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CN117285628A - 抗vista抗体及其应用 - Google Patents

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CN117285628A
CN117285628A CN202311192857.3A CN202311192857A CN117285628A CN 117285628 A CN117285628 A CN 117285628A CN 202311192857 A CN202311192857 A CN 202311192857A CN 117285628 A CN117285628 A CN 117285628A
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antibody
seq
amino acid
acid sequences
chain variable
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CN202311192857.3A
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仝爱平
康竞月
郑美君
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Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了抗VISTA抗体及其应用，涉及抗体领域，本发明提供了抗VISTA的抗体，其CDRs选自(1)～(7)中任一项所示，该抗体或抗原结合片段对VISTA具有高亲和力，能够特异性识别并结合VISTA，且将其应用于抗体药物偶联物ADC的构建，通过体外杀伤实验，验证VISTA‑MMAE ADC具有显著的抗肿瘤作用，可广泛应用于制备预防、诊断和治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物。

Description

抗VISTA抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及抗VISTA抗体及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗作为一种创新治疗方式已成为肿瘤治疗研究领域的一大热点，有望为患者带去新的治疗选择。通过阻断PD-L1/PD-1通路或者CTLA-4信号传导通路，可以逆转T细胞的免疫抑制状态，提高患者自身免疫系统抑制或杀伤肿瘤的能力。但是目前PD-L1/PD-1通路或者CTLA-4通路的阻断剂在临床上仅对少部分患者有效，仍需探寻新的免疫治疗靶点或新的免疫治疗策略。
T细胞活化V结构域Ig抑制因子(V-domain Ig suppressor of T cellactivation,VISTA)，属于B7家族分子。与其他免疫检查点分子不同，VISTA组成型表达于初始T细胞(T cell)上，发生免疫反应时丢失；除了T细胞，VISTA也表达与抗原呈递细胞表面。VISTA通过T细胞内和T细胞外机制抑制T细胞活化。简而言之，VISTA是初始T细胞上的一种独特的负性检查点调节因子，对于维持其静息和外周免疫耐受的稳定状态至关重要。
人源VISTA蛋白共有279个氨基酸残基，包括162个氨基酸残基的胞外区(extracellular domain,ECD)，21个氨基酸残基的跨膜区(transmembrane domain)和96个氨基酸残基的胞质区(cytoplasmic domain)。VISTA在骨髓来源的细胞中高度表达，如CD11b+单核细胞、CD11c+树突状细胞，以及在较小程度上CD4+和CD8+T细胞。VISTA的过量表达已在多种人类癌症中被发现，包括前列腺癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和胸膜间皮瘤。
因此，研发特异性强、亲和力高的抗VISTA抗体，将为多种癌症的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供抗VISTA抗体及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗VISTA的抗体或抗原结合片段，其包括(1)～(7)项中任意一项所示的CDRs：
(1)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：2～4所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：6～8所示；(2)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：10～12所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：14～16所示；(3)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：18～20所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：22～24所示；(4)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：26～28所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO：30～32所示；(5)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：34～36所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：38～40所示；(6)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：42～44所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：46～48所示；(7)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：50～52所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：54～56所示。
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括：前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备VISTA抗原的检测产品中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于靶向VISTA以诊断、预防或治疗疾病的产品中的应用。
第五方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
第七方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述实施例所述的分离的核酸。
第八方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述实施例所述的载体。
第九方面，本发明实施例提供了一种药物或药物组合物，其有效成分包括如前述实施例所述的抗体或其抗原结合片段、如前述实施例所述的抗体偶联物、如前述实施例所示的试剂或试剂盒、如前述实施例所述的分离的核酸和如前述实施例所述的载体或前述实施例所述的细胞中的至少一种。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了抗VISTA的抗体，其对于VISTA具有高亲和力，能够特异性识别并结合VISTA。
本发明基于提供的抗VISTA抗体，进行了抗体药物偶联物(ADC)的构建，通过体外杀伤实验，验证了本发明提供的VISTA-MMAE ADC的抗肿瘤作用，VISTA-MMAE ADC对NCI-H2803-hVISTA-GFP肿瘤细胞具有显著的杀伤效应。
本发明提供的抗VISTA抗体可广泛应用于制备预防、诊断和治疗肿瘤和自身免疫性疾病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为免疫荧光分析重组鼠单抗2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY对细胞过表达的VISTA分子的结合结果；
图2为2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY分别与MMAE偶联的ADC的体外杀伤肿瘤结果；
图3为使用NCG鼠模型评价2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY分别与MMAE偶联的ADC的体内抗肿瘤分析结果；
图4为胸膜间皮瘤临床组织样本VISTA的免疫组化分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一方面，本发明实施例提供了一种抗VISTA的抗体或抗原结合片段，其包括(1)～(7)项中任意一项所示的CDRs：
(1)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：2～4所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：6～8所示；
(2)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：10～12所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：14～16所示；
(3)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：18～20所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：22～24所示；
(4)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：26～28所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：30～32所示；
(5)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：34～36所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：38～40所示；
(6)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：42～44所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：46～48所示；
(7)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：50～52所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：54～56所示。
本发明提供了抗VISTA的抗体，其对于VISTA具有高亲和力，能够特异性识别并结合VISTA。
在本发明中，术语“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)，鼠源抗体，嵌合抗体，全长抗体等，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
本发明所述的“嵌合抗体”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，其是抗体可变结构域内主要促成与抗原特异性结合的区域。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，重链可变区中含有的3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3，或VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，轻链可变区中含有的3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3，或VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还包括重链可变区的骨架区和轻链可变区的骨架区。
在本发明中，“骨架区”或“FR”区是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；重链骨架区可以被进一步细分成被CDRs分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中，重链骨架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4骨架区；轻链骨架区可以被进一步细分成被LCDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4骨架区。重链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在一些实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区如(a)～(g)中任一项所示：
(a)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：1和5所示；
(b)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：9和13所示；
(c)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：17和21所示；
(d)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：25和29所示；
(e)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：33和37所示；
(f)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：41和45所示；
(g)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：49和53所示。
需要说明的是，(1)～(7)所示的CDRs依次与(a)～(g)所示的重链可变区和轻链可变区一一对应。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还包括恒定区。可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。全长抗体的轻链包括轻链可变区结构域VL及恒定区结构域CL，VL处于轻链的氨基末端，CL结构域处于羧基末端，轻链包括κ链及λ链；全长抗体重链包括重可变区结构域VH及恒定区CH，VH处于重链的氨基末端，CH结构域处于羧基末端。
在一些实施例中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。
在一些实施例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、鼠源抗体、嵌合抗体和全长抗体中的任意一种。
本文中的“抗原结合片段”是完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原特异性结合。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，抗原结合片段可以通过本领域已知方法制备获得，例如，酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得，还可以通过重组遗传学技术或通过自动肽合成仪(如Applied BioSystems的自动肽合成仪)合成获得。
在一些实施例中，所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
另一方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括：前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或抗原结合片段偶联的药物分子。
在一些实施例中，所述药物分子包括：单甲基奥瑞他汀E。
在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。
在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的可被检测的标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，均属于本发明的保护范围。
在一些实施例中，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备VISTA抗原的检测产品中的应用。
在一些实施例中，所述产品包括试纸、试剂和试剂盒中的任意一种；
在一些实施例中，所述检测的方法选自：ELISA、免疫荧光法、化学发光免疫分析、Western blot、免疫层析法、电化学免疫分析和磁珠法中的任意一种。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于靶向VISTA以诊断、预防或治疗疾病的产品中的应用。
在一些实施例中，所述疾病包括：肿瘤和自身免疫性疾病中的任意一种。
在一些实施例中，所述肿瘤包括：前列腺癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和胸膜间皮瘤中的至少一种。
在一些实施例中，所述产品选自试剂、试剂盒和药物中的任意一种。
另一方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明实施例提供了一种载体，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸。
在一些实施例中，所述载体包括表达载体。本发明所述的“表达载体”是指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。
本领域技术人员也可以通过体外转录的方式，以本发明所述核酸序列为模板，转录成RNA，进一步通过转染，转导或转化该RNA到宿主细胞，也可以表达本发明抗体或其功能性片段，发挥本发明的生物功效。
另一方面，本发明实施例提供了一种细胞，其含有前述任意实施例所述的载体。
在一些实施例中，所述细胞为宿主细胞，宿主细胞包括原核宿主细胞、真核宿主细胞以及噬菌体。所述的原核宿主细胞可以为大肠杆菌、链霉菌或枯草杆菌等。所述真核宿主细胞可以为293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、Per6，酿酒酵母、毕赤酵母、汉森酵母、假丝酵母、部分昆虫细胞以及植物细胞。293系列细胞，Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
另一方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段的生产方法，其包括培养能表达所述抗体或其抗原结合片段的细胞。
在本发明公开了抗体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可以采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体，其均属于本发明的保护范围。
此外，本发明实施例还提供了一种药物或药物组合物，其有效成分包括如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段、如前述任意实施例所述的抗体偶联物、如前述任意实施例所示的试剂或试剂盒、如前述任意实施例所述的分离的核酸和如前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述的细胞中的至少一种。
本发明所述的“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。一些药物组合物是通过联合施用一些可药用成分或化合物，达到增强本发明的生物功效或减小药物副作用(例如，可以和其他抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤效果)。另一些药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收，增强稳定性或靶向性，延长半衰期，进而更好的发挥本发明的生物功效。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
(1)VISTA重组蛋白的制备：编码人源VISTA的核酸序列(NM_022153.2)由安徽通用生物公司合成。PCR扩增并亚克隆至pcDNA3.1表达载体中(Invitrogen)。然后，将VISTA的胞外域分别亚克隆到C端携带Fc或His标签的pcDNA3.1表达载体中。其中Fc标签包括人源Fc(hFc)和鼠源Fc(mFc)。通过瞬时转染293FT，使用FreeStyleTM无血清培养基(LifeTechnologies)摇瓶培养5-7天，收集上清，经过离心超滤，然后通过Protein A/G或镍柱亲和层析以及分子筛色谱柱纯化携带Fc或His标签的重组VISTA蛋白。
(2)表达人VISTA抗原的稳转细胞株制备：将编码人源VISTA的全长序列构建到携带IRES-EGFP的pcDNA3.1表达载体中。CHO-S(ATCC)细胞于CD-CHO培养基(LifeTechnologies)内培养；Hela细胞于含10％胎牛血清的DMEM中培养。采用LipofectamineLTX(Life Technologies)转染试剂进行细胞转染，48小时之后进行流式分选，培养至96孔板，进行单克隆稳定细胞株筛选和鉴定，并对稳定表达VISTA的CHO(CHO-VISTA-EGFP)和Hela(Hela-VISTA-EGFP)细胞进行保种。
实施例2
1.抗VISTA单克隆抗体的制备：
(1)动物免疫
使用5-6周龄的Balb/c雌性小鼠作为被免疫动物，免疫剂量为100μg/只。首次免疫采用100μl弗氏完全佐剂(Sigma)与等体积重组VISTA蛋白混合，充分乳化后进行皮下多点注射。每隔2周，用等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)与重组蛋白混合，充分乳化后进行皮下多点注射。加强免疫共4次，最后一次加强免疫后第10天，割尾采血检测小鼠抗体效价。细胞融合前3天，100μg重组蛋白腹腔冲击一次。
(2)细胞融合与杂交瘤筛选
无菌条件下，取小鼠脾脏，制备富含B细胞的悬液，按经典的PEG(Sigma)法，与SP2/0进行细胞融合。融合后的细胞重悬于HAT培养基进行培养。融合后第5天和第10天使用新鲜的HAT培养基进行半换液培养。融合后第11-15天进行ELISA，免疫荧光和流式分析，筛选阳性克隆。
ELISA筛选采用96孔板进行，简言之，将VISTA重组蛋白按100ng/孔的量4度过夜包被到孔板底部，使用HRP偶联抗小鼠IgG抗体和化学发光试剂(碧云天生物科技公司)进行显色，并于酶标仪在450nm波长读值。免疫荧光染色使用稳定表达VISTA的Hela细胞株，简言之，将细胞株在96孔板贴壁培养，加入50μl杂交瘤上清作为一抗，4度孵育2小时，PBS清洗3次，Cy3标记的Goat Anti-Mouse IgG(Proteintech)作为二抗，常温孵育1小时，PBS清洗3次，使用荧光显微镜采集图像。流式细胞术分析采用稳定表达VISTA的CHO细胞，简言之，离心收集细胞重悬于含有50μl杂交瘤上清的PBS缓存液中，4度孵育2小时，PBS清洗3次，CY3标记的Goat Anti-Mouse IgG(碧云天生物科技公司)作为二抗，常温孵育1小时，PBS清洗3次，上流式细胞仪(Agilent-Novosampler Pro)进行分析。
根据上述ELISA分析，免疫荧光分析和流式细胞术分析结果，最终可确定七个最优的杂交瘤克隆(分别命名为2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY)，用于后续的序列克隆和亲和力分析等实验。
实施例3
杂交瘤抗体可变区序列克隆：收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen)提取RNA并反转录(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen)进行PCR扩增后测序，最终获得七种单克隆抗体的重链和轻链可变区序列。其中重链和轻链的可变区CDR序列如表1所示。
表1.鼠单抗的重链和轻链可变区含有的CDR序列
备注：VH为重链可变区，VL为轻链可变区。
实施例4
重组嵌合抗体对hela宫颈癌细胞过表达VISTA的结合分析。
将人(IgG1)和鼠(IgG2a)重链恒定区，以及人/鼠轻链恒定区，克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)质粒载体，然后将杂交瘤克隆2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY的VH和VL基因片段分别构到有人IgG1重链恒定区(ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT，SEQ ID NO:57)和人IgGκ轻链恒定区(TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC，SEQ ID NO:58)的基因重组载体上，得到重组嵌合抗体重链表达载体和轻链表达载体，通过瞬时转染293FT，使用FreeStyleTM无血清培养基(Life Technologies)摇瓶培养5-7天，收集上清，经过离心超滤，然后通过Protein A/G亲和层析以及分子筛色谱柱纯化获得相应类型抗VISTA重组单克隆抗体。将Hela-VISTA-EGFP细胞铺于24孔细胞培养皿中，第二天将重组嵌合抗体2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY作为一抗，CY3标记的Goat Anti-Mouse IgG(碧云天生物科技公司)作为二抗，并用荧光共聚焦对其进行观察拍照。
如图1所示，由图1结果表明：重组嵌合抗体2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY可以和细胞Hela-VISTA-EGFP发生特异性结合。
实施例5
杂交瘤抗体对鼠源VISTA的结合分析。
鼠源VISTA的cDNA克隆购自义翘神州，然后按照实施例2构建鼠源VISTA的稳定表达细胞株CHO-mVISTA。然后取杂交瘤2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY上清，按照实施例2进行流式细胞分析。结果表明单克隆抗体不能够与鼠源VISTA结合。
实施例6
体外结合亲和力和动力学实验。
本实施例采用表面等离子共振(SPR)方法测定，使用GE公司Biacore 8K仪器进行分析。利用由Biacore提供的试剂盒，采用标准氨基偶联法将VISTA-His重组蛋白共价连接至CM5(GE)芯片上，然后将待测抗体(重组嵌合抗体2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY)按不同浓度梯度稀释于同样缓冲液中进样，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。数据的分析和采集使用Biacore 8K配套分析软件进行。所得结果如下表2。
表2.抗体抗原体外结合亲和力和动力学分析
抗体 抗原 结合速率ka(1/M*s) 解离速率kd(1/s) 亲和力KD(M)
2D12 VISTA-His 6.78E+05 2.33E-04 3.44E-10
16H8 VISTA-His 5.28E+05 2.31E-03 4.38E-09
10A12 VISTA-His 1.64E+06 2.87E-04 1.75E-10
1G2 VISTA-His 2.34E+05 3.55E-07 1.52E-12
JCY VISTA-His 4.32E+05 3.14E-05 7.28E-11
F8 VISTA-His 1.32E+06 6.02E-06 4.59E-12
KY VISTA-His 1.96E+06 3.82E-04 1.95E-10
实施例7
VISTA-MMAE ADC的体外杀伤实验。
用VISTA-MMAE和NCI-H2803-hVISTA-GFP细胞共孵育三天后用CCK8试剂检测细胞活率。药物分为单克隆抗体组和VISTA-MMAE组。药物浓度从1μM三倍稀释到第十二个浓度。对照组为只加入细胞和只加入培养基。每组3个复孔。在96孔板中铺板NCI-H2803-hVISTA-GFP细胞约5000个/孔。第二天，向细胞中分别加入各组药物，置于孵箱37℃培养72h。取出96孔板，每孔加入10μlCCK8试剂，再次置于37℃培养箱，孵育2h。取出孔板，在450nm处检测吸光度。结果如图2所示。
由图2结果可知，与添加单克隆抗体组相比，VISTA-MMAE ADC(重组嵌合抗体2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY)对NCI-H2803-hVISTA-GFP肿瘤细胞具有显著的杀伤效应。
实施例8
异种移植物小鼠模型抗肿瘤实验。
本实施例采用异种移植物小鼠模型来评估VISTA靶向的抗体(重组嵌合抗体2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY)的体内抗肿瘤活性。采用一种免疫缺陷鼠模型进行评估。
NCG重症免疫缺陷鼠模型：NCG重症免疫缺陷鼠购自南京大学模式动物所，将3×106个对数生长期的NCI-H2803-hVISTA-GFP细胞接种于NCG鼠右后背部皮下。待6天左右肿瘤长至200mm3后，将荷瘤体积均匀的小鼠随机分组，每组5只小鼠。设置与给药等体积的ADC储存缓冲液为对照组。ADC的给药方式为尾静脉给药，5，10或15mg/kg只，每4天给药1次，共计给药3次。每4天进行小鼠称重并测量肿瘤大小。移植瘤平均体积按照公式V＝1/2(L×W2)计算，其中L代表瘤体的长度，W代表瘤体的宽度。当小鼠肿瘤体积达到2000mm3或者肿瘤表面出现明显溃破，则处死小鼠，结束动物实验。实验结果如图3所示。
由图3结果可知，与不给药的对照组相比，VISTA-MMAE ADC(2D12、16H8、10A12、1G2、JCY、F8、KY)对NCI-H2803-hVISTA-GFP肿瘤细胞的生长均具有显著的抑制效果。
实施例9
临床肿瘤组织标本VISTA的免疫组化分析。
组织切片在65℃孵育1h,在室温下用含有10％山羊血清的PBS封闭30分钟,然后用VISTA单克隆抗体(实施例4的2D12、16H8)4℃孵育过夜。用山羊抗人二抗孵育,用3,3'-二胺苯胺染色。简单统计随机选取5个视野的阳性染色细胞百分比和细胞染色强度。
染色强度评分:0(阴性)；1(弱阳性)；2(中度阳性)；3(强阳性)。总评分量化为:组织病理学评分＝(1×弱阳性染色％+2×阳性染色％+3×强阳性染色％)×100。实验结果如图4所示。
由图4结果可知，VISTA在胸膜间皮瘤中表达较高。
以下为本发明涉及的序列：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗VISTA的抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包括(1)～(7)项中任意一项所示的CDRs：
(1)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：2～4所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：6～8所示；
(2)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：10～12所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：14～16所示；
(3)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：18～20所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：22～24所示；
(4)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：26～28所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：30～32所示；
(5)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：34～36所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：38～40所示；
(6)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：42～44所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：46～48所示；
(7)HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：50～52所示，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：54～56所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括重链可变区的骨架区和轻链可变区的骨架区；
可选地，所述重链可变区和所述轻链可变区如(a)～(g)中任一项所示：
(a)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：1和5所示；
(b)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：9和13所示；
(c)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：17和21所示；
(d)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：25和29所示；
(e)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：33和37所示；
(f)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：41和45所示；
(g)所述重链可变区和所述轻链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：49和53所示；
可选地，所述抗体或抗原结合片段还包括恒定区；
可选地，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
可选地，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、鼠源抗体、嵌合抗体和全长抗体中的任意一种；
可选地，所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
3.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括：权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或抗原结合片段偶联的药物分子；
可选地，所述药物分子包括：单甲基奥瑞他汀E；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的可被检测的标记物。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段在制备VISTA抗原的检测产品中的应用；
可选地，所述产品包括试纸、试剂和试剂盒中的任意一种；
可选地，所述检测的方法选自：ELISA、免疫荧光法、化学发光免疫分析、Western blot、免疫层析法、电化学免疫分析和磁珠法中的任意一种。
5.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于靶向VISTA以诊断、预防或治疗疾病的产品中的应用；
可选地，所述疾病包括：肿瘤和自身免疫性疾病中的任意一种；
可选地，所述肿瘤包括：前列腺癌、肾透明细胞癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和胸膜间皮瘤中的至少一种；
可选地，所述产品选自试剂、试剂盒和药物中的任意一种。
6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种载体，其特征在于，其含有权利要求7所述的分离的核酸。
9.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体。
10.一种药物或药物组合物，其特征在于，其有效成分包括：如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求3所述的抗体偶联物、如权利要求6所示的试剂或试剂盒、如权利要求7所述的分离的核酸和如权利要求8所述的载体和权利要求9所述的细胞中的至少一种。
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