CN117264985A - 海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开海水多毛类参与再生功能的重组蛋白的原核表达纯化方法；本发明利用全基因合成基因序列并通过PCR扩增将含有限制性内切酶位点的产物插入到质粒中，构建pET‑30a‑His‑OxLumbricin原核表达载体；在温度为15℃，0.5mM IPTG的条件下诱导下16h；分别对全细胞、上清和沉淀进行检测，最终得到分子量为12kD的蛋白大量分布在裂解上清液中，表明目的蛋白呈可溶性表达，进一步纯化后获得纯度较高的OxLumbricin蛋白，本发明可为今后研究OxLumb蛋白在海洋动物尤其是海洋无脊椎动物再生的作用机制和蛋白功能研究提供材料。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法及应用。
背景技术
环节动物门内具有不同的再生能力，包括具有全再生能力(头尾部均可再生)，部分再生能力(尾部再生)和不可再生三种类型的再生能力，使其成为研究再生过程中形态及分子机制的理想模型。其中，Ophryotrocha xiamen属于环节动物多毛纲Polychaeta、矶沙蚕目Eunicida，Dorvilleinae科的小型海洋底栖生物。由于Ophryotrocha属有生命周期短，体型小，易于实验室培养等特点，可作为环境监测、进化生物学等方面的良好模式物种。然而目前环节动物中关于再生的作用机制尚不清楚，参与再生的功能基因的发掘鉴定及功能验证有助于阐明海洋生物再生的分子机制。
从环节动物中分离得到富含脯氨酸的Lumbricin蛋白具有抗菌作用。近期研究也证明由医用水蛭(Hirudo medicinalis)神经元表达的HmLumbricin不仅具有抗菌活性，也可增强水蛭中枢神经系统的再生能力。同样的，在发明人前期的研究中也验证了OxLumbricin参与Ophryotrocha xiamen伤口愈合、再生芽基形成、细胞分裂分化及再生组织等不同阶段的再生，同时明确其是再生芽基形成(关键阶段)中的主要调节因子。然而目前尚未有任何关于Ophryotrocha属中OxLumbricin蛋白的体外表达的报道。
发明内容
鉴于此，本发明提供海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法及应用，通过原核表达与纯化能够获得纯度较高的重组蛋白OxLumbricin，为研究OxLumbricin在海洋动物尤其是海洋无脊椎动物再生的作用机制和蛋白功能研究提供材料。
本发明的技术方案如下：
本发明提供海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，包括如下步骤：
(1)序列合成
根据重组蛋白OxLumbricin核酸序列，在两端分别添加NdeI和HindIII核酸酶切位点及保护碱基，在OxLumbricin蛋白的N端添加6个组氨酸标签，进行人工合成His-OxLumbricin序列；
(2)PCR扩增
将合成的His-OxLumbricin基因序列连接于pMD-19T克隆载体，适量稀释后，以其为模板、利用克隆载体通用引物和Takara高保真ExTaq酶进行PCR反应，所获PCR产物送公司测序，验证后的片段用于双酶切反应；
(3)PCR扩增产物双酶切
利用NdeI和HindIII，对经过步骤(2)的扩增产物进行双酶切，以获得His-OxLumbricin基因序列中具有粘性末端的目的片段；
(4)pET-30a(+)质粒的提取及双酶切
将含有原核表达载体pET-30a(+)质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒；利用EcoRI和HindIII，对提取的pET-30a(+)质粒进行双酶切，以获得具有与His-OxLumbricin基因序列中相同粘性末端的原核表达载体片段；
(5)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的构建
连接经过步骤(3)双酶切获得的His-OxLumbricin基因目的片段与步骤(4)双酶切处理获得的原核表达载体片段：
(6)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的转化
构建的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，转化后菌液接种于LB液体培养基中，振荡培养后涂至卡那霉素抗性平板上，进行抗性筛选；
(7)pET-30a-His-OxLumbricin重组多肽的表达纯化及鉴定
挑选带有重组表达质粒的表达菌株E.coliBL21(DE3)，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，加入IPTG，并继续振荡培养，诱导表达重组蛋白OxLumbricin；
(8)进行SDS-PAGE和Western Blot分析
(9)His-OxLumbricin纯化：诱导表达结束后，先将上清液过滤后，再用镍亲和层析法进行纯化。
进一步的，所述步骤(2)中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸5min。
进一步的，所述步骤(3)和步骤(4)双酶切反应体系为：
| DDW | 42μL |
| 10×Buffer | 5μL |
| EcoRI | 1μL |
| HindIII | 1μL |
| PCR产物 | 1μL |
| 总体积 | 50μL |
进一步的，所述步骤(5)中连接体系具体为：
| DDW | 1.5μL |
| 10×T4 Ligase Buffer | 2.5μL |
| T4 Ligase | 1μL |
| pET-30a(+)载体 | 16μL |
| His-OxLumbricin基因片段 | 4μL |
| 总体积 | 25μL |
进一步的，所述步骤(9)His-OxLumbricin纯化的方法为：
将上清液过0.45μm滤膜滤去杂质，进行预处理；
将注射器用蒸馏水装满，把镍柱连接到注射器，保持连接处有液体；
除掉镍柱底部的密封，用3～5倍体积去离子水洗去乙醇；
用至少5倍体积的结合缓冲液平衡柱子，结合缓冲液的流速为1mL/min；
用注射器加入预处理的破碎液，破碎液流速为0.2～1mL/min；
用至少5～10个体积的结合缓冲液洗涤柱子，除净杂蛋白，洗涤过程中保持流速1～2mL/min；
最后用适量的洗脱缓冲液进行目的蛋白的洗脱，保持1～2mL/min。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：利用全基因合成基因序列并通过PCR扩增将含有限制性内切酶位点的产物插入到质粒中，构建pET-30a-His-OxLumbricin原核表达载体；在温度为15℃，0.5mM IPTG的条件下诱导表达；分别对全细胞、上清和沉淀进行检测，最终得到分子量为12kD的蛋白大量分布在裂解上清液中，表明重组蛋白OxLumbricin呈可溶性表达，进一步纯化后获得纯度较高的OxLumbricin蛋白，本发明提供的海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法可为今后研究OxLumb蛋白在海洋动物尤其是海洋无脊椎动物再生的作用机制和蛋白功能研究提供材料。
附图说明
图1为本发明的His-OxLumbricin重组蛋白表达的SDS-PAGE分析结果图；
图2为本发明的His-OxLumbricin重组蛋白表达的western blot分析结果图；
图3为本发明His-OxLumbricin重组蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入；
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
主要试剂：大肠杆菌BL21(DE3)、pMD-19T载体、pET-30a(+)质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；THE His标签单克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗购自南京金斯瑞生物科技有限公司；DNA Marker、蛋白Marker、NdeI和HindIII限制性酶、Ex-Taq DNA聚合酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品；IPTG、卡那霉素均为Amesico公司产品，序列测序及合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，包括如下步骤：
(1)序列合成
根据重组蛋白OxLumbricin核酸序列，在两端分别添加NdeI和HindIII核酸酶切位点及保护碱基，同时为便于下一步纯化，在OxLumbricin蛋白的N端添加6个组氨酸标签，His-OxLumbricin重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1；
(2)PCR扩增
将合成的His-OxLumbricin核酸序列连接于pMD-19T克隆载体，以适量稀释后，以其为模板、利用克隆载体通用引物和Takara高保真ExTaq酶进行PCR反应；
PCR扩增中利用的克隆载体通用引物的序列是
上游引物(SEQ ID NO:2)5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
下游引物(SEQ ID NO:3)5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸5min；
反应结束后，用2％(W/V)TAE琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；所获PCR产物用于双酶切反应；
(3)PCR扩增产物双酶切
利用NdeI和HindIII，对经过步骤(2)的扩增产物进行双酶切，以获得His-OxLumbricin基因序列中具有粘性末端的目的片段；
双酶切反应体系为：
| DDW | 42μL |
| 10×Buffer | 5μL |
| EcoRI | 1μL |
| HindIII | 1μL |
| PCR产物 | 1μL |
| 总体积 | 50μL |
反应体系溶液配制好后，置于37℃水浴2h，进行双酶切反应；待反应结束后，2％TAE琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果后切胶回收；
(4)pET-30a(+)质粒的提取及双酶切
将含有原核表达载体pET-30a(+)质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，200rpm、37℃振荡培养6～8h，用质粒提取试剂盒提取质粒；具体提取步骤为：
取1.5～4.5mL菌液，9000rpm离心30s，倾弃上清液后，加250μL溶液P1重悬菌体；
加250μL溶液P2，温和地上下翻转4～7次，室温放置4min；
加350μL溶液P3，立即温和地上下翻转4～7次，冰上静置3～5min，13000rpm离心10min后取上清液；
将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心30～60s；
加700μL漂洗液，12000rpm离心30s后倾弃废液，重复1次；
将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；
加100μL洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心1min；
利用EcoRI和HindIII，对提取的pET-30a(+)质粒进行双酶切，在37℃水浴酶切反应2h后，加入1μL CIAP继续水浴1h，终止反应后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，使用胶回收试剂盒回收表达载体pET-30a(+)片段，进而获得具有与His-OxLumbricin基因序列中相同粘性末端的原核表达载体片段；
(5)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的构建
连接经过步骤(3)双酶切获得的His-OxLumbricin基因目的片段与步骤(4)双酶切处理获得的原核表达载体片段，连接体系具体为：
| DDW | 1.5μL |
| 10×T4 Ligase Buffer | 2.5μL |
| T4 Ligase | 1μL |
| pET-30a(+)载体 | 16μL |
| His-OxLumbricin基因片段 | 4μL |
| 总体积 | 25μL |
(6)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的转化
从超低温冰箱中取出大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上融化后，加入100ng构建的重组质粒，混匀后冰上放置30min，加入100μL室温LB液体培养基，在13000rpm的条件下离心2min后涂至卡那霉素抗性平板上，37℃培养过夜，进行抗性筛选；
(7)pET-30a-His-OxLumbricin重组多肽的表达纯化及鉴定
通过预实验确定重组表达菌株的最佳表达条件为37℃，4h，IPTG浓度为0.5mM；
挑选带有重组表达质粒的表达菌株E.coliBL21(DE3)，接种于5mL含有50μg/m卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，当OD600达到0.6～0.8时，加入0.5mM IPTG，在15℃下并继续振荡培养16h，诱导表达重组蛋白OxLumbricin，以无菌水作为阴性参照；
(8)进行SDS-PAGE和Western Blot分析
取450μL培养基离心后的沉淀，重悬于300μL裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl，150mMNaCl，5％glycerol，pH 8.0)，超声裂解1min；对全细胞、裂解后上清液和沉淀，以甲醇-氯仿法浓缩沉淀蛋白，用20μL去离子水溶解蛋白，加入SDS上样缓冲液后煮沸10min，进行SDS-PAGE和Western Blot分析；
转印后的膜用0.5％(体积分数)的BSA封闭1h，加入Anti-6-His单克隆抗体(GenScript,Cat.No.A 00186)孵育1h，磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered solutiontween-20，PBST)漂洗3次，10min/次，再以HRP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1h，PBST漂洗3次后，用TMB显色；
分别进行12％SDS-PAGE电泳，分析His-OxLumbricin重组多肽的可溶性；
(9)His-OxLumbricin纯化
将上清液过0.45μm滤膜滤去杂质，进行预处理；
将注射器用蒸馏水装满，把镍柱连接到注射器，保持连接处有液体；
除掉镍柱底部的密封，用3～5倍体积去离子水洗去乙醇；
用至少5倍体积的结合缓冲液平衡柱子，结合缓冲液的流速为1mL/min；
用注射器加入预处理的破碎液，破碎液流速为0.2～1mL/min；
用至少5～10个体积的结合缓冲液洗涤柱子，除净杂蛋白，洗涤过程中保持流速1～2mL/min；
最后用适量的洗脱缓冲液进行目的蛋白的洗脱，保持1～2mL/min；
取少量洗脱得到的目的蛋白以及各步洗脱的样品，加入1×SDS上样缓冲液处理样品，12％SDS-PAGE电泳检测纯化效果。
结果数据分析
1、His-OxLumbricin重组蛋白表达结果
在15℃、IPTG浓度0.5mM、诱导16h条件下实现表达；诱导菌经超声破碎后上清液和沉淀中均有目的蛋白存在，SDS-PAGE分析结果显示，其大小与根据氨基酸序列(SEQ ID NO:1)计算的分子量一致，在相对分子质量10-20kD之间目的蛋白表达较多(如图1)，图中，M：蛋白分子标准；而未诱导的菌体蛋白无此条带，表明目的蛋白在原核系统中实现了可溶性表达；
进一步，如图2所示的Western blot结果显示，图中，M：蛋白分子质量标准；上清中的目的蛋白能与一抗发生反应，在相对分子量12kD左右出现明显的反应条带。
二、His-OxLumbricin重组蛋白纯化结果
His-OxLumbricin重组蛋白纯化后其SDS-PAGE结果如图3所示，目标蛋白在12kD左右存在重组蛋白条带并且重组蛋白的条带单一，说明可以获得所需的His-OxLumbricin原核表达蛋白；由此可证实该实验方案的可行性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.海水多毛类参与再生功能的重组蛋白的原核表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)序列合成
根据OxLumbricin核酸序列，在两端分别添加NdeI和HindIII核酸酶切位点及保护碱基，在OxLumbricin蛋白的N端添加6个组氨酸标签，进行人工合成His-OxLumbricin序列；
(2)PCR扩增
将合成的His-OxLumbricin基因序列连接于pMD-19T克隆载体，适量稀释后，以其为模板、利用克隆载体通用引物和Takara高保真ExTaq酶进行PCR反应，所获PCR产物送公司测序，验证后的片段用于双酶切反应；
(3)PCR扩增产物双酶切
利用NdeI和HindIII，对经过步骤(2)的扩增产物进行双酶切，以获得His-OxLumbricin基因序列中具有粘性末端的目的片段；
(4)pET-30a(+)质粒的提取及双酶切
将含有原核表达载体pET-30a(+)质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中进行培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒；利用EcoRI和HindIII，对提取的pET-30a(+)质粒进行双酶切，以获得具有与His-OxLumbricin基因序列中相同粘性末端的原核表达载体片段；
(5)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的构建
连接经过步骤(3)双酶切获得的His-OxLumbricin基因目的片段与步骤(4)双酶切处理获得的原核表达载体片段：
(6)重组表达质粒pET-30a-His-OxLumbricin的转化
构建的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，转化后菌液接种于LB液体培养基中，振荡培养后涂至卡那霉素抗性平板上，进行抗性筛选；
(7)pET-30a-His-OxLumbricin重组蛋白的表达及鉴定
挑选带有重组表达质粒的表达菌株E.coliBL21(DE3)，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG，并继续振荡培养，诱导表达；
(8)进行SDS-PAGE和Western Blot分析；
(9)His-OxLumbricin纯化：诱导表达结束后，先将上清液过滤后，再用镍亲和层析法进行纯化。
2.如权利要求1所述的海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸5min。
3.如权利要求1所述的海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)双酶切反应体系为：
4.如权利要求1所述的海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，其特征在于：所述步骤(5)中连接体系具体为：
5.如权利要求1所述的海水多毛类参与再生功能的重组蛋白原核表达纯化方法，其特征在于：所述步骤(9)His-OxLumbricin纯化的方法为：
将上清液过0.45μm滤膜滤去杂质，进行预处理；
将注射器用蒸馏水装满，把镍柱连接到注射器，保持连接处有液体；
除掉镍柱底部的密封，用3～5倍体积去离子水洗去乙醇；
用至少5倍体积的结合缓冲液平衡柱子，结合缓冲液的流速为1mL/min；
用注射器加入预处理的破碎液，破碎液流速为0.2～1mL/min；
用至少5～10个体积的结合缓冲液洗涤柱子，除净杂蛋白，洗涤过程中保持流速1～2mL/min；
最后用适量的洗脱缓冲液进行目的蛋白的洗脱，保持1～2mL/min。
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| CN118792330B (zh) * | 2024-09-14 | 2025-02-28 | 青岛大学 | 原核表达高效获取Cullin1-Rbx1 E3连接酶复合物的方法 |
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