CN117304344B - 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用，所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到；所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。本发明的融合蛋白表达量高，不仅保留干扰素广谱的抗病毒活性，还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒，可以降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率。

Description

一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用，属于遗传工程技术领域。

背景技术

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性、高度接触性病毒性传染病，主要引起雏鸡死亡、肉鸡的饲料报酬低、产蛋鸡的产蛋能力下降。该病主要通过接种疫苗进行防控，但由于疫苗交叉保护性差导致该病在免疫鸡群中仍时有发生。鸡α干扰素（IFN-α）是鸡免疫相关细胞产生的一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有抗病毒活性。鸡α干扰素抗病毒作用并不是直接杀死病毒，而是间接的通过机体细胞来发挥作用，鸡α干扰素通过自分泌或者旁分泌作用，与细胞膜表面上的特定受体结合后，引发级联性的信号放大过程，最后将信号传递到细胞核内，对一系列基因的表达进行调控，并介导各种生理生化反应。对于鸡用抗病毒生物制品来说，与传统的化学药物和疫苗相比，重组鸡IFN-α不会产生耐药性与药物残留等安全性问题。干扰素作为一种广谱抗病毒药物，如何提高干扰素的特异性抗病毒效果也将成为研究的重点。

氨肽酶N（APN）亲和肽是位于细胞表面的一种锌离子依赖的金属糖蛋白，是大多数Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒发生感染时的细胞受体。鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于Ⅲ型冠状病毒中的一种禽类冠状病毒，在进化上被认为是处于Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒之间。目前研究表明APN亲和肽是鸡传染性支气管炎病毒感染的功能性受体，且APN基因敲除鸡能够显著提高抗IBV感染能力，开发APN分子抑制剂一直是目前研究抗IBV药物的重点。

现有技术中未见鸡α干扰素与氨肽酶N亲和肽结合制备融合蛋白的报道。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用，实现以下发明目的：

在保留干扰素广谱抗病毒活性的条件下，还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒，降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率；提高融合蛋白的表达量和抗病毒活性。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种融合蛋白，所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到；所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示；所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 9所示。

所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

一种表达所述融合蛋白的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母。

所述重组菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 20211521，分类命名为毕赤酵母Pichia pastoris，保藏日期为2021年12月1日。

所述的融合蛋白在制备治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。

本发明表达APN-G-(GGGGS)3-IFNα的重组毕赤酵母X-33-chIFNα，分类命名为：毕赤酵母Pichia pastoris，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月1日，保藏编号为CCTCC NO：M 20211521。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

（1）本发明所述APN-G-(GGGGS)₃-IFNα融合蛋白，APN亲和肽可以与APN结合，阻止IBV与APN结合，进而抑制IBV对细胞的感染，加上鸡IFN-α自身的抗病毒作用，进一步提高了治疗效果，特定的柔性Linker的加入，有利于APN亲和肽和IFNα的独立表达，提高融合蛋白的稳定性。本发明的融合蛋白在保留干扰素广谱抗病毒活性的条件下，还特异性的防治鸡传染性支气管炎病毒，有更好的治疗效果。

（2）本发明对APN亲和肽、IFNα、连接子的核苷酸序列进行了优化，并采用特定长度的连接子，可以提高毕赤酵母中融合蛋白的表达量，提高融合蛋白的特异性抗病毒效果，降低感染病毒后鸡的发病率和死亡率。

本发明纯化后的融合蛋白中鸡α干扰素的浓度为17.52g/L；

本发明纯化后的融合蛋白的抗IBV病毒活性为1.09×10⁶IU/mL；

本发明纯化后的融合蛋白用于感染IBV的鸡后，总发病率为20%，总死亡率为4%。

附图说明

图1为本发明重组毕赤酵母的阳性克隆电泳图；

图2为鉴定本发明APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白特异性的SDS-PAGE图；

图3为本发明纯化后的APN-G-(GGGGS)3-IFNα融合蛋白的SDS-PAGE图。

具体实施方式

下述实施例中为了更方便表述，将氨肽酶N简称为APN。

实施例1一种含鸡α干扰素、氨肽酶N亲和肽的融合蛋白的制备方法

一、APN亲和肽的筛选

根据目前已知的APN亲和肽的氨基酸序列（表1），通过委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并委托山东省农业科学院进行APN亲和肽的体外活性检测，确定对IBV抑制效果最好的亲和肽。

表1 APN亲和肽的氨基酸序列

采用CEK-IBV检测系统检测APN亲和肽对IBV入侵CEK细胞的抑制作用，各APN亲和肽针对IBV的抗病毒活性见表2。

表2各APN亲和肽针对IBV的抗病毒活性检测结果

由表2可见，APN亲和肽a（命名为G）针对IBV的抗病毒活性最高，采用该APN亲和肽进行后续试验。

二、将融合蛋白APN-G-(GGGGS)₃-IFNα的基因片段插入分泌表达载体pPICZαA载体

优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)₃-IFNα的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα由以下模块依次串联得到：

（1）APN亲和肽，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

（2）连接子，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

（3）IFNα，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；

本发明针对上述SEQ ID NO.1序列进行了密码子优化，得到优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα的核酸人工序列，如序列表中SEQ ID NO.6所示。

优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)₃-IFNα由以下模块依次串联得到：

（1）优化后APN亲和肽，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；

（2）优化后连接子，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；

（3）优化后IFNα，其核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；

将优化后APN亲和肽的核酸人工序列、优化后连接子的核酸人工序列、优化后IFNα的核酸人工序列，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框，并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点，构建pPICZαA-APN-G-(GGGGS)₃-IFNα，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得1μg/μL的重组质粒。

三、电转化以及阳性菌株的筛选

对上述获得的pPICZαA-APN-G-(GGGGS)₃-IFNα重组质粒进行限制性内切酶SacⅠ消化，具体操作为：30μL ddH₂O、4μL 10×FuniCut™ Buffer、4μL上述质粒、2μL FuniCut™SacI，37℃孵育15min。

采用异丙醇法快速纯化DNA，具体操作为：在上述体系加0.6倍体积的异丙醇于室温下充分混匀，于4℃离心25min，用乙醇清洗DNA 沉淀，在4℃再次离心25min，弃上清液，使DNA 沉淀干燥后，用20μL TE 缓冲液重新溶解DNA沉淀，得到DNA溶液。

最后将DNA溶液与毕赤酵母X-33感受态菌悬液以1：8 (V/V)混合后进行电转(2000V，25µF，200Ω，电击5ms)，电转后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，于28℃静置1.5h；然后加入1mL YPD，于150r/min、28℃培养1.5h；离心收集菌体，涂布于含100μg/mL博来霉素的YPD平板，于28℃培养至酵母单菌落长出；挑取长势良好的酵母菌落，以其基因组DNA为模板，进行PCR，对重组毕赤酵母菌株X-33/pPICZαA-APN-G-(GGGGS)₃-IFNα进行验证，经1.5%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳后，在预期分子量(1125bp)处有明显条带(图1)，获得含有优化后融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母，命名为重组毕赤酵母X-33-chIFNα；将该重组毕赤酵母制成冻干粉保存备用，同时进行生物保藏。

所述毕赤酵母X-33菌株购自山东赛恩斯科技有限公司；

所述毕赤酵母X-33感受态菌悬液采用CN114539426A的实施例1中毕赤酵母X-33感受态菌悬液的制备方法制得。

四、APN-G-(GGGGS)₃-IFNα融合蛋白的鉴定

取步骤三得到的重组毕赤酵母X-33-chIFNα冻干粉1支（1克）接种于50mL YPD培养基，于28℃、250r/min培养12h；取10mL上述培养液转接于50mL BMGY培养基；在同样条件下继续培养24h，离心收集菌体，全部菌体转接于甲醇浓度为1.5%（V/V）的50mL BMMY培养基，于28℃、250r/min继续培养64h，得到发酵液，取发酵液的上清液用于SDS-PAGE，结果表明在21.31kD 处有明显条带 (图2)；

所述BMGY培养基，包括以下组分：1%（质量体积比）酵母粉、2%（质量体积比）胰蛋白胨、1.34%（质量体积比）YNB、4×10^-5%（质量体积比）生物素、1%（V/V）甘油，100mM 的pH6.0的磷酸钾溶液补足100%。

所述的BMMY液体培养基，包括以下组分：1%（质量体积比）酵母粉、2%（质量体积比）胰蛋白胨、1.34%（质量体积比）YNB、4×10^-5%生物素（质量体积比）、0.5%（V/V）甲醇，100mM的pH6.0的磷酸钾溶液补足100%。

五、融合蛋白的制备

参考CN110684681A实施例4的方法进行融合蛋白制备。具体步骤如下：

（1）菌株活化与筛选

将重组毕赤酵母X-33-chIFNα划线接种到含300μg/mL、600μg/mL、900μg/mL博来霉素的YPD固体培养基上，筛选出稳定多拷贝的高产菌种。

（2）一级种子培养

从第三次筛选的YPD固体培养基上挑取单菌落，接入装有250mL YPD液体培养基的1L三角瓶中，置于摇床中，在30℃、200rpm的条件下培养至OD600＝0.7，作为一级种子液。

（3）二级种子培养

将4瓶一级种子液共1L接种到已灭菌的100L BMGY发酵培养基中，使用发酵种子罐培养，控制通气量在5L/min，温度30℃，转速200rpm，待OD600＝0.7，为二级种子液备用。

（4）发酵培养

用泵将备好的100L二级种子液泵入1吨BMMY液体培养基中，发酵条件控制在转速200rpm，温度30℃，pH5.0，通气量10L/min。每4h取样一次测定其碳源剩余、菌体浓度，初期使用分光光度计测量其600nm吸光值(OD600)，后期测量湿重作为参考。发酵期间通过调整转速和通气量使溶氧保持在30％以上，以溶氧电极数值上升到100％为标志表示初始碳源已消耗殆尽，即可进入边富集边诱导阶段，具体为以7mL/h/L的恒定速率补加浓度为0.1g/mL的山梨醇溶液，以2.5mL/h/L的恒定速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH5.0，溶氧(DO)在20～30％之间，每6h取样1次，测OD600、细胞湿重及细胞干重，分析酵母菌生长状态，菌体湿重达400g/L以上时，停止补加山梨醇，转入菌体诱导阶段，具体为以10mL/h/L的速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH6.0，DO在20～30％之间，湿重达到500g/L以上，结束发酵，得发酵液。

（5）纯化工艺

将上述发酵液在8000r/min下离心30min，收集上清液，再将上清液通过30kD孔径超滤膜包将发酵液上清浓缩10倍；在浓缩后的上清中加入等量的平衡缓冲液并调pH至7.4，加入钴柱中与介质充分结合；分别使用含5mmol/L和150mmol/L咪唑的缓冲液进行洗涤和洗脱。

将含目标蛋白脱液合并，使用30kD超滤管超滤去除杂带、浓缩目标蛋白，收集截留液为纯化后融合蛋白。SDS-PAGE结果表明本发明纯化工艺可以有效除去大多数降解条带，保留较高纯度的APN-G-(GGGGS)₃-IFNα条带(图3)。采用鸡α干扰素定量检测试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)测定本发明纯化后融合蛋白中鸡α-干扰素，委托山东省农业科学院采用CEK-IBV检测系统进行融合蛋白的体外抗病毒活性检测，结果如下：

表3本发明融合蛋白中鸡α干扰素浓度 (g/L)

表4本发明融合蛋白的抗IBV病毒活性

实施例2 APN-G-(GGGGS)₃-IFNα融合蛋白的实验室防治试验

将75只14日龄鸡随机分成3组，每组25只，第1组为本发明APN-G-(GGGGS)₃-IFNα融合蛋白治疗组；第 2 组为IFNα治疗组；第3组为未进行治疗组。各组鸡滴鼻0.1mL IBV病毒液(病毒浓度为1.0×10^6.22EID₅₀/0.1mL)，随后立即，第1组鸡注射本发明纯化后APN-G-(GGGGS)₃-IFNα融合蛋白，稀释1.3倍使用，每次用量2mL，每天1次，连续3天；第2组鸡静脉注射IFNα（采用CN110684681A实施例4的方法发酵得到IFNα，再采用上述步骤五纯化制得，纯化后的IFNα（浓度13.5g/L和IBV抗病毒活性为0.3×10⁶IU/mL），每次用量2mL，每天1次，连续3天；第3组为空白对照组，鸡静脉注射同等剂量生理盐水2mL，每天1次，连续3天。

观察防治效果，统计发病及死亡情况。结果表明第1组在鸡静脉注射本发明APN-G-(GGGGS)₃-IFNα后，发病率20%，死亡率为4%。第2组鸡静脉注射IFNα后发病率52%，死亡率为44%；空白对照组未采取治疗措施鸡，则全部发病死亡，发病率100%，死亡率为88%。具体见表5。

表5实验室治疗结果

。

对比例1连接子的选择试验

为了将APN亲和肽和鸡α干扰素更好地进行连接，在二者之中分别加入柔性（GGGGS）₀、（GGGGS）₁、（GGGGS）₅，其中（GGGGS）₁的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.10所示、（GGGGS）₅的核酸人工序列如序列表中SEQ ID NO.11所示，分别按APN亲和肽的核酸人工序列（SEQ ID NO.7）、（GGGGS）_n、IFNα核酸人工序列（SEQ ID NO.9）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框，并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点，构建pPICZαA-APN-G-（GGGGS）_n-IFNα，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得1μg/μL的重组质粒。按照实施例1的方法获得表达APN-G-（GGGGS）_n-IFNα的重组毕赤酵母并制备融合蛋白，委托山东省农业科学院检测融合蛋白的体外抗IBV病毒活性。

表6各融合蛋白体外抗IBV病毒活性检测结果

表6可见，融合蛋白中加入柔性Linker后，可以提高IBV的抑制率，实施例1制备的融合蛋白（（GGGGS）₃作为连接子）的体外抗IBV病毒活性为1.09×10⁶IU/mL，明显高于其它连接子制备的融合蛋白，说明（GGGGS）₃作为连接子更有利于毕赤酵母中鸡α干扰素的表达，融合蛋白的稳定性更好，抗病毒活性更高，因此选择柔性连接子（GGGGS）₃作为构建重组氨肽酶N亲和肽-干扰素α融合蛋白制备的组成部分。

对比例2优化前融合蛋白中鸡α干扰素和抗病毒活性的测定

优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα基因序列SEQ ID NO.1委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成其整个表达框，并插入pPICZαA载体EcoRI-KpnI位点，构建优化前pPICZαA-APN-G-(GGGGS)₃-IFNα，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得1μg/μL的优化前的重组质粒。将优化前的重组质粒采用实施例1方法步骤三的操作，进行电转化以及阳性菌株的筛选，得到含有优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母，并采用步骤四的操作，进行融合蛋白的鉴定，结果符合预期。

将含有优化前融合蛋白APN-G-(GGGGS)3-IFNα序列的重组毕赤酵母按实施例1的步骤五的操作进行发酵和纯化，得到优化前融合蛋白。将优化前融合蛋白进行3批次实验，采用鸡α干扰素定量检测试剂盒测定融合蛋白中鸡α-干扰素的浓度，委托山东省农业科学院采用CEK-IBV检测系统检测融合蛋白的抗IBV病毒活性。

表7优化前融合蛋白中鸡α干扰素的浓度 (g/L)

表8优化前融合蛋白的抗IBV病毒活性

本发明融合蛋白中鸡α-干扰素的浓度为17.52g/L，明显高于优化前融合蛋白，本发明融合蛋白的抗病毒活性为1.09×10⁶IU/mL，也明显高于优化前融合蛋白。

Claims (4)

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由氨肽酶N亲和肽、连接子、IFNα依次串联得到；所述氨肽酶N亲和肽的核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示；所述IFNα的核酸序列如序列表中SEQ ID NO. 9所示。

2.一种表达权利要求1所述融合蛋白的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为重组毕赤酵母。

3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株的保藏编号为CCTCCNO：M 20211521，分类命名为毕赤酵母Pichia pastoris，保藏日期为2021年12月1日。

4.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗鸡传染性支气管炎药物中的应用。