[go: up one dir, main page]

CN117242174A - 生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途 - Google Patents

生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117242174A
CN117242174A CN202280029402.7A CN202280029402A CN117242174A CN 117242174 A CN117242174 A CN 117242174A CN 202280029402 A CN202280029402 A CN 202280029402A CN 117242174 A CN117242174 A CN 117242174A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
days
opc
day
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280029402.7A
Other languages
English (en)
Inventor
R·斯卡利特
F·比内特
D·哈尤恩·尼曼
A·巴哈特
O·维泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genealogical Cell Therapy Co
Original Assignee
Genealogical Cell Therapy Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genealogical Cell Therapy Co filed Critical Genealogical Cell Therapy Co
Publication of CN117242174A publication Critical patent/CN117242174A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

提供了用于将人多能干细胞分化成少突胶质细胞祖细胞(OPC)的方法。还提供了通过此类方法获得的细胞和细胞组合物，以及此类细胞的用途。进一步提供了用于将人多能干细胞有效地分化成OPC的方法和方案。

Description

生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月10日提交的美国临时申请号63/159,350的权益，该临时申请的全部内容和所有目的通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于使多能干细胞诸如人胚胎干细胞首先分化成具有背侧脊髓祖细胞表型的神经外胚层祖细胞，然后进一步分化成神经胶质祖细胞，并且进一步分化成少突胶质细胞祖细胞的新方法。还提供了通过此类方法获得的细胞和细胞组合物，以及此类细胞的用途。本公开进一步涉及通过根据本发明的方法产生的表达一种或多种标志物的细胞。
背景技术
少突胶质细胞祖细胞(OPC)是中枢神经系统(CNS)中的神经胶质细胞的亚型，其出现在脑和脊髓的脑室区中，并且在发育中的CNS中迁移，然后成熟为少突胶质细胞。成熟的少突胶质细胞产生髓鞘，该髓鞘隔离神经元轴突并且对髓鞘丧失的CNS病变进行再髓鞘化。少突胶质细胞还通过其它机制有助于神经保护，包括产生促进神经元存活的神经营养因子(Wilkins等人，2001，《神经胶质(Glia)》36(1):48至57；Dai等人，2003，《神经科学杂志(JNeurosci.)》23(13):5846至53；Du和Dreyfus，2002，《神经科学研究杂志(JNeurosciRes.)》68(6):647至54)。与大多数祖细胞不同，OPC在成年CNS中保持丰富，其中它们保持生成新少突胶质细胞的能力。因此，OPC和衍生自OPC的成熟少突胶质细胞是脱髓鞘和髓鞘形成障碍病症(诸如多发性硬化、肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病)、其它神经变性病症(诸如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和亨廷顿病)和急性神经损伤(诸如中风和脊髓损伤(SCI))的重要治疗靶点。
已经开发了几种方案用于将人多能干细胞诸如胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)分化成可以用于细胞治疗的OPC。尽管这些方法已经成功地从人多能干细胞中生成OPC用于研究目的，但在将现有方案转化为临床商业规模生产过程相关联的商品的质量、可扩展性和成本方面仍存在挑战。
需要用于将多能干细胞分化成OPC的改进方法。理想地，此类方法应易于扩展以产生足够量的用于细胞治疗应用的OPC，同时一致地和可再现地产生具有所需质量属性的靶细胞OPC。
发明内容
在本文所描述的各种实施例中，本公开尤其提供了用于将人多能干细胞诸如ESC和iPSC分化成少突胶质细胞祖细胞(OPC)的稳健、可靠的方案。
本公开部分地基于以下发现：在不存在由SHH信号传导介导的神经外胚层限制性祖细胞的腹侧化的情况下，人多能干细胞可以容易并且有效地分化成脊髓OPC。
在一个方面，本文提供了一种从未分化的多能干细胞中获得少突胶质细胞祖细胞(OPC)群的方法，该方法包含：a)获得未分化的多能人胚胎干细胞(hESC)的培养物；b)在足以诱导该hESC分化成神经外胚层细胞和神经祖细胞的培养条件下培养该未分化的多能hESC第一时间段；和c)在足以将神经祖细胞分化成OPC的培养条件下培养来自步骤b)的神经祖细胞第二时间段。
在实施例中，该方法中，在贴壁组织培养容器中的层粘连蛋白上，或悬浮复合物中，或两者中培养步骤b)中的多能细胞。
在实施例中，该方法中，该多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在实施例中，该多能干细胞是人诱导的多能干细胞(hiPSC)。
在实施例中，该方法中，在多索吗啡(Dorsomorphin)、PD0325901和RA(视黄酸)的存在下培养步骤b)的未分化的hESC。在实施例中，培养步骤进一步包含在AA(抗坏血酸)和RA(视黄酸)的存在下。
在实施例中，该方法中，在EGF和hsbFGF(热稳定碱性成纤维细胞生长因子)的存在下培养来自步骤b)的神经外胚层细胞。在实施例中，培养步骤进一步包含在EGF(表皮生长因子)和PDGF-AA(血小板衍生生长因子AA)的存在下。
在实施例中，该方法中，步骤b)中的第一时间段为从约3天至约60天。在实施例中，其中该第一时间段为从约10天至约15天。在实施例中，其中该第一时间段为约14天。
在实施例中，该方法中，来自步骤c)的第二时间段为从约10天至约60天。在实施例中，其中该第二时间段为从约20天至约40天。在实施例中，其中该第二时间段为约28天。
在实施例中，该方法中，在约第14天将步骤b)中分化的hESC冷冻保存。
在实施例中，该方法中，将冷冻保存的细胞解冻，并且其中在该方法的任何剩余步骤中培养后续解冻细胞。
在实施例中，该方法包含在第一时间段结束时或约在第一时间段结束时冷冻保存来自步骤b)的神经祖细胞的步骤。
在实施例中，该方法中，该冷冻保存的神经外胚层细胞根据步骤c)解冻和培养。
在实施例中，该方法中，将步骤c)的OPC冷冻保存。
在实施例中，该方法中，将冷冻保存的OPC解冻。
在实施例中，该方法中，该OPC表达选自以下的一种或多种标志物：神经/神经胶质抗原2(NG2)、血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体B(PDGFRβ)。
在一个方面，本文提供了一种配制用于在解冻后直接施用至受试者的少突胶质细胞祖细胞(OPC)组合物的方法，所述方法包含：(a)根据以上方法将OPC悬浮在冷冻保存培养基中以形成细胞悬浮液，(b)在冷冻保存温度下储存细胞悬浮液，和(c)解冻冷冻保存的悬浮液。
在实施例中，该方法中，该冷冻保存培养基包含以下中的一种或多种：腺苷、右旋糖酐-40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水。
在一个方面，本文提供了一种用于施用至受试者的药物组合物，所述组合物包含根据以上方法的OPC和冷冻保存培养基。
在实施例中，该药物组合物中，该冷冻保存培养基包含以下中的一种或多种：腺苷、右旋糖酐-40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗受试者的脊柱损伤的方法，该方法包含向所述受试者施用治疗有效量的以上药物组合物。
在实施例中，用于治疗受试者的脊柱损伤的方法中，该施用包含将该组合物施用至脊髓损伤部位中或脊髓损伤部位附近。
在实施例中，用于治疗受试者的脊柱损伤的方法中，施用通过注射进行。
在实施例中，用于治疗受试者的脊柱损伤的方法中，该施用通过植入进行。
在实施例中，用于治疗受试者的脊柱损伤的方法中，该施用通过移植进行。
在实施例中，该药物组合物中，细胞的浓度为约1×106个细胞/mL至约100×106个细胞/mL。
在实施例中，该药物组合物中，该药物组合物以约100微升至约1毫升的体积储存。
在实施例中，该药物组合物中，细胞的浓度为100×106个细胞/mL。
在实施例中，该药物组合物中，该药物组合物以250微升的体积储存。
在实施例中，该药物组合物中，该药物组合物以300微升的体积储存。
在实施例中，该药物组合物中，该冷冻保存培养基是冻存液。
在实施例中，该药物组合物中，该冻存液是CryoStor10(CS10)。
在实施例中，该药物组合物中，该OPC表达选自以下的一种或多种标志物：神经/神经胶质抗原2(NG2)、血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体B(PDGFRβ)。
附图说明
图1是绘示本公开的OPC解冻和注射(TAI)收获和冷冻保存过程的概述的流程图。
图2是与本公开的改进的OPC制造过程(顶部)相比的杰龙记录过程(GeronProcess of Records)(GPOR过程)(底部)的图示。
图3是绘示用于确立本公开的OPC分化过程的从多能干细胞到少突胶质细胞祖细胞的信号传导序列示意图的流程图。
图4是绘示本公开的OPC产生过程的流程和时间线的流程图。
图5是绘示根据本公开的用于制造100个OPC的TAI小瓶的良好制造过程(GMP)的流程图。
图6示出了对照培养条件，在第10天(时间＝0，第7天)在神经胶质祖细胞培养基(GPM/E)中培养的细胞在10X放大率(左)和20X放大率(右)下的OPC形态。
图7示出了处理后第3天在50％ GPM/E和50％ N2.1(无IBMX)中培养的细胞在10X放大率(左)和20X放大率(右)下的OPC形态。
图8示出了对照培养条件，在第12天在GPM/E中培养的细胞在10X放大率(左)和20X放大率(右)下的OPC形态。
图9示出了处理后第5天在100％ N2.1(用IBMX处理2天)中培养的细胞在10X放大率(左)和20X放大率(右)下的OPC形态。
图10示出了在GPM/E中培养的对照系统(左)和在100％ N2.1中培养的细胞(右)在第13天(固定细胞)的Hoechst(蓝色)和MBP(绿色)共焦免疫染色。
图11是大批量OPC分化方案的流程图。
图12示出了从第35天和第42天开始的细胞形态照片。成功和失败组的培养因形态不同而不同。ER-ICBRD-02批细胞呈现有组织的、紧凑且密集的细胞形态，并且没有获得纺锤状“失败”形态。
图13是解冻细胞OPC分化方案的流程图。
图14示出了所呈现的正在进行的轮次的形态照片，与ICB解冻细胞相比，在第21天呈现了在来源轮次和它们衍生的ICB之间的聚集体形态相似性。
图15示出了与ICB解冻细胞相比，在第35天和第42天所呈现的正在进行的轮次的形态照片。呈现了在来源轮次和它们衍生的ICB之间的形态相似性，将细胞组织为紧凑且密集的细胞。
具体实施方式
本描述不旨在是可以实施本公开的所有不同方式或可以添加到本公开的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例说明的特征可以并入其它实施例，并且关于特定实施例说明的特征可以从该实施例中删除。因此，本公开设想在本公开的一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。另外，根据本公开，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本公开的情况下，对本文提出的各种实施例的许多变化和添加是显而易见的。在其它情况下，没有详细示出公知的结构、接口和过程，以免不必要地模糊本发明。本说明书的任何部分都不旨在解释为对本发明的全部范围的任何部分的否定。因此，以下描述旨在说明本公开的一些特定方面，并且不是穷尽地指定其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本文公开的描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制本公开。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考以全文引用的方式并入。
除非上下文另有指示，特别意指本文描述的本公开的各种特征可以以任何组合使用。此外，本公开还设想在本公开的一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
本文公开的方法可以包含用于实现所描述方法的一个或多个步骤或动作。
在不脱离本发明的范围的情况下，该方法步骤和/或动作可以彼此互换。换句话说，除非需要步骤或动作的特定顺序来适当地操作该方面，否则可以在不脱离本发明的范围的情况下修改特定步骤和/或动作的顺序和/或使用。
I.定义
如在本公开和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
如本文所用，“和/或”是指并且涵盖相关联的所列项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时组合的缺乏。
如本文所用，术语“约”和“大约”当指可测量的值诸如百分比、密度、体积等时，意指涵盖指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
如本文所用，诸如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”的短语应解释为包括X和Y。如本文所用，诸如“在约X和Y之间”的短语意指“在约X和约Y之间”，并且诸如“从约X至Y”的短语意指“从约X至约Y”。
如本文所用，“少突胶质细胞祖细胞”(OPC)是指在中枢神经系统中发现的细胞，其具有神经外胚层/神经胶质谱系、表达特征性标志物神经/神经胶质抗原2(NG2)并且能够分化成少突胶质细胞。
术语“神经胶质谱系细胞”、“神经胶质祖细胞”和“神经胶质细胞”在本文中可互换使用，并且是指衍生自神经外胚层/神经祖细胞的非神经元CNS细胞。神经胶质祖细胞可以进一步分化以形成OPC/少突胶质细胞或星形胶质细胞。在某些实施例中，本公开的神经胶质祖细胞表达选自以下的一种或多种标志物：钙电压门控通道辅助亚基γ4(CACNG4)、脂肪酸结合蛋白7(FABP7)和神经轴突导向因子-1(netrin-1)受体(DCC)。
术语“神经外胚层”、“神经外胚层细胞”、“神经外胚层前体”、“神经外胚层祖细胞”、“神经祖细胞”和“神经前体”在本文中可互换使用，并且是指可以沿着神经前体通路分化并且能够形成CNS神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞的细胞。在某些实施例中，本公开的神经外胚层细胞表达选自以下的一种或多种标志物：成对盒6(PAX6)、Hes家族BHLH转录因子5(HESS)以及含锌指和BTB结构域16(ZBTB16)。
如本文所用，术语“背侧”和“腹侧”是指从祖细胞出现的不同神经细胞亚型，该祖细胞沿着发育中的脊髓中的神经管的背侧-腹侧轴排列成空间离散结构域。该过程，称为背侧-腹侧图案化，是由分离神经祖细胞的分泌信号控制的。BMP和Wnt信号传导从背侧神经管开始图案化(Lee和Jessell，1999，《神经科学年评(Annu.Rev.Neurosci.)》22:261至294)，而SHH的分泌在确立腹侧神经元细胞命运中具有关键作用(Chiang等人，1996，《自然(Nature)》383:407至413；Ericson等人，1996，《细胞(Cell)》87:661至683；Briscoe等人，2001，《分子细胞学(Mol.Cell)》7:1279至1291)。
术语“背侧神经外胚层祖细胞”、“背侧神经祖细胞”和“dNPC”在本文中可互换使用，并且是指具有背侧脊髓表型并且在不存在外源性SHH或SHH信号传导激活剂的情况下通过使多能干细胞分化成神经外胚层限制性前体而获得的神经祖细胞。在某些实施例中，dNPC表达选自以下的一种或多种标志物：成对盒3(PAX3)、成对盒7(PAX7)和激活蛋白2(AP2)。
如本文所用，术语“拟胚体”(EB)是指衍生自多能干细胞的三维细胞聚集体，该多能干细胞已经历向所有三个胚层的自发分化。当从抑制分化的培养条件中移除多能干细胞时，形成EB。例如，在人胚胎干细胞的情况下，从培养基中移除碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β(TGE13)导致向所有三个胚层自发分化并且形成EB。
如本文所用，术语“BMP信号传导抑制剂”是指能够下调沿着骨形态发生蛋白(BMP)信号传导通路的信号传导的小分子或蛋白质调节剂。在某些实施例中，BMP信号传导抑制剂直接靶向I型活化素A受体(ACVR1)，也称为活化素受体样激酶2(ALK2)。在某些实施例中，BMP信号传导抑制剂选自由以下组成的组：多索吗啡、DMH-1、K02288、ML347、LDN193189和头蛋白质(Noggin protein)。
如本文所用，术语“MAPK/ERK抑制剂”是指抑制MAPK/ERK激酶的小分子或蛋白质调节剂。在某些实施例中，MAPK/ERK抑制剂选自由以下组成的组：PD0325901、AZD6244、GSK1120212、PD1 84352和考比替尼(Cobimetinib)。
术语“SHH信号传导激活剂”、“SHH信号传导激动剂”、“SHH激活剂”和“SHH激动剂”在本文中可互换使用，并且是指能够激活音猬因子(Sonic Hedgehog，SHE)信号传导通路的小分子或蛋白质调节剂。SHE信号传导激活剂的非限制性实例包括嘌吗啡胺(Purmorphamine，PMA)、平滑激动剂(SAG，CAS 364590-63-6)和音猬因子(SHH)蛋白质。
如本文所用，术语“FGF”或“bFGF”是指人碱性成纤维细胞生长因子或FGF-2，其为由FGF2基因编码的生长因子和信号传导蛋白。该术语也可互换地用于指任何序列变体或其缀合物，包括市售的“热稳定的”FGF(hs-FGF、hs-bFGF、hs-hbFGF和/或hsbFGF)。
如本文所用，术语“不期望的细胞类型”是指神经外胚层谱系之外的细胞，其在植入后可能导致异位组织的形成，或在如本文所描述的囊肿测定中导致一个或多个囊肿的形成。在实施例中，“不期望的细胞类型”可以包括上皮谱系细胞，诸如CD49f阳性的细胞，由神经祖细胞和上皮细胞两者表达的标志物，或CLDN6或EpCAM阳性的细胞，由多能细胞和上皮细胞两者表达的两种标志物。
如本文所用，“植入”或“移植”是指使用合适的递送技术(例如，使用注射装置)将细胞群施用至靶组织中。
如本文所用，“受试者”是指动物或人。
如本文所用，“有此需要的受试者”是指在中枢神经系统中具有受损组织的动物或人。在实施例中，动物或人正在经历运动功能的丧失。
术语“中枢神经系统”和“CNS”在本文中可互换使用，并且是指控制身体的一种或多种活动的神经组织的复合物，其包括但不限于脊椎动物的脑和脊髓。
如本文所用，关于病症或疾病的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于在病症或疾病在患者中显现后获得有益或所需结果，优选包括临床结果，的方式。关于疾病的有益或期望结果包括但不限于以下中的一种或多种：改善与疾病相关联的病症、治愈疾病、减轻疾病的严重性、延缓疾病的进展、减轻与疾病相关联的一种或多种症状、提高患有疾病的人的生活质量、延长存活期，及其任何组合。同样，出于本公开的目的，关于病症的有益或期望结果包括但不限于以下中的一种或多种：改善病症、治愈病症、减轻病症的严重性、延缓病症的进展、减轻与病症相关联的一种或多种症状、提高患有病症的人的生活质量、延长生存期，及其任何组合。
I.OPC组合物
本公开的方法可以用于获得包含适于细胞治疗的少突胶质细胞祖细胞(OPC)的组合物。根据本公开获得的OPC表达高水平的OPC特征性的蛋白聚糖NG2、PDGFRa和/或PDGFRβ以及低水平的与不期望的细胞类型，诸如CD49f，相关联的非OPC标志物，其可以由神经祖细胞和上皮细胞两者表达并且与体外囊肿形成相关联(Debnath J,Muthuswamy SK,BruggeJS.《生长在三维基底膜培养物中的MCF-10A乳腺上皮腺泡的形态发生和肿瘤形成(Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown inthree-dimensional basement membrane cultures.)》2003，《方法(Methods.)》3:256至68)、细胞角蛋白7(CK7)、或CLDN6和EpCAM，由多能细胞和上皮细胞表达的两种标志物(LinD,Guo Y,Li Y,Ruan Y,Zhang M,Jin X,Yang M,Lu Y,Song P,Zhao S,Dong B,Xie Y,DangQ,Quan C，《生物信息学分析揭示人密蛋白-6调节和功能的潜在特性(Bioinformaticanalysis reveals potential properties of human Claudin-6regulation andfunctions.)》《肿瘤报告(Oncol Rep.)》2017年8月；38(2):875至885；Huang L,Yang Y,Yang F,Liu S,Zhu Z,Lei Z,Guo J，《在生理过程和疾病中EpCAM的功能(综述)(Functionsof EpCAM in physiological processes and diseases(Review).)》，《国际分子医学杂志(Int JMol Med.)》2018年10月；42(4):1771至1785)。
在某些实施例中，根据本公开生成的OPC是人多能干细胞的体外分化后代。在某些实施例中，根据本公开获得的OPC是人胚胎干细胞的体外分化后代。在其它实施例中，根据本公开获得的OPC是诱导多能干细胞(iPS)的体外分化后代。
获得的OPC群体的一种或多种特征可以通过使用流式细胞术定量各种细胞标志物来确定，例如，以确定细胞群的什么百分比对特定标志物或标志物组是阳性的，或鉴定OPC群体中存在的不期望的细胞类型。
根据本公开获得的OPC群体可以包含从约30％至约100％的OPC，诸如至少约35％、诸如至少约40％、诸如至少约45％、诸如至少约50％、诸如至少约55％、诸如至少约60％、诸如至少约65％、诸如至少约70％、诸如至少约75％、诸如至少约80％、诸如至少约85％、诸如至少约90％、诸如至少约95％、诸如至少约98％、诸如至少约99％、诸如至少约99.5％、诸如至少约99.8％，或诸如至少约99.9％的OPC。该百分比可以是所列举范围内的任何值或子范围，包括端点。群体中OPC的百分比可以例如通过OPC的阳性标志物的存在和/或OPC的阴性标志物的不存在来确定。OPC阳性标志物的实例包括但不限于NG2、PDGFRa和/或PDGFRβ。OPC标志物的附加实例可以在WO 2020/154533中找到，在此通过引用将其全部公开内容并入本文，包括例如OPC和其它细胞类型的标志物、分化细胞的方法、使用分化细胞的方法、细胞类型、试剂和所有其它方法、组合物和公开内容。
根据本公开获得的OPC群体可以包含从约30％至约100％的NG2阳性细胞，诸如至少约35％、诸如至少约40％、诸如至少约45％、诸如至少约50％、诸如至少约55％、诸如至少约60％、诸如至少约65％、诸如至少约70％、诸如至少约75％、诸如至少约80％、诸如至少约85％、诸如至少约90％、诸如至少约95％、诸如至少约98％、诸如至少约99％、诸如至少约99.5％、诸如至少约99.8％，或诸如至少约99.9％的NG2阳性细胞。在某些实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约45％至约75％的NG2阳性细胞，诸如约45％至约50％、诸如约50％至约55％、诸如约55％至约60％、诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％、诸如约70％至约75％、诸如约50％至约70％、诸如约55％至约65％，或诸如约58％至约63％的NG2阳性细胞。在其它实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约60％至约90％的NG2阳性细胞，诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％的阳性细胞。该百分比可以是所列举范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据本公开获得的OPC群体可以包含从约30％至约100％的PDGFRa阳性细胞，诸如至少约35％，诸如至少约40％、诸如至少约45％、诸如至少约50％、诸如至少约55％、诸如至少约60％、诸如至少约65％、诸如至少约70％、诸如至少约75％、诸如至少约80％、诸如至少约85％、诸如至少约90％、诸如至少约95％、诸如至少约98％、诸如至少约99％、诸如至少约99.5％、诸如至少约99.8％，或诸如至少约99.9％的PDGFRa阳性细胞。在某些实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约45％至约75％的PDGFRa阳性细胞，诸如约45％至约50％、诸如约50％至约55％、诸如约55％至约60％、诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％、诸如约70％至约75％、诸如约50％至约70％、诸如约55％至约65％，或诸如约58％至约63％的PDGFRa阳性细胞。在其它实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约60％至约90％的PDGFRa阳性细胞，诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％的阳性细胞。该百分比可以是所列举范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据本公开获得的OPC群体可以包含从约30％至约100％的PDGFRβ阳性细胞，诸如至少约35％、诸如至少约40％、诸如至少约45％、诸如至少约50％、诸如至少约55％、诸如至少约60％、诸如至少约65％、诸如至少约70％、诸如至少约75％、诸如至少约80％、诸如至少约85％、诸如至少约90％、诸如至少约95％、诸如至少约98％、诸如至少约99％、诸如至少约99.5％、诸如至少约99.8％，或诸如至少约99.9％的PDGFRβ阳性细胞。在某些实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约45％至约75％的PDGFRβ阳性细胞，诸如约45％至约50％、诸如约50％至约55％、诸如约55％至约60％、诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％、诸如约70％至约75％、诸如约50％至约70％、诸如约55％至约65％，或诸如约58％至约63％的PDGFRβ阳性细胞。在其它实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以包含从约60％至约90％的PDGFRβ阳性细胞，诸如约60％至约65％、诸如约65％至约70％的阳性细胞。该百分比可以是所列举范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以能够在如本公开的实例8中所描述的囊肿测定中每100,000个细胞形成小于或等于4个上皮囊肿。在另一实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以能够在囊肿测定中每100,000个细胞形成小于或等于三个上皮囊肿。在另一实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以能够在囊肿测定中每100,000个细胞形成小于或等于两个上皮囊肿。在又一实施例中，根据本公开获得的OPC群体可以能够在如本公开的实例8中所描述的囊肿测定中每100,000个细胞形成小于或等于1个上皮囊肿。
II.药物制剂
根据本公开的OPC组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在实施例中，药学上可接受的载体可以包含二甲基亚砜(DMSO)。在实施例中，药学上可接受的载体不包含二甲基亚砜。如上所述，组合物可以进一步适合于在-80℃至-195℃或低于-80℃冷冻保存。在实施例中，可以配制组合物使其解冻并直接施用至受试者，例如经由注射，而无需在施用前进行附加操控。在实施例中，可以配制包含冻存液诸如10(CS10)作为冷冻保存培养基的组合物。在实施例中，可以在冷冻保存之前使用60um过滤器套件过滤组合物。
根据本公开的OPC组合物可以被配制用于经由直接注射施用至受试者的脊髓。在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以被配制用于脑内、心室内、鞘内、鼻内或脑池内施用至受试者。在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以被配制用于经由注射直接施用至受试者脑中的梗塞腔中或施用至梗塞腔附近。在实施例中，根据本公开的组合物可以被配制用于通过植入施用。在实施例中，根据本公开的组合物可以被配制为溶液。
根据本公开的OPC组合物可以包含从约1×106至约200×106个细胞/毫升，诸如约1×106个细胞/毫升、诸如约2×106个细胞/毫升、诸如约3×106个细胞/毫升、诸如约4×106个细胞/毫升、诸如约5×106个细胞/毫升、诸如约6×106个细胞/毫升、诸如约7×106个细胞/毫升、诸如约8×106个细胞/毫升、诸如约9×106个细胞/毫升、诸如约10×106个细胞/毫升、诸如约20×106个细胞/毫升、诸如约30×106个细胞/毫升、诸如约40×106个细胞/毫升、诸如约50×106个细胞/毫升、诸如约60×106个细胞/毫升、诸如约70×106个细胞/毫升、诸如约80×106个细胞/毫升、诸如约90×106个细胞/毫升、诸如约100×106个细胞/毫升、诸如约101×106个细胞/毫升、诸如约102×106个细胞/毫升、诸如约103×106个细胞/毫升、诸如约104×106个细胞/毫升、诸如约105×106个细胞/毫升、诸如约106×106个细胞/毫升、诸如约107×106个细胞/毫升、诸如约108×106个细胞/毫升、诸如约109×106个细胞/毫升、诸如约110×106个细胞/毫升、诸如约120×106个细胞/毫升、诸如约130×106个细胞/毫升、诸如约140×106个细胞/毫升、诸如约150×106个细胞/毫升、诸如约160×106个细胞/毫升、诸如约170×106细胞/毫升、诸如约180×106细胞/毫升、诸如约190×106细胞/毫升、诸如约200×106细胞/毫升。该细胞的数量可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在又一实施例中，根据本公开的OPC组合物可以具有范围从约250微升至约1毫升，诸如约300微升、诸如约400微升、诸如约500微升、诸如约600微升、诸如约700微升、诸如约800微升、诸如约900微升，或诸如约1毫升的体积。在实施例中，根据本公开的组合物可以具有范围从约250微升至约1毫升，诸如约250微升至约900微升、诸如约300微升至约800微升、诸如约400微升至约700微升，或诸如约500微升至约600微升的体积。在另一实施例中，根据本公开的组合物可以具有范围从约100微升至约1毫升，诸如约200微升至约900微升、诸如约300微升至约800微升、诸如约400微升至约700微升，或诸如约500微升至约600微升的体积。该体积可以是所列举范围内的任何值或子范围。在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以在配置成用于冷冻保存或用于施用至有此需要的受试者的容器中。在实施例中，容器可以是预装注射器。
在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以以范围从约50微升至约100微升，诸如约55微升、诸如约60微升、诸如约65微升、诸如约70微升、诸如约75微升、诸如约80微升、诸如约85微升、诸如约90微升、诸如约95微升，或诸如约100微升的体积施用。在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以以范围从约50微升至约100微升，诸如约55微升至约95微升、诸如约60微升至约90微升、诸如约65微升至约85微升，或诸如约70微升至约80微升的体积施用。该体积可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以以范围从约5.0×106个细胞至约10.0×106个细胞，诸如约5.5×106个细胞、诸如约6.0×106个细胞、诸如约6.5×106个细胞、诸如约7.0×106个细胞、诸如约7.5×106个细胞、诸如约8.0×106个细胞、诸如约8.5×106个细胞、诸如约9.0×106个细胞、诸如约9.5×106个细胞，或诸如约10.0×106个细胞的体积施用。在实施例中，根据本公开的OPC组合物可以以范围从约5.0×106个细胞至约10.0×106个细胞，诸如约5.5×106个细胞至约9.5×106个细胞、诸如约6.0×106个细胞至约9.0×106个细胞、诸如约6.5×106个细胞至约8.5×106个细胞，或诸如约7.0×106个细胞至约8.0×106个细胞的体积施用。该细胞数量可以是所列举范围内的任何值或子范围。
III.使用方法
根据本公开获得的OPC组合物可以用于细胞治疗以改善需要治疗的受试者的一种或多种神经功能。在实施例中，可以将根据本公开的OPC细胞群注射或植入有此需要的受试者中。在实施例中，可以将根据本公开的细胞群植入有此需要的受试者中以治疗脊髓损伤、中风或多发性硬化。
在实施例中，根据本公开的细胞群可以能够在受试者的植入部位诱导裸露轴突的髓鞘形成。在实施例中，根据本公开的方法生成的细胞群可以表现出改善的移入和迁移能力。在实施例中，根据本公开的方法生成的细胞群可以能够改善受试者中神经组织的损伤后修复或再生。
根据本公开的细胞群可以能够在将该群体植入受试者后改善需要治疗的受试者的感觉功能。可以使用脊髓损伤的神经学分类的国际标准(ISNCSCI)检查来评估感觉功能的改善，诸如确定右侧和左侧的感觉水平为针刺和轻触感觉。根据本公开的细胞群可以能够在将该群体植入受试者后改善需要治疗的受试者的运动功能。可以使用ISNCSCI检查来评估改善的运动功能，诸如确定右侧和左侧的运动水平为完全麻痹、可触知或可见的收缩、主动移动、抵抗重力的全范围运动和足够的阻力。
根据本公开的细胞群可以能够在12个月或更少的时间内减小损伤诱导的中枢神经系统实质空化的体积。在实施例中，根据本公开的细胞群可以能够在6个月或更少、5个月或更少、4个月或更少、3个月或更少、2个月或更少，或少于1个月内减小受试者中损伤诱导的中枢神经系统实质空化的体积。
用于治疗CNS创伤性损伤。在某些实施例中，根据本公开的细胞群可以能够在将包含该细胞群的组合物植入脊髓损伤部位后在脊髓损伤部位移入。
在某些实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约90天或更长的时间段。在其它实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约1年或更长的时间段。在进一步的实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约2年或更长的时间段。在进一步的实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约3年或更长的时间段。在进一步的实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约4年或更长的时间段。在又进一步的实施例中，在将一定剂量的组合物植入脊髓损伤部位后，根据本公开的细胞群能够在受试者的脊髓损伤部位内保留约5年或更长的时间段。
在某些实施例中，根据本公开的细胞组合物当施用至有脊髓损伤的人类受试者时能够改善所述受试者的上肢运动功能。在某些实施例中，受试者患有颈脊髓损伤。在其它实施例中，受试者患有胸脊髓损伤。
在一个实施例中，本公开提供了改善有脊髓损伤的人类受试者的上肢运动功能的方法，其包含向所述受试者施用组合物，该组合物包含能够在脊髓损伤部位移入的同种异体人少突胶质细胞群。在某些实施例中，施用组合物包含将组合物注射到脊髓损伤部位。在一些实施例中，将组合物注射到脊髓损伤中心的尾侧大约2至10mm处。在进一步的实施例中，将组合物注射到脊髓损伤中心的尾侧大约5mm处。在一些实施例中，受试者患有颈脊髓损伤。在其它实施例中，受试者患有胸脊髓损伤。
在某些实施例中，根据本公开的方法向受试者施用包含同种异体人少突胶质细胞群的组合物，该受试者的上肢运动功能得到改善，其等于至少一种运动水平(如基于脊髓损伤的神经学分类的国际标准[ISNCSCI]所定义的)。功能的改善可以是单侧的或双侧的。在其它实施例中，根据本公开的方法向受试者施用包含同种异体人少突胶质细胞群的组合物，该受试者的单侧或双侧上肢运动功能得到改善，其等于至少两种运动水平。在某些实施例中，受试者上肢运动功能得到改善，一侧等于至少一个运动水平，并且另一侧等于至少两个运动水平。在某些实施例中，相对于根据本公开的方法施用同种异体人少突胶质细胞群之前的受试者基线评分，受试者表现出改善的上肢运动评分(UEMS)。
在某些实施例中，根据本公开的细胞组合物被配制用于递送或施用至脊柱实质中，或通过邻近或在硬脑膜、蛛网膜或软脑膜下的损伤部位的外周灌注。
IV.未分化的多能干细胞的增殖和培养
根据本公开的多能干细胞的分化可以使用任何合适的多能干细胞作为起始材料来进行。在一个实施例中，一种方法可以在人胚胎干细胞(hESC)系上进行。在另一实施例中，一种方法可以使用诱导多能干细胞(iPSC)进行。在另一实施例中，一种方法可以使用衍生自H1、H7、H9、H13或H14细胞系的细胞进行。在另一实施例中，一种方法可以在灵长类多能干细胞(pPS)细胞系上进行。在又一实施例中，一种方法可以使用衍生自孤雌生殖体的未分化的干细胞进行，该孤雌生殖体是未经受精而被刺激产生hESC的胚胎。
先前已经描述了未分化的多能干细胞的增殖和培养方法。关于多能干细胞的组织和细胞培养，读者可能希望参考本领域可获得的众多出版物中的任一种，例如《畸胎癌和胚胎干细胞：实用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells:A PracticalApproach)》(E.J.Robertson编辑，IRL出版公司，1987)；《小鼠发育的技术指南(Guide toTechniques in Mouse Development)》(P.M.Wasserman等人编辑，学术出版社(AcademicPress)，1993)；《胚胎干细胞的体外分化(Embryonic Stem Cell Differentiation inVitro)》(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900，1993)；《胚胎干细胞的特性和用途：人类生物学和基因治疗的应用前景(Properties and Uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy)》(P.D.Rathjen等人，)《繁殖、生育和发育(Reprod.Fertil.Dev.)》10:31，1998；和R.I.Freshney，《动物细胞培养(Cultureof Animal Cells)》，纽约Wiley-Liss，2000)。这些中的每一个都在此以全文引用的方式并入。
未分化的多能干细胞可以在不添加饲养细胞的情况下维持在未分化状态(参见，例如(2004)Rosler等人，《发育动力学(Dev.Dynam.)》229:259)。无饲养细胞培养物通常由含有促进细胞增殖而不分化的因子的营养培养基支持(参见，例如美国专利第6,800,480号)。在一个实施例中，可以使用含有此类因子的条件培养基。条件培养基可以通过培养具有分泌此类因子的细胞的培养基获得。合适的细胞包括但不限于照射的(4,000Rad)原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞，或衍生自pPS细胞的成纤维细胞样细胞(美国专利第6,642,048号)。可以通过将饲养细胞接种在无血清培养基中调节培养基，诸如补充有20％血清替代品和4ng/mL bFGF的敲除DMEM。可以用另外的bFGF补充已经调节1至2天的培养基，并且用于支持pPS细胞培养1至2天(参见，例如，WO 01/51616；Xu等人，(2001)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》19:971)。
替代地，可以使用新鲜或非条件培养基，其补充有促进未分化形式的细胞增殖的添加因子(如成纤维细胞生长因子或毛喉素(forskolin))。非限制性实例包括基础培养基，如X-VIVOTM 10(马里兰州沃克斯维尔龙沙公司(Lonza,Walkersville,MD.))，或QBSFTM-60(马里兰州盖瑟斯堡质量生物公司(Quality Biological Inc.Gaithersburg,MD.))，或mTeSR1、mTeSR plus，或NutriSTem(康涅狄格州克伦威尔生物工业公司(BiologicalIndustries,Cromwell,CT))，其补充有40-80ng/mL的bFGF，并且任选地含有SCF(15ng/mL)，或Flt3配体(75ng/mL)(参见，例如，Xu等人，(2005)《干细胞(Stem Cells)》23(3):315)。这些培养基制剂具有支持细胞在其它系统中以2至3倍的速率生长的优势(参见，例如，，WO03/020920)。在一个实施例中，未分化的多能细胞诸如hES细胞可以在包含bFGF和TGFβ的培养基中培养。bFGF的非限制性实例浓度包括约80ng/ml。TGFβ的非限制性实例浓度包括约0.5ng/ml。在又一实施例中，未分化的多能干细胞可以维持在市售的完全培养基中，诸如mTeSkrm(加拿大温哥华干细胞技术公司(Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada))。
未分化的多能细胞可以在饲养细胞层上培养，通常为衍生自胚胎或胎儿组织的成纤维细胞(Thomson等人，(1998)《科学(Science)》282:1145)。饲养细胞可以衍生自人或鼠源。人饲养细胞可以从各种人组织中分离，或者可以经由将人胚胎干细胞分化成成纤维细胞而衍生(参见，例如，WO 01/51616)。可以使用的人饲养细胞包括但不限于胎盘成纤维细胞(参见，例如，Genbacev等人，(2005)《生育和不育(Fertil.Steril.)》83(5):1517)、输卵管上皮细胞(参见，例如，Richards等人，(2002)《自然生物技术》，20:933)、包皮成纤维细胞(参见，例如，Amit等人(2003)《生殖生物学(Biol.Reprod.)68:2150)，和子宫内膜细胞(参见，例如，Lee等人，(2005)《生殖生物学》72(1):42)。
各种固体表面可以用于培养未分化的多能细胞。这些固体表面包括但不限于标准市售组织培养瓶或细胞培养板，诸如6孔、24孔、96孔或144孔板。其它固体表面包括但不限于微载体和盘。适于使未分化的多能细胞生长的固体表面可以由多种物质制成，包括但不限于玻璃或塑料诸如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、melinex、thermanox或其组合。合适的表面可以包含一种或多种聚合物，诸如例如一种或多种丙烯酸酯。固体表面在形状上可以是三维的。三维固体表面的非限制性实例先前已描述于例如美国专利公开第2005/0031598号。
未分化的干细胞也可以在无饲养细胞条件下在生长基底上生长。生长基底可以是基质胶(Matrigel)(例如GFR)、重组层粘连蛋白、层粘连蛋白-511重组片段E8或玻连蛋白。在本公开的某些实施例中，生长基底是重组人层粘连蛋白-521(瑞典Biolamina公司(Biolamina,Sweden)，由纽约州康宁市康宁公司分销(CorningInc,Corning,NY))。在其它实施例中，基底是合成基底，诸如例如-IISC基底。
未分化的干细胞使用各种方法传代或传代培养，诸如使用胶原酶，或诸如手工刮擦。未分化的干细胞可以通过生成单细胞悬浮液的酶促手段传代培养，诸如使用(由密苏里州西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich, MO)分销)或类似的胰蛋白酶。替代地，未分化的干细胞可以使用非酶促手段传代培养，诸如0.5mM EDTA于PBS中，或诸如使用ReLeSR(加拿大温哥华干细胞技术公司)。
在实施例中，以允许细胞在约3天至约10天内达到汇合的接种密度接种或传代培养多个未分化的干细胞。在实施例中，接种密度可以为范围从约6.0×103个细胞/cm2至约5.0×105个细胞/cm2，诸如约1.0×104个细胞/cm2、诸如约5.0×104个细胞/cm2、诸如约1.0×105个细胞/cm2，或诸如约3.0×105个细胞/cm2的生长表面。在另一实施例中，接种密度可以为范围从约6.0×103细胞/cm2至约1.0×104细胞/cm2的生长表面，诸如约6.0×103细胞/cm2至约9.0×103细胞/cm2、诸如约7.0×103细胞/cm2至约1.0×104细胞/cm2、诸如约7.0×103细胞/cm2至约9.0×103细胞/cm2，或诸如约7.0×103细胞/cm2至约8.0×103细胞/cm2的生长表面。在又一实施例中，接种密度可以为范围从约1.0×104细胞/cm2至约1.0×105细胞/cm2的生长表面，诸如约2.0×104细胞/cm2至约9.0×104细胞/cm2、诸如约3.0×104细胞/cm2至约8.0×104细胞/cm2、诸如约4.0×104细胞/cm2至约7.0×104细胞/cm2，或诸如约5.0×104细胞/cm2至约6.0×104细胞/cm2的生长表面。在实施例中，接种密度可以为范围从约1.0×105细胞/cm2至约5.0×105细胞/cm2的生长表面，诸如约1.0×105细胞/cm2至约4.5×105细胞/cm2、诸如约1.5×105细胞/cm2至约4.0×105细胞/cm2、诸如约2.0×105细胞/cm2至约3.5×105细胞/cm2，或诸如约2.5×105细胞/cm2至约3.0×105细胞/cm2的生长表面。该接种密度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
多种合适的细胞培养和传代培养技术中的任一种可以用于根据本公开的方法培养干细胞。例如，可以每天完全更换培养基，在细胞传代培养后约2天开始。在实施例中，当培养物达到约90％集落覆盖度时，可以使用一种或多种合适的试剂，诸如例如分离细胞并且接种用于随后的培养以获得用于定量的单细胞悬浮液。在实施例中，然后可以在将细胞接种到合适的生长基底(例如，重组人层粘连蛋白-521)上之前，以允许细胞在合适的时间段，诸如例如约3天至10天，内达到汇合的接种密度传代培养未分化的干细胞。在一个实施例中，未分化的干细胞可以使用胶原酶IV传代培养并且在重组层粘连蛋白上扩增。在另一实施例中，未分化的干细胞可以使用胶原酶IV传代培养并且在上扩增。在一个实施例中，未分化的干细胞可以使用ReLeSRTM传代培养并且在重组人层粘连蛋白-521上扩增。
对于接种未分化的干细胞，接种密度可以为范围从约6.0×103个细胞/cm2至约5.0×105个细胞/cm2，诸如约1.0×104个细胞/cm2、诸如约5.0×104个细胞/cm2、诸如约1.0×105个细胞/cm2，或诸如约3.0×105个细胞/cm2的生长表面。在另一实施例中，接种密度可以为范围从约6.0×103细胞/cm2至约1.0×104细胞/cm2的生长表面，诸如约6.0×103细胞/cm2至约9.0×103细胞/cm2、诸如约7.0×103细胞/cm2至约1.0×104细胞/cm2、诸如约7.0×103细胞/cm2至约9.0×103细胞/cm2，或诸如约7.0×103细胞/cm2至约8.0×103细胞/cm2的生长表面。在又一实施例中，接种密度可以为范围从约1.0×104细胞/cm2至约1.0×105细胞/cm2的生长表面，诸如约2.0×104细胞/cm2至约9.0×104细胞/cm2、诸如约3.0×104细胞/cm2至约8.0×104细胞/cm2、诸如约4.0×104细胞/cm2至约7.0×104细胞/cm2，或诸如约5.0×104细胞/cm2至约6.0×104细胞/cm2的生长表面。在实施例中，接种密度可以为范围从约1.0×105细胞/cm2至约5.0×105细胞/cm2的生长表面，诸如约1.0×105细胞/cm2至约4.5×105细胞/cm2、诸如约1.5×105细胞/cm2至约4.0×105细胞/cm2、诸如约2.0×105细胞/cm2至约3.5×105细胞/cm2，或诸如约2.5×105细胞/cm2至约3.0×105细胞/cm2的生长表面。该接种密度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
V.人多能干细胞分化成背侧神经外胚层祖细胞并且进一步分化成背侧衍生的神经胶质祖细胞和少突胶质细胞祖细胞
本公开提供了使用BMP信号传导的小分子和蛋白质调节剂与MAPK/ERK激酶的抑制剂的组合将人多能干细胞分化成具有背侧脊髓表型的神经外胚层并且进一步分化成神经胶质祖细胞和少突胶质细胞祖细胞的方法。不受任何特定理论的束缚，本发明人已发现根据本公开的方法获得的人背侧神经外胚层祖细胞可以在不存在SHH信号传导活化的情况下容易并且有效地分化成脊髓OPC。令人惊讶的是，这种早期背侧表型尽管不是体内早期OPC生成的区域，但在分化过程的第21天产生神经胶质祖细胞，并且在分化过程的第28天产生OPC。根据本公开在第28天产生的OPC表达规范的OPC标志物NG2和PDGFRa，并且(就其总体标志物表达谱而言)与使用目前在临床测试中治疗脊髓损伤的替代方法生成的OPC相当。
在实施例中，一种方法包含使人多能干细胞与结合有骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的一种或多种抑制剂的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)的一种或多种抑制剂接触。在某些实施例中，MAPK/ERK抑制剂是小分子。在其它实施例中，MAPK/ERK抑制剂是蛋白质，诸如使MAPK/ERK激酶去磷酸化的磷酸酶。在某些实施例中，BMP信号传导抑制剂是小分子。在其它实施例中，BMP信号传导抑制剂是蛋白质。在一些实施例中，BMP信号传导抑制剂的直接靶点是ALK2，也称为I型活化素A受体(ACVR1)。在某些实施例中，在MAPK/ERK和BMP信号传导抑制后，在尾化剂视黄酸的存在下培养细胞，从而获得具有背侧脊髓表型的神经外胚层限制的祖细胞。
在某些实施例中，MAPK/ERK抑制剂可以选自由以下组成的组：PD0325901、AZD6244、GSK1120212、PD1 84352和考比替尼及其衍生物。在某些实施例中，BMP信号传导抑制剂可以选自由以下组成的组：多索吗啡、DMH-1、K02288、ML347、LDN193189和头蛋白质。
在实施例中，一种方法包含获得保持未分化状态的未分化的人多能干细胞；在小分子PD0325901和多索吗啡以及视黄酸的存在下，贴壁培养未分化的人多能干细胞第一时间段；并且随后在视黄酸的存在下和在SHH信号传导激活剂不存在下将细胞贴壁培养第二时间段，从而获得背侧神经外胚层细胞。在实施例中，第一时间段和第二时间段可以各自范围为从约1天至约6天，诸如约1天、诸如约2天、诸如约3天、诸如约4天、诸如约5天或诸如约6天。
在实施例中，一种方法包含在PD0325901的存在下，以范围从约1μM至约100μM，诸如约2μM、诸如约3μM、诸如约4μM、诸如约5μM、诸如约6μM、诸如约7μM、诸如约8μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约20μM、诸如约30μM、诸如约40μM、诸如约50μM，或诸如约60μM、70μM、80μM或90μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在PD0325901的存在下以约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在一个实施例中，一种方法包含在AZD6244的存在下，以范围从约1μM至约100μM，诸如约2μM、诸如约3μM、诸如约4μM、诸如约5μM、诸如约6μM、诸如约7μM、诸如约8μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约20μM、诸如约30μM、诸如约40μM、诸如约50μM，或诸如约60μM、70μM、80μM或90μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在AZD6244的存在下以约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在GSK1120212的存在下，以范围从约1μM至约100μM，诸如约2μM、诸如约3μM、诸如约4μM、诸如约5μM、诸如约6μM、诸如约7μM、诸如约8μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约20μM、诸如约30μM、诸如约40μM、诸如约50μM，或诸如约60μM、70μM、80μM或90μM的浓度的PD0325901培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在GSK1120212的存在下以约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在PD184352的存在下，以范围从约1μM至约100μM，诸如约2μM、诸如约3μM、诸如约4μM、诸如约5μM、诸如约6μM、诸如约7μM、诸如约8μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约20μM、诸如约30μM、诸如约40μM、诸如约50μM，或诸如约60μM、70μM、80μM或90μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在PD184352的存在下以约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在考比替尼的存在下，以范围从约1μM至约100μM，诸如约2μM、诸如约3μM、诸如约4μM、诸如约5μM、诸如约6μM、诸如约7μM、诸如约8μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约20μM、诸如约30μM、诸如约40μM、诸如约50μM，或诸如约60μM、70μM、80μM或90μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在考比替尼的存在下以约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在多索吗啡的存在下，以范围从约0.2μM至约20μM，诸如约0.5μM、诸如约0.8μM、诸如约1μM、诸如约1.5μM、诸如约2μM、诸如约2.5μM、诸如约3μM、诸如约3.5μM、诸如约4μM、诸如约4.5μM、诸如约5μM、诸如约5.5μM、诸如约6μM、诸如约6.5μM、诸如约7μM、诸如约7.5μM、诸如约8μM、诸如约8.5μM、诸如约9μM、诸如约10μM、诸如约11μM、诸如约12μM、诸如约13μM、诸如约14μM、诸如约15μM、诸如约16μM、诸如约17μM、诸如约18μM，或例如约19μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在另一实施例中，一种方法包含在多索吗啡的存在下，以范围从约0.2μM至约1μM，诸如约0.2μM至约0.9μM、诸如约0.3μM至约0.8μM、诸如约0.4μM至约0.7μM，或诸如约0.5μM至约0.6μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在又一实施例中，一种方法包含在多索吗啡的存在下，以范围从约1μM至约10μM，诸如约1μM至约9μM、诸如约2μM至约8μM、诸如约3μM至约7μM，或诸如约4μM至约6μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在多索吗啡的存在下，以范围从约10μM至约20μM，诸如约10μM至约19μM、诸如约12μM至约18μM、诸如约13μM至约17μM，或诸如约14μM至约16μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在多索吗啡的存在下以约2μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在ALK2抑制剂的存在下，以范围从约1nM至约20μM，诸如约10nM、约50nM、约100nM、约150nM、约200nM、约500nM、约1μM、约5μM、约10μM或约15μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在DMH-1的存在下，以范围从约1μM至约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在约2μM的DMH-1的存在下培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在K02288的存在下，以范围从约1μM至约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在约2μM的K02288的存在下培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在ML347的存在下，以范围从约1μM至约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在约2μM的ML347的存在下培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在实施例中，一种方法包含在LDN193189的存在下，以范围从约1μM至约10μM的浓度培养未分化的人多能干细胞。在实施例中，一种方法包含在约2μM的LDN193189的存在下培养未分化的人多能干细胞。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
任何适于贴壁细胞培养的组织培养容器均可以用于获得根据本公开的背侧神经外胚层祖细胞。合适的生长基底包括，例如，重组层粘连蛋白、层粘连蛋白-511重组片段E8或基质(例如，GFR)、多索吗啡、PD0325901、视黄酸(RA)、抗坏血酸(AA)、重组人EGF(rhEGF)、热稳定的重组人碱性FGF(rhbFGF)、ROCK抑制剂、rhLN521或PDGF-A。
在实施例中，根据本公开获得的背侧神经外胚层祖细胞可以被收获，并且在热稳定的rhbFGF和EGF的存在下在悬浮培养物中作为聚集体进一步培养，直至细胞成熟为神经胶质祖细胞。在实施例中，进一步的培养期可以为范围从约5天至15天，诸如约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。在实施例中，进一步的培养期为约7天。
在实施例中，可以通过酶促手段收获贴壁培养的背侧神经外胚层祖细胞。酶促手段包括但不限于TrypLETM选择(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific,Waltham,MA))、(密苏里州西格玛奥德里奇公司)或类似的胰蛋白酶。替代地，可以使用非酶促手段收获贴壁培养的背侧神经外胚层祖细胞。非酶促手段包括但不限于0.5mM EDTA于PBS中，或诸如使用ReLeSRTM(加拿大温哥华干细胞技术公司)。
适于悬浮培养的任何细胞培养容器或反应器可以用于本公开中设想的非贴壁培养步骤。容器壁通常是惰性的或抗培养细胞的粘附。对于动态悬浮，还存在用于防止细胞沉析的工具，诸如像磁力或机械驱动的搅拌棒或桨的搅拌机构、摇动机构(通常通过外部附接至容器)，或反转机构(即，旋转容器以改变细胞上的重力方向的装置)。
适用于过程开发的悬浮培养的容器包括通常市售范围的旋转器、旋转器烧瓶、摇动袋或摇动烧瓶。适于商业生产的示例生物反应器包括垂直轮(VerticalWheel)TM生物反应器(加利福尼亚州卡马里奥PBS生物技术公司(PBS Biotech,Camarillo,CA))。
聚集体也可以在动态悬浮之前形成。例如，可以将细胞置于AggreWellTM板中以生成均匀的细胞聚集体。约3天后，可以将细胞聚集体转移到动态悬浮中。
在一个实施例中，根据本公开获得的神经胶质祖细胞可以被收获、向下铺板，并且可以在表皮生长因子(EGF)的存在下，贴壁培养另外的时间段，直至细胞成熟为少突胶质细胞祖细胞。在某些实施例中，培养基附加地包含血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)。在实施例中，进一步的培养期可以为范围约从约7天至14天，诸如约7天、约10天、约12天或约14天。在实施例中，进一步的培养期为范围从约14天至25天，诸如约15天、约16天、约17天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天或约25天。该培养期可以是所列举范围内的任何值或子范围，包括端点。
VI.不期望的细胞类型
根据本公开获得的OPC群体含有低水平的不期望的细胞类型，如例如通过流式细胞术定量与不期望的细胞类型相关联的标志物所测量的。在非限制性实例中，根据本公开第35天获得的OPC可以含有低水平的表达上皮细胞相关联标志物细胞角蛋白7(CK7)、EpCAM、CD49f和CLDN6的细胞。在另一非限制性实例中，根据本公开第42天获得的OPC可以含有低水平的表达上皮细胞相关联标志物ck7、EpCAM、CD49f和CLDN6的细胞，而没有与标志物TRA-1-60和OCT4相关联的hESC残留物。
与不期望的细胞类型相关联的标志物可以包含少于约20％的不期望的细胞类型，诸如少于约19％、诸如少于约18％、诸如少于约17％、诸如少于约16％、诸如少于约15％、诸如少于约14％、诸如少于约13％、诸如少于约12％、诸如少于约11％、诸如少于约10％、诸如少于约9％、诸如少于约8％、诸如少于约7％、诸如少于约6％、诸如少于约5％、诸如少于约4％、诸如少于约3％、诸如少于约2％、诸如少于约1％、诸如少于约0.5％、诸如少于约0.1％、诸如少于约0.05％，或诸如少于约0.01％的不期望的细胞类型。在另一实施例中，细胞群可以包含从约15％至约20％的不期望的细胞类型，诸如约19％至约20％、诸如约18％至约20％、诸如约17％至约20％、诸如约16％至约20％、诸如约15％至约19％，或诸如约16％至约18％的不期望的细胞类型。在又一实施例中，细胞群可以包含从约10％至约15％的不期望的细胞类型，诸如约14％至约15％、诸如约13％至约15％、诸如约12％至约15％、诸如约11％至约15％，或诸如约12％至约14％的不期望的细胞类型。在实施例中，细胞群可以包含从约1％至约10％的不期望的细胞类型，诸如约2％至约10％、诸如约1％至约9％、诸如约2％至约8％、诸如约3％至约7％，或诸如约4％至约6％的不期望的细胞类型。在实施例中，细胞群可以包含从约0.1％至约1％的不期望的细胞类型，诸如约0.2％至约1％、诸如约0.1％至约0.9％、诸如约0.2％至约0.8％、诸如约0.3％至约0.7％，或诸如约0.4％至约0.6％的不期望的细胞类型。在实施例中，细胞群可以包含从约0.01％至约0.1％的不期望的细胞类型，诸如约0.02％至约0.1％、诸如约0.01％至约0.09％、诸如约0.02％至约0.08％、诸如约0.03％至约0.07％，或诸如约0.04％至约0.06％的不期望的细胞类型。在实施例中，低水平的不期望的细胞类型可以表示存在少于约15％的不期望的细胞类型。
在实施例中，不期望的细胞类型可以包含表达选自以下的一种或多种标志物的细胞：ck7、CD49f、CLDN6或EpCAM。
VII.冷冻保存
收获后，可以以特定的治疗剂量(例如，细胞的数量)配制扩增的OPC群并且冷冻保存以运送至诊所。然后可以在解冻后直接施用现成即可施用的(RTA)OPC治疗组合物而无需进一步处理。适于冷冻保存的培养基的实例包括但不限于90％的人血清/10％的DMSO、10％的培养基3(CS10)、5％的培养基2(CS5)和2％的培养基1(CS2)、干细胞库、PRIMEFREEZIS、CSB、海藻糖等。
在一些实施例中，在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的存活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在其它实施例中，在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的回收率百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。该存活力可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在进一步的实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的存活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在其它实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的回收率百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。该存活力可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在又其它实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时，冷冻保存的组合物解冻后，过滤后细胞的存活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另外其它实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时，冷冻保存的组合物解冻后，过滤后细胞的回收率百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。该存活力可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在一些实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时，冷冻保存的组合物解冻后，过滤后OPC能够分泌核心蛋白聚糖。在其它实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时，冷冻保存的组合物解冻后，过滤后OPC能够扩增。
在一些实施例中，在室温下在中和培养基中储存约0至约8小时的过滤后OPC的存活力百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，在室温下在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后OPC的存活力百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在进一步的实施例中，在室温下在中和溶液中储存约0至约8小时，然后在室温下在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的存活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在更进一步的实施例中，在室温下在中和溶液中储存约0至约8小时，然后在室温下在冷冻保存培养基中储存约0至约8小时的过滤后细胞的回收率百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％。该存活力可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在适于解冻后现成即可施用的(RTA)应用的冷冻保存培养基中配制的OPC可以包含悬浮在腺苷、右旋糖酐-40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水中的OPC。这种冷冻保存培养基的实例可以商品名商购获得，并且由BioLife Solutions公司制造。
DMSO可以用作防冷冻剂以防止冰晶的形成，该冰晶可以在冷冻保存过程中杀死细胞。在一些实施例中，可冷冻保存的OPC治疗组合物包含在约0.1％至约2％之间的DMSO(v/v)。在一些实施例中，RTA OPC治疗组合物包含在约1％至约20％之间的DMSO。在一些实施例中，RTA OPC治疗组合物包含约10％的DMSO。在一些实施例中，RTA OPC细胞治疗组合物包含约5％的DMSO。该浓度可以是所列举范围内的任何值或子范围。
在一些实施例中，在适于解冻后现成即可施用的(RTA)应用的冷冻保存培养基中配制的OPC治疗可以包含悬浮在不含DMSO的冷冻保存培养基中的OPC。例如，RTAOPC治疗性细胞组合物可以包含悬浮在Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、c1-、H2P04-、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱甘肽中的OPC，而不含DMSO(二甲基亚砜、(CH3)2S0)或任何其它偶极非质子溶剂。这种冷冻保存培养基的实例可以商品名或-FRS商购获得，并且也由BioLifeSolutions公司制造。在其它实施例中，在适于解冻后现成即可施用的应用的冷冻保存培养基中配制的OPC组合物可以包含悬浮在海藻糖中的OPC。
RTA OPC治疗组合物可以任选地包含支持OPC移入、整合、存活、效力等的附加因子。在一些实施例中，RTA OPC治疗组合物包含本文所描述的OPC制剂的功能激活剂。
在一些实施例中，RTA OPC治疗组合物可以在包含在冷冻和解冻过程中通过清除自由基、pH缓冲、膨胀/渗透支持和维持离子浓度平衡来降低分子细胞应激的组分的培养基中配制。
在一些实施例中，在适于解冻后现成即可施用的应用的冷冻保存培养基中配制的OPC治疗可以包含一种或多种免疫抑制化合物。在某些实施例中，在适于解冻后现成即可施用的应用的冷冻保存培养基中配制的OPC治疗可以包含一种或多种免疫抑制化合物，其被配制用于一种或多种免疫抑制化合物的缓慢释放。与本文所描述的制剂一起使用的免疫抑制化合物可以属于以下类别的免疫抑制药物：糖皮质激素、细胞抑制剂(例如烷化剂或抗代谢物)、抗体(多克隆或单克隆)、作用于免疫亲和素的药物(例如环孢菌素(cyclosporin)、他克莫司(Tacrolimus)或西罗莫司(Sirolimus))。附加药物包括干扰素、阿片样物质、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小生物制剂。免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS 1L1 X1MABO(抗-I L-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、(抗-I L-2Ra受体抗体)、依维莫司(everolimus)、霉酚酸、RITUX1MABO(抗CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、他克莫司和/或吗替麦考酚酯(Mycophenolate mofetil)。
现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实例将更容易地理解本发明，该实例以说明的方式提供，并且不旨在限制本公开，除非另有说明。应理解，本文所描述的实例和实施例仅出于说明性目的，并且根据其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在该申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的在此以全文引用的方式并入。
实例
实例1：OPC1解冻和注射(TAI)药物产品(DP)制剂的确立
本实例的目的是证明新的少突胶质细胞祖细胞(OPC1)解冻和注射(TAI)药物产品制剂的确立。开发了用于TAI的OPC1药物产品(DP)，将其解冻并且直接应用于临床部位。先前，进行了一系列研究以开发改进的OPC1细胞的按比例扩大的生产和收获工艺。本实例的焦点是使用CryoStor 10(CS10)作为冷冻保存培养基确立TAI DP制剂，用于生成100×106个活细胞/ml的临床剂量，每小瓶的细胞悬浮液最终体积为300μl，以及一种用于解冻OPC1TAI小瓶的方法。
以下方面在本实例中具体确立：确立OPC1 TAI制剂为100×106个活细胞/ml，在CS10中，每小瓶的细胞悬浮液最终体积为300μl；确立含有300μl的OPC1 TAI小瓶的解冻程序；评价从LN521扩增的细胞获得的OPC1 TAI对iMatrix511-E8扩增的细胞的可比性；评价最佳细胞解离酶中和溶液；以及证实优化的按比例扩大的OPC分化过程生成符合所有验收标准的OPC1 TAI的能力。
在本实例中使用以下缩写和定义。CF-细胞工厂(细胞培养容器)。CS10-CryoStor10(细胞冷冻保存剂)。DMEM/F12-细胞培养基。DP-药物产品。DS-药物物质。GF-生长因子。HSA-人血清白蛋白。ICB-中间细胞库。iMatrix511-E8-片段化的层粘连蛋白-511涂覆基质。LN521-层粘连蛋白-521涂覆基质。Min.-分钟。具有HSA的NUTS(-)-含有人血清白蛋白的NutriStem(细胞培养基)。OPC1的“解冻和注射”配方。RT-室温。Sec.-秒。TS-TrypLE Select(细胞解离酶)。
下表1和2列出了本实例中使用的材料和设备。
表1.研究材料
材料 制造商 目录号
DMEM/F-12GlutMax Gibco 10565-018
Via-2盒 Chemometec 941-0024
DPBS(-) HyClone SH30028
DPBS(+) HyClone SH30264.02
iMatrix511-E8 nippi 892012
LN521 生物薄层 LN521-05/LN521-01
NUNC细胞工厂 赛默飞世尔科技公司 140000/165250
具有HSA的NUT(-) 生物工业公司 06-5100-01-1B
TrypLE Select Gibco 12563-011/029
表2.设备
设备 制造商
离心机5810R 艾本德公司(Eppendorf)
离心机5804 艾本德公司(Eppendorf)
8通道起盖器 赛默飞世尔科技公司
多移液管E3 艾本德公司(Eppendorf)
CryoMed 赛默飞世尔科技公司
CryoMed 赛默飞世尔科技公司
NC-200细胞计数器 Chemometec
图1呈现了OPC1 TAI收获和冷冻保存的实验程序的概述。如图所示，培养OPC1细胞直至第28至35天或第35至42天。接着，使用TS收获OPC1细胞，然后中和细胞解离酶，经由70um的细胞粗滤器过滤，以及离心并且将细胞重悬于CS10中。将OPC1TAI制剂在CS10中以100×106个活细胞/mL浓缩，并且以30×106个活细胞/300uL的浓度储存在0.5mL的小瓶中。最后，进行OPC1 TAI冷冻保存，并且最终解冻OPC1 TAI小瓶。
下表3列出了几个TAI实验的细节和目的。
表3.测试条件
21％的HSA，基于先前施用的在Isolyte S中的1％的HSA的GPOR剂量制剂
在上表3中，不包括实验TAI#9和TAI#10，因为发现2-层CF不支持OPC1扩增。
OPC1培养(阶段II)
将OPC1细胞在CF(用iMatrix511-E8直接涂覆或用LN521预涂覆)中培养7天。使用源于使用mTeSR1(TAI#3和#4)或mTeSR Plus培养基(TAI#5至13)在LN521涂覆的容器中培养的H1细胞的OPC1细胞进行最终DP体积和细胞浓度的初始鉴定，并且用GPM(+)作为培养基进行分化。TAI#11和TAI#12随后从当应用使用iMatrix511-E8补充的接种培养基而不是LN521涂覆的烧瓶的直接涂覆方法时培养的细胞确立DP制剂。
收获OPC
在第35天或第42天使用TS收获细胞。测试了三种细胞解离酶(TS)中和溶液(TAI#6和#12)以评价它们对TAI细胞质量属性和升级原材料的GMP等级的影响：GPM+(无GF)是最初确立的用于OPC培养的溶液，DMEM/F12–原样或补充有1％的HSA-和具有HSA的NUT(-)。在TAI#13和DEVOPC_测试#25研究中应用所选择的细胞解离酶(TS)中和溶液，具有HSA的NUT(-)。
OPC1 DS的过滤和离心
OPC1 TAI旨在作为单细胞悬浮液施用。获得单细胞DS要求使从收获的细胞中获得的DS经由70μm的细胞粗滤器通过。过滤后，将细胞悬浮液离心(丢弃sup)并且立即继续至DP的最终制剂。
OPC1 TAI DP制剂
将DS离心后获得的细胞小球重悬于CS10中，以生成100×106个活细胞/ml的最终DP细胞浓度。
将DP等分到小瓶中
将最终制剂后的DP立即等分到小瓶中；每小瓶30×106个活细胞/300μl-使用自动分配器和封口器/起盖器－然后继续冷冻保存。
解冻OPC1 TAI小瓶
由于需要解冻本研究过程期间生成的TAI小瓶以进行细胞分析，因此要求进行可比性测试，与使用37℃水浴的标准解冻方法相比，该测试评价了基于干浴的解冻方法，该方法使用具有用于容纳小瓶的定制加热块的MD-迷你型干浴。
QC测定
在第35天或第42天测定解冻的TAI小瓶的生物标志物表达。测定解冻细胞的核心蛋白聚糖分泌。
验收标准
纯度标志物(PDGFRα)>95.00％。杂质标志物(密蛋白6、EpCAM、CK7)<2.00％。核心蛋白聚糖分泌(第42天的细胞)≥15ng/ml。形态：小且紧凑的细胞，没有细长纺锤状形态。
回收率计算
基于100×106个活细胞/ml的目标最终DP浓度计算回收率百分比。
结果
确立用于OPC1 TAI小瓶的解冻方法。开发了OPC1 TAI以将其解冻并且直接应用在临床部位，因此需要确立用于解冻冷冻保存并且储存在气相LN2中的小瓶的稳健、便携且简单的方法。与使用37℃水浴的普通解冻方法相比，这要求进行可比性测试，该测试评价了基于干浴的解冻方法，该方法使用具有用于容纳小瓶的定制加热块的MD-迷你型干浴。使用填充有300μl的CS10的0.5ml的冷冻管模拟临床小瓶的实际体积的初步研究确立MD-迷你型干浴中的最佳解冻持续时间为2分钟，并且在37℃水浴中的最佳解冻持续时间为1分钟25秒。附加地，已确立(TAI#3/4)解冻细胞应在GPM+中温育2分钟，然后使用NC-200细胞计数器测定回收率％和存活力％。此后，用上述方法中的一种解冻所有TAI小瓶，用于R&D和QC分析。
确立OPC1 TAI DP细胞浓度和体积
将OPC1 TAI DP确立为浓度为100×106个活细胞/ml的300μl的CS10细胞悬浮液，每个小瓶总计为30×106个活细胞。下表4总结了相关研究的TAI小瓶的解冻后回收率％和存活力％值。
表4.TAI解冻后的回收率％和存活力％结果
注：由于生成期望TAI DP所需的大量细胞数量，取决于容器大小，获得两个TAI小瓶并不总是可实现的。
从用GPM(+)中和的DS获得的解冻DP TAI细胞的存活力％范围在所有测试中为88％至98％，并且这些测试中的回收率％范围为90％至117％(表6)。这种相对宽范围的回收率％归因于处理高细胞浓度与非常小的DP工作体积(通常几百μl)时的累积误差，该DP工作体积用于这些测试中的每一个以生成期望浓度的最终DP制剂。TAI#7示出了在第35天从LN521涂覆的烧瓶收获的细胞生成关于存活力％和回收率％与第42天的TAI小瓶一样好的TAI小瓶。然而，PDGFRα标志物表达值略低(表6)需要在TAI#13中证实这些结果，其中使用从LN521涂覆的1层CF收获的细胞。事实上，TAI#13结果符合所有验收标准。已经证明了在第35天从LN521涂覆的摇瓶衍生的细胞生成TAIDP的能力，TAI#11、TAI#12和DEVOPC-测试#25证明了当使用iMatrix511-E8-补充的培养基时生成TAI DP的可行性，其具有与LN521涂覆的摇瓶衍生的DP细胞一样好的回收率％和存活力％结果。TAI#6和TAI#12旨在评价用DMEM/F12(如在TAI#6中原样或在TAI#12中补充有1％的HSA)或具有HSA的NUT(-)替代酶中和溶液的可行性。
结果示出了GPM(+)和具有HSA的NUT(-)给出了高度类似的存活力％和回收率％结果。标志物表达分析还示出了具有HSA的NUT(-)与目前确立的GPM(+)酶中和溶液相当，其中所有相关标志物符合目前的验收标准(表6)。此外，显然使用DMEM/F12-原样或补充有1％的HSA，TAI#6和TAI#12中的B组-作为酶中和溶液使解冻后细胞的存活力％降低大约8％，但对回收率％没有很大影响。其中具有HSA的NUT(-)也用作TS中和溶液的DEVOPC-测试#25进一步证实了该数据。
下表5和6示出了标志物表达和核心蛋白聚糖分泌分析结果。
表5.标志物表达分析结果
注：如下文详述，测试TAI#12和TAI#13中的GFAP、CK7和β微管蛋白III标志物表达值衍生自相对少量的FACS事件：
1低活细胞数量(>2000、<5000)；
2低活细胞数量(>1000、<2000)；
3低活细胞数量(>400、<1000)
4G组：使用60μm的过滤器套件过滤细胞，并且冷冻保存在CryoMed或CoolCell中。
除TAI#7中的PDGFRα表达略低于95.00％外，包括杂质标志物的标志物表达值在所有测试中均符合其各自的验收标准(表5)。这些结果与原始RD轮次相关；因此，这种轻微降低不归因于OPC1 TAI冷冻保存方法。
尽管NG2表达在测试中似乎不同，但已确定其表达受到收获程序的高度影响，因此NG2阳性细胞的减少不一定指示OPC同一性的潜在损失，尤其已确立NG2表达在过夜培养期后完全恢复；过夜培养期后测定GMP批次的NG2表达。
表6.核心蛋白聚糖分泌测定结果
所有测试和条件下的核心蛋白聚糖分泌均符合验收标准(>20.00ng/ml，表8)。注意，与其它测试相比，TAI#6的核心蛋白聚糖分泌值在所有三种条件下相对较低，这导致假定这可以归因于细胞来源而不是测试条件的直接结果，如从应用与TAI#6相同的测试条件的TAI#12中进一步变得明显。
讨论
本研究的焦点是确立在优化的OPC分化过程阶段II中生成的OPC TAI DP的最终制剂，同时提供一种用于解冻TAI小瓶的方法。
使OPC DP参与临床研究需要配制OPC1 TAI DP，同时维持其靶活细胞浓度为100×106个细胞/ml，这允许100μl中10×106个细胞的临床剂量。因此，每个临床小瓶在300μl的CS10细胞悬浮液中含有30×106个活细胞。
用于解冻OPC1 TAI小瓶以进行临床研究的稳健并且简单的方法是允许在本研究过程期间进一步分析OPC1 TAI细胞的先决条件。因此，将使用37℃水浴的标准融化方法与使用MD-迷你型装置的37℃干浴进行比较。
用300μl的CS10填充的0.5ml的NUNC小瓶模拟临床TAI小瓶，确立使用MD-迷你型干浴解冻为2分钟程序，其示出等同于在37℃水浴中1分钟25秒的解冻程序(在解冻时间结束时小瓶具有可见的冰碎片)。随后，本研究中的所有TAI小瓶在MD-迷你型干浴中解冻。附加地，将解冻细胞在NC-200分析所需的稀释液中的温育时间确立为在GPM(+)中在室温下2分钟。
在OPC分化过程阶段I中，使用具有mTeSR1的LN521涂覆的容器进行细胞分化和培养，并且按照OPC分化过程阶段II将GPM(+)作为培养基，对OPC TAI DP确立了初步鉴定(测试TAI#3和TAI#4，表3)。这些证明了在新优化的OPC分化过程阶段II中生成符合所有验收标准，包括标志物表达和效力(核心蛋白聚糖分泌)的TAI细胞的可行性，从而为进一步的过程按比例扩大铺平了道路。
TAI#6和TAI#12的目的是证明使用细胞解离酶中和溶液的可行性，该中和溶液不仅维持OPC1 TAI DP质量属性，而且允许在收获日消除非临床级和动物衍生的培养基组分(B27和T3补充剂)(表3)。比较3种溶液类型，已经示出了使用具有HSA的NUT(-)与用于中和细胞解离酶的标准GPM(+)一样好，其细胞质量属性符合所有验收标准(表4和5)，并且存活力％和回收率％结果与使用GPM(+)用于该目的时获得的结果一样好(表4)。
评价制造从源自第14天ICB培养物并且在第42天收获的OPC细胞生成OPC1 TAIDP的可行性是TAI#11的目的。结果示出了细胞质量属性与从在第42天收获的正在进行的培养物中获得的细胞的质量属性相当(表4和5)。
还进行了评价使用在第35天收获的细胞配制的TAI DP并将其质量属性与使用在第42天收获的细胞配制的OPC1 TAI DP的质量属性进行比较的测试。TAI#7和TAI#13的结果示出了这些细胞符合所有验收标准(尽管与其源培养物相比，TAI#7表现出稍低的PDGFRα标志物表达)。此外，在TAI#13中第35天生成的TAI DP不仅证实了在第35天从细胞工厂容器获得的细胞的质量，而且证实了在收获期间使用NUT(-)HSA作为细胞解离酶中和溶液的益处。
最后，测试DEVOPC_测试#25证明了按比例扩大OPC分化过程阶段II作为完全完整过程的稳健性和可重复性，因为该测试涵盖应用使用iMatrix511-E8的直接涂覆方法的CF中的细胞扩增过程，以及使用60μm的过滤器套件的优化的按比例扩大的过滤程序和使用CryoMed的OPC1 TAI DP冷冻保存过程。在CryoMed中冷冻保存的60μm过滤细胞生成的OPC1TAI的标志物表达和核心蛋白聚糖分泌值符合验收标准。
总之，本研究中呈现的数据支持并确立了OPC1 TAI DP为100×106个活细胞/mlCS10的细胞悬浮液，最终体积为300μl/0.5ml的NUNC小瓶。此外，本研究证实了OPC的按比例扩大的制造过程从使用iMatrix511-E8补充的培养基在直接涂覆的1层CF中培养的细胞中生成OPC1 TAI DP的能力，其在第35天或第42天用TS和作为TS中和剂的具有HSA的NUT(-)收获，并且在CryoMed中冷冻保存之前经由60μm的过滤器套件过滤。在该优化的按比例扩大的制造过程中获得的细胞符合OPC1验收标准，并且证明了OPC1 TAI的功能性生物活性。
将OPC TAI确立为在CS10中100×106个活细胞/ml的悬浮液；在0.5ml小瓶中，TAI小瓶含有30×106个活细胞/300μl。在37℃的MD-迷你型干浴中解冻OPC TAI小瓶2分钟与在37℃水浴中解冻一样好并且一样稳健。从使用iMatrix511-E8补充培养基在直接涂覆的1层CF中培养的细胞生成的OPC1 TAI DP与从在LN521预涂覆的容器中培养的细胞获得的OPC1TAI DP一样好。在OPC分化过程阶段II的第35天收获细胞以生成TAI DP在上述过程条件下是可行的。具有HSA的NUT(-)作为细胞解离酶中和溶液以在第35天或第42天从收获的细胞生成OPC1 TAI DP与GPM(+)一样好。示出了第14天ICB生成OPC1 TAI DP，显示与从正在进行的细胞培养物获得的DP相当的质量属性。使用60μm的过滤器套件在优化的按比例扩大的生产过程中制造的并且在CryoMed中冷冻保存的OPC1 TAI DP符合所有验收标准并且表现出功能性生物活性。
实例2：一次性施用OPC1治疗亚急性脊髓损伤(SCI)
本实例的目的是呈现在开发OPC1(也称为LTCOPC1)CMC程序期间生成的科学数据。提供的信息包括LCTOPC1的开发计划、关于基于改进制造过程的R&D轮次的初步可比性结果、GPOR和LCT R&D制造材料之间的可比性、新提出的效力测定的引入、基于GPOR体内数据的OPC1安全性状态的审查和使用改进的分析方法对GPOR批次的再分析。
LCTOPC1(OPC1)，先前称为GRNOPC1和AST-OPC1，是衍生自H1 hESC系的少突胶质细胞祖细胞群，其旨在用于一次性施用治疗亚急性脊髓损伤(SCI)。在临床前研究中已经示出OPC1产生神经营养因子、在脊髓实质中迁移、刺激血管形成并且诱导裸露轴突的髓鞘再生，所有这些都是少突胶质细胞祖细胞的基本功能，并且对于轴突的存活、再生长和功能是重要的。
LCTOPC1的临床评价于2010年开始。第一个临床试验是1期安全性研究(NCT01217008)，其中将低剂量的2×106OPC1细胞注射到患有亚急性、神经完全性胸椎T3至T11损伤的受试者的病变部位。从2010年10月到2011年11月，计划8名受试者中的5名受试者接受OPC1，作为初始1期CP35A007安全性研究的一部分。在2011年11月暂停入组本试验。
2014年，开始了一项1/2a期研究(NCT02302157)，对亚急性感觉运动完全(美国脊柱损伤协会损伤量表A(ASIA损伤量表A))、单一神经水平(SNL)的从C5至C7颈脊髓损伤的受试者进行OPC1剂量的升级，随后如果上肢运动评分(UEMS)≥1，则将研究扩展到C4神经水平损伤(NLI)的患者，并且将给药窗口从脊髓损伤后14至30天变更为21至42天。本研究共入组了5个队列中的25名受试者，并且在专门的外科手术期间接受了单次施用的OPC1细胞，该OPC1细胞使用注射器定位装置通过实质内注射递送至脊髓损伤部位。研究入组于2017年12月完成。
2018年11月，FDA提出了一项随机、对照、单盲2期研究，并且代理人未反对在拟定2期临床研究中使用OPC1药物产品批次M26D1A。
简单地说，新的主细胞库(MCB)的来源是H1库批次号MCBH101。MCBH101于2009年由杰龙公司(杰龙；加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA))直接根据H1原始细胞库(OCB)制造的。新MCB直接源自H1库-批次号MCBH101。它是在无饲养细胞条件下使用明确定义的原料、新的培养系统和收获程序制造的，并且通过hESC定制的冷冻保存过程冷冻保存。另外，优化了用于评估H1 hESC多能性的方法。新WCB源自新MCB，并且在组织培养中扩增4代，同时维持hESC特征，并且然后冷冻保存。用于LCTOPC1制造的起始材料由WCB提供。根据预定义的释放标准释放新的主细胞库和工作细胞库，并且使用经批准的测试实验室根据经批准的研究方案、通常流行的工业标准(ICH Q5A(R1)、Q5D)和当前制造规范(“规则”)和适用于正在进行的研究的不时修订的法律测试外来因子。
OPC1是在1期和1/2a期脊柱损伤临床研究中使用杰龙生产的在2008年至2011年制造的OPC1临床批次进行研究的研究用药物。杰龙的制造过程(GPOR)最初在21世纪早期开发。当时，明确定义的和细胞治疗级试剂和材料不能广泛获得。因此，GPOR制造过程的阶段1包括H1胚胎细胞在基质胶TM、动物衍生的细胞外基质(ECM)、胶原酶上的增殖，以及手工刮擦培养皿表面以收获、传代和扩增H1胚胎干细胞。
此外，GPOR制造过程是基于在细胞聚集体中发生的分化过程，该过程直接从呈胚状体形式(第0天至第26天，图2)的多能H1细胞开始，其对自发分化具有强敏感性。从第27天开始，在基质胶TM涂覆的粘附表面上完成分化，用于少突胶质细胞祖细胞扩增和成熟。GPOR制造过程因此具有低产率，并且由纯度/杂质/非靶标细胞群标志物限定的关键质量属性表现出有限的再现性。附加地，最终冷冻保存的产品需要在解冻、洗涤和制剂制备后施用。
根据本公开的改进的制造过程的发展是更受控的H1向OPC的定向分化，其由生长因子和小分子的特定序列引导以进行抑制，或在可能时使用细胞治疗级材料的定向分化通路(如图3中详述的)。此外，该新过程将杰龙所使用的长聚集期从多能细胞状态，期易于自发异常分化，的26天直接减少到H1细胞单层定向分化成神经外胚层的14天后的7天，降低了聚集期自发分化的可能性。GPOR对LCTOPC1分化过程总结于图2中。在图4中描述了改善的分化过程的诱导和抑制因子的信号传导序列的生物学原理。附加地，添加了新的过程中控制(IPC)，以更好地监测和表征分化过程，如图4中详述的。
最后，将产品作为现成即可注射的，本文称为“解冻和注射(TAI)”OPC1制剂冷冻保存。用于制造OPC1细胞的材料(原始GPOR和经改善的过程两者)汇总于下表7中。
表7.OPC单元(GPOR和LCTOPC1过程)生产期间使用的材料。
阶段I-H1扩增
将多能H1细胞解冻并且在层粘连蛋白涂覆的容器上在mTeSR Plus培养基中培养12至15天。使用非酶促试剂ReLeSR传代和扩增细胞。在扩增期间，对细胞进行形态评估，并且在3代结束时(在分化过程开始之前)，通过基于流式细胞术的方法评价hESC多能性。
阶段II-H1分化成OPC1
从分化的第0天直至过程结束，将细胞在神经胶质祖细胞培养基(GPM)中培养，该培养基是补充有B27和T3的DMEM/F-12。
第0至7天-在第0天，当H1培养物达到由乳酸盐浓度和细胞形态定义的所需标准时，通过如下改变在层粘连蛋白涂覆的容器上培养的扩增的多能hESC的培养基来开始分化过程。在第0至3天，GPM培养基补充有视黄酸(RA)、多索吗啡和PD0325901，以便将分化过程导向神经外胚层通路(Kudoh,Wilson等人，2002)。多索吗啡抑制骨形态发生蛋白(BMP)信号传导(SMAD通路)，并且因此抑制中胚层和滋养层分化(Li和Parast，2014)。PD0325901抑制MEK1和MEK2处的下游bFGF信号传导，并且抑制多能性和内胚层分化(Sui,Bouwens等人，2013)。总之，除了活化RA信号传导通路外，抑制多能性、内胚层、中胚层和滋养层形成促进神经管(神经外胚层)形成(Watabe和Miyazono，2009；Sui,Bouwens等人，2013；Li和Parast，2014；Patthey和Gunhaga，2014；Janesick,Wu等人，2015)。在第4至7天，向培养物中补充视黄酸和抗坏血酸以继续神经外胚层分化诱导(Duester，2008)。
第7至14天-在第7天，使用TrypLE Select酶促收获细胞，并且然后从第7天至第14天作为单层培养物接种在层粘连蛋白涂覆的容器上，并且在补充有rhEGF、hsFGF和ROCK抑制剂(ROCK抑制剂仅用于前48小时)的GPM中培养(Hu,Du等人，2009；Patthey和Gunhaga，2014；Zheng,Li等人，2018)。
第14至21天-在第14天，为了促进神经体(NB)聚集体形成，使用TrypLE Select酶促收获细胞，并且在补充有ROCK抑制剂(用于前48小时)和始终补充有rhEGF和hs-rhFGF的GPM中作为动态悬浮培养物培养一周。
第21至42天-在第21天，将聚集体作为贴壁培养物，在补充有rhEGF和PDGF的GPM中重新铺板在层粘连蛋白涂覆的容器上(Ota和Ito，2006；Koch,Lehal等人，2013)，并且然后在第28天，使用TrypLE Select酶促收获细胞，并且作为贴壁培养物在补充有rhEGF和PDGF的GPM中的层粘连蛋白涂覆的容器上扩增，直至第35至42天用于最终扩增和成熟，其中每约7天使用TrypLE Select进行酶促传代。
在扩增过程结束时，使用TrypLE Select收获OPC1细胞，并且在10(CS10；BioLife Solutions公司)冷冻保存溶液中冷冻保存为解冻和注射(TAI)制剂。LCTOPC1生产过程流程描绘于图4中。
过程中控制测试在hESC向OPC1的分化过程期间的每个关键步骤进行，如图4所描绘的。使用多色流式细胞术(FCM)和qPCR方法(分别地)评估生物标志物蛋白和mRNA表达。测试细胞的OPC1、上皮、中胚层、星形胶质细胞和神经元生物标志物以及残余hESC的表达。另外，在该过程期间评估存活力、细胞产量和代谢活性(例如，乳酸盐)。乳酸盐浓度用作在第0天起开始分化的指示剂，并且在第21天用作细胞计数的替代物，以确定用于前OPC生成和扩增的聚集体铺板所需的表面积。
作为解冻和注射制剂的LCTOPC1 DP的冷冻保存
改进的LCTOPC1药物产品(DP)被开发为解冻和注射(TAI)制剂，其在注射到脊髓中之前被解冻并且立即装载到递送装置中。这种改进显着地降低了与临床部位的附加操控相关联的风险，诸如在施用前洗涤和重悬最终制剂，并且增加了对产品一致性、安全性和质量的控制。
TAI DP制剂的开发包括使用10(CS10)作为冷冻保存培养基，用于生成靶向100×106个存活细胞/mL的临床剂量，最终体积为300μL细胞悬浮液/小瓶，并且集中于：评价最佳细胞解离酶中和溶液，并且在冷冻保存前添加过滤步骤；在CS10中确立靶向100×106个存活细胞/mL的OPC1 TAI制剂，最终体积为300μL细胞悬浮液/小瓶；确立含有300μL的OPC1 TAI小瓶的解冻程序；并且确认优化的按比例扩大的OPC1改进的制造过程生成符合所有验收标准的OPC1 TAI。
开发研究支持并确立LCT OPC1 TAI DP为靶向100×106个存活细胞/mL CS10的细胞悬浮液，在0.5mL的NUNC小瓶中的最终体积为300μL。此外，这些研究证明了LCT OPC1的按比例扩大的制造过程生成OPC1 TAI DP的能力，用TrypLE Select收获，并且具有HSA的NUT(-)作为TrypLE Select中和剂，并且在CryoMed受控速率冷冻器中冷冻保存之前经由60μm的过滤器套件过滤。在该优化和按比例扩大的制造过程中获得的细胞示出了可接受的质量属性、存活力和回收率，以及功能性生物活性。
材料控制
辅助材料的控制。基于过程开发研究和个体鉴定要求、基于风险水平评估(USP NF<1043>)和材料对产品和/或过程质量的关键性，考虑用于制造LCTOPC1的每种辅助材料。通过风险评估程序确定风险水平(RL)，以评价制造商的质量体系、安全风险(材料来源和制造过程相关风险)和材料等级(质量标准)。通过评估材料对生产程序和/或产品质量的影响来确定对过程/产品的关键性。
非细胞杂质。基于在制造最终DP制剂和DP剂量之前完成的程序计算LCTOPC1 DP中潜在的非细胞杂质的估计量。基于非细胞杂质水平、材料生物安全性和药理学风险的理论计算进行风险评估。基于风险评估结果，实施了进一步的缓解措施，诸如用于检测和测量特定的非细胞杂质的DP的分析测试、DP的材料移除/减少，以及根据需要延长生物安全性测试。
拟定CMC可比性测试
OPC1根据改进的过程在GMP设施中制造，根据修订后的释放参数释放，并且在开发的TAI制剂中冷冻保存。将LCTOPC1 DP与杰龙制造的代表性批次进行比较，并且使用更新的分析方法进行表征，该分析方法用于经由新过程制造的OPC1的释放。该计划包括测试用作GPOR释放标准的属性以及鉴定的附加标志物。赞助者建议基于表8中描述的表征药物产品的质量属性进行比较。
LCTOPC1和GPOR OPC1批次之间的并列比较是基于统计分析，计算GPOR OPC1批次质量属性的定量测量的预期范围。在LCTOPC1批次中测量的那些质量属性的值是相对于测试的质量属性的那些预期范围进行评估的。可比性数据分析预期确立LCTOPC1过程的可重复释放标准并且证明LCTOPC1具有低的批次间可变性。
测试的质量属性包括3至4个代表性GPOR和LCT OPC1批次各自的存活力、同一性/纯度、杂质群和功能/效力测定。
所建议的可比性质量属性如下：存活力-任何活细胞药物产品的关键质量属性；同一性/纯度-特征性少突胶质细胞祖细胞蛋白标志物的评估：NG2、PDGFRα和PDGRFβ；非靶标细胞群/杂质；以及体外细胞功能/效力。
关于非靶标细胞杂质群。起始材料中残留的H1 hESC-人胚胎干细胞蛋白标志物TRA-1-60和Oct-4，在多色流式细胞术测试中结合作为致畸剂的潜在来源。TRA-1-60和Oct-4是通常已知的并且用于胚胎干细胞的标志物，并且先前用作OPC1释放标准。评估潜在的异常分化通路。上皮细胞蛋白标志物：角蛋白7、密蛋白-6、EpCAM和CD49f是已知的上皮标志物。中胚层细胞蛋白标志物CXCR4和CD56作为已知的中胚层和软骨标志物。星形胶质细胞蛋白标记物GFAP作为已知的星形胶质细胞标志物。诱导上皮-间充质转化的间充质细胞mRNAOLR1。FOXA2、SOX17的内胚层细胞mRNA标志物作为已知的内胚层标志物。目前不计划包括先前使用的巢蛋白和α-辅肌动蛋白属性，因为新数据指示巢蛋白对于OPC不是特异性的，而是NSC和其它细胞类型的标志物(参见网站ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5948302/)并且α-辅肌动蛋白可以被CXCR4/CD56的组合有效替代。CXCR4在定形内胚层和中胚层中表达：参见网站pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16258519/和网站pnas.org/content/107/31/13742。
关于体外细胞功能/效力。核心蛋白聚糖分泌-小的分泌的细胞基质蛋白聚糖，作为OPC1的效力指示剂。中枢神经系统中神经元和星形胶质细胞表达的核心蛋白聚糖减弱瘢痕组织形成、抑制空化并且促进伤口愈合。OPC1细胞迁移响应于血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)，这对于损伤部位的细胞运动性是重要的，以确保脊柱中单个注射部位的最广泛的解剖学覆盖。开发用于评估OPC1的成熟和髓鞘化潜力的新效力测试。该测定基于OPC1细胞的基本功能-裸露轴突的髓鞘再生。在该测定中，将OPC1细胞解冻并且铺板在3D组织培养环境(例如基质胶或纳米纤维管)中的特定培养基中，该培养基应诱导OPC1成熟为少突胶质细胞(OL)。3D环境纳米管模拟裸露轴突以在简单的体外环境中诱导OPC1细胞的髓鞘化活性。该测定通过免疫细胞化学、流式细胞术和qPCR测量与OL功能和成熟状态相关联的蛋白质诸如MBP、O4、MAG、MOG、PLP、CNpase的表达。
用于检验GPOR OPC1和LCTOPC1的拟定测试面板以及用于LCTOPC1的拟定释放标准可以在下表8中看到。
表8.拟定测试面板和原理用于过程开发、释放和可比性。
来自代表性轮次的R&D LCTOPC1批次的初步可比性在下表9至13中呈现。
表9.来自代表性GPOR OPC1和LCTOPC1 R&D轮次的可比性数据-通过流式细胞术的OPC1同一性分布
*MG-在FCM分析之前将细胞接种在基质胶上过夜。GPOR OPC1制剂和冷冻降低NG-2和PDGFR-α表达。这些数据如前所示并且现在将基质胶过夜培养。
1临床批次
表10.来自代表性GPOR和LCTOPC1 R&D轮次的可比性数据-通过流式细胞术的非靶标/杂质细胞群分布
1临床批次
表11.代表性GPOR OPC1和LCTOPC1 R&D轮次的可比性数据-通过流式细胞术的hESC残留物
1临床批次
表12.来自代表性GPOR OPC1和LCTOPC1 R&D轮次的可比性数据-通过qPCR的非靶标/杂质细胞群基因分布(相对于GPOR OPC1 M08)
*ND-未检测到
1临床批次
表13.来自代表性GPOR OPC1和LCT OPC1 R&D轮次的可比性数据-通过核心蛋白聚糖分泌和迁移测定确定的体外功能
1临床批次
作为OPC1药物产品释放标准的异位组织形成评估综述
OPC1设置历史方式以解决异位组织(囊肿)形成风险。作为初始OPC1 IND提交的一部分进行和提供的毒性研究揭示了在接受某些OPC1批次的动物中形成囊性结构和颗粒增生(AGS)的异位组织。大量批次间差异以及FDA担心拟定释放标准不足以预测预期临床批次的安全性，导致FDA要求对每个预期临床批次进行9个月的毒理学研究作为释放要求。体外囊肿测定作为用于筛选OPC1批次的研究工具呈现。该假说表明可以容易地鉴定具有强体外形成囊肿倾向的批次，并且所有体外囊肿阳性批次将示出体内囊肿形成。附加地，表明采取了一些步骤，通过更一致的染色和体外囊肿大小的评价作为体内囊肿形成的预测因子来改进囊肿的鉴定，从而改善该测定。对体外囊肿测定进行的进一步工作揭示了以下结论：尽管进行了几年的开发努力，但囊肿测定不符合QC释放方法的基本要求；体外囊肿形成和体内囊肿频率之间不存在线性相关或准确预测。
基于GPOR数据和可比性测试的初步结果、通过/未通过GPOR批次与新的/开发的标 志物之间的相关性，审查OPC1安全性状态。我们持续致力于OPC1制造过程的改进，包括OPC1产品的新过程中控制、释放和效力测试。过程改进的原理和制造材料的可比性计划在本实例的前面部分中呈现。作为开发工作的一部分，我们使用基于新开发方法的改进产品表征面板对相关GPOR OPC1 GMP批次进行了全面分析和重新测试。该分析揭示了来自杰龙GMP批次的GLP毒理研究的可用数据与纯度和杂质/非靶标细胞群特异性标志物的表达水平之间的某些相关性。重新测试的结果和分析示出了体内杂质和批次失效之间的相关性，指示LCTOPC1的特征在于显著较低的杂质水平和高纯度分布，其具有比GPOR OPC1显著降低的体内囊肿形成的可能性。
总结
代表性GPOR和LCTOPC1批次的初步可比性数据证明如下：GPOR OPC1和R&DLCTOPC1证明了类似的OPC1同一性/纯度分布谱，除了PDGFR-α生物标志物，其在R&D LCTOPC1中更高并且可以由改进的OPC1制造过程(定向分化)产生；与GPOR OPC1相比，R&D LCTOPC1具有较低水平的来自上皮、星形胶质细胞和神经元非靶标细胞的杂质；LCTOPC1和GPOR OPC1均具有极少可检测的残留hESC(通过％TRA-1-60+/Oct4+检测)，然而，GPOR OPC1与LCTOPC1相比具有较高百分比的多能细胞，如通过展示TRA-1-60+/Oct4-和CD49f+的细胞群所证明；与GPOR OPC1相比，LCTOPC1具有较低水平的内胚层和间充质非靶标细胞基因表达；LCTOPC1和GPOR OPC1证明类似的核心蛋白聚糖分泌和迁移能力。
结论。迄今为止积累的数据示出用改进的过程制造的LCTOPC1药物产品，通过高度可重复和严格控制的分化过程从定义的细胞库系统生成并且用更新的分析方法监测，呈现与GPOR OPC1类似的基本质量属性，但总体上受益于纯度标志物的较高表达和杂质/非靶标群体标志物的较低表达。因此，潜在地增加了LCTOPC1药物产品的安全性分布。
实例3：概念验证研究
本研究的目的是提供OPC1髓鞘化和成熟概念验证研究的实验数据。
LCT OPC1细胞在96视觉板中的基质胶(MG)1：30上在如表14中所列的不同培养基组分中培养。每种培养条件构成一个“系统”。前5至6天在GPM/E中培养细胞，然后对于成熟系统，根据表14中列出的步骤更换培养基。系统#2示出了少突胶质细胞样细胞的形态变化，并且通过免疫染色显示MBP表达。
表14.研究设计
图6至9示出了不同系统的OPC形态。图6示出了对照系统#1，第10天(时间＝0，第7天)的GPM/E。对于DCN ELISA效力测定，OPC形态是典型的。图7示出了处理后第3天的系统#2，50％的GPM/E和50％的N2.1(没有IBMX)的OPC形态。与对照相比，细胞示出了形态变化。图8示出了第12天的对照系统#1和DCN ELISA效力测定的典型OPC形态。图9示出了处理后第5天的系统#2，100％的N2.1(用IBMX处理2天)。细胞示出形态变化。
图10示出了第13天Hoechst和MBP的共焦免疫染色(固定细胞)。GPM/E中的控制系统#1在左侧示出，并且具有100％的N2.1的系统#2在右侧示出。
实例4：OPC分化方案
表15：为达到期望的最终浓度，每ml的GPM添加的储备溶液体积
本实例的目的是证明用于将hESC分化成OPC的GMP条件的确立。
第0天-培养评价。第0天IPC：在初始阶段II之前，执行hESC集落评价。仅当符合以下标准时才能开始分化：在培养物中的汇合度为≥95％；培养物中的分化％为<5％；紧密堆积集落的％为>50％；并且培养基中的乳酸盐浓度为>17.40mM。
培养基替换，第0至6天：应每24小时±4小时替换一次培养基。在第0天和第4天，使用5x和10x放大率观察并且对培养物拍照。在第3天和第4天测量乳酸盐。根据表15解冻小分子并且温热所需的GPM体积。根据表15将GF体积添加到温热的GPM。替换培养基。从第4天开始，根据表15更换GF。
收获，第7天：如果适用，在收获前一天至一周确定并且用10μg/ml rh LN521涂覆所需数量的烧瓶。使用5x和10x物镜观察并且对培养物拍照。测量乳酸盐水平。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存在-80℃下。根据表15解冻GF并且温热所需的GPM体积(用于GPM+GF和GPM w/o GF的最终溶液)。根据表15将GF体积添加至温热的GPM。
收获方案：抽吸培养基。向每个T25烧瓶中添加3ml的PBS(-)。将烧瓶倾斜2至3次并且在室温下温育1分钟。使用计时器。抽吸并且添加1ml/T25 TrypLE Select。注：打开一瓶新TS。在37℃和5％的CO2下温育6分钟。使用计时器。在一侧非常用力地拍打烧瓶，倾斜烧瓶以洗涤细胞，并且在烧瓶的另一侧非常用力地拍打。添加5ml的GPM w/o GF。将培养基直接添加到细胞上，轻轻洗涤表面1至2次。将细胞收集到锥形管中。添加5ml/T25 GPM w/o GF并且轻轻冲洗2至3次。收集细胞。离心机：200g，5分钟，室温。使用计时器。任选：在淬灭后使用2.5x物镜拍摄每个处理的烧瓶的图像，以记录剩余细胞的％。抽吸上清液，用力拍打沉淀并且使用5ml移液管将每T25烧瓶收获的5ml GPM+GFS轻轻重悬。小心不要超过移液管。
细胞计数方案：制备两个标记的艾本德管(Eppendorf tube)并且将约100μl的细胞悬浮液转移到每个单独的艾本德管中。对于x5稀释：制备两个具有200μl的GPM+GF的附加艾本德管，并且将第0部分制备的50μl的细胞悬浮液转移到每个含有培养基的管中，至最终体积为250μl。充分混合。使用NC-200细胞计数器计数每个稀释的艾本德管。
细胞接种方案：根据表16，计算接种所需的培养基体积和细胞数(密度为2.67×104个活细胞/cm2)。
表16：接种细胞的体积和#
烧瓶 活细胞#/烧瓶 总体积/烧瓶
T225 6×106 90ml
如果适用，从冰箱中取出LN521涂覆的烧瓶。对于LN521涂覆的烧瓶：向每个T225LN521涂覆的烧瓶中添加6ml的GPM+GF。将烧瓶在室温下温育1分钟。使用计时器。从烧瓶中抽吸涂覆溶液和GPM+GF培养基。用24ml的PBS(+)/T225洗涤。将计算的GPM+GF添加到烧瓶中。轻轻吸移以混合细胞悬浮液，并且以计算的细胞体积接种。将容器转移到培养箱中，轻轻搅拌容器，使细胞均匀分布在容器表面。IPC第7天：冷冻保存样品细胞。
培养基替换，第9至13天：在以下天中：9、11和13，观察培养物，使用2.5x、5x和10x物镜拍照并且测量乳酸盐。根据表15解冻GF。确定所需的GPM体积，并且在37℃水浴中温热。根据表15向GPM添加GF。抽吸培养基并且向每个T225烧瓶中添加90ml的GPM+GF培养基。
收获，第14天：PBS-轮制备：在第13天，用70ml的GPM培养基标记并且预加载PBS-轮，倾斜PBS并且洗涤轮壁。在37℃和5％的CO2的潮湿CO2培养箱中以35RPM温育过夜。在第14天，观察培养物，使用2.5x、5x和10x物镜拍照。测量乳酸盐。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存在-80℃下。根据表15解冻GF并且温热所需的GPM体积(用于GPM+GF和GPMw/o GF的最终溶液)。根据表15将GF体积添加至温热的GPM。
收获：抽吸培养基。向每个T225烧瓶中添加24ml的PBS(-)。将烧瓶倾斜2至3次并且在室温下温育1分钟。抽吸并且添加9ml/T225 TrypLE Select。在37℃和5％的CO2下温育8分钟。在一侧用力地拍打烧瓶，倾斜烧瓶以洗涤细胞，并且在烧瓶的另一侧用力地拍打。添加18ml的GPM w/o GF。将培养基直接添加到细胞上。将细胞收集到锥形管中。添加18ml/T225 GPM w/o GF并且轻轻冲洗2至3次。收集细胞。离心机：170至180g，5分钟，室温。任选：在淬灭后使用2.5x物镜拍摄每个处理的烧瓶的图像，以记录剩余细胞的％。抽吸上清液，用力地拍打沉淀并且用每T225烧瓶收获的30ml(首先用5ml移液管重悬5ml，并且然后添加25ml)GPM+GFS重悬。小心不要超过移液管。
细胞计数：制备两个标记的艾本德管并且将约100μl的细胞悬浮液转移到每个单独的艾本德管中。对于X4稀释：制备两个具有150μl的GPM+GF的附加艾本德管，并且将50μl的细胞悬浮液转移到每个含有培养基的管中，至最终体积为200μl。充分混合。使用NC-200细胞计数器计数每个稀释的艾本德管。
细胞接种：根据表17，计算接种所需的培养基体积和细胞数(128×106个活细胞/0.1PBS轮)。
表17：接种细胞的体积和#
容器 活细胞#/轮 总体积/轮
0.1PBS轮 128×106 70ml
从轮中抽吸预装载的培养基。将计算的GPM+GF添加到烧瓶中。轻轻吸移以混合细胞悬浮液，并且以计算的细胞体积接种。将PBS轮容器置于37℃和5％的潮湿CO2培养箱中的PBSmini上。将PBSmini速度设置为35RPM，持续24小时±4。IPC第14天：冷冻保存细胞。
第15天：将PBSmini速度增加至45RPM。打开PBSmini的灯并且仔细检查在PBS-轮仍旋转时没有看到凝块。只有当观察到凝块时，才迅速将其移除以避免沉积。如果不需要，请勿从PBSmini中移除PBS-轮。
培养基替换：第16、18、20天：在以下天中：16、18和20，观察培养物，使用2.5x和5x物镜拍照并且测量乳酸盐。根据表15解冻GF。确定所需的GPM体积，并且在37℃水浴中温热。根据表15向GPM添加GF。从PBSmini中移除PBS-轮，并且将其置于培养箱中的架子上，每天持续所指示的沉降时间，如表18。
表18：每天沉降时间
天 16 18 20
时间(分钟) 10 5 5
检查培养基替换前的沉降物。如果聚集体没有沉降，另外增加5分钟沉降时间附。使用10ml移液管，移除PBS-轮中体积的80％(56ml)，保留其用于乳酸盐测量。向PBS-轮的侧面添加56ml(与上面部分中去除的GPM+GF的体积相同)。检查PBS-轮是否形成凝块，如果观察到凝块，则将其去除，因为凝块的检查和去除对于该过程至关重要。在37℃和5％的CO2、45RPM的潮湿CO2培养箱中，将PBS-轮返回至PBSmini。测量乳酸盐。
展平聚集体，第21天：在收获前一天至一周确定并且用适当的涂覆溶液(10μg/mlrhLN521或iMatrix-511-E8)涂覆的T75/T150烧瓶的数量。为了确定接种容器，在培养基更换后大约24小时测量乳酸盐。如果乳酸盐浓度为≤15.00mM，则将聚集体接种在一个T75中。否则，将聚集体接种在一个T150中。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存-80℃下。观察培养物并且对聚集体拍照。根据表15解冻GF并且温热所需的GPM体积(用于GPM+GF的最终溶液)。根据表15将GF体积添加至温热的GPM。
制备用于接种的涂覆容器：从冰箱中取出经涂覆的烧瓶。标记每个烧瓶。向每个T75/T150涂覆的烧瓶中添加2/4ml的GPM+GF。将烧瓶在室温下温育1分钟。使用计时器。从烧瓶中抽吸涂覆溶液和GPM+GF培养基。仅对于LN521涂覆的烧瓶-每个T75/T150涂覆的容器用10/20ml PBS(+)洗涤。向T75/T150中添加20/40ml GPM+GF。将容器转移到37℃和5％的CO2的潮湿CO2培养箱中，直至铺板。使用25ml移液管将35ml的PBS-轮内容物转移到50ml锥形管中。使聚集体沉降4分钟。使用25ml移液管手动抽吸并且移除30ml的GPM至单独的50ml管中。重复步骤(25ml移液管将35ml的PBS-轮内容物转移到50ml锥形管中，使聚集体沉降4分钟)，以将剩余的聚集体从PBS-轮转移到标记为“接种聚集体”的相同50ml锥形管中。在聚集体沉降期间，使用2ml的移液管收集留在PBS-轮中的剩余聚集体并且缓慢转移到“接种聚集体”管的底部。当聚集体沉降在50ml管中时，将20ml的GPM+GF添加到PBS-轮中。重复步骤(25ml移液管将35ml的PBS-轮内容物转移到50ml锥形管中，使聚集体沉降4分钟，将剩余的聚集体从PBS-轮转移到标记为“接种聚集体”的相同50ml锥形管中，在聚集体沉降期间，使用2ml的移液管收集留在PBS-轮中的剩余聚集体并且缓慢转移到“接种聚集体”管的底部，当聚集体沉降在50ml管中时，将20ml的GPM+GF添加到PBS-轮中)。将来自PBS-轮的洗液收集到50ml管中。倾斜PBS-轮，并且用2ml移液管从PBS-轮收集剩余的培养基。离心50ml锥形管：140G，3分钟，室温。将准备好的容器转移到BSC中。验证烧瓶上表面是否清晰。如果需要，在接种前用培养基洗涤表面。轻轻抽吸上清液。使用25ml移液管，用5/10ml的GPM+GF/接种的T75/T150重悬沉淀(重悬前不要拍打)。测量悬浮液体积。将总体积快速接种到指定容器中(保持烧瓶垂直以避免聚集体非均匀地附着)。使用25ml移液管用额外体积洗涤管(分别完成每75/150cm2接种30/60ml)并且添加到容器中。在37℃和5％的CO2的潮湿培养箱中温育烧瓶。在培养箱中确保聚集体均匀分布在烧瓶中。
培养基更换第23、25、27天：在以下天中：23、25和27，观察培养物，使用5x和10x物镜拍照并且测量乳酸盐。根据表15解冻GF。确定所需的GPM体积，并且在37℃水浴中温热。根据表15向GPM添加GF。抽吸培养基并且向每个T75/T150烧瓶中添加30/60ml的GPM+GF培养基。
第28天：如果适用，在收获前一天至一周确定并且用10μg/ml rhLN521涂覆所需数量的烧瓶。使用5x和10x物镜观察并且对培养物拍照。测量乳酸盐水平。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存在-80℃下。根据表15解冻GF并且温热所需的GPM体积(用于GPM+GF和GPM w/o GF的最终溶液)。根据表15将GF体积添加到温热的GPM。收获：抽吸培养基。向每个T75/T150烧瓶中添加8/16ml PBS(-)。将烧瓶倾斜2至3次并且在室温下温育1分钟。抽吸并且每T75/T150 TrypLE Select添加3/6ml。在37℃和5％的CO2下温育7分钟。在一侧轻轻拍打烧瓶，倾斜烧瓶以洗涤细胞，并且在烧瓶的另一侧轻轻拍打。使用25ml移液管在细胞表面轻轻添加6/12ml的GPM w/o GF。将细胞收集到锥形管中。不要洗涤细胞表面。离心机：260至270g，10分钟，室温。抽吸上清液，轻轻拍打沉淀，直至沉淀从管中分离，并且用每T75/T150烧瓶收获的15/30ml的GPM+GFS重悬。首先，用25ml移液管重悬5ml，上下移液2至3次，并且然后使用25ml移液管添加剩余体积。小心不要超过移液管。
细胞计数：制备两个标记的艾本德管并且将约150μl的细胞悬浮液转移到每个单独的艾本德管中，避免转移用于计数样品的聚集体。对于X2稀释：制备两个具有100μl的GPM+GF的附加艾本德管，并且将100μl的细胞悬浮液转移到每个含有培养基的管中，至最终体积为200μl。充分混合。使用NC-200细胞计数器计数每个稀释的艾本德管。
细胞接种：根据表16，计算接种所需的培养基体积和细胞数(密度为4.0×104个活细胞/cm2)。
表19：接种细胞的体积和#
烧瓶 活细胞#/烧瓶 总体积/烧瓶
T225 9×106 90ml
如果适用，从冰箱中取出LN521涂覆的烧瓶。标记每个烧瓶。对于LN521涂覆的烧瓶：向每个T225 LN521涂覆的烧瓶中添加6ml的GPM+GF。将烧瓶在室温下温育1分钟。使用计时器。从烧瓶中抽吸涂覆溶液和GPM+GF培养基。用24ml的PBS(+)/T225洗涤。将计算的GPM+GF添加到烧瓶中。如果适用，制备培养基+E8池。轻轻吸移以混合细胞悬浮液，并且以计算的细胞体积接种。将烧瓶转移到培养箱中，轻轻搅拌烧瓶，使细胞均匀分布在容器表面。
IPC第28天：冷冻保存细胞。培养基替换第30天、第32天、第34天：在以下天中：30、32和34，观察培养物，使用5x和10x物镜拍照并且测量乳酸盐。根据表15解冻GF。确定所需的GPM体积，并且在37℃水浴中温热。根据表15向GPM添加GF。抽吸培养基并且向每个T225烧瓶中添加90ml的GPM+GF培养基。
第35天：第35天，观察培养物，使用5x和10x物镜拍照。测量乳酸盐。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存在-80℃下。根据表15解冻GF并且温热所需的GPM体积(用于GPM+GF和GPM w/o GF的最终溶液)。如果不接种细胞用于进一步培养，不解冻GF并且不制备GPM+GF，则仅需要GPM w/o GF。根据表15将GF体积添加至温热的GPM。
收获：抽吸培养基。向每个T225烧瓶中添加24ml的PBS(-)。将容器倾斜2至3次并且在室温下温育1分钟。抽吸并且添加9ml/T225 TrypLE Select。在37℃和5％的CO2下温育7分钟。在一侧轻轻拍打容器，倾斜烧瓶以洗涤细胞，并且在容器的另一侧轻轻拍打。添加18ml的GPM w/o GF。将培养基直接添加到细胞上。将细胞收集到锥形管中。添加18ml/T225GPM w/o GF并且轻轻冲洗2至3次。收集细胞。如果仅收获细胞而不接种，则进行细胞计数。如果接种细胞用于进一步培养，则离心：260至270g，10分钟，室温。抽吸上清液，用力拍打沉淀并且用每T225容器收获的30ml的GPM+GF重悬。首先，重悬5ml，上下移液2至3次，并且然后使用25ml移液管添加剩余体积。小心不要超过移液管。
细胞计数：制备两个附加艾本德管，并且将200μl细胞悬浮液转移到每个管中。使用NC-200细胞计数器计数每个管。
细胞接种(如果适用)：根据表16，计算接种所需的培养基体积和细胞数(密度为4.0×104个活细胞/cm2)。
表20：接种细胞的体积和#
烧瓶 活细胞#/烧瓶 总体积/烧瓶
T225 9×106 90ml
如果适用，从冰箱中取出LN521涂覆的烧瓶。标记每个烧瓶。对于LN521涂覆的烧瓶：向每个T225 LN521涂覆的烧瓶中添加6ml的GPM+GF。将烧瓶在室温下温育1分钟。使用计时器。从烧瓶中抽吸涂覆溶液和GPM+GF培养基。将计算的GPM+GF添加到烧瓶中。如果适用，制备培养基+E8池。轻轻吸移以混合细胞悬浮液，并且以计算的细胞体积接种。将烧瓶转移到培养箱中，轻轻搅拌烧瓶，使细胞均匀分布在烧瓶表面。IPC第35天：冷冻保存细胞。
培养基替换第37天、第39天、第41天：在以下天中：37、39和41，观察培养物，使用5x和10x物镜拍照并且测量乳酸盐。根据表15解冻GF。确定所需的GPM体积，并且在37℃水浴中温热。根据表15向GPM添加GF。抽吸培养基并且向每个T225烧瓶中添加90ml的GPM+GF培养基。
第42天：第42天，观察培养物，使用5x和10x物镜拍照。测量乳酸盐。将2ml的CM分到两个冷冻管中(每个1ml)，储存在-80℃下。温热所需的GPM体积。
收获：抽吸培养基。向每个T225烧瓶中添加24ml的PBS(-)。将烧瓶倾斜2至3次并且在室温下温育1分钟。抽吸并且添加9ml/T225 TrypLE Select。在37℃和5％的CO2下温育7分钟。在一侧轻轻拍打烧瓶，倾斜烧瓶以洗涤细胞并且在烧瓶的另一侧轻轻拍打。添加18ml的GPM w/o GF。注：将培养基直接添加到细胞上。将细胞收集到锥形管中。添加18ml/T225GPM w/o GF并且轻轻冲洗2至3次。细胞计数：制备两个附加艾本德管，并且将200μl细胞悬浮液转移到每个管中。使用NC-200细胞计数器计数每个管。IPC第42天：冷冻保存细胞。
实例5：大规模OPC批次的生产：
本实例的目的是证明用于生成OPC的大规模条件的确立。
实验程序：图13示出了OPC分化方案的步骤。
hESC培养(阶段1)–H1 hESC(PILOT-LCT-H1-002)根据ERI#ERI-H1-01和ERI-H1-02在LN521涂覆的容器上培养3代。在p30+6+4+2结束时，将细胞接种4天以开始OPC分化。
OPC分化–在阶段1的p30+6+4+3的第4天，根据图13在6个T25容器中开始OPC分化。(分化方案的第0天)。
第0至3天–如上培养。每天更换一次补充有2μM的多索吗啡、10μM的PD0325901和1μM的RA的GPM培养基。
第4至6天–根据实例5中的方案培养。每天更换一次补充有150μM的AA和1μM的RA的GPM培养基。
第7天–根据实例5中的方案用TS收获细胞。在LN521涂覆的容器上将11个T225容器以26,667个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF、10ng/ml的hs-FGF和10μM的RI的GPM中。
第9至13天-根据实例5中的方案培养。每2天更换一次补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的hs-FGF的GPM培养基。
第14天–根据实例5中的方案用TS收获细胞，并且为了形成聚集体，将12个PBS轮(用于#20-EROPCRD-02正在进行的轮次)以128×106个活细胞/PBS轮接种在补充有10ng/ml的EGF、10ng/ml的hs-FGF和10μM的RI的GPM中。另外，所有其它细胞作为ICB在CS10中冷冻保存。
第14天解冻-对于ICB解冻，根据#ER-ICBRD-02研究设计将冷冻保存的细胞解冻、计数并且接种在PBS轮中。根据实例5中的方案将128×106个活细胞/PBS轮接种在6个容器中，并将105×106个活细胞/PBS轮接种在一个容器中。
第16至20天-根据实例5中的方案培养。每2天更换一次补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的hs-FGF的80％的GPM培养基。
第21天-将聚集体在第21天展平，并且在7个T75 LN521涂覆的容器上接种在补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中。
第23至27天-如上培养。每2天更换一次补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基。
第28天-用TS收获细胞，并且在36个T225 E8直接涂覆的容器上以40,000个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中。
第29至34天-如上培养。每2天更换一次补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基。
第35天-用TS收获细胞，并且在45个细胞工厂E8直接涂覆的容器上以40,000个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中。报告了第35天培养箱中CO2水平的偏差。由于根据形态和乳酸盐水平评价，在受偏差影响的容器和所有其它容器之间没有出现差异，因此决定继续所有容器，因为偏差涉及细胞的较小风险。
第36至41天-如上培养。每2天更换一次补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基。
第42天-根据#ERI-OPC-07，在TAI制剂中用TS收获和冷冻保存细胞。
QC测试–流式细胞术–根据表21在第7、14、28、35和42天通过FACS对冷冻保存的细胞进行标志物分析。
表21：FACS染色
批次释放验收标准–第42天细胞的批次释放测试的拟定验收标准呈现于表22中。
表22：批次释放拟定验收标准。
结果：传代参数–关于#20-EROPCRD-02和#ER-ICBRD-02的所有传代参数呈现于表23和表24。在每次传代时，根据下式计算产率和PDL值：
a.
b.
c.PDL＝log2(产率)
讨论：批次#20-EROPCRD-02正在进行的轮次的和从ICB第14天工程轮次中解冻的#ER-ICBRD-02轮次是在R&D实验室中生产的，作为全规模LCTOPC1批次生产的可行性证明的一部分，并且其产品被指定用于可比性和动物研究目的。
在#20-EROPCRD-02正在进行的轮次中，同时加工多个容器显然导致在所有PBS轮中形成异常较高数量的凝块并且终止该轮次。在第14-21天之间，由于聚集体损失和第21天的非指示性乳酸盐读数，PBS轮中的凝块形成损害了分化过程。另外，冷冻保存和解冻第14天收获的细胞(LCTOPC1 ICB)，与相同细胞正在进行的轮次相比，可以减少在第14至21天形成的凝块的数量。实际上，在#20-EROPCRD-02期间生成的ICB开始的#ER-ICBRD-02轮次中，在PBS轮中没有观察到凝块。正在进行的和ICB轮次之间的这些差异得出结论，第14天ICB的冷冻保存和解冻对于GMP设施中的OPC1过程是有益的和必需的。
批次#ER-ICBRD-02通过了所测试的测定中所有拟定IPC和批次释放标准，批准在第14天冷冻保存ICB制造全规模LCTOPC1批次是可行的。该批次#ER-ICBRD-02代表LCTOPC1GMP过程和释放的细胞。
结论：#ER-ICBRD-02是GMP过程的代表性批次，并且释放了LCTOPC1的细胞，并且通过了批次释放的所有拟定标准。生产符合批次释放的拟定标准的全规模OPC1细胞是可行的。在第14天冷冻保存ICB并且在接种前解冻以形成聚集体有利于细胞并且防止凝块形成。
实例6：在第14天解冻细胞分化以产生OPC。
本实例的目的是证明解冻细胞向OPC的分化条件的确立。
实验程序：图13示出了OPC分化方案的步骤。
表28：所测试的条件：
**用抗粘附溶液预洗涤-抗粘附溶液被认为防止聚集体在第14至16天粘附在轮的底部，后来证明聚集体损失的主要原因是它们倾向于彼此粘结，这导致大的凝块产生。
HESC培养(阶段1)–将H1 hESC(PILOT-LCT-H1-002)在LN521涂覆的容器上培养3代。在p30+6+4+2结束时，将细胞接种4天以开始OPC分化。
OPC分化–在阶段1的p30+6+4+3的第4天，开始OPC分化。测试的任何变更详见于表28。
第0至3天–在补充有2μM的多索吗啡、10μM的PD0325901和1μM的RA的GPM培养基中培养细胞，每天更换一次。
第4至6天–在补充有150μM的AA和1μM的RA的GPM培养基中培养，每天更换一次。
第7天–用TS收获细胞并且在LN521涂覆的容器上以26,667个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF、10ng/ml的hs-FGF和10μM的RI的GPM中。
第9至13天–在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的hs-FGF的GPM培养基中培养，每2天更换一次。
第14天–用TS收获细胞。在正在进行的培养中，将未接种的细胞冷冻保存在CS10中。
ICB第14天解冻–将细胞解冻、重悬、计数并且将128×106个活细胞接种在补充有10ng/ml的EGF、10ng/ml的hs-FGF和10μM的RI的70ml的GPM培养基中。
第16至20天–在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的hs-FGF的80％的GPM培养基中培养，每2天更换一次。
第21天–根据第21天在LN521涂覆的容器上补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中的乳酸盐测量(如果乳酸盐浓度低于15.00mM，在75cm2上展平，或者如果乳酸盐浓度等于或高于15.00mM，在150cm2上展平)使聚集体展平。
第23至27天-在补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基中培养，每2天更换一次。
第28天-用TS收获细胞，并且在LN521涂覆的容器上以40,000个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中。
第29至34天-在补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基中培养，每2天更换一次。
第35天-用TS收获细胞，并且在LN521涂覆的容器上以40,000个活细胞/cm2接种在补充有10ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM中。
第36至41天-如上培养。每2天更换一次补充有20ng/ml的EGF和10ng/ml的PDGF-AA的GPM培养基。
第42天–用TS收获和冷冻保存细胞。
QC测试–流式细胞术–根据表29在第7、14、28、35和42天通过FACS对冷冻保存的细胞进行标志物分析。
表29：FACS染色
核心蛋白聚糖分泌–测试第35天和第42天的冷冻保存的细胞的核心蛋白聚糖分泌。
验收标准–由于评估OPC批次的测定是与该过程同时开发的，成功批次根据以下标准定义：纯度标志物(PDGFRα)>95.00％，杂质标志物(密蛋白、EpCAM、CK7)<2.00％，核心蛋白聚糖分泌(第42天的细胞)>25.00ng/ml，形态-小且紧凑的细胞，没有细长纺锤状形态。
结果：传代参数-在每次传代时，根据下式计算产率和PDL值：
●
●
●PDL＝log2(产率)
效力测定–第35天和第42天的核心蛋白聚糖分泌呈现于表35中。
表35：核心蛋白聚糖分泌。所有ICB 14轮次如下。
在第42天所有组的核心蛋白聚糖分泌>25ng/ml，并且符合预期标准。
形态–从第35天开始，成功和失败组的培养物因形态不同而不同。在图14和图15中，与ICB解冻细胞相比，呈现了正在进行的轮次的形态照片。在第35天和第42天，细胞被组织为紧凑且密集的细胞并且没有获得纺锤状“失败”形态。
原始轮次及其衍生ICB之间的清晰的第21天聚集体形态相似性呈现于图14中。
讨论：在OPC1分化过程期间，在第14天冷冻保存ICB具有巨大的潜在优势，诸如减少导致轮次失败的PBS轮中的凝块形成，从同一ICB生产多个批次，并且允许长达9周的过程具有灵活性。结果示出由正在进行的全轮次和它们第14天ICB衍生的轮次产生的OPC1细胞获得了OPC群体的预期标准。
在本报告中，总结了第14天解冻细胞相对于原始正在进行组的分化结果。传代参数、标志物表达和效力测定(核心蛋白聚糖分泌)示出除轮次10.1B组之外，在第14天解冻的所有细胞符合OPC1细胞的拟定验收标准。对于轮次10.1B组，在第14天接种细胞之前用抗粘附溶液预处理PBS轮。由于与GPM预负载相比，该处理对该过程没有示出明显的益处，因此决定在该过程中不使用该材料。另外，发现当实施本文所描述的ICB冷冻保存程序时，回收率％从75％提高到92％(参见表28)。该程序将在CCN OPC1过程中执行。
结论：第14天可以是OPC1分化方案的断点。第14天可以将ICB细胞直接解冻到PBS轮中并且继续正在进行的方案的确立过程。第14天ICB在第14至21天聚集体步骤中减少沉积物方面示出了明显的优势。当根据本文所描述的方法进行冷冻保存时，在解冻第14天获得更好的解冻后回收率。
参考文献
Duester,G.(2008)，《早期器官发生期间的视黄酸合成和信号传导(Retinoicacid synthesis and signaling during early organogenesis.)》，《细胞(Cell)》134(6):921至931。
Hu,B.Y,Z.W.Du,X.J.Li,M.Ayala和S.C.Zhang(2009)，《来自胚胎干细胞的人少突胶质细胞：保守的SHH信号传导网络和发散的FGF效应(Human oligodendrocytes fromembryonic stem cells:conserved SHH signaling networks and divergent FGFeffects.)》，《发展(Development)》136(9):1443至1452。
Janesick,A,S.C.Wu和B.Blumberg(2015)，《视黄酸信号传导和神经元分化(Retinoic acid signaling and neuronal differentiation.)》，《细胞与分子生命科学 (Cell Mol Life Sci)》72(8):1559至1576。
Koch,U,R.Lehal和F.Radtke(2013)，《与Notch共存的干细胞(Stem cells livingwith a Notch.)》，《发展(Development)》140(4):689至704。
Kudoh,T,S.W.Wilson和I.B.Dawid(2002)，《Fgf、Wnt和视黄酸在神经外胚层后部化中的不用作用(Distinct roles for Fgf,Wnt and retinoic acid in posteriorizingthe neural ectoderm.)》，《发展(Development)》129(18):4335至4346。
Li,Y.和M.M.Parast(2014)，《BMP4对人滋养层发育的调节(BMP4 regulation ofhuman trophoblast development.)》，《国际发育生物学杂志(Int J Dev Biol)》58(2至4):239至246。
Ota,M.和K.Ito(2006)，《BMP和FGF-2调节感觉神经元和神经胶质的神经发生素-2表达和分化(BMP and FGF-2regulate neurogenin-2expression and thedifferentiation of sensory neurons and glia.)》，《发育动力学(DevDyn)》235(3):646至655。
Patthey,C.和L.Gunhaga(2014)，《调节外胚层细胞命运选择的信号传导通路(Signaling pathways regulating ectodermal cell fate choices.)》，《实验细胞研究 (Exp Cell Res)》321(1):11至16。
Sui,L,L.Bouwens和J.K.Mfopou(2013)，《胚胎干细胞的维持和定形内胚层分化期间的信号传导通路(Signaling pathways during maintenance and definitiveendoderm differentiation of embryonic stem cells.)》，《国际发育生物学杂志》57(1):1至12。
Watabe,T.和K.Miyazono(2009)，《TGF-β家族信号传导在干细胞更新和分化中的作用(Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewal anddifferentiation.)》，《细胞研究(Cell Res)》19(1):103至115。
Zheng,W,Q.Li,C.Zhao,Y.Da,H.L.Zhang和Z.Chen(2018)，《从hiPSC分化神经胶质细胞：在神经疾病和细胞替代治疗中的潜在应用(Differentiation of Glial Cells FromhiPSCs:Potential Applications in Neurological Diseases and Cell ReplacementTherapy.)》，《前细胞神经科学(Front Cell Neurosci)》12:239。
本文提供的所有参考文献(包括所有非专利文献、专利和专利出版物)以全文引用的方式并入。

Claims (38)

1.一种从未分化的多能干细胞中获得少突胶质细胞祖细胞(OPC)群体的方法，所述方法包含：
a)获得未分化的多能人胚胎干细胞(hESC)的培养物；
b)在足以诱导所述hESC分化成神经外胚层细胞和神经祖细胞的培养条件下培养所述未分化的多能hESC第一时间段；以及
c)在足以将所述神经祖细胞分化成OPC的培养条件下培养来自步骤b)的所述神经祖细胞第二时间段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在贴壁组织培养容器中的层粘连蛋白上，或悬浮复合物中，或两者中培养步骤b)中的所述多能细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导的多能干细胞(hiPSC)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在多索吗啡(Dorsomorphin)、PD0325901和RA的存在下培养步骤b)的所述未分化的hESC。
6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包含在AA和RA的存在下培养的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在EGF和hsbFGF的存在下培养来自步骤b)的所述神经外胚层细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包含在EGF和PDGF-AA的存在下培养的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段为从约3天至约60天。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一时间段为从约10天至约15天。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一时间段为约14天。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段为从约10天至约60天。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二时间段为从约20天至约40天。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二时间段为约28天。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在约第14天将步骤b)中分化的hESC冷冻保存。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将冷冻保存的细胞解冻，并且其中在所述方法的任何剩余步骤中培养后续解冻细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其包含在所述第一时间段结束时或约在所述第一时间段结束时冷冻保存来自步骤b)的所述神经祖细胞的步骤。
18.根据权利要求16所述的方法，其中冷冻保存的神经外胚层细胞根据步骤c)解冻和培养。
19.根据权利要求14所述的方法，其中步骤c)的所述OPC是冷冻保存的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中冷冻保存的OPC被解冻。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述OPC表达选自以下的一种或多种标志物：神经/神经胶质抗原2(NG2)、血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体B(PDGFRβ)。
22.一种配制用于在解冻后直接施用至受试者的少突胶质细胞祖细胞(OPC)组合物的方法，所述方法包含：(a)将根据权利要求1所述的OPC悬浮在冷冻保存培养基中以形成细胞悬浮液，(b)在冷冻保存温度下储存所述细胞悬浮液，和(c)解冻冷冻保存的悬浮液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述冷冻保存培养基包含以下中的一种或多种：腺苷、右旋糖酐-40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水。
24.一种用于施用至受试者的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的OPC和冷冻保存培养基。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述冷冻保存培养基包含以下中的一种或多种：腺苷、右旋糖酐-40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水。
26.一种用于治疗受试者的脊柱损伤的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求22所述的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述施用包含将所述组合物施用至脊髓损伤部位中或脊髓损伤部位附近。
28.根据权利要求26所述的方法，其中施用通过注射进行。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述施用通过植入进行。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述施用通过移植进行。
31.根据权利要求26所述的药物组合物，其中细胞的浓度为约1×106个细胞/mL至约100×106个细胞/mL。
32.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述药物组合物以约100微升至约1毫升的体积储存。
33.根据权利要求26所述的药物组合物，其中细胞的所述浓度为100×106个细胞/mL。
34.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述药物组合物以250微升的体积储存。
35.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述药物组合物以300微升的体积储存。
36.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述冷冻保存培养基是冻存液。
37.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述冻存液是CryoStor10(CS10)。
38.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述OPC表达选自以下的一种或多种标志物：神经/神经胶质抗原2(NG2)、血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体B(PDGFRβ)。
CN202280029402.7A 2021-03-10 2022-03-10 生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途 Pending CN117242174A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163159350P 2021-03-10 2021-03-10
US63/159,350 2021-03-10
PCT/US2022/019847 WO2022192605A1 (en) 2021-03-10 2022-03-10 Methods of generating oligodendrocyte progenitor cells and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117242174A true CN117242174A (zh) 2023-12-15

Family

ID=83227111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280029402.7A Pending CN117242174A (zh) 2021-03-10 2022-03-10 生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240158745A1 (zh)
EP (1) EP4305154A4 (zh)
JP (1) JP2024512385A (zh)
KR (1) KR20230154071A (zh)
CN (1) CN117242174A (zh)
AU (1) AU2022235278A1 (zh)
CA (1) CA3212873A1 (zh)
IL (1) IL305737A (zh)
WO (1) WO2022192605A1 (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11603518B2 (en) * 2019-01-23 2023-03-14 Asterias Biotherapeutics, Inc. Dorsally-derived oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP4305154A4 (en) 2025-02-12
KR20230154071A (ko) 2023-11-07
IL305737A (en) 2023-11-01
JP2024512385A (ja) 2024-03-19
AU2022235278A1 (en) 2023-09-07
US20240158745A1 (en) 2024-05-16
WO2022192605A8 (en) 2022-10-13
WO2022192605A1 (en) 2022-09-15
CA3212873A1 (en) 2022-09-15
EP4305154A1 (en) 2024-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7088496B2 (ja) 網膜組織の製造方法
JP7569089B2 (ja) 動的懸濁培養において多能性幹細胞を分化させるための方法
US20230139899A1 (en) Dorsally-derived oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells
JP7664318B2 (ja) 下垂体組織を含む細胞塊の製造方法及びその細胞塊
JP2008099662A (ja) 幹細胞の培養方法
JP6495830B2 (ja) 毛様体周縁部様構造体の製造法
CN113272422A (zh) 用于无载体3d球体悬浮培养中视网膜神经元生成的方法和组合物
CN117242174A (zh) 生成少突胶质细胞祖细胞的方法及其用途
US12365872B2 (en) Methods for differentiating pluripotent stem cells in dynamic suspension culture
HK40061262A (zh) 來自人多能幹細胞的背源性少突膠質祖細胞

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination