推注，以5mg/kg的剂量注射PSB103和IgG4抗体。施用前一天被称为第-1天，并且其之前的日期被顺序编号为第-2天、第-3天等。第1天之后的日期被顺序编号为第2天、第3天等。在第-4、-1、9和23天记录体重，在适应期间的所选日期进行临床观察，并在生命中每天两次进行临床观察。在剂量施用前和施用后0.083(5分钟)、0.5(30分钟)、2、8、16、24、72、144、240、336、504和672小时收集大约0.5mL血样。通过在室温下以2,000x g离心15分钟获得血清。将每个样品分成两个等分试样，即等分试样1和2。
使用针对PSB103的抗独特型抗体，通过经验证的ELISA方案对样品进行生物分析。简而言之，使用针对PSB103的抗独特型抗体(3G12)预包被微孔板的孔。在封闭和清洗后，将样品(包括测试样品、空白、标准品和质控样品)添加到孔中，将板温育，然后清洗。然后向孔添加抗独特型3G12抗体的生物素化版本(bio-3G12)。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素检测结合的bio-3G12。将含有HRP底物四甲基联苯胺(TMB)的显色溶液添加到微孔板的孔中，并在450nm处产生与样品中的PSB103浓度成比例的比色信号。通过与根据四参数逻辑模型回归的同时分析的校准曲线进行比较，将光密度数据转换为样品中的PSB103浓度。PSB103的定量下限(LLOQ)为50ng/mL。图6示出了这些数据的半对数图。
使用经验证的Phoenix6.1版软件(Pharsight Corporation)中的非房室分析模型血浆(200-202)IV推注，使用个体血清浓度和标称时间数据进行药代动力学(PK)评估。标称PK采血时间点为给药前和给药后0.083(5分钟)、0.5(30分钟)、2、8、16、24、72、144、240、336、504和672小时。通过线性对数梯形法则估算血清浓度-时间曲线下的面积(AUC)，并通过具有最佳拟合和均匀加权浓度数据的软件选择用于估计λz的时间点进行回归。这些数据示出在下面的表1中。
表1：PSB103和IgG4同型对照抗体在食蟹猴中单次施用后的药代动力学参数
a包括在每个时间点从该组中的两只猴中的每只猴获取的样品，其被分成两个独立的等分试样用于分析。
bSD表示标准偏差。
单个动物的等分试样之间或动物之间的PK参数的差异被归因于生物分析数据的可变性和动物的数量有限。正如为IV推注施用所预期的，最高血清浓度(Cmax)通常在第一个时间点处，即0.083小时(Tmax)。
第二个单剂量PK研究评估了抗hCTLA4抗体PSB105的PK参数。将6只未经过蛋白质处理的食蟹猴分成三组，每组含有一只雄性和一只雌性猴。三个组接受单剂量PSB105(第1组)、不相关的人IgG1抗体(第2组)或被称为伊匹单抗的可商购的抗hCTLA4抗体(第3组)，通过3mg/kg的剂量IV推注。标称采血时间点是给药前和给药后0.083(5分钟)、0.5(30分钟)、2、8、16、24、72、144、240、336、504和672小时。如上所述制备血清，并使用针对PSB105的抗独特型抗体(3G4)，通过经验证的ELISA方法测定测试抗体的血清浓度。该测定按照如上针对PSB103所述来进行，区别在于使用3G4及其生物素化版本(bio-3G4)代替3G12和bio-3G12。PSB105的LLOQ为250ng/mL。图7示出了这些数据。
如上所述确定PK参数，并示出在下面的表2中。
表2：PSB105(不相关的IgG1抗体)和伊匹单抗在食蟹猴中单次施用后的药代动力学参数
a包括在每个时间点从该组中的两只猴中的每只猴获取的样品。
bSD表示标准偏差。
与表1中的数据合在一起，这些数据表明PSB103在食蟹猴中的t1/2(297小时)几乎为PSB105的t1/2(109小时)的三倍，表明PSB103在血流中的存留时间可能比PSB105更长。此外，PSB105在食蟹猴中的t1/2也比已获批的抗hCTLA4抗体伊匹单抗的t1/2(397小时)短得多。
实施例4：表达PSB103和PSB105两者的哺乳动物宿主细胞系的建立
下面描述了表达PSB103和PSB105的CHO宿主细胞系的建立。第一步，如实施例1中所述制备了CHO-STM细胞(ThermoFisher Scientific)的RCB。
然后，如图8所示，分两步建立了表达抗hPD1抗体PSB103和抗hCTLA4抗体PSB105两者的细胞系。首先，将来自上文实施例1中描述的克隆细胞系G19G4-4B4 RCB(其表达PSB103)的一个小瓶解冻，并在含有19mL补充有8mM谷氨酰胺和1μM MTX的CD FortiCHOTM培养基的125mL摇瓶中扩增。通过每2至3天将细胞稀释传代两周，然后转染。在转染之前，将上述编码抗hCTLA4抗体PSB105的HC和LC的质粒(图3和4所示)用(New EnglandBiolabs,Ipswich,Massachusetts)线性化。使用FreeStyleTM MAX试剂(ThermoFisherScientific)，按照制造商的说明书进行两次转染，每次转染使用3x 107个细胞加上述编码抗hCTLA4抗体PSB105的HC和LC的质粒各25μg。将转染的细胞以106个细胞/mL的细胞浓度接种到两个含有30mL补充有8mM谷氨酰胺和1μM MTX的CD FortiCHOTM培养基的摇瓶中。将摇瓶在37℃、5％CO2下，在以150RPM旋转的25mm轨道直径的摇床平台上温育48小时。
然后，将两个摇瓶合并进行筛选，将得到的培养物分成三个池，并使用约1000-3000个细胞/孔的量将细胞接种到96孔板中，孔中含有0.5X谷氨酰胺合成酶表达(GS)补充培养基(Sigma)、100nM MTX、200μg/mL潮霉素B(HGB)，并且不含甲硫氨酸亚砜酰亚胺(MSX)、含有10μM MSX或25μM MSX。该选择方案图示在图9中。所述MTX选择存在编码抗hPD1抗体PSB103的载体。所述HGB选择存在编码抗hCTLA4抗体PSB105的HC的载体。不存在谷氨酰胺且存在谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX选择存在编码抗hCTLA4抗体PSB105的LC的载体，该载体包括编码小鼠谷氨酰胺合成酶的DNA。将板温育12天，然后成像以鉴定有生长迹象的孔。选择了48个孔，将其扩增到更大的孔中，直至将它们接种在12孔板中。
当细胞在12孔板中达到汇合时，通过ELISA分析上清液，以鉴定以大约1:2的比例表达抗hCTLA4抗体PSB105和抗hPD1抗体PSB103的孔。分析来自三种池(无MSX、10μM MSX或25μM MSX)中的每一者的选定的孔，以确定由细胞产生的抗hPD1抗体PSB103占总抗体的百分率。数据示出在下面的表3中。
表3：含有不同浓度的MSX的孔中抗hPD1抗体PSB103的百分率
表3中的数据表明不含MSX的孔平均产生更高比例的抗hPD1抗体PSB103。将测试的不含MSX的16个孔中的15个孔(即除了5G7之外的所有孔)合并在50mL锥形管中，将其在37℃、5％CO2下，在以225RPM旋转的25mm轨道直径的摇床平台上继续温育4天。将细胞在补充有6mM谷氨酰胺的CD FortiCHOTM培养基中稀释至2.5个细胞/mL，并以0.5个细胞/mL接种在96孔板中。在铺板后2小时和第2、13和21天对孔进行成像，以鉴定只含有一个细胞的孔。扩增了140个单细胞克隆。
首先将所述细胞通透化，然后对IgG4和IgG1的细胞内表达进行染色，从而筛选了这些细胞系中的125个的抗hPD1抗体PSB103(IgG4抗体)和抗hCTLA4抗体PSB105(IgG1抗体)的表达。其中一些细胞仅主要表达IgG4或仅主要表达IgG1抗体的克隆细胞系(如图10的图C中所示)未被选择用于进一步分析。其中几乎所有细胞均表达抗hPD1和抗hCTLA4抗体两者的克隆细胞系(如图10B中所示)被选择用于进一步分析。
将这些细胞系中的14个在摇瓶中扩增，并在培养开始后12和/或14天使用蛋白A柱从细胞上清液回收抗体。通过测定220nm处的吸光值并将结果与已知浓度的标准蛋白的连续稀释液的吸光值进行比较，来评估抗体的量。抗hPD1抗体占总抗体的百分比(抗hPD1的％)通过pH梯度阳离子交换层析(CEX)来确定，该方法如Zhang等，(2013)，通过控制离子强度改进单克隆抗体的pH梯度阳离子交换层析(Improving pH gradient cation-exchange chromatography of monoclonal antibodies by controlling ionicstrength)，J.Chromatography A 1272:56-64中所述，其通过引用并入本文。这些数据示出在下面的表4和图11中。
表4：克隆细胞系中抗hPD1的％*
*被选择用于进一步分析的细胞系
如上述表4中所示，选择了产生约50-75％的抗hPD1抗体和至少1g/L总抗体的5个克隆细胞系用于进一步分析。将这些细胞在台式生物反应器中生长，并确定细胞倍增时间。从细胞上清液回收抗体，并如上所述确定抗体滴度和抗hPD1抗体的％。通过进行尺寸排阻层析(SEC)评估抗体混合物中抗体的纯度。这些数据显示在下面的表5中。
表5：所选克隆细胞系的抗体表达的表征
选择细胞系20F5用于进一步表征。如上所述产生20F5细胞的RCB。进行进一步实验以确定群体倍增水平(PDL)即自从RCB建立以来群体中的细胞倍增次数和/或培养基中甲氨蝶呤(MTX)或潮霉素B(HGB)的存在是否影响整体抗体表达、抗hCTLA4:抗hPD1抗体比例和/或细胞倍增时间。
简单来说，将一小瓶20F5 RCB在含有100nM MTX和200μg/mL HGB的培养基(+MTX/+HGB培养基)中解冻。在解冻后3天，将该培养物用于在含有100nM MTX并缺乏HGB的培养基(+MTX/-HGB培养基)中产生另外的培养物。通过在相应的培养基中每3-4天传代，将得到的两个培养物老化约60PDL。监测倍增时间，产生如图12C中示出的数据。这些数据表明20F5的倍增时间在约10至60的PDL下相当恒定，并且在+MTX/+HGB和+MTX/-HGB培养基中相近。
在上述将+MTX/+HGB和+MTX/-HGB培养基中的培养物老化期间，在约13和约28的PDL时将每种培养物的小瓶冷冻(如上为制备RCB所述)。在约35的PDL时，使用+MTX/-HGB培养基中的培养物在缺乏MTX和HGB两者的培养基(-MTX/-HGB培养基)中产生另一个培养物，将其培养直至达到45.3的PDL。此时，将其用于接种-MTX/-HGB培养基中的补料分批培养，其产生在图12A中左起第4个条形中示出的数据。此外，当+MTX/-HGB培养基中的培养物达到45.4的PDL时，将其用于接种-MTX/-HGB培养基中的补料分批培养，其产生在图12A中左起第5个条形中示出的数据。
此外，当+MTX/+HGB培养基中的培养物达到44.5的PDL时，将它用于开始-MTX/-HGB培养基中的补料分批培养，其产生在图12A中最右侧条中示出的数据。
此外，将来自在约13和28的PDL时冷冻的+MTX/-HGB培养物的小瓶的细胞在-MTX/-HGB培养基中解冻，并在-MTX/-HGB培养基中培养直至它们分别达到22.4和37.2的PDL。此时，将这些培养物用于接种-MTX/-HGB培养基中的补料分批培养，其分别产生在图12A中左起第2和第3个条形中示出的数据。
最后，将来自20F5 RCB的小瓶的细胞在-MTX/-HGB培养基中解冻并在-HGB/-MTX培养基中培养，直至其达到9.2的PDL，此时将该培养物用于接种-MTX/-HGB培养基中的补料分批培养，其产生在图12A中最左侧条形中示出的数据。
在每次培养开始后的6、8和11天，从上述所有补料分批培养中取出细胞培养上清液样品，以确定产生的抗体的总量和抗体中抗hPD1抗体的百分比。使用蛋白A柱回收第11天样品中的抗体。通过测定220nm处的吸光值并将结果与已知浓度的抗体的连续稀释液的吸光值进行比较，来评估回收的抗体的量。这些结果示出在图12A中。
使用装配有链霉亲和素(SA)传感器(Sartorius，目录号：18-5019)的Octet Red系统(Sartorious)，使用开发的内部方法直接从第6、8和11天收集的细胞培养上清液样品中测定抗hPD1抗体的百分比。简单来说，使用可商购的试剂盒，按照制造商的方案(ThermoScientific，目录号：21955)将对抗hPD1抗体和抗hCTLA4抗体具有特异性的抗独特型抗体(抗id Ab)以1:1的生物素/抗id Ab摩尔比进行生物素化。然后将生物素化的抗独特型抗体固定到SA传感器上以产生两套传感器，一套使用抗hPD1抗id Ab，另一套使用抗hCTLA4抗idAb。将纯化的抗hPD1和抗hCTLA4抗体在PBS中连续稀释，以产生已知浓度的每种抗体的标准曲线，并添加到还含有稀释的第6、8和11天细胞上清液样品的测定板中。使用固定有抗hPD1抗id抗体的SA传感器测定细胞培养物样品中抗hPD1抗体的量，并使用固定有抗CTLA4抗id抗体的SA传感器测定细胞培养物样品中抗CTLA4抗体的量。将结果与来自已知浓度的每种抗体的纯化样品的结果进行比较，以确定细胞培养物样品中存在的抗体量。通过将样品中检测到的抗hPD1和抗CTLA4抗体的量相加，来确定每种样品中存在的抗体的总量。通过用每个样品中测定到的抗hPD1抗体的量除以每个样品中存在的抗体的总量，来确定每个样品中存在的抗hPD1抗体的百分比。这些数据示出在图12B中。
综上所述，图12中的数据表明PDL对所测试的范围内的PDL的细胞群体的抗hCTLA4:抗hPD1抗体比例或整体抗体表达不产生实质性影响。图12A和B。此外在所有培养物中总体抗体滴度和抗hCTLA4/抗hPD1抗体比例基本上相同，表明所测试的各种培养基对这些指标没有影响。图12A和B。此外，在PDL约10至60的培养物中，细胞系20F5在培养中的倍增时间相当恒定，不论培养基是+MTX/-HGB还是+HGB/+MTX培养基。图12C。由20F5细胞系产生的PSB103和PSB105的混合物在本文中被称为PSB205。
实施例5：制备PSB205
如下所述制备PSB205。培养20F5细胞系并收获细胞上清液。使用蛋白A亲和层析从细胞上清液纯化PSB205，其中抗体混合物从蛋白A上单步而不是梯度洗脱。可以任选地添加其他步骤以提高制备物的纯度，例如各种柱层析步骤如阴离子和/或阳离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析和/或尺寸排阻层析，加上各种沉淀策略、透析和/或各种过滤步骤中的任一者。
最后，在两个不同批次的PSB205中，确定了PSB105与PSB103的重量/重量(w/w/)百分率，其中一个批次用于毒理学研究(PSB205-Tox)，另一个批次使用良好生产规范(GMP)方案(PSB205-GMP)生产。使用利用降低的盐浓度分离抗体的疏水相互作用高效液相色谱(HI-HPLC)测定抗体的相对浓度。用UV光检测抗体。将PSB103和PSB105的不同峰面积并行积分且求和。通过用两个抗体峰中的每一者的面积除以两个抗体峰面积之和，来确定每种抗体的比例。这些数据列表于下面的表6中。
表6：PSB205的不同批次中PSB103和PSB105的w/w百分率
批次 PSB103(％w/w) PSB105(％w/w)
PSB205-Tox 67.3 32.7
PSB205-GMP 69.3 30.7
这些数据表明，不同批次中PSB105:PSB103的比例非常接近。
通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定PSB205-Tox和PSB205-GMP中抗体的非还原完整质量。从PSB205的制备物中分离的PSB103和PSB105种类获得了相似的数据，其在本文中被称为PSB103-S和PSB105-S。更具体来说，通过与带有电喷雾电离(ESI)的四级杆飞行时间(Q TOF)质谱仪联用的尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)获取质谱。结果示出在图13的A(PSB103-S)、B(PSB105-S)和C(从其中分离PSB103-S和PSB105-S的PSB205制备物)以及图14的A(PSB205-Tox)和B(PSB205-GMP)中。检测到的主要抗体种类的大小对应于PSB103和PSB105的各种糖基化种类(N-糖基化抗体种类的详细解释参见例如Yang等，(2016)，单克隆抗体的超快速和高通量N-聚糖分析(Ultrafast and high-throughput N-glycananalysis for monoclonal antibodies)，MAbs 8(4):706-717，其通过引用并入本文)，其中正如下文解释的，两种抗体的HC均缺乏C-端赖氨酸，并且两种抗体的HC的N-端谷氨酰胺均已被转变成焦谷氨酸。在图13的简要说明中解释了检测到的糖基化种类的身份。没有检测到包括C-端赖氨酸或未修饰的N-端谷氨酰胺的主要种类的抗体。从图13所示结果得出的尺寸如下表7所示。
表7：通过LC-MS测定的PSB205及其各个抗体的主要糖型质量
使用差示扫描量热法(DSC)测定PSB205的稳定性。理论上，DSC测定溶液中蛋白质相对于不含蛋白质的对照溶液的过剩热容作为温度变化的函数，在此期间观察到结构展开转变为吸收峰。该转变的中点处的温度被定义为熔化温度(Tm)。在本研究中，使用MicroCalVP-DSC毛细管池微量量热计通过DSC测定热稳定性。DSC及其结果的分析描述在例如Durowoju等，(2017)，差示扫描量热法—一种评估蛋白质抗原的热稳定性和构象的方法(Differential scanning calorietry–a method for assessing the thermalstability and conformation of protein antigen)，J.Visualized Experiments 121:e55262中，其可以在doi:10.3792/55262处获得，并通过引用并入本文。
如图15所示的示例性热图表明，GMP批次的PSB205显示出3次热转变。PSB205的毒理学和GMP批次均显示出相似的热图。将非二态模型拟合到每个热扫描，以获得三个Tm值(Tm1、Tm2和Tm3)。具体来说，PSB205的毒理学批次具有分别为64.6℃、73.3℃和77.9℃的Tm1、Tm2和Tm3值。PSB205的GMP批次具有分别为64.0℃、73.0℃和78.0℃的Tm1、Tm2和Tm3值。因此，观察到的热转变在不同批次之间几乎没有变化。
实施例6：PSB205的结构变体
由于PSB205在CHO细胞中生产这一事实，因此在制备物PSB205中可能会存在结构变体，例如翻译后修饰的形式，包括糖基化形式或包含修饰或缺失氨基酸的形式。如上所述，PSB205中的抗hCTLA4抗体的HC和LC即PSB105可以由SEQ ID NO：14和18的核酸序列编码。这些序列分别编码SEQ ID NO：13和17的氨基酸序列。同样，PSB205中的抗hPD1抗体的HC和LC即PSB103可以由SEQ ID NO：2和6的核酸序列编码，这些核酸序列编码SEQ ID NO：1和5的氨基酸序列。然而，由于潜在的翻译后修饰，当在包含这些核酸序列的多核苷酸转染的CHO细胞中制备这些抗体时，这些序列可能不能精确地定义PSB105和PSB103的结构。
如上所述，通过液相色谱-质谱法(LC-MS)测定PSB205中抗体的非还原完整质量。具体而言，通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)与带有电喷雾电离(ESI)的四级杆飞行时间质谱仪(Q TOF MS)联用来获取质谱。针对PSB205以及从PSB205的制备物中分离的PSB105和PSB103进行了色谱分析。这些分离的PSB105和PSB103制备物分别被称为PSB105-S和PSB103-S。利用频谱解卷积软件分析原始数据。如下所述，在PSB205中存在的大多数种类中PSB103和PSB105两者的HC上的N-端谷氨酰胺可以被转变成焦谷氨酸(参见例如PubChem化合物摘要中的焦谷氨酸，可以在https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Pyroglutamate处获得)，并且在PSB205中存在的大多数种类中，这两个HC中的C-端赖氨酸可以被缺失。PSB205中两种最丰富的抗体种类的尺寸即147,609.8和149,319.7道尔顿，分别与PSB105和PSB103种类一致，这两种抗体分别具有上述两种修饰加上在每个HC/HC对上的G0F/G0F糖基化(参见例如上文Yang等和图13的简要说明)，推测附连到每个HC的N297处的公知糖基化位点。这些位置是按照上述Edelman等编号的位置，其分别对应于SEQ ID NO：1和13中的第296和298位。在147,769.7和149,475.0道尔顿处检测到的第二突出的两个种类与PSB105和PSB103种类一致，具有上述两种修饰加上HC/HC对上的G0F/G1F(同上)糖基化，同样推测附连到N297。因此，PSB205含有特定糖基化的抗体种类。
如上所述，发现在检测到的抗体种类中，PSB205中抗体的一级氨基酸序列被修饰。这是通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)胰蛋白酶肽图谱确定的。参见例如Jenkins等，(2015)，蛋白质生物治疗的LC-MS/MS生物分析方法的验证建议(Recommendations forvalidation ofLC-MS/MS bioanalytical methods for protein biotherapeutics)，AAPSJournal 17(1):17页(可以在DOI:10.1208/s12248-014-9685-5处获得)，其通过引用并入本文。LC-MS/MS使用具有UV 215nm检测的反相超高效液相色谱(RP-UPLC)，与具有ESI的QTOF MS联用。
由于PSB205含有PSB105和PSB103两者，因此首先将单个纯化的抗体PSB105-S和PSB103-S的胰蛋白酶肽图谱与PSB205的胰蛋白酶肽图谱进行比较，以确定PSB205图谱中的胰蛋白酶肽来自哪个抗体。PSB105和PSB103的大多数预期的单个肽分别在PSB105-S和PSB103-S的胰蛋白酶肽图谱中并且也在PSB205的肽图谱中检测到。只有几个长度为4个以下氨基酸的短肽未被检测到，这归因于方法的局限性。
然而，某些肽与其理论预测的尺寸不符。基于编码HC的DNA序列，预测PSB105和PSB103在其HC中均具有N-端谷氨酰胺残基。PSB105和PSB103两者(采取分离的形式以及当在PSB205中作为混合物的一部分时)的N-端胰蛋白酶肽的尺寸与这些肽在N-端谷氨酰胺被转变成焦谷氨酸情况下的理论尺寸一致。同样，基于编码HC的DNA序列，预测PSB105和PSB103两者的HC的C-端氨基酸是赖氨酸。然而，PSB105和PSB103的C-端肽的尺寸均与不具有C-端赖氨酸的这些肽的理论确定的尺寸一致。因此，PSB103和PSB105均具有N-端谷氨酰胺的修饰以及C-端赖氨酸的缺失。
此外，在PSB103和PSB105两者的某些胰蛋白酶肽中观察到一些天冬酰胺(N)残基的脱酰胺作用。使用上述LC-MS/MS方法通过检测胰蛋白酶肽尺寸的变化来检测这种脱酰胺作用。通过用脱酰胺的胰蛋白酶肽的峰面积除以脱酰胺肽加上相同的未脱酰胺肽的峰面积之和，得出百分率。这些结果总结在下面的表8中。
表8：在PSB103和PSB105的某些肽中检测到的天冬酰胺残基的脱酰胺百分比
a与图14A中示出的质量数据是同一毒性批次。
b与图14B中示出的质量数据是同一GMP批次。
cPSB103与PSB105之间共有的序列。
这些数据显示，在两批PSB205中脱酰胺百分比基本上相同。在某些天冬酰胺残基处相对高的脱酰胺水平可能是由于胰蛋白酶消化条件(即pH8和37℃下过夜)，这种条件可以诱导脱酰胺。
实施例7：PSB103、PSB105和PSB205与其抗原的结合动力学
使用表面等离子体共振(SPR)技术，通过装备有CM5传感器芯片的Biacore 3000光学生物传感器，按照制造商的通用流程进行测定，确定了PSB103与人和食蟹猴PD1(hPD1和cPD1)的细胞外结构域的结合动力学以及PSB205与hPD1的细胞外结构域的结合动力学。
首先，将传感器芯片置于仪器上并允许其平衡过夜或更长时间。将运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P20(HBS-EP,GELife Sciences(现为Cytiva)，目录号BR100188))过滤并脱气，然后置于系统上。连接运行缓冲液后，将Biacore3000启动三次，并在运行实验之前执行“归一化”系统程序，以校准系统的光学元件。所有测量均在25℃下进行。
首先，使用胺偶联试剂盒(GE Life Sciences,BR100050)将约8000个共振单位(RU)的山羊抗人抗体捕获抗体(Jackson Labs，目录号109-005-098)固定在CM5芯片(GELife Sciences，目录号BR100399)的两个流动池中的每一个上。为了评估食蟹猴PD1与PSB103配体的结合，使用CM5芯片的一个流动池捕获约100-200RU的PSB103，另一个流动池用作实验的参比芯片。将cPD1-his分析物(在C-端处带有组氨酸标签的cPD1的第1-167位氨基酸；Sino Biological，目录号90311-C08H)在补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的运行缓冲液中稀释到1.2、3.7、11.1、33.3、100和300nM的浓度。将这些稀释液以50μL/min的流速进样到带有捕获的PSB103的测试流动池和参比流动池中。允许复合物分别结合和解离300和1500秒。通过进样10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)30秒使表面再生。使每种分析物样品和空白缓冲液的两份平行注射样流过参比和捕获配体的流动池。
使用Scrubber 2软件2.0c版(BioLogic Software)对cPD1-his分析物产生的数据进行比对和双重参比。从解离相数据确定解离常数(kd)。将该解离相系数作为固定参数应用于使用一阶结合模型的结合相数据的全局拟合中，以确定结合速率系数(ka)。
为了评估与含有与组氨酸标签融合的人PD1的细胞外结构域(hPD1-his)的PD1分析物的结合，如上所述将约8000个共振单位(RU)的上述山羊抗人抗体捕获抗体固定在CM5芯片的3个流动池的每一个上。然后将约350RU的PSB103或600RU的PSB205捕获在包被有山羊抗人捕获抗体的两个不同流动池上。第三个流动池用作参比流动池。将hPD1-his配体在补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的运行缓冲液中稀释到12、25、50、100、200和300nM的浓度。将这些稀释液以30μL/min的流速进样到三个流动池。允许复合物分别结合和解离120和600秒。通过两次进样10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)20秒使表面再生。使每种分析物样品和空白缓冲液的两份平行注射样流过参比和捕获配体的流动池。
将这些数据用BIevaluation 4.1.1版软件(General Electric Company)进行手动对齐和双重参比。使用软件中的全局数据分析选项，将数据拟合到简单的1:1朗缪尔相互作用模型。cPD1-his和hPD1-his的数据均示出在下面的表9中。
表9：cPD1和hPD1与PSB103和PSB205结合的动力学数据
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
PSB103 cPD1-his 1.18x105 5.97x10-4 5.06
PSB103 hPD1-his 5.22x104 1.62x10-4 3.10
PSB205 hPD1-his 5.61x104 1.62x10-4 2.87
这些数据表明，PSB103以相当高的亲和性与单体抗原cPD1-his和hPD1-his结合，并且PSB103和PSB205以几乎相同的结合动力学与hPD1-his结合。
在一组类似的实验中，评估了PSB105与人CTLA4(hCTLA4)和食蟹猴CTLA4(cCTLA4)的结合动力学和PSB205与hCTLA4的结合动力学。将CM5传感器芯片置于BIAcore 3000仪器上并允许其平衡过夜或更长时间。将运行缓冲液过滤并脱气，然后置于系统上。连接运行缓冲液后，将Biacore 3000启动三次，并在运行实验之前执行“归一化”系统程序，以校准系统的光学元件。所有测量均在25℃下进行。将约8000个共振单位(RU)的山羊抗人抗体捕获抗体固定在CM5芯片的每个流动池上，包括用于每种配体的流动池和不含配体的参比流动池。
将约550RU的PSB105捕获在流动池上。将hCTLA4-his配体(与组氨酸标签融合的人CTLA4的细胞外结构域；AcroBiosystems，目录号CT4-H5229-100μg)在含有0.1％BSA的运行缓冲液中稀释到0.64、1.25、2.5、5、10和20nM，并以30μL/min的流速进样到流动池中。将浓度为3.75、7.5、15、30和60nM的cCTLA4-his配体(与组氨酸标签融合的食蟹猴CTLA4的细胞外结构域；AcroBiosystems，目录号CT4-C5227-200μg)以30μL/min的流速进样到流动池中。允许复合物分别结合和解离180和300秒。通过以30μL/min的流速进样10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)40秒使表面再生。使每种分析物样品和空白缓冲液的两份平行注射样流过参比和捕获配体的流动池。
作为收集关于另一种分析物hCTLA4-GST-his(与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签和组氨酸标签融合的人CTLA4的细胞外结构域，内部制备)与PSB105和PSB205的结合的信息的第一步，将约300RU的PSB105和约480RU的PSB205捕获在CM5芯片的两个不同流动池上。另一个流动池不含配体并被用作参比流动池。将浓度为12.5、25、50、100和200nM的分析物以30μL/min的流速进样到流动池中。允许复合物分别结合和解离120和600秒。通过两次进样10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)12秒使表面再生。使每种分析物样品和空白缓冲液的两份平行注射样流过参比和捕获配体的表面。
将来自上述使用CTLA4分析物的实验的数据用BIevaluation软件4.1.1版(General Electric Company)进行评估，以手动对齐和双重参比所述数据。使用软件中的全局数据分析选项，将数据拟合到简单的1:1朗缪尔相互作用模型。结果示出在下面的表10中。
表10：cCTLA4和hCTLA4与PSB105和PSB205结合的动力学数据
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(nM)
PSB105 cCTLA4-his 1.73x105 3.76x10-4 2.17
PSB105 hCTLA4-his 2.35x105 1.13x10-3 4.78
PSB205 hCTLA4-GST-his 4.53x104 6.67x10-5 1.47
PSB105 hCTLA4-GST-his 4.36x104 5.51x10-5 1.26
这些数据表明，PSB105以高亲和性与单体人类和食蟹猴CTLA4抗原两者结合。此外，PSB105和PSB205与hCTLA4-GST-his分析物的结合具有相似的动力学。结合表9中的数据，这些数据表明在PSB205中的两种抗体中的每一者与其抗原结合的动力学与这两种抗体中的任一者单独的结合动力学基本上相同。
实施例8：PSB205在巨细胞病毒(CMV)回忆应答测定中的活性
下面的实验测试了PSB205与PSB103、PSB105或IgG1同型对照抗体相比，对在CMV回忆应答测定中检测到的CD8+T细胞数量的影响。
IgG1同型对照抗体制备物从Southern Biotech获得(目录号0151k-14)，PSB103、PSB105和PSB205如本文中所述制备。来自CMV+供体的人外周血单个核细胞(PBMC)购自Bentech Bio(现为Bloodworks Northwest，Seattle,WA的一部分)。
将PBMC解冻并接种在微量滴定板的16个孔中，其中每个孔接种3.8x106个细胞，培养基为200μL体积的补充有10％胎牛血清(FCS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)。将这些细胞在5μg/mL IgG1同型对照、5μg/mL PSB103、2.5μg/mL PSB105或7.5μg/mL PSB205存在下，用浓度为3μg/mL的CMV感染细胞的裂解物(购自Astarte Biologics(现为Cellero)，目录号1004，批号3341DE16)刺激。在刺激开始后7天，收集细胞，并在室温下用2μL dextramer(HLA-A*0201[NLVPMVATV]-PE，购自Immudex，一种藻红蛋白(PE)标记的葡聚糖/I类MHC(MHCI)/肽偶联物，其预期与特异性识别CMV抗原pp65的CD8+T细胞结合)染色15分钟。然后添加2μL购自BD Bioscience的与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗CD8抗体，并在室温下继续染色30分钟。然后将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗三次，并将最终的细胞沉积物重悬在400μL补充有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。使用FACscaliburTM流式细胞仪(Becton Dickinson)分析细胞，以确定被抗CD8抗体和/或dextramer结合的细胞的数量。
由这些数据产生的图示出在图16中。数据表明，与在CMV裂解物和单独的PSB105或PSB103存在下刺激的PBMC相比，在CMV裂解物(抗原)和PSB205存在下刺激的PBMC扩增出更多结合dextramer的CD8+细胞，即识别CMV抗原的CD8+T细胞(CD8+CMV+细胞)。(1)CD8+CMV+细胞的绝对数量和(2)CD8+CMV+细胞占所有细胞的百分比的定量表明，与用CMV裂解物和单独的PSB103或PSB105刺激的细胞相比，在CMV裂解物加上PSB205存在下刺激的PBMC具有更多的CD8+CMV+细胞。图17。这些数据表明，PSB105对CD8+CMV+细胞的数量影响很小或没有影响，而PSB103具有一定的积极作用，并且PSB205的积极作用明显比PSB103更大。因此，PSB205对CMV抗原特异性CD8+T细胞的扩增具有协同效应(相对于单独的PSB103或PSB105)。
实施例9：PSB205、PSB103和PSB105在HCC827异种移植肿瘤模型系统中的疗效
本研究的目的是评估PSB205及其组分抗体PSB103和PSB105针对已建立的人肺腺癌细胞系来源的肿瘤异种移植的疗效。用于产生异种移植的人腺癌细胞系是HCC827。参见例如ATCC目录号CRL-2868。
更详细来说，将20只小鼠中的每一只在右侧皮下接种含有5x 106个HCC827细胞的0.1mL PBS。该接种的当天被称为第0天。其后的研究日按顺序向上编号。同时，使用标准程序从一位健康人类供体的外周血中分离人PBMC并以1x 108个细胞/mL的密度重悬，用于移植。当平均肿瘤尺寸达到60-80mm3时(肿瘤接种后约5天)，将1x 107个PBMC静脉内移植到每只小鼠中。然后将所有小鼠称重，并使用卡尺测定肿瘤尺寸。然后将小鼠分成四组进行抗体治疗。
使用四种不同抗体治疗中的任一者的治疗(每组5只小鼠)在PBMC移植后1小时开始。该治疗是在每周两次(BIW)持续共三周的抗体治疗过程中的第一次施用。抗体通过腹膜内注射施用。每周两次使用卡尺测定肿瘤体积。方案的详情提供在下面的表11中。
表11：实验设计
结果示出在图18中。使用双因素方差分析(ANOVA)来分析肿瘤抑制随时间和治疗的变化。这些数据表明与人IgG1组中的小鼠相比，PSB205组显示出统计学显著的肿瘤缩小，而PSB103和PSB105组中的小鼠则没有。因此，PSB103和PSB105的组合即PSB205比单独的这些抗体中的任一者更加有效。
实施例10：PSB205在人体内中的剂量和安全性的初步评估
在鼻咽癌(NPC)和癌症(LC)患者治疗中心进行了一项开放标签、剂量递增研究，以确定PSB205在人类患者中的安全性。剂量递增是基于加速3+3设计，PSB205剂量从0.3至10mg/kg，每3周(q3w)静脉内施用一次。在选定的剂量组中进行扩大阶段。所述研究的主要目的是通过确定PSB205在晚期恶性肿瘤患者中的最大耐受剂量(MTD)和推荐2期剂量(RP2D)来确定PSB205的安全性和耐受性。
纳入了44位NPC和LC患者。在基线时和之后的第7、13、22和31周，使用计算机断层扫描(CT扫描)测量每位患者的一个或多个肿瘤(最多五个肿瘤)的直径。如果测量了一个以上的肿瘤，则确定所测量的肿瘤的直径的总和。该总和被称为靶病变的总和。患者可以随时停止参与研究。下面的表12总结了应答可评估的受试者的入组状态和初步疗效数据。为了“应答可评估”，患者必须至少在第7周进行CT扫描，以确定在使用PSB205治疗后其肿瘤是缩小、生长还是保持相同。
表12：受试者、剂量和初步应答数据
1剂量后面跟有“-PK”说明表示除了检测安全性和疗效指标之外还进行了药代动力学测定的患者。
2“LC”代表肺癌。
3“NPC”代表鼻咽癌。
4空白框表示之前没有接受过抗hPD1靶向治疗。被描述为已接收两种治疗中的任一者例如“卡瑞利珠单抗/安慰剂”的先前治疗的患者，曾参加过一项盲法临床试验，他们不知道他们接受的是药物还是安慰剂的。
5“周期数”表示患者被给药PSB205的次数。
6“Disctd”代表停止。
7这些受试者由于剂量限制性毒性(DLT)而停止研究治疗。
8这位受试者由于4级输液反应而停止研究治疗。
9应答被标注为如上文中所定义的疾病进展(PD)、部分应答(PR)、疾病稳定(SD)或完全应答(CR)，与RECIST指南(1.1版)相符。
为了强调本试验中的结果所表明的PSB205的观察疗效，表13中总结了可用的初步数据，其示出了疾病控制率(DCR，即表现出部分或完全应答(PR或CR)或疾病稳定(SD)的可评估受试者的百分率)以及客观应答率(ORR，即在治疗后显示出PR或CR的患者的百分率)。
表13：初步疗效数据
1-10mg/kg剂量下的综合数据表明，这些剂量的PSB205可能是LC和NPC的有效治疗剂量。为了说明观察到的应答的程度，图19示出了32位可评估受试者中每一位的肿瘤直径自基线起的变化，以及每一位接受的剂量。这些数据表明，接受剂量为1-10mg/kg的PSB205的某些患者实现了实质性应答。
表14提供了给药1或3mg/kg PSB205的患者所经历的不良事件(AE)的数据。1、2、3和4级AE的定义如上文和《不良事件常用术语标准》(Common Terminology CriteriaforAdverse Events)(CTCAE)第5.0版，2010中所示，其可以在//ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_8.5x11.pdf处获得，其通过引用并入本文)。在用0.3mg/kg治疗的患者中没有观察到AE。
表14：1和3mg/kg PSB205剂量下的不良事件汇总
表15示出了在给药5或10mg/kg PSB205的患者中观察到的AE数据。
表15：5和10mg/kg PSB205剂量下的不良事件汇总
表16总结了来自表14和15的数据。
表16：1-10mg/kg剂量下所有AE的汇总
表14-16中的数据显示，在1mg/kg或3mg/kg剂量组中未观察到3级或4级AE。在5mg/kg组中，22位患者中只有一位(4.5％)经历3级或4级事件。在10mg/kg下，6位患者中的三位(50％)经历3级或4级事件。最常见的AE包括1级瘙痒、皮疹和天冬氨酸转氨酶升高(这可能表明例如肝脏、心脏或其他器官的功能失常)。
实施例11：PSB205在人体内的剂量和安全性的补充评估
下面的实施例11，包括图20-32、表17-26及其图例，提供了关于上述内容的各个方面的额外数据和分析，旨在补充但不限制上述内容的范围。PSB205的设计和产生
重组抗体通常由单个工程化细胞系产生，其中抗体的重链(HC)和轻链(LC)需要正确组装才可以被分泌。为了同时产生两种抗体，需要在同一宿主细胞中引入两种不同的HC和LC。由于HC和LC的随机配对，总共可以产生十种产物，其中只有两种具有同源链配对(图20A)。我们特别地更改了HC/HC和HC/LC界面残基从而更有益于同源HC/HC和HC/LC配对的正确组装。当引入这些独特设计的HC配对键和LC配对键时，两种不同的抗体可以一起表达，而不会出现任何错误配对的种类。通过该抗体工程技术平台产生的产品含有固定比例的两种重组抗体的混合物，其被称为MabPair分子。PSB205是一种针对PD-1和CTLA-4这两种关键免疫检查点调节因子开发的MabPair产品。
将抗PD-1和抗CTLA4抗体分别进行工程化改造和表征(表20-21)。在多种基于细胞的测定中，被命名为PSB103的抗PD-1IgG4显示出具有与帕博利珠单抗相似的效力(图24，表20)。被命名为PSB105的抗CTLA-4IgG1表现出与伊匹单抗相似的阻断活性。在Fc区中引入第255位精氨酸(R255K)的单突变以降低与FcRn的结合(表22)，导致所述抗CTLA-4抗体与伊匹单抗相比在体内的更快清除和抗体半衰期的缩短(表23)。
PSB103(抗PD-1IgG4)和PSB105(抗CTLA-4IgG1)在CHO细胞系中以2:1的固定比例一起产生(图20B)。PSB205中抗PD-1和抗CTLA-4抗体的相对比例通过对其组分使用异速缩放的PK模拟来确定。所述模拟预测当PSB205以三周的间隔给药时，它将获得抗PD-1和抗CTLA-4抗体的不同的稳态暴露水平。PSB205作为单一产品制备，其纯度和产品质量通过使用一系列分析方法进行了全面表征。在产品中未发现可检测的错误配对种类(图20C-E)。
PSB205的临床前表征
使用两种不同的双细胞报告物测定法评估了PSB205及其抗PD-1组分(PSB103)或抗CTLA4组分(PSB105)阻断PD-1：PD-L1相互作用或CTLA-4：B7-1/B7-2相互作用的能力。如图25中所示，PSB103和PSB205均介导PD-L1：PD-1相互作用的浓度依赖性抑制，使得NFAT激活并且萤光素酶信号提高。PSB105和PSB205在报告物测定法中也释放出CTLA4介导的抑制。
树突状细胞表达共刺激(B7-和B7-2)和共抑制(PD-L1)分子以分别接合由T细胞表达的CD28/CTLA4和PD-1。为了确定PSB205如何影响树突状细胞对T细胞的刺激，使用源自同种异体反应供体的单核细胞的未成熟树突状细胞刺激纯化的T细胞。如图21A中所示，单独的PSB103和PSB205在不同的DC/T比例下均提高了T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)生产。抗CTLA-4对IFN-γ生产的提高没有贡献。
由于PSB103和PSB105具有不同的PK曲线，二者在人体中的比例将随时间变化。为了评估PSB205的协同效应的范围，在不同浓度的PSB103和PBS105以不同比例混合后的情况下使用SEB刺激外周血单个核细胞(PBMC)。如图21B和图26中所示，PSB103(范围为0.5至20μg/mL)和PSB105(范围为0.05至4μg/mL)以不同比例(范围为5:1至0.2:1)的组合提高T细胞的白介素2(IL-2)生产，这表明PBS205中的PSB103和PBS105可以在治疗期间在体内实现广范围的协同效应。
为了确定PSB205中比例为2:1的PSB103和PSB105的组合是否可以在刺激抗原特异性CD8 T细胞方面实现协同效应，使用来自CMV感染细胞的巨细胞病毒(CMV)裂解物刺激来自血清阳性个体的PBMC。我们使用来自Immundex的dextramer HLA-A*0201/NLVPMVATV计算了在第7天对CMV的pp65具有特异性的CD8 T细胞的扩增。如图21C和图27中所示，与单独用PSB103(抗PD1)或PSB105(抗CTLA4)治疗的组相比，从PSB205治疗的组回收的CMV+CD8 T细胞的百分率和绝对数量更高。
在含有源自PBMC的人免疫细胞的NOD-Prkdcscid IL2Rγ缺失(NCG)小鼠肿瘤异种移植物模型中对PSB205进行了评估。如图21D中所示，PSB103和PSB105以2:1比例的组合(PSB205)有效控制HCC827肿瘤生长，而单独的PSB103或PSB105在该模型中没有显示出任何效果。我们在Jeko-1肿瘤模型中进一步测试了PSB205，其中肿瘤生长速度快于HCC827。如图28中所示，单独的PSB103或PSB105显著抑制Jeko-1肿瘤的生长，但PSB205比单独的PSB103更加有效。
在食蟹猴中的单剂量探索性实验中，分别评估了PSB103和PSB105的PK曲线。所有动物在单次静脉注射后均达到全身暴露。经测定，PSB103的平均终末消除半衰期(t1/2)为297小时(表23)。与伊匹单抗相比，PSB105显示出提高的清除率和减少的全身暴露。PSB105和伊匹单抗的t1/2分别为109和397小时(图21E)。这至少部分归因于PSB105中FcRn亲和力的降低。
在多剂量GLP毒性实验中对PSB205进行了评估。每2周分别以3、15或60mg/kg的剂量向食蟹猴注射一次PSB205，持续4周以上(第1、15和29天)，结果显示其耐受性良好，并且未导致任何与PSB205相关的严重不良事件。在60mg/kg剂量下，观察到少数动物出现稀便，但未鉴定到病理变化。PSB205治疗导致Ki67+T细胞和ICOS+CD4 T细胞增加，这是CTLA-4阻断的独特生物标志物。ICOS+CD4+T细胞的增加与PSB205的剂量直接相关(图29)。
PSB205的1期临床试验(QL1706)
基线特征
2020年3月31日至12月20日期间，共有47位实体瘤患者入组，其中剂量递增组和扩大组分别有16位和31位患者。纳入的患者的基线特征如表17中所示。中位年龄为51岁(范围为27至73岁)，38位(80.9％)为男性。17位(36.2％)患者的ECOG表现状态为0。在患者中，25位(53.2％)患有鼻咽癌(NPC)，20位(42.6％)患有NSCLC，1位(2.1％)患有甲状腺癌，1位(2.1％)患有脐管黏液腺癌。46位(97.9％)患者处于IV期，只有1位患者处于III期。28位(59.6％)患者没有免疫治疗史，18位(38.3％)接受过ICI治疗，4位(8.5％)接受过其他免疫治疗。既往接受过治疗的中位数为2.0(范围为0-5)。
药代动力学分析
PSB205的抗PD-1和抗CTLA-4组分的PK曲线通过使用对每种组分具有特异性的两种不同抗独特型抗体分别进行表征。所述分析利用从治疗的第1周期(N＝36)和第6周期(N＝9)收集的数据来进行。
图22A-B示出了每3周(Q3W)施用0.3至10mg/kg PSB205后aPD-1和aCTLA-4的平均浓度-时间曲线。在单剂和多剂施用后，aCTLA-4和aPD-1两者的暴露量随着剂量的增加而增加。如图30A-D中所示，在不同剂量之间aCTLA-4和aPD-1的个体剂量归一化Cmax和AUC0-t的分布相似，表明aCTLA-4和aPD-1两者在0.3至10mg/kg范围内的单剂量下可能表现出线性PK特征。鉴于可获得的多剂量数据的患者数量有限，目前尚未确立多剂量施用后aCTLA-4和aPD-1的PK特征的线性关系。aCTLA-4和aPD-1的PK参数汇总在表24中。
在单剂量和多剂量施用后aCTLA-4的清除率(CL)保持相近(即分别为0.0159-0.0252L/h和0.0134-0.0225L/h)。相应的平均t1/2分别为104-121h(4-5天)和111-190h(5-8天)。在多次给药后未观察到aCTLA-4的显著积累。
单剂量施用后aPD-1的平均CL为0.0122-0.0159L/h(n＝10)，其在多剂量施用后降至0.00676-0.00720L/h(n＝5，第6周期)。平均t1/2在单剂量施用后为147-227h(6-9天)(n＝10)，但由于采样时间点有限而无法准确多剂量施用后的时间。尽管如此，在稳定状态下预期的t1/2会更长。如表24中所示，在Q3W重复施用PSB205后可能存在一定的aPD-1积累。平均Rac_Ctrough(通过谷浓度[Ctrough]评估的积累率)、Rac_Cmax(通过Cmax评估的积累率)和Rac_AUC(通过AUC0-tau评估的积累率)分别为1.79-2.40(n＝8)、1.24-1.59(n＝9)和1.52-1.77(n＝4)。
药效学
通过循环CD3 T细胞的受体占有率测定来评估PSB205对PD-1的靶覆盖水平。在整个治疗周期中，在所有给药组中都观察到PD-1受体占有率的持续的高百分率(图22C)。未观察到受体占有率的剂量依赖性差异。在一些接受10mg/kg的患者中显示出的受体占有率的波动可能是由于样本量较小和个体差异所致。PSB205施用与CD4和CD8细胞两者的增殖增强有关。如图22D中所示，与较低剂量组相比，在5mg/kg和10mg/kg组中CD4和CD8 T细胞群体中KI67+细胞的增加更加显著。此外，CD4 T细胞作为CTLA-4阻断的公认替代物，ICOS对CD4 T细胞存在剂量依赖性上调。在5mg/kg和10mg/kg组中观察到ICOS+CD4 T细胞相比于基线的最高增加(图22E，图31)。在5mg/kg和10mg/kg组中ICOS+CD4 T细胞的增加持续至少两周(336小时)，但在1mg/kg和3mg/kg组中则没有这种情况(图32)。Ki67+T细胞和ICOS+CD4 T细胞的一贯且持续的增加表明，在高于5mg/kg的剂量下可以实现PD-1和CTLA-4的功能性阻断。
安全性数据
患者接受中位数为2个周期(1-12)的PSB205治疗，每3周施用一次。截至2020年12月20日，中位随访时间为54天(16，128)，47位患者中的25位(53.2％)仍在接受治疗。在22位停止治疗的患者中，最常见的原因是疾病进展(n＝15，68.2％)，其次是AE(n＝5，22.7％)和退出研究(n＝2，9.1％)。
47位患者中有31位(66.0％)发生治疗相关不良事件(TRAE)，在1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg和10mg/kg组中的频率分别为83.3％(5/6)、33.3(2/6)、67.8(19/28)和83.3％(5/6)(表18)。大多数患者经历1级TRAE(38.3％，18/47)，尤其是接受5mg/kg的患者(50％，14/28)。2位接受5mg/kg的患者和3位接受10mg/kg的患者经历≥3级的TRAE。总体而言，最常见(≥5％)的TRAE是瘙痒(23.4％，11/47)、皮疹(21.3％，10/47)、AST升高(14.9％，7/47)、疲劳(12.8％，6/47)、甲状腺功能亢进(10.6％，5/47)、甲状腺功能减退(10.6％、5/47)，ALT升高(8.5％，4/47)、发热(8.5％，4/47)和输液相关反应(6.4％，3/47)。
47位患者中有16位(34.0％)发生了任何级别的irAE。最常见(≥5％)的irAE是瘙痒(23.4％，11/47)、皮疹(21.3％，10/47)、甲状腺功能亢进(10.6％，5/47)和甲状腺功能减退(10.6％、5/47)(表25)。2位(4.3％)患者(一位在5mg/kg组中，一位在10mg/kg组中)的irAE≥3级。
无论原因如何，47位患者中的7位(14.9％)发生了严重不良事件(SAE)，6例被认为与药物有关并发生在5位患者中，其中1位接受5mg/kg治疗，4位接受10mg/kg治疗。
10mg/kg组中的两位患者出现剂量限制性毒性(DLT)，其中一位出现3级血小板计数下降并伴有1级牙龈出血，另一位出现4级免疫介导的肾炎。因此，最大耐受剂量(MTD)被确定为5mg/kg Q3W。
临床疗效
如表19中所示，在35位可获得疗效分析数据的患者中，10位(28.6％)部分应答(PR)，7位(20.0％)疾病稳定(SD)，从而客观应答率(ORR)为28.6％，疾病控制率(DCR)为48.5％。在20位NPC患者中，7位(35.0％)实现PR，2位(10.0％)实现SD，ORR为35.5％并且DCR为45.0％。在14位NSCLC患者中，3位(21.4％)实现PR，5位(35.7％)实现SD，ORR为21.4％并且DCR为57.1％。所有患者从基线开始的靶病变最佳客观应答(BOR)和治疗持续时间示出在图23A和23B中。由于随访的患者数量少且随访时间相对短，因此未评估中位无进展生存期(PFS)、应答持续时间和总生存期(OS)。对于20位既往未接受免疫治疗的患者来说，PR和SD率分别为40.0％(n＝8)和25.0％(n＝5)，ORR为40.0％(n＝8)，DCR为65.0％(n＝13)(表26)。
在先前接受过抗PD-1/PD-L1治疗的10位患者中，两位(20.0％)实现PR，一位(10.0％)实现SD，从而ORR为20.0％，DCR为30.0％(表26)。图23C和图23D显示了在既往未接受任何免疫治疗的患者和既往接受过抗PD-1/PD-L1治疗的患者中肿瘤缩小相对于基线的百分比变化。一位患有IV期NPC的55岁男性患者(其对先前作为第三线治疗的靶向PD-L1/TGFβ的双特异性抗体的最佳肿瘤应答是疾病进展(PD))被纳入5mg/kg组，并在第7周实现PR。该患者的肿瘤CT扫描示出在图23E中。一位患有IV期NSCLC的46岁男性患者(其最佳肿瘤应答在先前的纳武单抗治疗(二线)期间为PR，在先前的抗4-1BB抗体治疗(四线)期间为SD)被纳入10mg/kg组，并在第13周实现PR(图23F)。
RP2D测定
基于耐受性、PK和药效学的总体评估，选择5mg/kg Q3W方案作为RP2D，进一步研究PSB205在晚期实体恶性肿瘤中的作用。
讨论
根据本发明，本文提供了PSB205的设计和1期临床试验，PSB205是第一个具有PD-1和CTLA-4双重阻断作用的MabPair产品。PSB205在1期研究的混合组中表现出令人鼓舞的抗肿瘤应答，其中包括以前接受过其他PD-1/PD-L1抑制剂治疗的患者。尽管试验仍在进行中，但初步分析也表明与其他双重PD-1和CTLA-4阻断相比，总体安全性良好，3级或更高级TRAE发生率低。初步数据支持进一步研究PSB205在用于治疗实体恶性肿瘤时改善患者预后以及提高抗肿瘤应答和耐受性方面的潜力。这项研究代表了MabPair分子的首次临床测试。用于开发PSB205的策略可能适用于其他项目，其中需要仔细地保持每种抗体组分的疗效和毒性的最佳平衡。
PSB205的两种抗体组分作为单一产品生产，分别靶向和抑制PD-1和CTLA-4。与双特异性抗体(抗体的两个臂以1:1的比例锁定)相比，MabPair产品例如PSB205使其两种抗体组分能够提供不同的靶特异性水平的PK覆盖和抗体效应功能。这种功能可以通过调节在CHO细胞系中一起生产的两种抗体的比例和每种抗体的PK曲线来实现。PSB205的抗PD-1组分是IgG4，而抗CTLA-4组分是IgG1同型。抗CTLA-4IgG1的Fc介导的效应机制可能对其在肿瘤微环境中对调节性T细胞的影响至关重要。最近的报告支持了这一点，即在具有高亲和性Fc受体等位基因(CD16a-V158)的患者中对伊匹单抗的应答提高20。此外，CTLA-4阻断可以改善T细胞应答的启动，并增加T细胞克隆的多样性，这可能有助于将新的T细胞带到肿瘤25。然而，延长的T细胞扩增可导致免疫相关毒性26。如何在每个治疗周期内通过PD1和CTLA4途径的双重阻断和由PD1抑制引起的肿瘤特异性T细胞的局部激活来调整CTLA-4阻断水平以实现强共刺激和T细胞扩增的最佳平衡，将是联合疗法成功的关键。PSB205的抗CTLA-4IgG1被工程化改造以减少与FcRn的结合，从而加快循环清除速率。PSB205中的抗CTLA4抗体在人类中的消除半衰期约为5天，与伊匹单抗的15天的半衰期相比明显更短。这允许在剂量滴定过程中更加灵活地控制其暴露，并在TRAE的情况下快速消除药物。这种独特的特点可以转化为在人体中改善的肿瘤应答和更好的耐受性。
首次人体研究的PK分析表明，我们已实现了在每剂PSB205后为PD-1和CTLA-4带来不同的靶覆盖水平的设计目标。在5mg/kg剂量组中，在首次单次施用PSB205后aPD-1和aCTLA-4组分的平均t1/2分别为约8天和4天。在多次施用后aCTLA-4的平均t1/2为约5天。在每个剂量组中，aCTLA-4在多次施用后均未显示出在体内明显积累。相比之下，纳武单抗和伊匹单抗的平均t1/2分别约为19.127和15.4天。由于半衰期长，在每3周使用时伊匹单抗的水平可以在多个治疗周期后显著积累，这可能导致irAE升高。当纳武单抗(3mg/kg)和伊匹单抗(1mg/kg)一起Q3W使用时，与每6周给药伊匹单抗(1mg/kg)的方案相比观察到明显更高的irAE发生率23。将伊匹单抗的给药频率降至每6周可以降低抗体的稳态浓度并提高联合治疗的耐受性。由于aCTLA-4组分的半衰期较短，因此在每3周给药一次PSB205的重复施用后可以维持所需的aCTLA-4谷值水平而没有显著积累。这种独特的PK特性可能有助于PSB205的整体良好安全特性。尽管清除相对较快，但有强有力的证据表明在PSB205治疗后CTLA-4被功能性阻断。当以5mg/kg剂量给药时，PSB205可以有效诱导CD8细胞的增殖和ICOS+CD4 T细胞的扩增，表明在5mg/kg剂量下PD1和CTLA4途径的功能性阻断，但不会导致irAE加重。
在本研究中，PSB205总体耐受性良好，在RP2D下在7.1％的患者中出现3级或更高级的TRAE。既往研究显示，在Opdivo和Yervoy的联合中≥3级TRAE的发生率在22％-59％的范围内，在NSCLC中为32.8％17，在MSI-H/dMMR结肠直肠癌中为22％28，在肝细胞癌中为29％-53％29，在恶性胸膜间皮瘤中为30.3％30，在肾细胞癌中为46％31，在黑素瘤中为59％32。尽管随着试验的进行数据仍在成熟，但基于初步数据，PSB205的总体安全性与来自抗PD-1和抗CTLA-4抗体组合的其他研究的已发表数据相比是有利的。TRAE发生率的降低将使患者能够坚持更长时间的治疗，这可能有助于提高疗效。
在本研究中PSB205还显示出令人鼓舞的临床活性。在35位可评估的患者中有10位(28.6％)实现了部分应答，包括以前接受过其他PD1/PDL1抑制剂治疗的患者。尽管需要通过更长的随访来确定应答的持续时间，但抗肿瘤活性的初步观察结果是有希望的，尤其是对NPC而言，其总应答率为35％(7/20)。目前尚无获批的用于NPC的免疫疗法。几项≥2线NPC免疫疗法的临床试验正在进行中，报告的ORR范围为20.5％至34％33-36。已显示NPC患者在肿瘤中具有升高的Treg浸润37。它们可能对抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合更加敏感。最近的一项在≥2线NPC患者中纳武单抗(3mg/kg，每2周)加低剂量伊匹单抗(1mg/kg，每6周)的2期研究报告的总应答率为30％(12/40)；86％(34/40)的患者经历TRAE，并且10％(4/40)经历3级或更高的TRAE38。本研究中观察到的最初令人鼓舞的数据表明，PSB205在实现抗肿瘤应答方面的潜力类似于通过纳武单抗和低剂量伊匹单抗的联合获得的潜力，值得在NPC患者中进行进一步临床研究。PD-1难治性NSCLC和NPC患者的抗肿瘤应答的初步发现表明，可以在这些难以治疗的患者群体中探索PSB205，从而带来联合治疗的前景。
由于具有良好的安全性和有希望的抗肿瘤活性，PSB205可以作为骨架进一步开发，用于与其他治疗性分子例如小分子、癌症疫苗、溶瘤病毒或治疗性抗体的其他联合研究。与需要施用两种药物的传统抗体联合疗法相比，MabPair产品可以被开发为具有简单调节途径的单一实体。这将减少开发抗体联合疗法的时间和成本。
根据本发明，本文提供了一种使用单瓶产品递送抗体联合疗法的新方法。PSB205(QL1607)是首个具有PD-1和CTLA-4双重阻断的MabPair产品，已在1期临床试验中进行了评估，显示出可接受的安全特性，并在晚期实体恶性肿瘤中显示出临床抗肿瘤活性的早期证据。
材料和方法
PSB205的设计和产生
MabPair平台的开发将在单独的报告中描述(Liu Z等，正在准备初稿)。抗人PD-1抗体克隆#1和抗人CTLA-4抗体11F4的产生和工程化分别进行了描述(US2019/0248899和US2019/0276542)。将抗PD1抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因分别插入到人γ-4恒定重链和恒定κ轻链中。在铰链区引入替换取代S228P以防止IgG4的Fab臂交换。将抗CTLA-4抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因分别插入到人γ-1恒定重链和恒定κ轻链中。在抗CTLA-4IgG1抗体中引入多个取代以在与抗PD-1IgG4抗体在同一细胞中共表达时精确控制同源HC/HC和HC/LC链的配对。在抗CTLA-4IgG1的CH3区域中引入两个取代(D399R和K409E)以控制HC配对。在CH1区域中引入三个取代(K147D、F170C和V173C)，在重链的上铰链区中引入一个取代(C220G)，并在Cκ区中引入四个取代(S131K、Q160C、S162C和C214S)，以控制抗CTLA-4IgG1抗体中LC的正确配对。此外，在CH2区中引入一个取代(R255K)以改变FcRn的结合。
通过在Expi293和ExpiCHO细胞两者中进行多轮瞬时转染产生MabPair混合物，并用蛋白A柱纯化。质谱分析证实，所有HC/HC和HC/LC链均正确组装，没有任何错误配对。
在稳定CHO细胞系中生产PSB205(QL1706)
将编码抗PD-1IgG4抗体的HC和LC两者的DNA亚克隆到pCHO1.0载体(来自ThermoFisher)中，并用于CHO-STM细胞系的转染和选择。选择一个产生高水平抗PD-1IgG4抗体的稳定细胞系即克隆G19G4-4B4作为宿主细胞，用于引入工程化抗CTLA-4IgG1抗体的LC和HC。进一步筛选具有两种抗体的高表达滴度的稳定克隆，以鉴定能够以大约2:1的比例产生抗PD1IgG4和抗CTLA-4IgG1抗体的CHO细胞的单个克隆。
临床试验
研究设计和患者
这是一项I期、开放标签、剂量递增和扩展研究，用于在晚期恶性肿瘤患者中评估PSB205的安全性、耐受性、MTD、PK和主要临床活性。
进行第一次剂量递增，以确定PSB205的DLT、MTD和RP2D。采用与标准3+3剂量递增设计相结合的加速滴定。简而言之，只有一位受试者被纳入第一剂量组。在DLT评估期间，如果仅观察到≤2级的药物相关AE，则受试者将被纳入使用标准的3+3剂量设计进行的第二剂量组。最大施用剂量(MAD)被设定为10mg/kg。在剂量递增过程中，所选剂量组中的受试者得到了扩展，从而为晚期恶性肿瘤患者中PSB205的PK评估以及主要疗效评估提供了足够的病例。研究方案经中山大学癌症中心伦理委员会批准(编号A2019-091-1)。所有参与者均已提供书面知情同意书。
满足下述关键纳入标准的患者入组：(1)18岁或以上的男性或女性受试者；(2)病理证实诊断为标准治疗失败或无有效治疗的晚期恶性肿瘤，并且对于实体瘤来说根据RECIST v1.1观察影像学可测量的病变；(3)东部肿瘤合作组织(ECOG)体能状态为0或1，并且预期寿命大于3个月；(4)在首次施用前具有所需的器官功能水平；(5)同意在整个研究治疗期间并直至最后一剂研究药物后180天实施有效的屏障避孕措施。关键的排除标准是：(1)既往或活动性自身免疫性疾病、间质性肺病和其他需要长期使用全身皮质类固醇(>10mg/天泼尼松或等效物)或其他免疫抑制药物的疾病；(2)与既往癌症免疫疗法相关的3级或4级免疫相关AE；(3)先前接受过CTLA-4抑制剂与PD-1或PD-L1抑制剂联合的治疗；(4)妊娠或哺乳期女性受试者。
治疗
每3周通过静脉内输注施用5种剂量的PSB205(0.3、1、3、5和10mg/kg)。每位受试者只接受一种剂量。任何受试者都可以因下述任何原因停止研究：疾病进展(除非研究人员认为有持续的临床益处)、完成研究(长达2年)、发生不可耐受的AE、开始新的抗肿瘤治疗或撤回知情同意书，以先出现为准。
对于根据RECIST v1.1标准出现疾病进展的实体瘤患者来说，如果研究人员判断受试者临床稳定且继续治疗的益处是有利的，则PSB205治疗将继续。同时，应通过影像学检查监测疾病进展(间隔≥4周)。如果疾病进展得到证实，但研究人员判断受试者临床稳定且继续治疗的益处是有利的，则继续PSB205治疗直至没有益处。
结果
主要结果是PSB205的安全性和耐受性，正如通过晚期恶性肿瘤患者中的AE、SAE和DLT的发生率所定义的，以及PSB205的RP2D。次要结果是PSB205在晚期恶性肿瘤患者中的PK、初步疗效和免疫原性。
还分析了PSB205暴露与功能性RO之间的相关性，以及生物标志物与PSB205疗效之间的相关性。
安全性分析包括所有接受至少一剂PSB205的受试者。AE的分级根据常见不良事件评估标准(CTCAE)v5.0进行。在剂量递增阶段，基于在第一剂的PSB205施用后21天(1个周期)内发生的PSB205相关AE来评估DLT。根据CTCAE v5.0标准，DLT定义如下：3级或4级非血液学毒性(在适当的支持性护理下在72小时内消退的3级疲劳、3级恶心/呕吐除外)，任何4级血液学事件(包括4级血小板减少症)，任何3级血小板减少症伴出血，或3级发热性中性粒细胞减少症和任何新的类固醇使用事件(不包括已经使用类固醇的受试者)。irAE主要根据当地医疗实践进行管理。研究人员根据《使用免疫检查点抑制剂治疗的患者中免疫相关不良事件的管理：美国临床肿瘤学会临床实践指南》(Management of Immune-RelatedAdverse Events in Patients Treated with Immune Checkpoint Inhibitor Therapy:American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline)(2018年版)42对受试者的利益/风险比进行全面评估，并对停止/恢复给药做出判断。
对于实体瘤患者来说，根据RECIST v1.1评估肿瘤应答。在基线时、前四个治疗周期中每2个周期(6周)和之后每3个治疗周期(9周)进行CT扫描或MRI。
使用每个周期给药前采集的血液进行免疫原性评估。
药代动力学采样时间表和测定方法
在下述时间点采集血浆样品，以表征aCTLA-4和aPD-1的药代动力学。第1周期第1天至第14天(单剂量)和第6周期第1天至第14天(多剂量)：给药前，输注结束，给药后2、8、24、48、72、168、336小时；在第2周期和其他周期：给药前、输注结束和输注结束后48小时；访视结束和最后一次施用后30、60和90天。使用经验证的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法对这些样品进行分析。
药代动力学分析方法
使用WinNonlin 8.2版软件(Certara USA,Inc.,New Jersey,US)中的非房室方法分析aCTLA-4和aPD-1的PK参数。单剂量阶段的PK参数包括达到最大浓度的时间(Tmax)、最大浓度(Cmax)、谷值浓度(Ctrough)、从零时到最后可量化浓度的时间的曲线下面积(AUC0-t)、外推后得到的曲线下面积的百分率(AUC_％Extrap)、从零时到无穷的曲线下面积(AUC0-inf)、从零时到第21天的曲线下面积(AUC0-21d)、消除半衰期(t1/2)，清除率(CL)和分布体积(Vz)，并且对于多剂量阶段来说，包括Tmax、Cmax、Ctrough、平均浓度(Cavg)、给药间期内的曲线下面积(AUC0-tau，tau等于21天)、AUC0-inf、AUC_％Extrap、t1/2、稳态清除率(CLss)、稳态分布体积(Vss)、通过Cmax评估的累积率(Rac_Cmax)、通过Ctrough评估的累积比率(Rac_Ctrough)、通过AUC评估的累积率(Rac_AUC)。
药效评估
在第1周期给药前、给药后72、168和336小时、第2周期第1天给药前和给药后48小时以及肿瘤的每次成像评估时，收集用于PD-1受体占有率检测的血液。在第1周期给药前、给药后168和336小时、第2周期第1天给药前和给药后48小时以及肿瘤的每次成像评估时，检测T细胞中的其他生物标志物。
统计分析
该I期试验被设计成允许在与标准3+3剂量递增设计结合的加速滴定的基础上对安全性和耐受性进行评估。人口统计学、安全性和耐受性的分析是描述性的。ORR(包括DCR)及其95％CI的估算基于可评估的患者通过Exact Clopper-Pearson方法计算。使用Wilcoxon符号秩检验在某些药效学标志物的给药前和给药后(第1周期168h)值之间进行比较。
表格和表格说明
表17：纳入患者的基线特征
缩写：ECOG，东部肿瘤合作组织；NSCLC，非小细胞肺癌；NPC，鼻咽癌；aPD-1，抗程序性细胞死亡蛋白1抗体；aPD-L1，抗PD-1配体抗体；
a一位受试者接受过针对PD-L1/TGFβ的双特异性抗体；一位受试者接受过两种免疫疗法：抗PD-1抗体和抗4-1BB抗体；一位受试者接受过两种免疫疗法：抗PD-1抗体和抗OX40抗体；这3个病例在“aPD-1/aPD-L1”和“其他免疫疗法”两者中均记录一次。
b包括靶向OX40、4-1BB和TGFβ的药物。
表18：在≥5％的PSB20治疗的患者中发生的治疗相关不良事件
缩写：TRAE，治疗相关不良事件；AST，天冬氨酸转氨酶；ALT，丙氨酸转氨酶
a在该剂量水平下未发生≥3级TRAE。
b在0.3mg/kg中未发生TRAE(N＝1)
c一位患者出现心肌炎(3级)。
d一位患者出现血小板计数减少(3级)和免疫介导的肾炎(4级)，一位患者出现血小板计数减少(4级)。
e 4级。
表19：根据RECIST v1.1的最佳客观应答
缩写：BOR，最佳客观应答；CR，完全应答；PR，部分应答；SD，疾病稳定；PD，疾病进展；ORR，客观应答率；DCR，疾病控制率；NPC，鼻咽癌；NSCLC，非小细胞肺癌。
表20：PSB103(抗PD1 IgG4)的临床前评估总结
*T细胞活化的IFNμ产量读数^已发表的报告
表21：PSB105(抗CTLA-4IgG1)的临床前评估总结
表22：通过Biacore分析测定的在pH6.0下抗CTLA-4IgG1变体与人FcRn/β2M复合物的结合的总结
表23：食蟹猴中单次静脉施用后测试品的性别平均药代动力学参数
表24：PSB205(QL1706)静脉内输注后aCTLA-4和aPD-1的药代动力学参数
注1：药代动力学参数用平均值±SD(CV％)[N]表示，其中N是统计描述中包含的数据数量。如果N为2，则所有参数都被呈现为中位数(最小值，最大值)[2]。Tmax和Tlast被呈现为中位数(最小值，最大值)[N]。注2：第6周期的AUC0-21d、Vz和CL的结果分别使用第6周期中的AUC0-tau、Vss和CLss的结果进行报告。
a.在第1周期中，5mg/kg组中的受试者01040、01041、01042和01048以及10mg/kg组中受试者的01030、01036和01037没有收集到所有样本，因此这些受试者中的Ctrough和AUC0-t未纳入分析。
b.在第1周期中，当AUC_％Extrap>20％且R2_adjust<0.9时，无法准确估计λz，因此，如果λz不准确，则分析中不会总结某些受试者的基于λz计算的参数，包括AUC0-∞、AUC_％Extrap、CL、Vz、t1/2。
c.在第1周期中，当λz未被准确估计时，某些受试者的AUC0-21d未纳入分析，但在这种情况下，如果Tlast<tau(504小时)并且Tlast与tau之间的差异不超过1％，则AUC0-21d的结果被AUC0-t值代替并纳入分析。
d.在第6周期中，5mg/kg组中的受试者01018没有收集到所有样品，因此该受试者的Ctrough和AUC0-t未纳入分析。
e.在第6周期中，当AUC_％Extrap>20％且R2_ajust<0.9时，无法准确估计λz，因此，如果λz不准确，则分析中不会总结某些受试者的基于λz计算的参数，包括AUC0-∞、AUC_％Extrap、t1/2。
f.在第6周期中，当AUC0-tau未被准确估计时，基于AUC0-tau计算的参数例如Cavg、CLss未被总结在分析中。
g.在第6周期中，如果λz或AUC0-tau未被准确估计，则不会总结基于这两者的Vss。
h.在第6周期中，如果任何受试者第1周期中的AUC0-21d或第6周期的AUC0-tau未被准确估计，则它们的Rac_AUC被认为是不准确的并且不会进行总结。
i.在第6周期中，如果受试者没有在第1周期或第6周期中的任一者中收集所有样品，则它们的Rac_Cthrough被认为是不准确的并且不会进行总结。
表25：免疫相关AE
缩写：irAE，免疫相关不良事件
a在该剂量水平下未发生≥3级irAE。
b在0.3mg/kg中(N＝1)未发生irAE。
表26：基于先前免疫治疗史的最佳客观应答
缩写：BOR，最佳客观应答；CR，完全应答；PR，部分应答；SD，疾病稳定；PD，疾病进展；ORR，客观应答率；DCR，疾病控制率
参考文献：
1.Swain SM,Baselga J,Kim S-B,Ro J,Semiglazov V,Campone M等，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和多西他赛治疗HER2阳性转移性乳腺癌中的(Pertuzumab,Trastuzumab,and Docetaxel in HER2-Positive Metastatic Breast Cancer)，New England JournalofMedicine.2015；372(8):724-734.
2.Finn RS,Qin S,Ikeda M,Galle PR,Ducreux M,Kim TY等，阿替利珠单抗加贝伐珠单抗治疗不可切除的肝细胞癌(Atezolizumab plus Bevacizumab in UnresectableHepatocellular Carcinoma)，The New England journal ofmedicine.2020；382(20):1894-1905.
3.Brunet JF,Denizot F,Luciani MF,Roux-Dosseto M,Suzan M,Mattei MG等，免疫球蛋白超家族的新成员——CTLA-4(A new member of the immunoglobulinsuperfamily--CTLA-4)，Nature.1987；328(6127):267-270.
4.Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,Honjo T，在程序性细胞死亡后免疫球蛋白基因超家族的新成员PD-1的诱导表达(Induced expression of PD-1,a novel member ofthe immunoglobulin gene superfamily,upon programmed cell death)，EMBO J.1992；11(11):3887-3895.
5.Fife BT,Bluestone JA，通过CTLA-4和PD-1途径控制外周T细胞耐受和自身免疫(Control ofperipheral T-cell tolerance and autoimmunity via the CTLA-4andPD-1pathways)，Immunol Rev.2008；224:166-182.
6.Wing K,Onishi Y,Prieto-Martin P,Yamaguchi T,Miyara M,Fehervari Z等，CTLA-4对Foxp3+调节性T细胞功能的控制(CTLA-4control over Foxp3+regulatory Tcell function)，Science.2008；322(5899):271-275.
7.Pardoll DM，癌症免疫疗法中免疫检查点的阻断(The blockade of immunecheckpoints in cancer immunotherapy)，Nat Rev Cancer.2012；12(4):252-264.
8.Chen L,Flies DB，T细胞共刺激和共抑制的分子机制(Molecular mechanismsofT cell co-stimulation and co-inhibition)，Nat Rev Immunol.2013；13(4):227-242.
9.Robert C,Long GV,Brady B,Dutriaux C,Maio M,Mortier L等，纳武单抗治疗先前未治疗的无BRAF突变的黑素瘤(Nivolumab in previously untreated melanomawithout BRAF mutation)，The New England journal ofmedicine.2015；372(4):320-330.
10.Wolchok JD,Hodi FS,Weber JS,Allison JP,Urba WJ,Robert C等，伊匹单抗的开发：一种治疗晚期黑色素瘤的新型免疫治疗方法(Development of ipilimumab:anovel immunotherapeutic approach for the treatment ofadvanced melanoma)，Ann NY Acad Sci.2013；1291:1-13.
11.Wei SC,Levine JH,Cogdill AP,Zhao Y,Anang NAS,Andrews MC等，抗CTLA-4和抗PD-1检查点阻断的不同细胞机制(Distinct Cellular Mechanisms Underlie Anti-CTLA-4and Anti-PD-1Checkpoint Blockade)，Cell.2017；170(6):1120-1133e1117.
12.Wei SC,Anang NAS,Sharma R,Andrews MC,Reuben A,Levine JH等，抗CTLA-4加抗PD-1检查点阻断的组合利用部分不同于单一疗法的细胞机制(Combination anti-CTLA-4plus anti-PD-1checkpoint blockade utilizes cellular mechanismspartially distinct from monotherapies)，Proc Natl Acad Sci U S A.2019；116(45):22699-22709.
13.Wei SC,Duffy CR,Allison JP，免疫检查点阻断疗法的基本机制(Fundamental Mechanisms of Immune Checkpoint Blockade Therapy)，CancerDiscov.2018；8(9):1069-1086.
14.Rotte A，CTLA-4和PD-1阻断剂的组合用于治疗癌症(Combination ofCTLA-4and PD-1blockers for treatment ofcancer)，Journal ofexperimental&clinicalcancerresearch:CR.2019；38(1):255.
15.Kooshkaki O,Derakhshani A,Hosseinkhani N,Torabi M,Safaei S,Brunetti O等，伊匹单抗和纳武单抗联合治疗癌症：从临床实践到正在进行的临床试验(Combination ofIpilimumab andNivolumab in Cancers:From Clinical Practice toOngoing Clinical Trials)，International journal of molecular sciences.2020；21(12).
16.Larkin J,Chiarion-Sileni V,Gonzalez R,Grob JJ,Rutkowski P,Lao CD等，纳武单抗和伊匹单抗联合治疗晚期黑素瘤的五年生存率(Five-Year Survival withCombinedNivolumab and Ipilimumab in Advanced Melanoma)，The New Englandjournalofmedicine.2019；381(16):1535-1546.
17.Hellmann MD,Paz-Ares L,Bernabe Caro R,Zurawski B,Kim SW,CarcerenyCosta E等，纳武单抗加伊匹单抗治疗晚期非小细胞肺癌(Nivolumab plus Ipilimumab inAdvanced Non-Small-Cell Lung Cancer)，The New Englandjournal ofmedicine.2019；381(21):2020-2031.
18.Rizvi NA,Cho BC,Reinmuth N,Lee KH,Luft A,Ahn MJ等，在转移性非小细胞肺癌一线治疗中德瓦鲁单抗联合或不联合曲美木单抗与标准化疗的比较：MYSTIC 3期随机临床试验(Durvalumab With or Without Tremelimumab vs Standard Chemotherapy inFirst-line Treatment of Metastatic Non-Small Cell Lung Cancer:The MYSTICPhase 3Randomized Clinical Trial)，JAMA oncology.2020；6(5):661-674.
19.Selby MJ,Engelhardt JJ,Quigley M,Henning KA,Chen T,Srinivasan M等，IgG2a同型的抗CTLA-4抗体通过减少肿瘤内调节性T细胞来增强抗肿瘤活性(Anti-CTLA-4antibodies ofIgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction ofintratumoral regulatory T cells)，Cancer Immunol Res.2013；1(1):32-42.
20.Arce Vargas F,Furness AJS,Litchfield K,Joshi K,Rosenthal R,GhoraniE等，Fc效应功能有助于人抗CTLA-4抗体的活性(Fc Effector Function Contributes tothe Activity ofHuman Anti-CTLA-4Antibodies)，Cancer Cell.2018；33(4):649-663e644.
21.Simpson TR,Li F,Montalvo-Ortiz W,Sepulveda MA,BergerhoffK,Arce F等，肿瘤浸润调节性T细胞的Fc依赖性耗竭共同定义了抗CTLA-4疗法对黑素瘤的疗效(Fc-dependent depletion oftumor-infiltrating regulatory T cells co-defines theefficacy ofanti-CTLA-4therapy against melanoma)，J Exp Med.2013；210(9):1695-1710.
22.Sznol M,Ferrucci PF,Hogg D,Atkins MB,Wolter P,Guidoboni M等，纳武单抗和伊匹单抗联合疗法在晚期黑素瘤患者中的汇总分析安全性概况(Pooled AnalysisSafety Profile of Nivolumab and Ipilimumab Combination Therapy in PatientsWith Advanced Melanoma)，Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology.2017；35(34):3815-3822.
23.Hellmann MD,Rizvi NA,Goldman JW,Gettinger SN,Borghaei H,Brahmer JR等，纳武单抗加伊匹单抗作为晚期非小细胞肺癌的一线治疗(CheckMate 012)：开放标签1期多组群研究的结果(Nivolumab plus ipilimumab as first-line treatment foradvanced non-small-cell lung cancer(CheckMate 012):results ofan open-label,phase 1,multicohort study)，The Lancet Oncology.2017；18(1):31-41.
24.Perets R,Bar J,Rasco DW,Ahn MJ,Yoh K,Kim DW等，新型抗CTLA-4抗体quavonlimab(MK-1308)联合帕博利珠单抗一线治疗晚期非小细胞肺癌的安全性和疗效(Safety and efficacy ofquavonlimab,a novel anti-CTLA-4antibody(MK-1308),incombination with pembrolizumab in first-line advanced non-small-cell lungcancer)，Annals ofoncology:official journal ofthe European Society forMedicalOncology.2020.
25.Kvistborg P,Philips D,Kelderman S,Hageman L,Ottensmeier C,Joseph-Pietras D等，抗CTLA-4疗法拓宽了黑素瘤反应性CD8+T细胞应答(Anti-CTLA-4therapybroadens the melanoma-reactive CD8+T cell response)，Science translationalmedicine.2014；6(254):254ra128.
26.Oh DY,Cham J,Zhang L,Fong G,Kwek SS,Klinger M等，癌症患者中由CTLA-4阻断引发的免疫毒性与T细胞库的早期多样化有关(Immune Toxicities Elicted byCTLA-4Blockade in Cancer Patients Are Associated with Early Diversificationofthe T-cell Repertoire)，Cancer Res.2017；77(6):1322-1330.
27.Lee KW,Lee DH,Kang JH,Park JO,Kim SH,Hong YS等，纳武单抗在韩国晚期实体瘤患者中的I期药代动力学研究(Phase I Pharmacokinetic Study ofNivolumab inKorean Patients with Advanced Solid Tumors)，The oncologist.2018；23(2):155-e117.
28.Lenz H-J,Lonardi S,Zagonel V,Van Cutsem E,Limon ML,Wong KYM等，纳武单抗加低剂量伊匹单抗作为治疗微卫星高度不稳定性/DNA错配修复缺陷转移性癌症的一线疗法：临床更新(Nivolumab plus low-dose ipilimumab as first-line therapy inmicrosatellite instability-high/DNA mismatch repair deficient metastaticcolorectal cancer:Clinical update)，Journal ofClinical Oncology.2020；38(4_suppl):11-11.
29.Yau T,Kang YK,Kim TY,El-Khoueiry AB,Santoro A,Sangro B等，纳武单抗加伊匹单抗在以前用索拉非尼治疗过的晚期肝细胞癌患者中的疗效和安全性：CheckMate040随机临床试验(Efficacy and Safety of Nivolumab Plus Ipilimumab in PatientsWith Advanced Hepatocellular Carcinoma Previously Treated With Sorafenib:TheCheckMate 040Randomized Clinical Trial)，JAMA oncology.2020；6(11).
30.Baas P,Scherpereel A,Nowak A,Fujimoto N,Zalcman GJJoTO，ID:2908一线纳武单抗+伊匹单抗与化疗相比治疗不可切除的恶性胸膜间皮瘤：CheckMate 743(ID:2908First-Line Nivolumab+Ipilimumab vs Chemotherapy in Unresectable MalignantPleural Mesothelioma:CheckMate743)，2020；15(10):e42.
31.Motzer RJ,Tannir NM,McDermott DF,Arén Frontera O,Melichar B,Choueiri TK等，纳武单抗加伊匹单抗与舒尼替尼相比治疗晚期肾细胞癌(Nivolumab plusIpilimumab versus Sunitinib in Advanced Renal-Cell Carcinoma)，The NewEnglandjournal ofmedicine.2018；378(14):1277-1290.
32.Hodi FS,Chiarion-Sileni V,Gonzalez R,Grob JJ,Rutkowski P,Cowey CL等，纳武单抗加伊匹单抗或单独使用纳武单抗与单独使用伊匹单抗相比治疗晚期黑素瘤(CheckMate 067)：一项多中心、随机、3期试验的4年结果(Nivolumab plus ipilimumab ornivolumab alone versus ipilimumab alone in advanced melanoma(CheckMate 067):4-year outcomes of a multicentre,randomised,phase 3trial)，The LancetOncology.2018；19(11):1480-1492.
33.Fang W,Yang Y,Ma Y,Hong S,Lin L,He X等，卡瑞利珠单抗(SHR-1210)单独或与吉西他滨加顺铂联合治疗鼻咽癌：两项单组1期试验的结果(Camrelizumab(SHR-1210)alone or in combination with gemcitabine plus cisplatin for nasopharyngealcarcinoma:results from two single-arm,phase 1trials)，The LancetOncology.2018；19(10):1338-1350.
34.Hsu C,Lee SH,Ejadi S,Even C,Cohen RB,Le Tourneau C等，帕博利珠单抗在程序性死亡配体1阳性鼻咽癌患者中的安全性和抗肿瘤活性：KEYNOTE-028研究的结果(Safety and Antitumor Activity of Pembrolizumab in Patients With ProgrammedDeath-Ligand 1-Positive Nasopharyngeal Carcinoma:Results ofthe KEYNOTE-028Study)，Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology.2017；35(36):4050-4056.
35.Ma BBY,Lim WT,Goh BC,Hui EP,Lo KW,Pettinger A等，纳武单抗在复发性和转移性鼻咽癌中的抗肿瘤活性：Mayo Clinic 2期联合会的一项国际多中心研究(NCI-9442)(Antitumor Activity ofNivolumab in Recurrent and MetastaticNasopharyngeal Carcinoma:An International,Multicenter Study of the MayoClinic Phase 2Consortium(NCI-9742))，Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology.2018；36(14):1412-1418.
36.Wang FH,Wei XL,Feng J,Li Q,Xu N,Hu XC等，特瑞普利单抗在以前治疗过的复发性或转移性鼻咽癌中的疗效、安全性及相关生物标志物：II期临床试验(POLARIS-02)(Efficacy,Safety,and Correlative Biomarkers of Toripalimab in PreviouslyTreated Recurrent or Metastatic Nasopharyngeal Carcinoma:A Phase IIClinicalTrial(POLARIS-02))，Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology.2021:Jco2002712.
37.Lau KM,Cheng SH,Lo KW,Lee SA,Woo JK,van Hasselt CA等，鼻咽癌患者中循环Foxp3+CD4+CD25(高)调节性T细胞的增加(Increase in circulating Foxp3+CD4+CD25(high)regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients)，Britishjournal ofcancer.2007；96(4):617-622.
38.Kao H,Ang M,Ng QS,Tan DSW,Tan W,Rajasekaran T等，266O-伊匹单抗和纳武单抗联合治疗复发性/转移性鼻咽癌(R/M NPC)：NCT03097939的更新的疗效和安全性分析(266O-Combination ipilimumab and nivolumab in recurrent/metastaticnasopharyngeal carcinoma(R/M NPC):Updated efficacy and safety analysisofNCT03097939)，Annals ofOncology.2020；31(suppl_6):S1347-S1354.
39.Socinski MA,Jotte RM,Cappuzzo F,Orlandi F,Stroyakovskiy D,Nogami N等，阿替利珠单抗用于转移性非鳞状NSCLC的一线治疗(Atezolizumab forFirst-LineTreatment ofMetastatic Nonsquamous NSCLC)，The New Englandjournalofmedicine.2018；378(24):2288-2301.
40.McGregor BA,McKay RR,Braun DA,Werner L,Gray K,Flaifel A等，阿替利珠单抗和贝伐珠单抗治疗具有变异组织学和/或肉瘤样特点的转移性肾细胞癌患者的多中心II期研究的结果(Results ofa Multicenter Phase II Study ofAtezolizumab andBevacizumab for Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma With VariantHistology and/or Sarcomatoid Features)，Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology.2020；38(1):63-70.
41.Kudo M,Matilla A,Santoro A,Melero I,Gracian AC,Acosta-Rivera M等，Checkmate-040：纳武单抗(NIVO)治疗具有晚期肝细胞癌(aHCC)和Child-Pugh B(CPB)状态的患者(pts)(Checkmate-040:Nivolumab(NIVO)in patients()with advancedhepatocellular carcinoma(aHCC)and Child-Pugh B(CPB)status)，，Journal ofClinical Oncology.2019；37(4_suppl):327-327.
42.Brahmer JR,Lacchetti C,Schneider BJ,Atkins MB,Brassil KJ,CaterinoJM等，在用免疫检查点抑制剂疗法治疗的患者中免疫相关不良事件的管理：美国临床肿瘤学会临床实践指南(Management of Immune-Related Adverse Events in PatientsTreated With Immune Checkpoint Inhibitor Therapy:American Society of ClinicalOncology Clinical Practice Guideline)，，Journal ofclinical oncology:officialjournal ofthe American Society ofClinical Oncology.2018；36(17):1714-1768.
序列表
<110> 齐鲁普吉湾生物治疗公司
<120> 抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的联合
<130> P231984CN1-P
<140>
<141>
<150> 63/151,030
<151> 2021-02-18
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Phe Thr Tyr Gly Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 2
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 2
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttccggcta cacctttacc aactactgga tccactgggt gcgacaggcc 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggcgag atcgacccct acgactccta caccaactac 180
aaccagaaat tcaagggccg cgtgaccatg accgtggaca agtccacctc caccgtgtac 240
atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagacccggc 300
ttcacctacg gcggcatgga tttttggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcctctgct 360
tctaccaagg gcccctccgt gttccctctg gccccttgct ccagatccac ctccgagtct 420
accgccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcccgtgac agtgtcttgg 480
aactctggcg ccctgacctc cggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctccggc 540
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgactgtg ccctccagct ctctgggcac caagacctac 600
acctgtaacg tggaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagcgggt ggaatctaag 660
tacggccctc cctgccctcc ttgcccagcc cctgagtttc tgggcggacc cagcgtgttc 720
ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 780
gtggtggtgg atgtgtccca ggaagatccc gaggtgcagt tcaattggta cgtggacggc 840
gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc cacctaccgg 900
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 960
aaggtgtcca acaagggcct gcccagctcc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020
cagccccggg aaccccaggt gtacacactg cctccaagcc aggaagagat gaccaagaac 1080
caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggaatgg 1140
gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctgtactc tcggctgaca gtggataagt cccggtggca ggaaggcaac 1260
gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320
tccctgtctc tgggaaagtg ataa 1344
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Phe Thr Tyr Gly Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 4
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttccggcta cacctttacc aactactgga tccactgggt gcgacaggcc 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggcgag atcgacccct acgactccta caccaactac 180
aaccagaaat tcaagggccg cgtgaccatg accgtggaca agtccacctc caccgtgtac 240
atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagacccggc 300
ttcacctacg gcggcatgga tttttggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcctct 357
<210> 5
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 6
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca agtcctccca gtccctgttc aactccggca accagaagaa ctacctggcc 120
tggtatcagc agaaacccgg caaggtgccc aagctgctga tctacggcgc ctccaccaga 180
gactctggcg tgccctacag attctccggc tctggctctg gcaccgactt taccctgacc 240
atcagctccc tgcagcccga ggatgtggcc acctactact gccagaacga ccactactac 300
ccctacacct tcggcggagg caccaaggtg gaaatcaagc ggaccgtggc cgctccctcc 360
gtgttcatct tcccaccttc cgacgagcag ctgaagtccg gcaccgcttc tgtcgtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc ccgcgaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480
cagtccggca actcccagga atccgtgacc gagcaggact ccaaggacag cacctactcc 540
ctgtcctcca ccctgaccct gtccaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc 600
gaagtgaccc accagggcct gtctagcccc gtgaccaagt ctttcaaccg gggcgagtgc 660
tgataa 666
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 8
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca agtcctccca gtccctgttc aactccggca accagaagaa ctacctggcc 120
tggtatcagc agaaacccgg caaggtgccc aagctgctga tctacggcgc ctccaccaga 180
gactctggcg tgccctacag attctccggc tctggctctg gcaccgactt taccctgacc 240
atcagctccc tgcagcccga ggatgtggcc acctactact gccagaacga ccactactac 300
ccctacacct tcggcggagg caccaaggtg gaaatcaag 339
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 焦谷氨酸
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Phe Thr Tyr Gly Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 焦谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (161)..(161)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (314)..(314)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (360)..(360)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (383)..(383)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (420)..(420)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Phe Thr Tyr Gly Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (96)..(96)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (96)..(96)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (144)..(144)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 13
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Lys Pro Ser Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Asp Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Cys Pro Ala Cys Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Lys
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Arg
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 14
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtggaac caggcagaag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atctggtaca agcccagcga gaaggactac 180
gccgacagcg ccaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc tagaggcggc 300
ctgctgggct acttcgacta ttggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc tagcgctagc 360
accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt cgacgactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc tgcccggctt gcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
ggcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctccaagac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctgcgg 1200
tccgacggct ccttcttcct ctatagcgag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaaa 1320
agcctctccc tgtctccggg taaatgatga 1350
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Lys Pro Ser Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 16
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtggaac caggcagaag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atctggtaca agcccagcga gaaggactac 180
gccgacagcg ccaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc tagaggcggc 300
ctgctgggct acttcgacta ttggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc tagc 354
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Lys Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Cys
145 150 155 160
Glu Cys Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 18
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 18
gagatcgtgc tgacccagag ccctggcacc ctgtcactgt ctccaggcga gagagccacc 60
ctgagctgta gagccagcca gagcatcaac agctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggacaggccc ccagacccct gatctatggc gtgtccagca gagccaccgg catccccgat 180
agattttccg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag actggaaccc 240
gaggactttg ccgtgtatta ctgccagcag tacggcagat accctttcac cttcggccca 300
ggaacaaaag tggacatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc aaggttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcctgc 480
gagtgtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagaga gctgatga 648
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 20
gagatcgtgc tgacccagag ccctggcacc ctgtcactgt ctccaggcga gagagccacc 60
ctgagctgta gagccagcca gagcatcaac agctacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggacaggccc ccagacccct gatctatggc gtgtccagca gagccaccgg catccccgat 180
agattttccg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag actggaaccc 240
gaggactttg ccgtgtatta ctgccagcag tacggcagat accctttcac cttcggccca 300
ggaacaaaag tggacatcaa g 321
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 焦谷氨酸
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Lys Pro Ser Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 焦谷氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (316)..(316)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (362)..(362)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (385)..(385)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Lys Pro Ser Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Asp Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Cys Pro Ala Cys Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Lys
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Arg
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Glu Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<220>
<221> MOD_RES
<222> (137)..(137)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Lys Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Cys
145 150 155 160
Glu Cys Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
210
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 25
Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 26
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
1 5 10 15
Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Tyr
20 25 30
Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
35 40
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 27
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
1 5 10 15
<210> 28
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 28
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
20 25 30
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
35 40 45
Lys
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 29
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 31
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1 5 10 15
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
20
<210> 32
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 32
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
1 5 10 15
His Asn His Tyr Thr Gln Lys
20
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 33
Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
1 5 10 15
Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Val Ser Ser Arg
20 25 30
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 天冬酰胺或天冬酰胺的脱酰胺版本
<400> 34
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
1 5 10

Claims (40)

1.一种抗体混合物，其包含：
(a)抗人程序性死亡蛋白1(抗hPD1)抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中(1)所述抗hPD1抗体的HC由编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸序列编码，并且(2)所述抗hPD1抗体的LC由编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的核酸序列编码；和
(b)抗人细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗hCTLA4)抗体，其包含HC和LC，其中(1)所述抗hCTLA4抗体的HC由编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列编码，并且(2)所述抗hCTLA4抗体的LC由编码SEQ ID NO：17的氨基酸序列的核酸序列编码；
其中所述混合物中抗hCTLA4抗体的量与所述混合物中抗hPD1抗体的量的重量比(w/w)(抗hCTLA4:抗hPD1比例)在1:1至1:4的范围内，
其中所述抗hPD1抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有220至380小时的体内半衰期(t1/2)，和/或所述抗hPD1抗体在施用到以前未给药过所述抗hPD1抗体的人时具有135至300小时的体内t1/2，并且
其中所述抗hCTLA4抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有40至150小时的体内t1/2，和/或所述抗hCTLA4抗体在施用到以前未给药过所述抗hCTLA4抗体的人时具有90至210小时的体内t1/2。
2.根据权利要求1所述的混合物，
其中所述编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ IDNO：10的氨基酸序列，
其中所述编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQ IDNO：12的氨基酸序列，
其中所述编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQID NO：22的氨基酸序列，并且
其中所述编码SEQ ID NO：17的氨基酸序列的核酸序列还编码SEQID NO：24的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1至1:3的范围内。
4.根据权利要求3所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.2至1:2.5的范围内。
5.根据权利要求4所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.5至1:2.5的范围内。
6.根据权利要求5所述的混合物，其中所述抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.7至1:2.3的范围内。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的混合物，其中：
所述抗hPD1抗体的HC和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：2和6的核酸序列编码；并且
所述抗hCTLA4抗体的HC和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：14和18的核酸序列编码。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的混合物，
其中所述抗hPD1抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有250至350小时的体内t1/2，和/或所述抗hPD1抗体在施用到以前未给药过所述抗hPD1抗体的人时具有140至250小时的体内t1/2，并且
其中所述抗hCTLA4抗体在食蟹猴中的单剂量研究中具有70至130小时的体内t1/2，和/或所述抗hCTLA4抗体在施用到以前未给药过所述抗hCTLA4抗体的人时具有90至140小时的体内t1/2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过15％、14％、13％、12％或11％的所述患者经历3级或4级不良事件(AE)。
10.根据权利要求9所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过10％、9％或8％的所述患者经历3级或4级AE。
11.根据权利要求10所述的混合物，其中
当将所述混合物以不超过5mg/kg的剂量施用到一组至少10位人类患者时，不超过7％、6％或5％的所述患者经历3级或4级AE。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的混合物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为pH 4.5至pH 5.5。
14.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其中所述组合物中的总蛋白浓度为20mg/mL至30mg/mL。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物具有250至380mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
16.一种或多种多核苷酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的混合物。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO：2、6、14和18的核酸序列。
18.一种或多种载体，其包含根据权利要求16或17所述的多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的载体，其是病毒载体。
20.根据权利要求19所述的载体，其是溶瘤病毒载体。
21.根据权利要求19或20所述的载体，其是反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)、疱疹病毒、慢病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒或痘病毒载体。
22.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16或17所述的多核苷酸和/或根据权利要求18所述的载体，其中所述宿主细胞能够产生根据权利要求1至11中任一项所述的混合物。
23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.2至1:3的范围内。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.5至1:2.5的范围内。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的混合物的抗hCTLA4:抗hPD1比例在1:1.7至1:2.3的范围内。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的宿主细胞，其是CHO细胞或小鼠骨髓瘤细胞。
27.一种制备抗体混合物的方法，其包括下述步骤：
培养根据权利要求22至26中任一项所述的宿主细胞；和
从培养上清液或宿主细胞团中回收所述抗体混合物。
28.一种治疗患有癌症、免疫缺陷病症或感染的患者的方法，其包括：
(a)向所述患者施用一定剂量的根据权利要求1至11中任一项所述的混合物或根据权利要求12至15中任一项所述的药物组合物，或
(b)向所述患者施用一定剂量的根据权利要求16或17所述的多核苷酸或根据权利要求18至21中任一项所述的载体。
29.根据权利要求28(a)所述的方法，其中所述剂量的混合物或药物组合物以约每周两次、每周一次或每2、3、4、5、6、7或8周一次施用，并且其中所述混合物或药物组合物的剂量由下述一者或多者描述：
(1)所述剂量为至少约0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0mg/kg；
(2)所述剂量为至多约9、8、7、6、5、4或3mg/kg；
(3)所述剂量为约1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0mg/kg；
(4)所述剂量为约200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500mg；
(5)所述剂量为至少约75、100、125、150、200、225或250mg；和
(6)所述剂量为至多约600、500、400或300mg。
30.根据权利要求29所述的方法，其中
所述剂量为至少3mg/kg且不超过5mg/kg，和/或
所述剂量为至少180mg且不超过400mg，
其中所述剂量约每3周一次施用。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述剂量为约5mg/kg。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述剂量为300至400mg。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，
其中所述患者患有癌症，
其中所述混合物或药物组合物被施用到至少10位患者，并且
其中客观应答率(ORR)为至少5、10、15、20、25、30或35％，和/或疾病控制率(DCR)为至少25、30、35、40、45、50、55或60％。
34.根据权利要求28(b)所述的方法，其中所述剂量的多核苷酸或载体以约每周两次、每周一次或每2、3、4、5、6、7或8周一次施用，并且其中所述多核苷酸或载体的剂量由下述一者或多者描述：
(1)所述剂量为每公斤患者体重至少约5x 109个拷贝的所述多核苷酸或载体(拷贝/kg)；
(2)所述剂量为至多约1015个拷贝/kg；
(3)所述剂量为约1010个拷贝/kg至约1014个拷贝/kg；和
(4)所述剂量为约1010、1011、1012、1013、5x 1013、1014、2x 1014、3x 1014、4x 1014、5x 1014、6x 1014、7x 1014、8x 1014、9x 1014或1015个拷贝。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体通过包括输注或推注的静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射施用。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述患者患有黑素瘤、包括鳞状非小细胞肺癌和小细胞肺癌的肺癌、鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌或胃食管癌、透明细胞或非透明细胞肾细胞癌、尿路上皮癌、软组织或骨肉瘤、间皮瘤、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、膀胱癌、梅克尔细胞癌、神经内分泌癌、宫颈癌、肝细胞癌、卵巢癌或微卫星高度不稳定性(MSI-H)或DNA错配修复缺陷型(dMMR)成人和儿童实体瘤。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中在使用所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体的之前、之后或同时用化学治疗剂或放射治疗所述患者。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的方法，其中所述剂量的混合物、药物组合物、多核苷酸或载体被施用到至少10位患者，其中已施用所述剂量的患者不同时使用放射或化学治疗剂治疗，并且其中不超过15％、14％、13％、12％或11％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
39.根据权利要求38所述的方法，其中不超过10％、9％或8％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
40.根据权利要求39所述的方法，其中不超过7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的已施用所述剂量的患者经历3级或4级AE。
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CN109475627B (zh) * 2016-05-26 2023-01-06 齐鲁普吉湾生物治疗公司 抗体混合物
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