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CN117286180B - GmACBP6蛋白质/基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成或大豆产量中的应用 - Google Patents

GmACBP6蛋白质/基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成或大豆产量中的应用 Download PDF

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CN117286180B CN202311206616.XA CN202311206616A CN117286180B CN 117286180 B CN117286180 B CN 117286180B CN 202311206616 A CN202311206616 A CN 202311206616A CN 117286180 B CN117286180 B CN 117286180B
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Abstract

本发明公开GmACBP6蛋白质/基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成或大豆产量中的应用，属于植物育种技术领域。本发明的目的是为了控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成或大豆产量。本发明提供GmACBP6蛋白质在控制大豆中种子油分含量或者大豆中种子脂肪酸含量或者提高大豆的产量中的应用，所述GmACBP6蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.7所示。GmACBP6a的过量表达能够促进油酸(18:1)的积累和提高大豆种子中的油含量以及提高大豆的产量。

Description

GmACBP6蛋白质/基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成 或大豆产量中的应用
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及GmACBP6蛋白质/基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸组成或大豆产量中的应用。
背景技术
大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的油料作物，同时也是人类摄入日常所需蛋白质和油分的重要来源之一，大豆籽粒中的蛋白质与油分含量约占干种子的40％和20％。大豆产量占世界油料作物产量的60％，提供了全球大约1/3的植物油用量。我国是世界最大的大豆消费国，由于国产大豆品种的产量和产油率低于进口大豆，无法满足人们日益增长的需求，我国每年约90％消费的大豆依赖于进口。因此，提高我国大豆的产量和含油量，是保证我国粮食安全的重要举措。大豆油中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量及组成比例直接影响了大豆油的品质和用途。富含不饱和脂肪酸的大豆油主要用作食用植物油，其不饱和脂肪酸除了可以满足人体营养必需外，还可以起到降低胆固醇的作用，对高血压及心脑血管疾病也有辅助治疗作用，因此，提高大豆油中油酸的含量既可以增加大豆的营养价值又可保证大豆油的货架期，是目前提高大豆油品质的重要途径。前期，育种家们虽然通过传统育种方法在提升大豆油含量上取得了一定成绩，但是传统育种方法受到种质资源的限制，具有育种周期长、有利变异少等劣势，导致提高大豆种子含油量的能力有限。随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展，越来越多的植物功能基因被鉴定，更多的表达调控模式和分子机制得到阐明，使得在分子水平上有目的性、针对性地对作物进行改良成为可能。相对于传统育种，转基因大豆育种可加速高油大豆育种进程，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是为了提高大豆中的油分的含量和脂肪酸的含量以及大豆的产量。
本发明提供一种GmACBP6蛋白质在控制大豆中油分含量或者大豆中脂肪酸含量或者提高大豆的产量中的应用，所述GmACBP6蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.7所示。
本发明提供一种GmACBP6蛋白质的编码基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸含量中的应用。
本发明提供一种含有超表达GmACBP6蛋白质的编码基因的大豆植株或敲除GmACBP6蛋白质的编码基因的大豆毛状根在控制大豆种子或者大豆毛状根中的脂肪酸的含量或大豆种子中的油分或者提高大豆的产量中的应用。
进一步地限定，GmACBP6蛋白质的编码基因的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。
进一步地限定，所述脂肪酸为油酸(18：1)、亚油酸(18：2)、亚麻酸(18：3)、棕榈酸(16：0)和硬脂酸(18：0)其中任意一个或者任意多个；所述大豆的产量为大豆种子长度、宽度和厚度或者大豆的百粒重。
本发明提供一种培育控制大豆中油分含量或者脂肪酸含量的植株的方法，所述的方法的具体步骤如下：
(1)扩增GmACBP6a蛋白质的编码基因，将基因序列插入到植物过表达载体；
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转基因大豆；
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆得到阳性转基因大豆；
或者
将大豆的毛状根中的GmACBP6s蛋白质的编码基因进行敲除，获得基因敲除的转基因的大豆的毛状根。
进一步地限定，所述大豆的GmACBP6蛋白质的编码基因的靶点序列如SEQ IDNO.25所示。
进一步地限定，GmACBP6蛋白质的编码基因为GmACBP6a基因或GmACBP6b基因。
进一步地限定，步骤(1)中表达的载体为pCAMBIA3301-MYC；敲除使用的载体为基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-GFP。
本发明提供一种提高大豆种子中的油分和亚油酸(18:1)的方法，将大豆的GmACBP6a蛋白质的编码基因在大豆中超表达获得大豆转基因植株，提取大豆种子中的油分和亚油酸(18:1)。
有益效果：GmACBP6a-OE大豆中油分和总脂肪酸含量分别升高了6.51％-9.26％和10.95％-12.87％，蛋白质的含量未发生变化。说明GmACBP6a的过量表达可以提高大豆种子中的油含量，但不会影响蛋白质含量。GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子中油酸(18:1)含量分别升高了12.03％、22.18％和8.84％，而GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子中的硬脂酸(18:0)、亚麻酸(18:3)和GmACBP6a-OE2株系的亚油酸(18:2)含量降低，其中硬脂酸含量分别降低了16.43％、16.29％和8.97％，亚麻酸含量分别降低了9.15％、13.93％和12.63％，GmACBP6a-OE2株系的亚油酸(18:2)含量降低了4.06％，其他脂肪酸组成并未发生改变，表明GmACBP6a的过量表达能够促进油酸(18:1)的积累。GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3种子的长度、宽度和厚度均显著增加。同时GmACBP6a-OE种子的百粒重相对于受体大豆品种东农50(DN50)种子增加了26.77％
附图说明
图1为GmACBP6a基因的结构示意图；
图2为GmACBP6和植物ACBP6蛋白的进化分析；注：Gm：大豆；Ah：花生；Si：芝麻；Bn：油菜；At：拟南芥；Zm：玉米；Os：水稻；Gs：野生大豆；Lu：亚麻，Rc：蓖麻；Gh：棉花；Ha：向日葵；Eg：油棕；
图3为GmACBP6和植物ACBP6蛋白的氨基酸序列比对；注：Gm：大豆；Ah：花生；Si：芝麻；Bn：油菜；At：拟南芥；Zm：玉米；Os：水稻；
图4为GmACBP6a的亚细胞定位分析；注：比例尺大小为50μm；
图5为GmACBP6基因在不同大豆组织和发育种子中的表达模式分析；注：单位d代表开花后第几天的大豆种子；
图6为GmACBP6a基因启动子在转基因拟南芥中时空表达分析；注：(a)5d幼苗；(b)15d幼苗；(c)莲座叶；(d)茎叶；(e)茎；(f)花；(g)-(l)果荚(2、4、6、8、10和12DAP)；比例尺：3mm；DAP:拟南芥开花后第几天的种子
图7为GmACBP6a过表达载体构建示意图；
图8为GmACBP6a-OE大豆叶片草铵膦鉴定；
图9为GmACBP6a-OE大豆植株的Bar试纸条检测；
图10为GmACBP6a-OE大豆植株的Western blot检测；
图11为GmACBP6基因在GmACBP6a-OE大豆种子中的表达水平分析；注：**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)；
图12为GmACBP6a-OE大豆种子的油分、总脂肪酸和蛋白质含量分析；注：A：GmACBP6a-OE大豆种子的油分含量；B：GmACBP6a-OE大豆种子的总脂肪酸含量；C：GmACBP6a-OE大豆种子的蛋白质含量；**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)；
图13为GmACBP6a-OE大豆种子的脂肪酸组成分析；注：**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)；
图14为GmACBP6a-OE大豆种子的长度、宽度、厚度分析；注：A-B：GmACBP6a-OE大豆种子长度比较和统计分析；C-D：GmACBP6a-OE大豆种子宽度比较和统计分析；E-F：GmACBP6a-OE大豆种子厚度比较和统计分析；比例尺：1cm；**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)；
图15为GmACBP6a-OE大豆种子的百粒重分析；注：**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)；
图16为GmACBPs基因编辑载体构建示意图；
图17为GmACBP6s基因编辑毛状根的荧光检测；注：K599：对照毛状根；p35Spro-Cas9-GmACBP6s：过表达GmACBP6s-pYLCRISPR/Cas9-GFP的毛状根；
图18为基因编辑毛状根的测序峰图分析；注：绿色方框代表外显子；黑色直线代表内含子；红色竖线代表外显子内靶位点所在的位置；红色下划线标记的碱基序列为靶点序列；红色框内的碱基代表PAM序列；红色箭头指示的为靶位点碱基发生突变的位点；deletion代表缺失；K599：对照毛状根；p35Spro-Cas9-GmACBP6s#1、#2和#3：三份独立的GmACBP6s基因编辑毛状根；
图19为GmACBP6s基因编辑毛状根的脂肪酸含量分析；注：K599：对照毛状根；p35Spro-Cas9-GmACBP6s：GmACBP6s基因编辑毛状根；**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)。
图20为GmACBP6s基因比对及靶点标记结果图；注：红色方框内表示靶点序列，红色线条上方表示PAM序列(靶点位于第一个外显子)。
具体实施方式
pCAMBIA1300-mCherry载体可以商业化购买(钦诚生物,QCP2954)，pCAMBIA1300-mCherry用来标记细胞核、细胞质、细胞膜定位，该载体在激光共聚焦显微镜检测下发红色荧光。pCAMBIA1300-EGFP载体可以商业化购买(科瑞思搏，VT11949)，该载体在激光共聚焦显微镜检测下发绿色荧光。
实施例1.GmACBP6蛋白质的编码基因的克隆
1.利用NCBI和Phytozome数据库对GmACBP6a序列进行分析。结果显示GmACBP6a的cDNA全长为273bp，其包括CDS编码序列273bp。GmACBP6a蛋白编码90个氨基酸，含有一个ACB结构域(图1)。为了分析GmACBP6与植物同源物的系统发育关系，我们使用GmACBP6a的氨基酸序列作为查询序列，在NCBI和Phytozome数据库中搜索同源物。通过这种方法，我们从大豆、拟南芥：NP_174462、水稻：XP_015648168、花生：XP_015963178、玉米：NP_001147418、野生大豆：GlysoPI483463.04G103600、蓖麻：XP_048230602、油棕：XP_029116599、向日葵：XP_022021546、芝麻：XP_011092638、油菜：XP_009145229、棉花：XP_016755542和亚麻：Lus10013605中查询small ACBP同源物，用于系统发育分析。结果显示，GmACBP6与野生大豆GsACBP6的亲缘关系最近(图2)。GmACBP6与其同源物的氨基酸序列比对显示，都含有一个保守的ACB结构域(图3)，说明它们属于同一家族基因。
Glyma.04G122900(GmACBP6a)SEQ ID NO.1:
>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.04G122900|Chr04:15819616..15820127forward基因序列ATGGTCATGCAGGAGGATTTTGAGCAGTATGCTGAGAAAGCAAAGACTTTGCCACCGACTCAATCAAACGAAGACTTGCTTATCCTTTATGGATTGTACAAGCAGGCCACCGTTGGACCTGTCAACACCAGTGAGTGCTCTTGTTTAGCCAATATCAATAAATCAATGTCTTTCTACTTTTGAATTCTCACTATCAATAGGTGGTGGTGGTTTTGTAATTCCACCCCTCTTTTCTCTATTAATAGGACTACCCTTATTCATGAATTTTCTGTATGATTTACAGGCCGTCCGGGAATGTTCAACATGAGGGACAGAGCTAAATGGGATGCATGGAAGGCTGTTGAAGGTAGATAAAAGCTAGGTTGATCAATATATGTTTTGTTCTATTACTTTTATGTTTTCTGAGAGACATCAAAACTCTTTTTTGGCAGGGAAATCCAAGGACGAAGCAATGAGTGATTACATCACTAAGGTGAAACAGCTGCTGGAAGCAGCCGGCATGCCTGCTTGA；
启动子序列(1335bp)SEQ ID NO.2:
AATTTATGACCGCAACACGCCCTCAAATGACGAATTGGGGTTTACAAACATATTTTAAACGGAGAGA
GAGGAATATAGTTGCGTTACGTAGACGCGCGTGAGGTGTGAAATTGTTCCCAGGCCCACACTCCATC
CACTCTGCTACTACAAGTACGCTTCGAACGTAACGCTGATTAGCAACATCATCATCGTCATCTACAAC
TAGTAACAAAGATCCAACAAGCAGATCAATCTCTCTCTCTGTCTCCCAATCAAAACAGACATGGGTT
TGAAGGTCTGTCTCCTTAATCTATGTGCTTTCATGTGTTTCAGCGTTTGTTTTTCATCAATCATTATATG
TCTCCATGATAGATATAATTGTTGAATATCATGCATATCATTCATAGCATTCAATTTTGCTACTGCCTTGT
GTTCTTCTATTATGATTTTTTTGTGGGGGGTTTCTGTGCTAGCAAATATGTTTCTTCTTCTGCTATGGAT
TTTCAGATCCGTGTCACTGTTTAATTTGTTATGGGGTGACGAATTTCTGGGGAATAAAGGGAATTTTT
GTTGGTTTTGATTGGTGGGTATTGCAGACTCATCTTGAAGTGAAAGAGATTTGATGGGGTCTGTTTTG
TTTTTGTGGCCTCAGAGGATGTAGTATCCTTTGATTTGTTGGAACTTTAGATTGAGTGGCTTCTTCCAT
AGTTATGCCTTACTTTTGAATAAAAGAAAGTAATAGATAATTGTAATTTCTCTATGTATTCATTTAGATT
TTATTAGTAATTCATGTGGACAAATGTCGATTCAGCATAGTACCATAAAATGTGATTTTTGGCTTCAGT
TGCTTTAGGGTTTGTAG
CAGGAATCCCTTGATCTACTGTTTGTATTGTAGACTTGAGGATACTGATTAGGTTTTTTGGGGAATTGA
TTGTTCTTTTATGGATCCTCGAATGAATGCAGAAGCACATGCTCTCAAATTAGTAATTTAATTTGCAAA
GGGAGATTATTATACTTTCAGTGATACTGGTTATATTAGTAAAGCAATGCTTTATATAATGCTTTTAACA
ACTATTTATTTGACCAAATTGTGGAAAGAATCCTGGTCTTCAAATGCTGTAATTGGCCTATTCTTTTGCCTGTGTGAAATTTAATTCATCAAATATGCATCCTAAATCTCTAGGAAGGGATGCTAATTCTGTACTCTATAATGATCATGGATAATTTTTAATGTAGTTTAGTATTTTATCAGAATCTTATTTGTGTGTATGTTCTGAATTTTGAACTAGCTTTATACTTCTATGCTTGATATTGTTCTGTCAAAAAGAATTGACACTTGAAGCATCACACACTAAT；
CDS：>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.04G122900.1CDS SEQ ID NO.3:
ATGGTCATGCAGGAGGATTTTGAGCAGTATGCTGAGAAAGCAAAGACTTTGCCACCGACTCAATCAAACGAAGACTTGCTTATCCTTTATGGATTGTACAAGCAGGCCACCGTTGGACCTGTCAACACCAGCCGTCCGGGAATGTTCAACATGAGGGACAGAGCTAAATGGGATGCATGGAAGGCTGTTGAAGGGAAATCCAAGGACGAAGCAATGAGTGATTACATCACTAAGGTGAAACAGCTGCTGGAAGCAGCCGGCATGCCTGCTTGA；
>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.04G122900.1.p蛋白序列SEQ ID NO.4：
MVMQEDFEQYAEKAKTLPPTQSNEDLLILYGLYKQATVGPVNTSRPGMFNMRDRAKWDAWKAVEGKSKDEAMSDYITKVKQLLEAAGMPA。
实施例2.构建含有GmACBP6基因的载体
1.构建pCAMBIA3301-GmACBP6a-MYC：
首先将pCAMBIA3301载体利用Nco I和BstE II两个限制性核酸内切酶将载体中的GUS基因切除，然后引入一个多克隆位点和3×MYC片段，构建成pCAMBIA3301-MYC载体。利用特异性扩增引物(pCAMBIA3301-GmACBP6a-F和pCAMBIA3301-GmACBP6a-R)扩增GmACBP6a基因的无终止子的CDS序列，将pCAMBIA3301-MYC载体用pml I限制性核酸内切酶切开，通过同源重组方法将GmACBP6a基因连入携带有MYC标签的pCAMBIA3301载体(MYC序列直接连在GmACBP6a基因的无终止子的CDS序列后面)。将构建好的过表达载体转入农杆菌EHA105中，用于后续转化。引物pCAMBIA3301-GmACBP6a-F/R见表1。
表1引物序列
2.pCAMBIA1300-GmACBP6a-EGFP载体的构建及农杆菌转化：利用特异性扩增引物(pCAMBIA1300-GmACBP6a-F和pCAMBIA1303-GmACBP6a-R)扩增GmACBP6a基因的CDS序列(无终止子)。将GmACBP6a通过SmalⅠ限制性核酸内切酶酶切位点构建到植物表达载体pCAMBIA1300-EGFP(GmACBP6a基因无终止子CDS序列连接在GFP序列前)中，获得GmACBP6a-EGFP融合蛋白表达载体pCAMBIA1300-GmACBP6a-EGFP，构建成功的pCAMBIA1300-GmACBP6a-EGFP质粒转入农杆菌GV3101(pSoup-P19)(上海唯地生物技术有限公司:根癌农杆菌感受态细胞(https://www.weidibio.com/info.php？class_id＝103104))中。引物pCAMBIA1300-GmACBP6a-F/R见表1。
3.pCAMBIA3301-ProGmACBP6a：GUS载体的构建及农杆菌转化：利用特异性扩增引物(pCAMBIA3301-proGmACBP6a-F和pCAMBIA3301-proGmACBP6a-R)扩增GmACBP6a基因的启动子序列(1335bp，SEQ ID NO.2)。ProGmACBP6a通过HindⅢ和BstEⅡ限制性核酸内切酶酶切位点构建到携带有GUS基因的pCAMBIA3301载体中，获得ProGmACBP6a：GUS。将构建成功的pCAMBIA3301-ProGmACBP6a:GUS质粒转入农杆菌EHA105中。特异性引物pCAMBIA3301-proGmACBP6a-F/R见表1。
GmACBP6a基因按照上述的方法构建载体。
4.GmACBP6s-pYLCRISPR/Cas9-GFP载体的构建及农杆菌转化
(1)GmACBP6s基因靶点的选择
GmACBP6s基因序列(GmACBP6a和GmACBP6b)，并对2个GmACBP6同源基因进行比对。使用两个靶点设计网站http://rna.urmac.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html和http://crispr.d--bcls.jp/对GmACBP6s基因的靶点进行设计，并选出合适的靶点。
靶点序列：5’-TTGGACCTGTCAACACCAGT-3’(SEQ ID NO.25)
(2)靶点引物与gRNA表达盒连接
靶点需要和U3启动子以及sgRNA进行融合，用PCR法构建sgRNA表达盒，需要采用二轮PCR反应，反应条件如表2和表3所示。
①第一轮PCR扩增
以中间载体LacZ/AtU3b为模板，利用引物U2b-T1和GmACBP6-t1-3bR为引物进行扩增，获得长度约600bp的PCR中间产物LacZ/AtU3b。同时，再以LacZ/AtU3b为模板，利用引物GmACBP-T1-3bF和Target1-gRNA为引物进行PCR扩增，得到长度约100bp的PCR扩增产物。PCR反应体系和反应程序如下表2-3。引物U3b-T1、GmACBP6-t1-3bR、GmACBP-T1-3bF、Target1-gRNA见附表1。
表2第一轮PCR反应体系
表3第一轮PCR反应程序
每个产物各取出5ul用于琼脂糖凝胶电泳。
②第二轮PCR扩增
利用引物U3b-T1和Target1-gRNA，以第一轮PCR扩增产物600bp和100bp的混合物为模板进行PCR扩增，得到约700bp左右的PCR产物。PCR反应体系和反应程序如下表4引物U3b-T1和Target1-gRNA见附表A1。
表4第二轮PCR反应体系
组分 用量
KOD Master Mix 12.5μL
引物F/R(10μM) 各0.5μL
反应1+反应2PCR产物 1μL
ddH2O 10.5μL
Total 25μL
将第二轮PCR产物各取出5ul用于琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)表达盒与pYLCRISPR/Cas9-GFP载体的连接
pYLCRISPR/Cas9-GFP载体构建：pYLCRISPR/Cas9-Bar载体来源发表的文章：10.1016/j.molp.2015.04.007。利用限制性核酸内切酶EcoR I切割载体pYLCRISPR/Cas9-Bar，切除Bar基因序列，回收大片段。然后利用基因合成的方法根据pCAMBIA3301载体中相应序列合成35S-GFP-Nos序列，连入线性化pYLCRISPR/Cas9载体大片段，形成pYLCRISPR/Cas9-GFP。
35S-GFP-NOS合成序列：(SEQ ID NO.24)
AATTCAGCAGTAAGCGCCGTCAGACCAGAAAAGAGATTTTCTTGTCCCGCATGGAGCAGATTCTGCCATGGCAAAACATGGTGGAAGTCATCGAGCCGTTTTACCCCAAGGCTGGTAATGGCCGGCGACCTTATCCGCTGGAAACCATGCTACGCATTCACTGCATGCAGCATTGGTACAACCTGAGCGATGGCGCGATGGAAGATGCTCTGTACGAAATCGCCTCCATGCGTCTGTTTGCCCGGTTATCCCTGGATAGCGCCTTGCCGGACCGCACCACCATCATGAATTTCCGCCACCTGCTGGAGCAGCATCAACTGGCCCGCCAATTGTTCAAGACCATCAATCGCTGGCTGGCCGAAGCAGGCGTCATGATGACTCAAGGCACCTTGGTCGATGCCACCATCATTGAGGCACCCAGCTCGACCAAGAACAAAGAGCAGCAACGCGATCCGGAGATGCATCAGACCAAGAAAGGCAATCAGTGGCACTTTGGCATGAAGGCCCACATTGGTGTCGATGCCAAGAGTGGCCTGACCCACAGCCTGGTCACCACCGCGGCCAACGAGCATGACCTCAATCAGCTGGGTAATCTGCTGCATGGAGAGGAGCAATTTGTCTCAGCCGATGCCGGCTACCAAGGGGCGCCACAGCGCGAGGAGCTGGCCGAGGTGGATGTGGACTGGCTGATCGCCGAGCGCCCCGGCAAGGTAAGAACCTTGAAACAGCATCCACGCAAGAACAAAACGGCCATCAACATCGAATACATGAAAGCCAGCATCCGGGCCAGGGTGGAGCACCCATTTCGCATCATCAAGCGACAGTTCGGCTTCGTGAAAGCCAGATACAAGGGGTTGCTGAAAAACGATAACCAACTGGCGATGTTATTCACGCTGGCCAACCTGTTTCGGGCGGACCAAATGATACGTCAGTGGGAGAGATCTCACTAAAAACTGGGGATAACGCCTTAAATGGCGAAGAAACGGTCTAAATAGGCTGATTCAAGGCATTTACGGGAGAAAAAATCGGCTCAAACATGAAGAAATGAAATGACTGAGTCAGCCGAGAAGAATTTCCCCGCTTATTCGCACCTTCCCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTAGACTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCTTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGATTACGA；
将pYLCRISPR/Cas9-GFP载体用限制性核酸内切酶Bsa I酶切后进行线性载体纯化。将酶切后的载体与第二轮PCR扩增的目的片段采用同源重组的方式进行连接。
(4)GmACBP6s-pYLCRISPR/Cas9-GFP重组载体转化大肠杆菌DH5α。
(5)检测阳性克隆
挑取单个菌斑，转移至液体培养基，放于37℃进行培养。待菌液摇起后利用通用引物U-F和gRNA-R进行菌液PCR反应，选取条带正确的阳性克隆送至公司测序，检查gRNA表达盒及其靶点序列是否完整。引物U-F、gRNA-R见附表1
(6)发根农杆菌转化
将上述构建好的GmACBP6s-pYLCRISPR/Cas9-GFP载体转入发根农杆菌K599。
烟草叶片注射：将含有pCAMBIA1300-GmACBP6a-EGFP质粒和pCAMBIA1300-mCherry(钦诚生物，QCP2954)质粒的农杆菌GV3101(pSoup-P19)共同注射到烟草叶片中进行亚细胞定位分析。培养3d后，利用激光共聚焦显微镜检测注射叶片的荧光信号。
实施例3.GmACBP6a的组织表达模式分析和亚细胞定位分析
为研究GmACBP6a基因在大豆各组织部位以及发育种子中的表达情况，将提取于第一组三出复叶完全展开时期的根、茎、叶，始花期的花以及不同发育时间的大豆种子的RNA反转录成cDNA用于qRT-PCR。采用的引物序列为qPCR-GmACBP6-F/R(表1)。
结果显示，GmACBP6在所有组织中均有表达，茎和63DAF(开花后种子发育天数)种子的表达低于其他组织。在种子发育过程中，GmACBP6表现出先降低后保持稳定的表达模式(图5)。
为了观察GmACBP6a在体内的时空表达模式，创制了携带proGmACBP6a：GUS的转基因拟南芥(proGmACBP6a的长度为1335bp，SEQ ID NO.2)，采用组织染色法对转基因拟南芥中GUS基因的表达情况进行分析。结果显示，在幼苗、莲座叶、茎生叶、茎、花和发育过程中的荚中均显示出特异性组织化学染色且染色程度较深。发育的荚和叶片显示出较强的GUS染色，而在成熟的种子中几乎未见GUS染色(图6)。
为研究GmACBP6a的亚细胞定位情况，将得到的重组载体pCAMBIA1300-GmACBP6a-EGFP转入农杆菌GV3101(pSoup-p19)(上海唯地生物技术有限公司:根癌农杆菌感受态细胞(https://www.weidibio.com/info.php？class_id＝103104))中。通过烟草注射的方法将携带有GmACBP6a-GFP和GFP序列的农杆菌GV3101(pSoup-p19)分别与携带有pCAMBIA1300-mcherry载体的农杆菌GV3101(pSoup-p19)共同注射到烟草叶片中。培养3d，利用共聚焦显微镜观察GFP和RFP的表达情况。结果如图4显示，GmACBP6a-GFP在烟草叶片中定位于细胞核、细胞质和细胞膜，与对照GFP和RFP的细胞定位一致，表明GmACBP6a在细胞核、细胞质和细胞膜均能表达，这也为GmACBP6a发挥酰基辅酶A的转运功能提供位置基础。
实施例4.GmACBP6a基因促进大豆种子的油分合成
为探究GmACBP6a是否能够促进大豆种子含油量的增加，将构建得到的重组载体pCAMBIA3301-GmACBP6a-MYC(图7)转入农杆菌EHA105，以创制转基因大豆植株。本试验利用农杆菌介导的大豆遗传转化的方法将携带有GmACBP6a基因的过表达载体转至DN50大豆品种中，利用草铵膦(200mg/L)涂抹(图8)、Bar试纸条检测(图9)和Western blot(图10)鉴定得到三个独立的且稳定遗传的T3代转基因大豆植株(GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3)。对R5期的GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2、GmACBP6a-OE3和DN50大豆种子中的GmACBP6基因进行qRT-PCR分析。结果显示，与对照DN50相比，GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子中GmACBP6a的表达水平显著升高(图11)，表明GmACBP6基因已成功转入大豆中，并且在转基因大豆种子中正常转录和翻译。利用上述的方法获得GmACBP6b-OE1、GmACBP6b-OE2、GmACBP6b-OE3。
对GmACBP6a-OE和DN50大豆种子中的油分、总脂肪酸和蛋白质含量进行分析，结果如图12显示，与DN50相比，GmACBP6a-OE大豆中油分和总脂肪酸含量分别升高了6.51％-9.26％和10.95％-12.87％，结果如表4-6所示，蛋白质的含量未发生变化。说明GmACBP6a的过量表达可以提高大豆种子中的油含量。
表4过表达GmACBP6a基因大豆种子含油量
DN50 GmACBP6a-OE1 GmACBP6a-OE2 GmACBP6a-OE3
油分含量(％) 17.98±0.36 19.15±0.38** 19.21±0.62** 19.64±0.45**
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
表5过表达GmACBP6a基因大豆种子总脂肪酸含量分析
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
表6过表达GmACBP6a基因大豆种子蛋白质含量分析
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
另外，对GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2、GmACBP6a-OE3和DN50大豆种子的脂肪酸组成进行分析，结果如表7所示，与对照DN50相比，GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子中油酸(18:1)含量分别升高了12.03％、22.18％和8.84％，而GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子中的硬脂酸(18:0)、亚麻酸(18:3)和GmACBP6a-OE2株系的亚油酸(18:2)含量降低，其中硬脂酸含量分别降低了16.43％、16.29％和8.97％，亚麻酸含量分别降低了9.15％、13.93％和12.63％，GmACBP6a-OE2株系的亚油酸(18:2)含量降低了4.06％，其他脂肪酸组成并未发生改变(图13)，表明GmACBP6a的过量表达能够促进油酸(18:1)的积累。
转基因大豆收获的过程中，我们发现GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3大豆种子的大小发生改变。随后，我们对GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2、GmACBP6a-OE3和DN50大豆种子的长度、宽度和厚度进行测量，并对其百粒重进行称量。结果显示，与对照DN50相比，GmACBP6a-OE1、GmACBP6a-OE2和GmACBP6a-OE3种子的长度、宽度和厚度均显著增加(图14)，结果如表8-9所示。同时GmACBP6a-OE种子的百粒重相对于DN50种子增加了26.77％(图15)。
表7过表达GmACBP6a基因大豆种子脂肪酸组成分析
脂肪酸组成(％) DN50 GmACBP6a-OE1 GmACBP6a-OE2 GmACBP6a-OE3
16:0 10.77±0.38 10.54±0.46 10.47±0.15 10.99±0.34
18:0 3.80±0.10 3.18±0.28** 3.18±0.25** 3.46±0.11**
18:1 19.95±0.75 22.34±1.05** 24.36±0.05** 21.71±0.56**
18:2 53.95±0.49 53.34±1.29 51.76±0.45** 53.99±0.85
18:3 10.44±0.51 9.49±0.05** 8.99±0.67** 9.12±0.72**
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
表8过表达GmACBP6a基因大豆种子大小分析
DN50 GmACBP6a-OE1 GmACBP6a-OE2 GmACBP6a-OE3
长度(mm) 5.07±0.16 5.63±0.23** 5.57±0.23** 5.84±0.28**
宽度(mm) 4.90±0.23 5.61±0.22** 5.47±0.24** 5.73±0.29**
厚度(mm) 4.25±0.18 4.96±0.21** 4.75±0.25** 5.01±0.27**
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
表9过表达GmACBP6a基因大豆种子百粒重分析
DN50 GmACBP6a-OE1 GmACBP6a-OE2 GmACBP6a-OE3
百粒重(g) 6.94±0.61 8.66±0.55** 8.54±0.27** 9.18±0.22**
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
实施例5.GmACBP6s基因突变抑制大豆毛状根的脂肪酸合成
为进一步证实GmACBP6基因对脂肪酸合成的影响，在GmACBP6s基因的第一个外显子内设计一个靶点靶向GmACBP6s基因(GmACBP6a和GmACBP6b)(图20所示)，利用PCR扩增和同源重组方法将靶点序列连入基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-GFP中，得到GmACBP6s-pYLCRISPR/Cas9-GFP载体(图16)，并转入发根农杆菌K599中用于大豆毛状根诱导转化。在黑暗的条件下利用蓝光光源照射大豆毛状根，结果如图17显示，大豆毛状根发出绿色荧光，表明携带有靶点的载体已经成功地转入大豆毛状根中。为进一步检测基因编辑载体是否在转化毛状根中发生编辑，我们选取10份独立的转化毛状根进行DNA提取，利用靶位点两端的特异性引物对可能发生编辑的靶位点进行PCR扩增并测序。结果如图18显示，获得了三份独立的GmACBP6s基因编辑毛状根(p35Spro-Cas9-GmACBP6s#1，p35Spro-Cas9-GmACBP6s#1和p35Spro-Cas9-GmACBP6s#3)，序列分析发现，GmACBP6s基因编辑毛状根中GmACBP6s基因的靶位点发生不同程度的碱基缺失，造成靶蛋白过早终止或截断，进而导致蛋白功能的丧失。为分析GmACBP6基因的突变是否会影响到毛状根中的脂肪酸合成。我们将得到的三份独立的GmACBP6s基因编辑毛状根进行脂肪酸含量检测，结果显示，与对照毛状根相比，GmACBP6s基因编辑毛状根中脂肪酸含量降低了41.96％(图19)和表10所示，表明GmACBP6基因能够影响油脂的积累。
表10GmACBP6a基因编辑大豆毛状根总脂肪酸含量分析
K599 GmACBP6a-CR
脂肪酸含量(mg/g DW) 15.91±0.25 9.34±0.55**
**表示0.01水平差异极显著(P<0.01)
GmACBP6b基因序列：SEQ ID NO.5
基因序列
>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.09G214500|Chr09:43780653..43781166forwardGmACBP6b
ATGGACATGCAGGAGGATTTTGAGCAGTATGCTGAGAAAGCAAAAACTTTGCCACCGACTCAATCAAACGAAGACTTGCTTATCCTTTATGGATTGTACAAACAGGCCACCGTTGGACCTGTCAACACCAGTGAGTGCTCTTGTTTAACGAATAACAATAAATCAATGTCTTCCACTTTTGAATTCTCTCTATCAATAGGTGGCGGGGGGTTTGTAATTCCACCCCTCTTTTCTATATTCATAAGGACTATATCCTTATTCATGAATTTTCTGAATGATTTACAGGCCGTCCTGGAATGTTCAACATGAGGGACAGAGCTAAATGGGATGCATGGAAGGCTGTTGAAGGTAGATAAAGGCTAGGTTGATCGATTAATGTTTTGTTCTATTACTTTTATGTTTTCTGAGAGACATCAAAACTCTTTTGTGGCAGGGAAATCCAAGGACGAAGCAATGGGTGATTACATCATTAAGGTGAAACAGCTGCTGGAAGCAGCTGGCTTGCCTGCTTGA；
CDS序列SEQ ID NO.6
>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.09G214500.1CDS
ATGGACATGCAGGAGGATTTTGAGCAGTATGCTGAGAAAGCAAAAACTTTGCCACCGACTCAATCAAACGAAGACTTGCTTATCCTTTATGGATTGTACAAACAGGCCACCGTTGGACCTGTCAACACCAGCCGTCCTGGAATGTTCAACATGAGGGACAGAGCTAAATGGGATGCATGGAAGGCTGTTGAAGGGAAATCCAAGGACGAAGCAATGGGTGATTACATCATTAAGGTGAAACAGCTGCTGGAAGCAGCTGGCTTGCCTGCTTGA；
氨基酸序列SEQ ID NO.7
>G.max Wm82.a2.v1|Glyma.09G214500.1.p
MDMQEDFEQYAEKAKTLPPTQSNEDLLILYGLYKQATVGPVNTSRPGMFNMRDRAKWDAWKAVEGKSKDEAMGDYIIKVKQLLEAAGLPA。

Claims (8)

1.GmACBP6蛋白质在控制大豆中油分含量或者大豆中脂肪酸含量或者提高大豆的产量中的应用，其特征在于，所述GmACBP6蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
2.GmACBP6蛋白质的编码基因在控制大豆中油分含量或者脂肪酸含量中的应用，其特在于，所述GmACBP6蛋白质的编码基因如SEQ ID NO.3所示。
3.含有超表达GmACBP6蛋白质的编码基因的大豆植株或敲除GmACBP6蛋白质的编码基因的大豆毛状根在控制大豆种子或者大豆毛状根中的脂肪酸的含量或大豆种子中的油分或者提高大豆的产量中的应用，其特在于，所述GmACBP6蛋白质的编码基因如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸为油酸（18：1）、亚油酸（18：2）、亚麻酸（18：3）和硬脂酸（18：0）其中任意一个或者任意多个；所述大豆的产量为大豆种子长度、宽度和厚度或者大豆的百粒重。
5.一种培育控制大豆中油分含量或者脂肪酸含量的植株的方法，其特征在于，所述的方法的具体步骤如下：
(1)扩增氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的GmACBP6a蛋白质的编码基因，将基因序列插入到植物过表达载体，
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转基因大豆，
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆得到阳性转基因大豆；
或者
将大豆的毛状根中的GmACBP6蛋白质的编码基因进行敲除，获得基因敲除的转基因的大豆的毛状根，所述 GmACBP6 蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO.4 或 SEQ ID NO.7 所示；所述大豆的GmACBP6蛋白质的编码基因的靶点序列如SEQ ID NO.25所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，GmACBP6蛋白质的编码基因为GmACBP6a基因。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中表达的载体为pCAMBIA3301；敲除使用的基因编辑载体为pYLCRISPR/Cas9-GFP。
8.一种提高大豆种子中的油分和油酸（18:1）的方法，其特征在于，将大豆的GmACBP6a蛋白质的编码基因在大豆中超表达获得大豆转基因植株，提取大豆种子中的油分和油酸（18:1）。
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