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CN117178060A - 酶组合物 - Google Patents

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CN117178060A
CN117178060A CN202280026427.1A CN202280026427A CN117178060A CN 117178060 A CN117178060 A CN 117178060A CN 202280026427 A CN202280026427 A CN 202280026427A CN 117178060 A CN117178060 A CN 117178060A
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glucoamylase
cellobiohydrolase
enzyme
ala
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CN202280026427.1A
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麦克·阿佩尔多伦
沃特·克罗斯
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DSM IP Assets BV
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Abstract

本申请涉及一种酶组合物、其制备方法以及所述酶组合物在酶促水解中的用途。

Description

酶组合物
技术领域
本公开涉及一种酶组合物、其制备方法以及酶组合物在酶促水解中的用途。
背景技术
纤维素材料主要由纤维素构成并且还可包含半纤维素和木质素。它提供了用于产生化石燃料的替代能源的有吸引力的平台。所述材料可大量获得并且可以转化为有价值的产物，例如糖或生物燃料，诸如生物乙醇。
由纤维素材料生产发酵产物是本领域已知的并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产物的步骤。
在可包括液化、预糖化和/或糖化步骤的水解过程中，纤维素材料中存在的纤维素部分地(通常为30％至95％，取决于酶活性和水解条件)被纤维素分解酶转化为还原糖。水解通常在45℃至50℃的高温和非无菌条件下在持续6小时至168小时的过程中发生。
通常，通过酵母等微生物将糖转化为有价值的发酵产物，诸如乙醇。发酵在相同容器中或在不同容器中，在单独的、优选厌氧的工艺步骤中进行。发酵过程中的温度调整至30℃至33℃，以适应微生物(通常是酵母)的生长和乙醇生产。在发酵过程中，剩余的纤维素材料被水解步骤中已经存在的酶转化为还原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦纤维素材料转化为可发酵糖并且所有可发酵糖都转化为乙醇、二氧化碳和微生物生物质，发酵就完成了。这可能要耗时长达6天。通常，水解和发酵的整个过程的时间量可长达13天。
在由纤维素材料生产发酵产物的整个过程中，酶的生产成本是主要的成本因素。因此，已经采取了几种方法来降低酶和酶组合物的成本，例如，增加由生产微生物产生的酶的量、通过诱变技术调节和构建新的和改进的酶，以及探索遗传多样性。
所有这些方法都没有充分提高酶促活性以克服在由纤维素材料生产发酵产物的整个过程中高成本的酶生产。这些方法的一个缺陷是一次只聚焦于一种酶，忽略了可能与其他纤维素分解酶的协同作用。
已经进行了几种尝试来开发酶组合物，以使纤维素材料的酶促水解最大化。例如，WO 2011/000949描述了篮状菌属(Talaromyces)突变株，其产生可以用于纤维素材料的酶促水解的特定酶组合物。
然而，这些尝试并未成功地开发出具有充分改善的纤维素生物质水解性能的酶组合物。
因此，尽管进行了大量的研究工作，仍然需要降低纤维素材料的水解和发酵的过程相关的总体生产成本的改进的酶组合物。
发明内容
本公开的一个目的是提供一种改进的酶组合物、制备酶组合物的方法以及酶组合物在用于由纤维素材料制备糖产物和/或发酵产物的方法中的用途。
具体实施方式
贯穿本说明书和随附权利要求书，词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的变型应被解释为包含性的。也就是说，这些词语旨在传达在上下文允许的情况下可能包含未具体叙述的其他要素或整数。冠词“一个/种(“a”和“an”)”在本文用于指一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)的该冠词的语法宾语。举例来说，“一个要素”可意指一个要素或多于一个要素。
本公开涉及一种包含葡糖淀粉酶(GA)和纤维二糖水解酶I(CBHI)的酶组合物，其中葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于纤维二糖水解酶I和葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.98至0.60。
葡糖淀粉酶比率(RGA)，定义为酶组合物中葡糖淀粉酶的总重量除以酶组合物中葡糖淀粉酶的总重量和纤维二糖水解酶I的总重量，可以通过下式计算：RGA＝总GA/(总GA+总CBHI)。
在一个实施方式中，RGA为0.02至0.40。在一个实施方式中，RGA为0.03至0.34。在一个实施方式中，RGA为0.09至0.29。在一个实施方式中，RGA为0.12至0.23。
在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至20％(w/w)的量存在。这意味着酶组合物包含量为酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至20％(w/w)的葡糖淀粉酶。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至19％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至18％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至17％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至16％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至15％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至14％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至13％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至12％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至11％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶以酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至10％(w/w)的量存在。
如本文所述，本公开的酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I。应当理解，“葡糖淀粉酶”意指“至少一种葡糖淀粉酶”并且“纤维二糖水解酶I”意指“至少一种纤维二糖水解酶I”。因此，本公开的酶组合物可包含多于一种葡糖淀粉酶和/或多于一种纤维二糖水解酶I。在存在几种葡糖淀粉酶和/或几种纤维二糖水解酶I的情况下，RGA涉及酶组合物中所有葡糖淀粉酶的重量除以酶组合物中所有葡糖淀粉酶和所有纤维二糖水解酶I的总重量，并且RCBH1涉及酶组合物中所有纤维二糖水解酶I的重量除以酶组合物中所有纤维二糖水解酶I和所有葡糖淀粉酶的总重量。
如本文所用，葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)是外切葡糖水解酶，其催化α-1,4和α-1,6糖苷键的水解，以从淀粉以及相关多糖和寡糖的非还原末端释放β-d-葡萄糖。它们也称为淀粉葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶或1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶。它们催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖。大多数葡糖淀粉酶是多结构域酶，其由通过不同长度的O-糖基化接头区域连接至淀粉结合结构域的催化结构域组成。如本文所用，葡糖淀粉酶还包括α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)。
如本文所述的酶组合物可包含葡糖淀粉酶，包括GH15葡糖淀粉酶、GH31葡糖淀粉酶、GH97葡糖淀粉酶或它们的任何组合。如本文所述的酶组合物优选包含葡糖淀粉酶，包括GH15葡糖淀粉酶。如本文所用的葡糖淀粉酶属于结构家族GH15、GH31或GH97。优选地，如本文所用的葡糖淀粉酶属于结构家族GH15。
如本文所用的葡糖淀粉酶可以是真菌葡糖淀粉酶。如本文所用的葡糖淀粉酶可以是来自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、罗萨氏菌属(Rasamsonia)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、嗜热菌属(Thermomyces)(仅举几例)的葡糖淀粉酶。如本文所用的葡糖淀粉酶还可以是工程改造的葡糖淀粉酶，诸如包含一个或多个突变、缺失和/或插入的变异酶。
在一个优选实施方式中，葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的葡糖淀粉酶，(b)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的多核苷酸编码的葡糖淀粉酶，以及(c)(a)或(b)的葡糖淀粉酶的具有葡糖淀粉酶活性的片段。
SEQ ID NO:2的成熟多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸21至643。信号肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸1至20。SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸61至1932。信号肽包含SEQ ID NO:1的核苷酸1至60。
在一个实施方式中，葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶的氨基酸序列由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。
在一个实施方式中，葡糖淀粉酶由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的多核苷酸编码。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶由包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的多核苷酸编码。在一个实施方式中，葡糖淀粉酶通过由SEQ ID NO:1组成的多核苷酸编码。
葡糖淀粉酶活性可以如下测量。使用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷作为底物确定酶组合物/混合液(cocktail)内的GA活性。底物的酶促水解导致对硝基酚(pNP)的释放，这在碱性条件下在405nm处进行测量。通过将2g对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶解于每升200mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)(每L缓冲液含有2g Triton X-100)中来制备底物溶液。将酶组合物/混合液用200mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)(每L缓冲液含有2g Triton X-100)适当稀释。随后，将150μl底物溶液在37℃下预孵育5分钟。接下来，将15μl经稀释的酶组合物/混合液添加到预孵育的底物溶液中并在37℃下孵育18.3分钟。通过添加60μl的0.3M碳酸钠溶液终止反应，并且在2分钟后在405nm处测量吸光度。通过将150μl底物溶液加60μl的0.3M碳酸钠溶液在37℃下预孵育5分钟来制备对照样品。接下来添加15μl经稀释的酶组合物/混合液并且在37℃下孵育18.3分钟。
在405nm处测量吸光度。GA活性计算如下：
(Abs 405nm经稀释的混合液共混物-Abs 405nm对照样品)*DF*1000050/(εpNP*t*C*％GA)
其中
DF＝开始测定前应用于组合物/混合液的稀释因子
εpNP＝pNP在405nm处的摩尔消光系数，其为18.0mM-1.cm-1
t＝孵育时间(以秒计)，在这种情况下为1100
C＝未稀释的组合物/混合液中的蛋白质含量，以mg/g发酵液
％GA＝在如上所述的酶组合物/混合液中确定的GA的％(w/w)。
纤维二糖水解酶I比率(RCBH1)，定义为酶组合物中纤维二糖水解酶I的总重量除以酶组合物中纤维二糖水解酶I的总重量和葡糖淀粉酶的总重量，可以通过下式计算：RCBH1＝总CBHI/(总CBHI+总GA)。
在一个实施方式中，RCBH1为0.60至0.98。在一个实施方式中，RCBH1为0.66至0.97。在一个实施方式中，RCBH1为0.71至0.91。在一个实施方式中，RCBH1为0.77至0.88。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键水解，从链末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖糖苷酶、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶(avicelase)、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I包括GH7纤维二糖水解酶I。
在一个优选实施方式中，纤维二糖水解酶I获自罗萨氏菌属、篮状菌属、曲霉属、木霉属或青霉属的真菌。在一个优选实施方式中，纤维二糖水解酶I获自埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、莱色篮状菌(Talaromyces leycettanus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、里氏木霉(Trichodermareesei)或埃默森青霉(Penicillium emersonii)物种的真菌。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自以下的纤维二糖水解酶I：曲霉属，诸如烟曲霉，诸如在WO 2011/057140中以SEQ ID NO:6或在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:6所公开的Cel7A CBHI或诸如WO 2013/028928或WO 2015/081139中所公开的CBHI；木霉属，诸如里氏木霉；毛壳菌属(Chaetomium)，诸如嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)；篮状菌属，诸如莱色篮状菌(例如，诸如WO 2015/187935或WO 2016/082771中所公开的)，或青霉属，诸如埃默森青霉(例如，诸如WO 2011/057140中所公开的)。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属诸如埃默森罗萨氏菌的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。
在一个优选实施方式中，纤维二糖水解酶I选自由以下组成的组：(a)与SEQ IDNO:4的成熟多肽具有至少60％序列同一性的纤维二糖水解酶I，(b)由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，以及(c)(a)或(b)的纤维二糖水解酶I的具有纤维二糖水解酶活性的片段。
SEQ ID NO:4的成熟多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸19至455。信号肽包含SEQ IDNO:4的氨基酸1至18。SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸55至1368。信号肽包含SEQ ID NO:3的核苷酸1至54。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％序列同一性的纤维二糖水解酶I，(b)由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，以及(c)(a)或(b)的纤维二糖水解酶I的具有纤维二糖水解酶活性的片段。
SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸55至1368。信号肽包含SEQ ID NO:5的核苷酸1至54。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I包含SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I的氨基酸序列由SEQ IDNO:4的成熟多肽组成。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的多核苷酸编码。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I由包含SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的多核苷酸编码。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I通过由SEQ ID NO:3组成的多核苷酸编码。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的多核苷酸编码。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I由包含SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列的多核苷酸编码。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I通过由SEQ ID NO:5组成的多核苷酸编码。
在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I是(a)或(b)(参见上文)的纤维二糖水解酶I的具有纤维二糖水解酶活性的片段。纤维二糖水解酶I活性可以如下测量。使用对硝基苯基-β-纤维二糖糖苷作为底物确定酶组合物/混合液内的CBHI活性。底物的酶促水解导致对硝基酚(pNP)的释放，这在碱性条件下在405nm处进行测量。利用对硝基酚在405nm处的摩尔消光系数计算CBHI活性。底物溶液由在100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)(每L缓冲液含有10mM葡糖酸内酯和25μl Triton X-100)中的3mM对硝基苯基-β-D-纤维二糖糖苷(Sigma N5759)制备。随后，将400μl的该底物溶液在62℃下预孵育约10分钟。将酶组合物/混合液用100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)(每L缓冲液含有10mM葡糖酸内酯和25μl Triton X-100)适当稀释。接下来，将400μl经稀释的酶组合物/混合液与400μl预孵育的底物溶液合并，并在62℃下孵育10分钟，同时不断振荡。通过添加800μl的1M碳酸钠溶液并剧烈混合来终止反应。通过将400μl底物溶液在62℃下预孵育约10分钟，然后添加400μl100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)(每L缓冲液含有10mM葡糖酸内酯和25μl Triton X-100)和800μl的1M碳酸钠溶液来制备对照样品。将其在62℃下孵育10分钟，同时不断振荡。在孵育后，在405nm处测量对照样品和经稀释的组合物/混合液的吸光度。CBHI活性计算如下：
(Abs 405nm经稀释的混合液共混物-Abs 405nm对照样品)*DF*10000/(εpNP*t*C*％CBH1)
其中
DF＝开始测定前应用于酶组合物/混合液的稀释因子
εpNP＝pNP在405nm处的摩尔消光系数，其为18.0mM-1.cm-1
t＝孵育时间(以秒计)，在这种情况下为600
C＝未稀释的混合液共混物中的蛋白质含量，以mg/g发酵液
％CBHI＝在如上所述的酶组合物/混合液中确定的CBHI的％(w/w)。
在一个实施方式中，酶组合物包含量为酶组合物中蛋白质总量的15％(w/w)至45％(w/w)的纤维二糖水解酶I。这意味着纤维二糖水解酶I以酶组合物中蛋白质总量的15％(w/w)至45％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I以酶组合物中蛋白质总量的17％(w/w)至45％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶I以酶组合物中蛋白质总量的20％(w/w)至45％(w/w)的量存在。
如本文所述的酶组合物还可包含β-葡糖苷酶(BG)。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含量为酶组合物中蛋白质总量的1％(w/w)至20％(w/w)的β-葡糖苷酶。这意味着β-葡糖苷酶以酶组合物中蛋白质总量的1％(w/w)至20％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶以酶组合物中蛋白质总量的2％(w/w)至15％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶以酶组合物中蛋白质总量的3％(w/w)至10％(w/w)的量存在。
如本文所用，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可对β-D-葡糖苷具有广泛的特异性，并且还可水解以下中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。该酶也可称为苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属诸如米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶，诸如WO 02/095014中公开的β-葡糖苷酶，或WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自烟曲霉的β-葡糖苷酶，诸如在WO 2005/047499中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，诸如WO 2012/044915中公开的β-葡糖苷酶，诸如具有以下取代的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)，或来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或白曲霉(Aspergilluskawachi)的β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于青霉属，诸如在WO 2007/019442中公开为SEQ ID NO:2的巴西青霉(Penicillium brasilianum)，或来源于木霉属，诸如里氏木霉，诸如US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US2006/0258554、US 2004/0102619中描述的那些。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)(WO2011/035029)或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)(WO 2007/019442)。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属诸如埃默森罗萨氏菌的β-葡糖苷酶(参见WO2012/000886或WO 2012/000890)。
在一个优选实施方式中，β-葡糖苷酶选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少60％序列同一性的β-葡糖苷酶，(b)由与SEQ ID NO:6的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的多核苷酸编码的β-葡糖苷酶，以及(c)(a)或(b)的β-葡糖苷酶的具有β-葡糖苷酶活性的片段。
SEQ ID NO:7的成熟多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸20至858。信号肽包含SEQ IDNO:7的氨基酸1至19。SEQ ID NO:6的成熟多肽编码序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸58至2577。信号肽包含SEQ ID NO:6的核苷酸1至57。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶包含SEQ ID NO:7的成熟多肽的氨基酸序列。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶的氨基酸序列由SEQ ID NO:7的成熟多肽组成。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶由与SEQ ID NO:6的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的多核苷酸编码。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶由包含SEQ ID NO:6的成熟多肽编码序列的多核苷酸编码。在一个实施方式中，β-葡糖苷酶通过由SEQ ID NO:6组成的多核苷酸编码。
β-葡糖苷酶活性可以如下测量。使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-BDG)作为底物，在37℃和pH 4.40下确定β-葡糖苷酶活性。pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷的酶促水解导致对硝基酚(pNP)和D-葡萄糖的释放。在碱性条件下确定的定量释放的对硝基酚是酶促活性的量度。孵育10分钟后，通过添加1M碳酸钠终止反应，并在405nm的波长处确定吸光度。利用对硝基酚的摩尔消光系数计算β-葡糖苷酶活性。对硝基酚校准线制备如下。首先，制备在包含0.1％BSA的100mM乙酸盐缓冲液pH 4.40中的10mM pNP储备溶液。随后，制备该pNP储备液的稀释液并获得0.25mM、0.40mM、0.67mM和1.25mM的浓度。接下来，由在100mM乙酸盐缓冲液pH4.40中的5.0mM pNP-BDG制备底物溶液。向3ml底物溶液中添加200μl pNP稀释液和3ml1M碳酸钠。使用100mM乙酸盐缓冲液作为空白测量，在405nm处测量校准混合物的吸收。使用本领域已知的标准计算方案，通过将OD405相对于具有已知浓度的pNP校准样品的浓度作图，随后使用由校准线产生的方程计算未知酶组合物样品的浓度来计算pNP含量。酶组合物样品按重量稀释，与介于1.7单位与3.3单位之间的活性相对应。向预热至37℃的3ml底物溶液中添加200μl经稀释的样品溶液。这记录为t＝0。10.0分钟后，通过添加3ml的1M碳酸钠终止反应。β-葡糖苷酶活性以每克酶组合物样品的单位数表示。1个单位，称为BG单位，定义为在限定的测定条件(pH＝4.40，T＝37℃)下每秒从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷中释放1纳摩尔对硝基酚的酶量。
在一个实施方式中，本公开的酶组合物可进一步包含内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖(lichenin)或谷物β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4并且还可能能够水解还含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。内切葡聚糖酶也可称为纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维素糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中的至少一种内切葡聚糖酶是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。GH分类可以在CAZy网站上找到。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自以下的内切葡聚糖酶：木霉属，诸如里氏木霉；曲霉属，诸如棘孢曲霉、土曲霉或白曲霉；欧文氏菌(Erwinia)，诸如胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；镰刀菌属，诸如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；梭孢壳属，诸如太瑞斯梭孢壳；腐质霉属，诸如灰腐质霉高温变种(Humicola griseavar.thermoidea)或特异腐质霉(Humicola insolens)；白丝菌属(Melanocarpus)，诸如热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；脉孢菌属(Neurospora)，诸如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；毁丝霉属(Myceliophthora)，诸如嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；枝鼻菌属(Cladorrhinum)，诸如多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或金孢子菌属(Chrysosporium)，诸如勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及褐色喜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶是热稳定的内切葡聚糖酶。如本文所用的“热稳定的”内切葡聚糖酶是指当在10-30分钟之间测量活性时，内切葡聚糖酶具有在45℃至90℃范围内的最佳温度。热稳定的内切葡聚糖酶可以例如从嗜热或耐热真菌中分离，或者可由技术人员设计并人工合成。在一个实施方式中，热稳定的内切葡聚糖酶可从嗜热或耐热的丝状真菌中分离或获得，或者从非嗜热或非耐热真菌中分离但被发现是热稳定的。在一个实施方式中，热稳定的内切葡聚糖酶是真菌的。在一个实施方式中，热稳定的内切葡聚糖酶获自嗜热或耐热真菌。“嗜热真菌”是指在45℃或更高的温度下生长的真菌。“耐热”真菌是指在20℃或更高的温度(最大值接近55℃)下生长的真菌。
在一个实施方式中，热稳定的内切葡聚糖酶获自包括但不限于以下的属的真菌：腐质霉属、根毛霉属、毁丝霉属、罗萨氏菌属、篮状菌属、青霉属、嗜热真菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、曲霉属、柱霉属(Scytalidium)、拟青霉属(Paecilomyces)、毛壳菌属、Stibella、棒囊孢壳菌属(Corynascus)、畸枝霉属(Malbranchea)或梭孢壳属。这些属的优选物种包括但不限于灰腐质霉高温变种、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、透明嗜热腐质霉(Humicola hyalothermophilia)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea)、丝衣霉状罗萨氏菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、埃默森罗萨氏菌、赭褐罗萨氏菌(Rasamsoniaargillacea)、象牙白罗萨氏菌(Rasamsonia eburnean)、短柄罗萨氏菌(Rasamsoniabrevistipitata)、柱罗萨氏菌(Rasamsonia cylindrospora)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromycesbacillisporus)、莱色篮状菌、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、星状嗜热丝孢菌(Thermomyces stellatus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)、嗜热嗜热子囊菌(Thermoascus thermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、柱状青霉(Penicilliumcylindrosporum)、土曲霉、烟曲霉、嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)、依丝霉拟青霉(Paecilomycesbyssochlamydoides)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、橄榄色毛壳菌(Chaetomium olivicolor)、嗜热束梗孢(Stibella thermophila)、瘤孢棒囊孢壳菌(Corynascus sepedonium)、樟绒枝霉(Malbranchea cinnamonmea)和太瑞斯梭孢壳。
在一个优选实施方式中，热稳定的内切葡聚糖酶获自罗萨氏菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属或青霉属的真菌。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶是如本文所述的内切葡聚糖酶的具有内切葡聚糖酶活性的片段。内切葡聚糖酶活性可以如下测量。使用AZO-羧甲基纤维素(AZO-CMC)作为底物在62℃和pH4.5下确定内切葡聚糖酶活性。AZO-CMC的酶促水解导致低分子量的染色片段的释放，当向反应混合物中添加沉淀剂溶液时，所述片段保留在溶液中。离心去除不溶的高分子量材料，并且上清液的颜色是EG活性的量度。通过将2g AZO-CMC粉末溶解在80ml热milliQ水(±95℃)中，搅拌约20分钟以使其变得均质来制备底物溶液。随后，添加5ml乙酸盐缓冲液(2M，pH 4.5)，并用milliQ水将底物溶液补足至100ml。沉淀溶液是通过将40g乙酸钠和4g乙酸锌二水合物溶解在150mL的milliQ水中制成的。用4M HCl将pH调整至5.0，并用milliQ水将最终溶液补足至200ml。使用前，将20mL的该溶液与80mL乙醇(96％)混合，从而得到最终沉淀溶液。与测定中介于0.15AU与1.0AU之间的最终吸收相对应，将酶样品基于重量在乙酸钠缓冲液(100mM，pH 4.5，含有±25μLTriton X-100/L)中稀释。使用恒温混匀仪将底物溶液(200μL)在2ml埃彭道夫管(eppendorf tube)中在62℃和800rpm下预热10分钟。随后，添加200μl经稀释的酶样品，并将反应混合物在62℃下再孵育10分钟。通过添加1mL沉淀溶液终止反应。将反应混合物混合并在室温下平衡10分钟。在此之后，再次混合反应混合物，并在室温下以1000xg离心10分钟。使用水将分光光度计校准到零，在590nm处测量上清液的吸光度。空白是以与上文针对酶样品所描述的相同方式制备的，只是不是添加经稀释的酶样品，而是添加乙酸钠缓冲液(100mM，pH 4.5，含有±25μL Triton X-100/L))。内切葡聚糖酶活性以每mg蛋白质的单位数表示。一个EG单位被定义为导致在所述测定条件(pH4.5，62℃，10分钟孵育)下在590nm处测量的AZO-CMC每秒增加1mAU的酶量。
在一个实施方式中，本公开的酶组合物还可包含半纤维素酶。如本文所述，本公开的酶组合物优选包含半纤维素酶。应当理解，“半纤维素酶”是指“至少一种半纤维素酶”。因此，本公开的酶组合物可包含多于一种半纤维素酶。在一个实施方式中，半纤维素酶包含β-木糖苷酶和/或内切木聚糖酶。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可水解木二糖。β-木糖苷酶也可称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在一个实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的β-木糖苷酶中的至少一种是GH3β-木糖苷酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶均为GH3β-木糖苷酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自粗糙脉孢菌、烟曲霉或里氏木霉的β-木糖苷酶。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属诸如埃默森罗萨氏菌的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。
如本文所用，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物是EC3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一个实施方式中，内切木聚糖酶包括GH10木聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶均为GH10木聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/041405)、青霉属物种(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、莱色篮状菌、嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)或囊状长毛盘菌GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属诸如埃默森罗萨氏菌的内切木聚糖酶(参见WO 02/24926)。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物进一步包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)和/或纤维二糖水解酶II(CBHII)。
如本文所用，裂解性多糖单加氧酶是最近被CAZy分类为AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)的酶。因此，存在AA9裂解性多糖单加氧酶和AA10裂解性多糖单加氧酶。裂解性多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构，并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人,Journal of Biological Chemistry,第289卷,第5期,第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解性多糖单加氧酶。GH61最初基于一个家族成员中非常弱的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性而被分类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy重新分类为AA9家族。CBM33(家族33碳水化合物结合模块)也是一种裂解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人,Journal of BiologicalChemistry,第289卷,第5期,第2632-2642页)。CAZy最近将CBM33重新分类为AA10家族。
在一个实施方式中，裂解性多糖单加氧酶包括AA9裂解性多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有裂解性多糖单加氧酶均为AA9裂解性多糖单加氧酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自嗜热子囊菌属(诸如橙色嗜热子囊菌)的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2以及在WO2014/130812和WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的裂解性多糖单加氧酶；或来自梭孢壳属(诸如太瑞斯梭孢壳)的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812和WO 2008/148131以及WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的裂解性多糖单加氧酶；或来自曲霉属(诸如烟曲霉)的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的裂解性多糖单加氧酶；或来自青霉属(诸如埃默森青霉)的裂解性多糖单加氧酶，诸如在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的裂解性多糖单加氧酶。其他合适的裂解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉((参见WO2011/005867)、嗜热子囊菌属物种(参见WO 2011/039319)和甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceous)(参见WO 2011/041504)。可包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593(仅举几例)中。在一个优选实施方式中，裂解性多糖单加氧酶来自罗萨氏菌属，例如埃默森罗萨氏菌(参见WO 2012/000892)。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属(诸如烟曲霉)的纤维二糖水解酶II，诸如在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:7示出的纤维二糖水解酶II；或来自木霉属(诸如里氏木霉)的纤维二糖水解酶II；或来自篮状菌属(诸如莱色篮状菌)的纤维二糖水解酶II；或来自梭孢壳属(诸如太瑞斯梭孢壳)的纤维二糖水解酶II，诸如来自太瑞斯梭孢壳的纤维二糖水解酶IICEL6A。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属诸如埃默森罗萨氏菌的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。
酶组合物优选包含至少两种活性，尽管通常组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。酶组合物可包含每个活性类别中的多于一种酶活性。酶组合物可包含一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在一个实施方式中，酶组合物包含至少两种纤维素酶。如本文所用，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。至少两种纤维素酶可包含相同或不同的活性。酶组合物还可包含除纤维素酶以外的至少一种酶，例如半纤维素酶或果胶酶。如本文所用，半纤维素酶是能够降解或修饰半纤维素的任何多肽。如本文所用，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。至少一种其他酶可具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的附加活性。此类辅助活性的示例在本文中提及。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物除了葡糖淀粉酶(GA)和纤维二糖水解酶I(CBHI)之外还包含一种、两种、三种、四种或更多种类别的纤维素酶，例如裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶II(CBHII)、和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含葡糖淀粉酶(GA)、纤维二糖水解酶I、裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶II、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和内切木聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物还包含以下提及的酶中的一种或多种。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可作用于地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖，但不作用于仅包含1,3-键或1,4-键的β-D-葡聚糖。该酶也可称为地衣多糖酶(licheninase)、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶、地衣聚糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种类型的酶的替代物是EC3.2.1.6，被称为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于来自黑曲霉、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和大型亚灰树花菌(M.giganteus)(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酯。该酶也可称为α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶还可水解4-O-甲基化的葡糖醛酸，所述4-O-甲基化的葡糖醛酸也可以作为取代基存在于木聚糖中。替代物是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶(glucuronosidase)，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基键的水解。可包含在酶组合物中的α-葡糖醛酸酶的示例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、黄灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)(参见WO 2009/068565)和里氏木霉的α-葡糖醛酸酶。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖的去乙酰化的任何多肽。此类多肽可催化来自聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、乙酸α-萘酯或乙酸对硝基苯酯的乙酰基的水解，但是通常不催化来自三乙酰基甘油的乙酰基的水解。此类多肽通常不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。可包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于来自棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、细丽毛壳(Chaetomium gracile)、特异腐质霉DSM 1800(参见WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(参见WO 2010/014880)、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌属，诸如埃默森罗萨氏菌的乙酰木聚糖酯酶(参见WO 2010/000888)。
如本文所用，阿魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰糖+H2O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。它通常可催化来自酯化糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)的水解，所述酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。该酶也可称为肉桂酰基酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。它也可称为半纤维素酶辅助酶，因为它可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁的半纤维素和果胶。可包含在酶组合物中的阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)的示例包括但不限于来自特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/076122)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、黄灰青霉(参见WO 2009/127729)和太瑞斯梭孢壳(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酰酯酶。
如本文所用，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰基糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。该酶也可被称为反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落入EC3.1.1.73之内，因此也可称为阿魏酰酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷中的末端非还原α-D-半乳糖残基水解的任何多肽，所述α-D-半乳糖苷包括半乳糖低聚糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。此类多肽还能够水解α-D-岩藻糖苷。该酶也可称为蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽还可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。该酶也可称为外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。该酶也可称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中的末端非还原β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。该酶也可称为甘露聚糖酶(mannanase)或甘露聚糖酶(mannase)。
如本文所用，内切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中的1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。该酶也可称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸酯。该酶也可称为果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲基酯酶、果胶酶、果胶酯酶或果胶甲酯酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所用，内切半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。该酶也可被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶、内切-1,4-β-半乳聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中定义为具有乙酰基酯酶活性的任何酶，该酶催化果胶的GalUA残基的羟基处的乙酰基的去乙酰化。
如本文所用，内切果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲酯的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可被称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶；内切果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，果胶酸酯裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸聚糖的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可称为聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸酯裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸酯反式消除酶、内切半乳糖醛酸酯反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PP酶-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中的末端非还原α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。该酶也可称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够水解来自非还原末端的果胶，从而释放二半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶也可称为外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶、外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸酯。该酶也可称为半乳聚糖1,4-α-半乳糖醛酸酶、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸酯)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切聚半乳糖醛酸酯裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸盐(即去酯化果胶)的还原末端清除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶可被称为果胶酸酯二糖裂解酶、果胶酸酯外切裂解酶、外切果胶酸反式消除酶、外切果胶酸酯裂解酶、外切聚半乳糖醛酸反式消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端-二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖酰-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳糖醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够通过β-消除在鼠李半乳糖醛酸聚糖中以内切方式切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶是催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中具有交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的骨架的去乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木糖基半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸骨架而作用于木糖半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。该酶也可称为木糖半乳糖醛酸聚糖水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中的1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可称为内切阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其他部分(诸如糖)之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶根据EC 3.4进行表征，并且适合用于如本文所述的方法中。蛋白酶的一些特定类型包括半胱氨酸蛋白酶，包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶，包括糜蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等)的酶。在植物中，脂质被用作限制水分流失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括衍生自脂肪酸的蜡，以及角质和软木脂。
“木质素酶”包括可以水解或破坏木质素聚合物的结构的酶。可以分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酰酯酶，以及其他本领域所述的已知用于解聚或以其他方式破坏木质素聚合物的酶。还包括能够水解在半纤维素糖(特别是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但也可以催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可使用的己糖基转移酶的示例是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)的水解以产生醇的酶。许多葡糖醛酸酶已经被表征并且可适于使用，例如β-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.36)、葡糖醛酸基-二硫葡糖胺葡糖醛酸酶(3.2.1.56)、甘草酸酯β-葡糖醛酸酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键合，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。膨胀素(Swollenin)，一种扩展蛋白样蛋白，含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白或膨胀素样蛋白可包含此类结构域中的一者或两者和/或可破坏细胞壁的结构(诸如破坏纤维素结构)，任选地不产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)、纤维素/纤维小体整合蛋白，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合物。这是通过两个互补类别的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域和每个酶单位上的停靠结构域)的相互作用来完成的。支架蛋白亚基还带有纤维素结合模块(CBM)，其介导纤维小体与其底物的附着。支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一者或两者。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”是指催化两个过氧化氢转换为氧气和两个水的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC1.11.1.21)。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应在240nm处监测过氧化氢降解来确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应是在25℃下在pH7.0的50mM磷酸盐中用10.3mM底物(H202)和每ml大约100单位的酶进行的。在16-24秒内用分光光度法监测吸光度，这应对应于吸光度从0.45降低到0.4。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解的一微摩尔H202。
如本文所用的术语“淀粉酶”是指水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉)中的α-1,4-葡糖苷键的酶，诸如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)；以及水解α-1,6-糖苷键(为支链淀粉中的分支点)的酶，诸如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限糊精酶(EC 3.2.1.142)。
酶组合物可由上述酶类别中的每个酶类别的一个成员、一个酶类别的几个成员、或这些酶类别的任何组合构成。如本文所述的酶组合物中的不同酶可从不同来源获得。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可同时提供(即，作为单一组合物本身)或分开提供或顺序提供。
在一个实施方式中，酶组合物中的酶来源于真菌，优选地丝状真菌，或者酶包括真菌酶，优选丝状真菌酶。在一个实施方式中，一组核心的(木质素)纤维素降解酶(即纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)可来源于埃默森罗萨氏菌。如果需要，可以用来自其他来源的附加酶活性补充该组酶。这样的附加活性可来源于经典来源和/或由基因修饰的生物产生。因此，酶组合物可包含来自除罗萨氏菌属之外的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。在一个实施方式中，它们可与一种或多种罗萨氏菌属酶一起使用，或者它们可在不存在附加罗萨氏菌属酶的情况下使用。
“丝状真菌”包括亚门真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式(如Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi,第8版,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中所定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长进行的，并且碳分解代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomiumpaecilomyces、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸胞壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢霉属(Pyricularia)、罗萨氏菌属、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属、嗜热子囊菌属、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、木霉属和毛癣菌属(Trichophyton)的菌株。
几种丝状真菌菌株是公众在许多培养物保藏中心中可容易获得的，所述培养物保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and ZellkulturenGmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research ServicePatent CultureCollection，Northern Regional Research Center，NRRL)。此类菌株的示例包括黑曲霉CBS 513.88、米曲霉ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CBS455.95、橘青霉(Penicilliumcitrinum)ATCC 38065、产黄青霉P2、埃默森篮状菌CBS393.64、产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)ATCC 36225或ATCC 48272、里氏木霉ATCC26921或ATCC 56765或ATCC 26921、酱油曲霉(Aspergillus sojae)ATCC11906、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)C1、Garg 27K、VKM F-3500-D、ATCC44006以及它们的衍生物。
酶(例如以全发酵液的形式)可通过用合适的微生物(例如丝状真菌)发酵合适的底物来制备，其中酶由微生物产生。可改变微生物以改良或制备酶。例如，可通过经典的菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可以原样用于产生酶，或者可经改变以增加产量或产生改变的酶，所述改变的酶可包括异源酶，例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶，因此不是该微生物最初产生的酶。优选地，使用真菌，更优选地丝状真菌来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热的微生物。任选地，使用底物，所述底物诱导产生酶的微生物进行酶的表达。
在一个实施方式中，酶组合物是全发酵液。在一个实施方式中，酶组合物是真菌，优选丝状真菌，优选罗萨氏菌属的真菌的全发酵液。全发酵液可以由非重组和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，所述重组丝状真菌包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因，其中一个或多个基因编码可以降解纤维素底物的酶。全发酵液可包含本文所述多肽中的任一者，或它们的任何组合。
优选地，酶组合物是全发酵液，其中细胞被杀死(即非活的)。在一个实施方式中，全发酵液包含多肽、有机酸、被杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基。
通常，丝状真菌在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养。使用本领域已知的程序，在包含碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。适用于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件是本领域中已知的。可以通过使丝状真菌生长到静止期并使丝状真菌保持在有限的碳条件下持续足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备全发酵液。一旦丝状真菌将诸如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的酶分泌到发酵培养基中，全发酵液就可以使用。全发酵液可包含丝状真菌。在一个实施方式中，全发酵液包括在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。通常，全发酵液包括用过的培养基和在丝状真菌生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施方式中，全发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。可以使用本领域已知的方法杀死全发酵液中存在的丝状真菌细胞，以产生细胞被杀死的全发酵液。例如，添加有机酸导致细胞被杀死。如果需要，还可以将细胞裂解和/或透化。在一个实施方式中，全发酵液是细胞被杀死的全发酵液，其中全发酵液含有被杀死的丝状真菌细胞。换句话说，全发酵液包含更多的非活细胞而不是活细胞，优选仅包含非活细胞。在一些实施方式中，通过利用化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，以产生丝状真菌发酵的细胞被杀死的全发酵液。在一些实施方式中，通过利用化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调整至合适的pH。在一个实施方式中，将全发酵液与有机酸混合。
如本文所用的术语“全发酵液”是指通过细胞发酵产生的制备物，所述制备物不进行或仅进行最小的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，宿主细胞对酶进行表达)并分泌到细胞培养基中时，产生全发酵液。通常，全发酵液是未分级的，并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶，以及微生物细胞，优选非活细胞。
在一个实施方式中，可以将全发酵液分级，并且可以使用分级的内容物中的一种或多种。例如，可以从全发酵液中去除被杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的酶组合物。
全发酵液可进一步包含防腐剂和/或抗微生物剂。此类防腐剂和/或抗微生物剂是本领域中已知的。在一个实施方式中，用于杀死细胞的有机酸还可以具有防腐剂和/或抗微生物剂的功能。
如本文所述的全发酵液通常是液体，但是可包含不溶性组分，诸如被杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性组分以提供澄清的全发酵液。
在一个实施方式中，可向全发酵液中补充一种或多种不是内源性表达的或者由丝状真菌以相对低的水平表达的酶活性，以改善将纤维素底物降解为例如可发酵的糖，诸如葡萄糖或木糖。补充酶可以作为全发酵液的补充物添加，即它们被掺入到全发酵液中。附加酶可以以全发酵液的形式补充，或者可作为纯化的、或最低限度回收和/或纯化的酶补充。
在一个实施方式中，全发酵液可用至少另一种全发酵液补充。另一种全发酵液可来源于相同类型的真菌或来自另一类型的真菌，例如第一全发酵液可来源于罗萨氏菌属，而第二全发酵液可来源于罗萨氏菌属或曲霉属。
在一个实施方式中，全发酵液是过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的全发酵液。可替代地，全发酵液是非重组丝状真菌发酵的全发酵液和过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的全发酵液的混合物。在一个实施方式中，全发酵液是过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌的发酵的全发酵液。可替代地，全发酵液是非重组丝状真菌发酵的全发酵液和过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌的发酵的全发酵液的混合物。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物具有2.0至5.5的pH。优选地，酶组合物具有2.5至5.0的pH。更优选地，酶组合物具有3.0至4.5的pH。因此，酶组合物中的酶能够在低pH下工作。
在一个实施方式中，用于制备如本文所述的酶组合物的方法中所使用的酶生产反应器具有至少1m3的体积。优选地，酶生产反应器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3的体积。通常，酶生产反应器将小于300m3。
在用于制备如本文所述的酶组合物的方法中，在液体或固体培养基中，在适合生长的条件下培养微生物细胞(例如丝状真菌细胞)的群体。在一个实施方式中，微生物细胞以补料分批培养、分批培养、连续培养或它们的任何组合进行培养。优选地，丝状真菌以补料分批培养进行培养。本领域技术人员熟知各种培养模式及其条件。在一个实施方式中，培养在需氧条件下进行。本领域技术人员熟知用于需氧培养的发酵罐设计，诸如搅拌罐和鼓泡塔。
本公开涉及一种用于由纤维素材料制备糖的方法，其包括以下步骤：(a)用酶组合物水解纤维素材料以获得糖，以及(b)任选地，回收糖，其中酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I，并且葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于纤维二糖水解酶I和葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。针对如本文所述的酶组合物所描述的所有实施方式也适用于如本文所述的用于由纤维素材料制备糖的方法。
本公开涉及一种用于由纤维素材料制备糖的方法，其包括以下步骤：(a)用如本文所述的酶组合物水解纤维素材料以获得糖，以及(b)任选地，回收糖。
本公开涉及一种用于由纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用酶组合物水解纤维素材料以获得糖，(b)通过使所获得的糖与发酵微生物接触来发酵所获得的糖以产生发酵产物，以及(c)任选地，回收发酵产物，其中酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I，并且葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于纤维二糖水解酶I和葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。针对如本文所述的酶组合物所描述的所有实施方式也适用于如本文所述的用于由纤维素材料产生发酵产物的方法。
本公开还涉及一种用于由纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用如本文所述的酶组合物水解纤维素材料以获得糖，(b)通过使所获得的糖与发酵微生物接触来发酵所获得的糖以产生发酵产物，以及(c)任选地，回收发酵产物。
在酶促水解后，可对经水解的纤维素材料进行至少一次固/液分离。固/液分离的方法和条件将取决于所使用的纤维素材料的类型，并且完全在技术人员的能力范围内。示例包括但不限于离心、旋风分离、过滤、滗析、筛分和沉降。在一个优选实施方式中，固/液分离是通过离心或沉降进行的。在固/液分离期间，可使用用于改善分离的手段和/或辅助手段。
在一个实施方式中，纤维素材料在酶促水解之前经受预处理步骤。在一个实施方式中，纤维素材料在酶促水解之前经受洗涤步骤。在一个实施方式中，纤维素材料在酶促水解之前经受至少一次固/液分离。因此，在对纤维素材料进行酶促水解之前，可以对所述纤维素材料进行至少一次固/液分离。固/液分离可在预处理步骤之前和/或之后进行。用于固/液分离的合适方法和条件已在上文中描述。
在一个实施方式中，经酶促水解的纤维素材料经受固/液分离步骤，之后是脱毒步骤和/或浓缩步骤。
在如本文所述的方法中，可将纤维素材料添加到一个或多个水解反应器中。在一个实施方式中，在添加纤维素材料之前，酶组合物已经存在于一个或多个水解反应器中。在另一个实施方式中，可将酶组合物添加到一个或多个水解反应器中。在一个实施方式中，在添加酶组合物之前，纤维素材料已经存在于一个或多个水解反应器中。在一个实施方式中，将纤维素材料和酶组合物两者同时添加到一个或多个水解反应器中。一个或多个水解反应器中存在的酶组合物可以是水性组合物。
在一个实施方式中，酶促水解至少包括液化步骤，其中在至少第一水解反应器中水解纤维素材料；以及糖化步骤，其中在至少第一水解反应器中和/或在至少第二水解反应器中水解液化的纤维素材料。糖化可以在与液化相同的水解反应器(即至少第一水解反应器)中进行，其也可以在单独的水解反应器(即至少第二水解反应器)中进行。因此，在酶促水解中，可将液化和糖化组合。可替代地，液化和糖化可以是单独步骤。液化和糖化可在不同的温度下进行，但是也可在单一温度下进行。在一个实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选在60-85℃的温度下进行，并且糖化优选在50-65℃的温度下进行。
酶促水解可以在一个或多个水解反应器中进行，但是也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中进行。当酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时也是如此。液化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，但是也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中进行，和/或糖化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，但是也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中进行。要使用的水解反应器的示例包括但不限于补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流动搅拌反应器和连续活塞流柱反应器。搅拌可以通过一个或多个叶轮、泵和/或静态混合器来完成。
酶促水解中使用的酶可在酶促水解之前和/或期间添加。如上所述，当在酶促水解之前对纤维素材料进行固/液分离时，酶促水解中使用的酶可在固/液分离之前添加。可替代地，它们也可在固/液分离之后或者固/液分离之前和之后添加。酶也可在酶促水解期间添加。在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，可在液化步骤期间和/或之后添加附加酶。可在糖化步骤之前和/或期间添加附加酶。也可在糖化步骤之后添加附加酶。
在一个实施方式中，总酶促水解时间为10小时或更长时间、12小时或更长时间、14小时或更长时间、16小时或更长时间、18小时或更长时间、20小时或更长时间、30小时或更长时间、40小时或更长时间、50小时或更长时间、60小时或更长时间、70小时或更长时间、80小时或更长时间、90小时或更长时间、100小时或更长时间、110小时或更长时间、120小时或更长时间、130小时或更长时间、140小时或更长时间、150小时或更长时间、160小时或更长时间、170小时或更长时间、180小时或更长时间、190小时或更长时间、200小时或更长时间。
在一个实施方式中，总酶促水解时间为10小时至300小时、16小时至275小时，优选20小时至250小时，更优选30小时至200小时，最优选40小时至150小时。
用于酶促水解的一个或多个水解反应器中的纤维素材料的粘度介于10cP与20,000cP之间、介于10cP与15,000cP之间，优选介于10cP与10,000cP之间。
在该方法包括包含液化步骤和糖化步骤的酶促水解的情况下，液化步骤中的纤维素材料的粘度介于10cP与4000cP之间、介于10cP与2000cP之间，优选介于10cP与1000cP之间，和/或糖化步骤中的纤维素材料的粘度优选介于10cP与1000cP之间。
粘度可以用Rheolab QC粘度计，使用Rushton叶轮，在用于水解的温度和雷诺数<10下确定。
在一个实施方式中，在酶促水解期间添加氧。在一个实施方式中，在酶促水解的至少一部分期间添加氧。可以在酶促水解期间连续或不连续地添加氧。在一个实施方式中，在酶促水解期间添加氧一次或多次。在一个实施方式中，可在酶促水解之前、在将纤维素材料添加到用于酶促水解的水解反应器期间、在将酶添加到用于酶促水解的水解反应器期间、在酶促水解的一部分期间、在整个酶促水解期间或它们的任何组合中添加氧。向在酶促水解中使用的一个或多个水解反应器中添加氧。
氧可以几种形式添加。例如，氧可以以氧气、富氧气体(诸如富氧空气)或空气的形式添加。如何添加氧的示例包括但不限于借助于以下方式来添加氧：鼓泡、电解、氧的化学添加、从顶部填充在酶促水解中使用的一个或多个水解反应器(将水解产物投入罐中，由此将氧引入水解产物中)，以及将氧添加到所述一个或多个水解反应器的顶部空间中。当将氧添加到水解反应器的顶部空间中时，可供应水解反应所需的足够的氧。通常，可以控制和/或改变添加到水解反应器中的氧的量。通过仅在水解时间的部分期间在所述水解反应器中添加氧，可以限制所供应的氧。另一种选择是添加低浓度的氧，例如通过使用空气和循环空气(离开水解反应器的空气)的混合物，或者通过用惰性气体“稀释”空气。通过在较长的水解时间段期间添加氧、添加较高浓度的氧或添加更多空气，可以实现氧添加量的增加。控制氧浓度的另一种方式是添加氧消耗器和/或氧发生器。可以将氧引入(例如吹入)水解反应器中存在的纤维素材料中。也可以将所述氧吹入水解反应器的顶部空间中。
在一个实施方式中，在将纤维素材料添加到所述一个或多个水解反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧添加到酶促水解中使用的一个或多个水解反应器中。氧可与进入水解反应器的纤维素材料一起引入。可将氧引入材料流中，所述材料流将进入水解反应器中，或者与水解反应器内容物的经过水解反应器的外部回路的部分一起引入。
在一个实施方式中，酶促水解和/或发酵中使用的反应器具有至少1m3的体积。优选地，反应器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的体积。通常，反应器将小于3000m3或5000m3。在酶促水解中使用几个反应器的情况下，它们可具有相同的体积，但也可具有不同的体积。在酶促水解包括单独的液化步骤和糖化步骤的情况下，用于液化步骤的水解反应器和用于糖化步骤的水解反应器可具有相同的体积，但也可具有不同的体积。
在一个实施方式中，酶促水解在40-90℃，优选45-80℃，更优选50-70℃并且最优选55-65℃的温度下进行。
如本文所用的纤维素材料包括任何含纤维素的材料。优选地，如本文所用的纤维素材料包括木质纤维素材料和/或半纤维素材料。如本文所用的纤维素材料还可包含淀粉和/或蔗糖。适用于如本文所述的方法的纤维素材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质，诸如农业生物质、商业有机物、建筑和拆除垃圾、城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、黑麦、燕麦、小麦秸秆、甘蔗、甘蔗秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、木薯、糖蜜、大麦、玉米、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、玉米芯、芸苔茎、大豆茎、甜高粱、玉米粒(包括来自谷粒的纤维)、酒糟(DDGS)、来自谷物(诸如玉米、小麦和大麦)的研磨(包括湿磨和干磨)的通常被称为“麸皮或纤维”的产物和副产物，以及城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废弃物、废纸，以及制浆造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、甘蔗、玉米和玉米壳、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、短期轮种木本作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、蔓藤、糖用甜菜、甜菜粕、小麦苗、燕麦壳，以及硬木和软木(不包括具有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括从包括农业和林业活动在内的农业过程中产生的有机废弃物材料，特别地包括林业木材废弃物。农业生物质可以是单独的任何上述，或者是它们的任何组合或混合物。
在一个实施方式中，纤维素材料在酶促水解之前进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，并且包括但不限于加热、机械、化学修饰、生物修饰，以及它们的任何组合。在一个实施方式中，预处理是蒸汽处理、稀酸处理、有机溶剂处理、石灰处理、ARP处理或AFEX处理。通常进行预处理是为了增强纤维素材料对酶促水解而言的可及性和/或水解半纤维素和/或溶解纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100-260℃、7-45巴的压力、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下在120-200℃、2-15巴的压力、酸性pH下用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在有机溶剂和蒸汽的存在下在160-200℃、在7-30巴的压力、酸性pH下用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在水/蒸汽的存在下在60-160℃、1-10巴的压力、碱性pH下用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(在150-180℃、9-17巴的压力、碱性pH下用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20巴的压力、碱性pH下用>15％的NH3处理5-30分钟)。
可洗涤纤维素材料。在一个实施方式中，可在预处理之后洗涤纤维素材料。洗涤步骤可用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。除了洗涤，还存在其他脱毒方法。纤维素材料也可通过这些方法中的任一种(或任何组合)进行脱毒，所述方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、过量加灰(overliming)、添加还原剂、添加脱毒酶(诸如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解产物脱毒的微生物。
在一个实施方式中，进行水解步骤，直到纤维素材料中70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多的可用糖被释放。
在一个实施方式中，酶促水解中纤维素材料的干物质含量为10％-40％(w/w)、11％-35％(w/w)、12％-30％(w/w)、13％-29％(w/w)、14％-28％(w/w)、15％-27％(w/w)、16％-26％(w/w)、17％-25％(w/w)。
在一个实施方式中，水解中添加的酶组合物的量(本文中也称为酶剂量或酶负载)低。在一个实施方式中，酶组合物的量为10mg蛋白质/g干物质重量或更低、9mg蛋白质/g干物质重量或更低、8mg蛋白质/g干物质重量或更低、7mg蛋白质/g干物质重量或更低、6mg蛋白质/g干物质重量或更低、5mg蛋白质/g干物质或更低、4mg蛋白质/g干物质或更低、3mg蛋白质/g干物质或更低、2mg蛋白质/g干物质或更低、或1mg蛋白质/g干物质或更低(表示为以mg蛋白质/g干物质计的蛋白质)。在一个实施方式中，酶组合物的量为5mg酶/g干物质重量或更低、4mg酶/g干物质重量或更低、3mg酶/g干物质重量或更低、2mg酶/g干物质重量或更低、1mg酶/g干物质重量或更低、0.5mg酶/g干物质重量或更低、0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低、0.3mg酶/g干物质重量或更低、0.25mg酶/g干物质重量或更低、0.20mg酶/g干物质重量或更低、0.18mg酶/g干物质重量或更低、0.15mg酶/g干物质重量或更低、或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为以mg酶/g干物质计的纤维素酶总量)。
在一个实施方式中，在酶促水解中以2mg蛋白质/克干物质重量至20mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中的葡聚糖的量使用酶组合物。在一个实施方式中，在酶促水解中以4.5mg蛋白质/克干物质重量至15mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中的葡聚糖的量使用酶组合物。在一个实施方式中，在酶促水解中以5mg蛋白质/克干物质重量至12mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中的葡聚糖的量使用酶组合物。在一个实施方式中，在酶促水解中以6mg蛋白质/克干物质重量至10mg蛋白质/克干物质重量的纤维素材料中的葡聚糖的量使用酶组合物。
如上所述，本公开还涉及一种用于由纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用酶组合物水解纤维素材料以获得糖，(b)通过使所获得的糖与发酵微生物接触来发酵所获得的糖以产生发酵产物，以及(c)任选地，回收发酵产物，其中酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I，并且葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于纤维二糖水解酶I和葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。
如上所述，本公开还涉及一种用于由纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用如本文所述的酶组合物水解纤维素材料以获得糖，(b)通过使所获得的糖与发酵微生物接触来发酵所获得的糖，以产生发酵产物，以及(c)任选地，回收发酵产物。
在一个实施方式中，在一个或多个发酵反应器中进行发酵(即步骤b)。在一个实施方式中，由产醇微生物进行发酵以产生醇。在一个实施方式中，由产有机酸微生物进行发酵以产生有机酸。由产醇微生物进行发酵以产生醇可以在其中进行酶促水解的同一发酵反应器中进行。可替代地，由产醇微生物进行发酵以产生醇和由产有机酸微生物进行发酵以产生有机酸可以在一个或多个独立的发酵反应器中进行，但是也可在一个或多个相同的发酵反应器中进行。
在一个实施方式中，发酵由酵母进行。在一个实施方式中，产醇微生物和/或产有机酸微生物是酵母。在一个实施方式中，产醇微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。在一个实施方式中，产有机酸微生物能够发酵至少C6糖。在一个实施方式中，产醇微生物和产有机酸微生物是不同的微生物。在另一个实施方式中，产醇微生物和产有机酸微生物是同一微生物，即产醇微生物还能够产生有机酸，诸如琥珀酸。
在另一方面，本公开因此包括发酵过程，其中微生物用于发酵包含一种或多种糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括任何碳水化合物寡聚体或聚合物，包括L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元，诸如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等。为了从此类碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单元，可将适当的糖酶(诸如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)添加到发酵培养基中，或者可由经修饰的宿主细胞产生所述糖酶。在后一种情况下，可对经修饰的宿主细胞进行遗传工程改造以产生和分泌此类糖酶。使用葡萄糖的低聚或聚合源的另外优点在于，其例如通过使用限速量的糖酶，使得能够在发酵期间保持(较)低的游离葡萄糖浓度。这继而将防止阻抑非葡萄糖的糖(诸如木糖)的代谢和运输所需的系统。在一种优选方法中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖两者，优选同时发酵，在这种情况下，优选使用对葡萄糖阻抑不敏感的经修饰的宿主细胞以防止二次生长。除了L-阿拉伯糖，任选地木糖(和葡萄糖)的来源作为碳源之外，发酵培养基还将包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(诸如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成是本领域中众所周知的。
发酵时间可比相同条件下的常规发酵更短，其中酶促水解的一部分仍然必须在发酵期间进行。在一个实施方式中，对于具有50g/l葡萄糖和来自碳水化合物材料的对应的其它糖(例如50g/l木糖、35g/l L-阿拉伯糖和10g/l半乳糖)的糖组合物，发酵时间为100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短、70小时或更短、或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，发酵时间可对应地缩短。在一个实施方式中，乙醇生产步骤的发酵时间对于由C6糖制成的乙醇介于10小时与50小时之间，并且对于由C5糖制成的乙醇介于20小时与100小时之间。在一个实施方式中，琥珀酸生产步骤的发酵时间介于20小时与70小时之间。
发酵过程可以是需氧或厌氧发酵过程。厌氧发酵过程在本文中定义为在不存在氧或基本上不消耗氧，优选消耗小于5mmol/L/h、2.5mmol/L/h或1mmol/L/h，更优选0mmol/L/h(即无法检测到氧消耗)的情况下进行的发酵过程，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体两者。在没有氧的情况下，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为了解决该问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而使NAD+再生。因此，在一个优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸用作电子(和氢受体)，并被还原为发酵产物，诸如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选实施方式中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有利的，因为它比需氧过程便宜：需要更少的专用设备。此外，厌氧过程有望比需氧过程提供更高的产物收率。通常在需氧条件下的生物质收率高于在厌氧条件下的生物质收率。因此，通常在需氧条件下的预期产物收率低于在厌氧条件下的预期产物收率。
在另一个实施方式中，发酵过程是在限氧条件下进行的。更优选地，发酵过程是需氧且在限氧条件下进行的。限氧发酵过程是其中氧消耗受到从气体传递到液体的氧的限制的过程。限氧程度取决于进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/质量传递特性。优选地，在限氧条件下的过程中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选至少6mmol/L/h，并且甚至更优选至少7mmol/L/h。
在一个实施方式中，醇发酵过程是厌氧的，而有机酸发酵过程是需氧的，但在限氧条件下进行。
发酵过程优选在对所用微生物最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，发酵过程是在低于42℃，优选38℃或更低的温度下进行的。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度和高于20℃、22℃或25℃的温度下进行。在一个实施方式中，醇发酵步骤和有机酸发酵步骤在介于25℃与35℃之间进行。
在一个实施方式中，用发酵微生物进行发酵。在一个实施方式中，用C5发酵微生物进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在一个实施方式中，用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇生产的可商购获得的酵母包括但不限于BIOFERMTMAFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOLREDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSMFood Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个优选实施方式中，发酵产物是醇并且发酵微生物是能够发酵至少一种C5糖的产醇微生物。
在一个实施方式中，在一个或多个繁殖反应器中进行产醇微生物和/或产有机酸微生物的繁殖。在繁殖后，可将产醇微生物和/或产有机酸微生物添加到一个或多个发酵反应器中。可替代地，将产醇微生物和/或产有机酸微生物的繁殖与由产醇微生物和/或产有机酸微生物进行的发酵进行组合，以分别产生醇和/或有机酸。
在一个实施方式中，产醇微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它还能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方式中，本公开还描述了一种用于由纤维素材料制备乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行如本文所述的由纤维素材料制备糖产物的方法，(b)发酵经酶促水解的纤维素材料以产生乙醇；以及(c)任选地，回收乙醇。可以用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行发酵。
在一个实施方式中，产有机酸微生物是能够发酵至少一种C6糖的微生物。在一个实施方式中，本公开描述了一种用于由纤维素材料制备琥珀酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行如本文所述的由纤维素材料制备糖产物的方法，(b)发酵经酶促水解的纤维素材料以产生琥珀酸；以及(c)任选地，回收琥珀酸。可以用能够发酵至少一种C6糖的微生物进行发酵。
产醇微生物可以是原核或真核生物。在该方法中使用的微生物可以是经遗传工程改造的微生物。合适的产醇生物的示例是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；汉逊酵母属(Hansenula)；伊萨酵母属(Issatchenkia)，例如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；毕赤酵母属(Pichia)，例如树干毕赤酵母(Pichia stipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)；假丝酵母属(Candida)，例如拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或酸性嗜热假丝酵母(Candida acidothermophilum)；管囊酵母属(Pachysolen)，例如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)；或细菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus)(诸如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis))、地芽胞杆菌属(Geobacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))、梭菌属(Clostridium)(例如植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans))、埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于酵母属，优选地属于酿酒酵母物种。在如本文所述的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)能够转化己糖(C6)和戊糖(C5)。在如本文所述的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)可以厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除葡萄糖外，酵母还能够厌氧地使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。能够从L-阿拉伯糖产生乙醇的生物，例如酿酒酵母菌株，可通过以下方式产生：修饰宿主酵母，从而引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖乙醛酸酯)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因。可将此类基因引入宿主细胞中，以使所述宿主细胞能够使用阿拉伯糖。此类方法描述于WO2003/095627中。来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD基因可被使用并公开于WO2008/041840中。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的araA基因和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的araB和araD基因可被使用并且公开于EP1499708中。在另一个实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于棒形杆菌属(Clavibacter)、节细菌属(Arthrobacter)和/或革兰菌属(Gramella)中的至少一种，特别是密歇根棒形杆菌(Clavibacter michiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和/或弗塞特革兰菌(Gramella forsetii)中的一种，如在WO 2009011591中所公开的。在一个实施方式中，酵母还可包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因，和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的示例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因；使醛糖还原酶(GRE3)基因缺失；过表达PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1，以允许增大通过细胞中的戊糖磷酸途径的通量。经遗传工程改造的酵母的示例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适的商业酵母的示例是RN1016，其为来自荷兰DSM的发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母菌株。
在一个实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是厌氧的。厌氧已经在本文先前定义。在另一个优选实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是需氧的。在另一个优选实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是在限氧条件下，更优选地需氧且在限氧的条件下进行的。限氧条件已经在本文先前定义。
可替代地，对于上述发酵过程，可使用至少两种不同的细胞，这意味着该过程是共发酵过程。如上所述的发酵过程的所有优选实施方式也是该共发酵过程的优选实施方式：发酵产物的鉴定、L-阿拉伯糖源和木糖源的鉴定、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、执行过程的温度、乙醇生产率、乙醇收率)。
产有机酸微生物可以是原核或真核生物。在该方法中使用的微生物可以是经遗传工程改造的微生物。合适的产有机酸生物的示例是酵母，例如酵母属，例如酿酒酵母；真菌，例如曲霉属菌株，诸如黑曲霉和烟曲霉、雪白丝衣霉(Byssochlamys nivea)、虎皮香菇属(Lentinus degener)、宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)和葡萄酒青霉(Penicilliumviniferum)；以及细菌，例如产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannhei succiniciproducers)MBEL 55E、大肠杆菌、丙酸杆菌属(Propionibacterium)物种、梳状菌属(Pectinatus)物种、拟杆菌属(Bacteroides)物种诸如嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amylophilus)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succcinimonas amylolytica)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinisolvens)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)和产琥珀酸噬纤维菌(Cytophagasuccinicans)。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C6糖的产有机酸微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于酵母属，优选地属于酿酒酵母物种。如本文所述的有机酸的生产过程中使用的酵母，例如酿酒酵母，能够转化己糖(C6)糖。如本文所述的方法中使用的酵母，例如酿酒酵母，可以厌氧发酵至少一种C6糖。
可缩短总反应时间(或水解步骤和发酵步骤一起的反应时间)。在一个实施方式中，在90％葡萄糖收率下，总反应时间为300小时或更短、200小时或更短、150小时或更短、140小时或更短、130或更短、120小时或更短、110小时或更短、100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短、75小时或更短、或约72小时。对应地，在较低的葡萄糖收率下可达到较低的总反应时间。
可通过如本文所述的方法生产的发酵产物可以是来源于发酵的任何物质。它们包括但不限于醇(诸如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(诸如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(诸如丙酮)；氨基酸(诸如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(诸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(诸如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃(诸如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；以及气体(诸如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶诸如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。在一个优选实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备有机酸和/或醇。在一个优选实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备琥珀酸和/或乙醇。优选地，发酵产物是醇，优选为乙醇。
发现如本文所述的有益效应适用于几种纤维素材料，并且因此据信对于水解所有种类的纤维素材料都存在所述有益效应。发现了对几种酶的有益效应，并且因此据信对所有种类的水解酶组合物都存在所述有益效应。
实施例
实施例1
GA与CBH1的比率对纤维素材料的酶促水解的影响
在本实施例中示出葡糖淀粉酶(GA)与纤维二糖水解酶I(CBHI)的比率对纤维素材料的酶促水解的影响。
基本上如US9738890和WO2011/054899中所述构建并选择表达GA的罗萨氏菌属菌株。基本上如WO2014/202622中所述产生包含GA的组合物。GA的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中示出。核苷酸序列在SEQ ID NO:1中示出。
基本上如WO2012/000890中所述产生包含β-葡糖苷酶(BG)的组合物。BG的氨基酸序列在SEQ ID NO:7中示出。核苷酸序列在SEQ ID NO:6中示出。
基本上如WO 2011/000949中所述产生埃默森罗萨氏菌酶混合液。埃默森罗萨氏菌酶混合液是包含CBHI的全发酵液。CBHI的氨基酸序列在SEQ ID NO:4中示出。核苷酸序列在SEQ ID NO:3中示出。
使用缩二脲法确定GA组合物、BG组合物和酶混合液的蛋白质浓度。在缩二脲反应中，铜(II)离子被还原为铜(I)，其在碱性溶液中与肽键的氮和碳形成络合物。紫色指示蛋白质的存在。根据朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律，颜色的强度以及因此在546nm处的吸收与蛋白质浓度成正比。肽在此测定中也有反应。通过对样品进行10kD过滤并从“原样的”样品中减去该10kD滤液的结果，可以在很大程度上排除这些问题。
使用含有0.2g/L Tween-80的水制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和15mg/ml)，以生成校准曲线。基于重量，用水适当稀释GA组合物、BG组合物和酶混合液样品，以落入BSA校准线的结果之内，并以>14000xg离心5分钟。收集每个经稀释样品的上清液并进一步称为样品上清液。接下来，将每个经稀释样品的500μL样品上清液转移到含有10kD过滤器的离心反应管中，并在15-20℃之间根据需要离心，以获得至少200μL滤液，其进一步称为样品上清液-10kD滤液。
将所有样品上清液、样品上清液-10kD滤液和BSA稀释液中的200μL转移到1.5mL反应管中，向其中添加800μL BioQuant缩二脲试剂并充分混合。接下来，将所有混合物在室温下孵育至少30分钟。使用水样品作为空白测量，在546nm处测量混合物的吸收。使用在BSA校准线范围内的在546nm处给出吸收值的GA组合物、BG组合物和酶混合液样品的稀释液，通过BSA校准线计算样品的总蛋白质浓度。从在样品上清液中测量的蛋白质浓度中减去在样品上清液-10kD滤液中测量的蛋白质浓度以得到GA组合物、BG组合物和酶混合液样品的最终蛋白质浓度。
如下确定GA组合物、BG组合物和酶混合液中的GA和CBHI的量。将酶混合液的样品在20817rcf和4℃下离心10分钟，并将上清液稀释至大约1mg/mL蛋白质的最终浓度(使用缩二脲法确定蛋白质浓度(参见上文))。将每个样品的100μg蛋白质转移到埃彭道夫管中，并向样品中添加蛋白酶抑制剂混合物(蛋白酶抑制剂混合液，HALT，Thermo FisherScientific)。使用DTT或TCEP对样品进行二硫桥还原，随后使用碘乙酰胺对游离半胱氨酸进行烷基化。使用冰冷的在丙酮中的20％ TCA沉淀蛋白质。用胰蛋白酶消化蛋白质沉淀，然后用PNG酶F去糖基化，并在与QExactive Plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific)联用的ultimate 3000(柱：Waters Acquity UPLC CSH C18，1.7μm，2.1mm x 100mm)上进行分析。使用Proteome Discoverer 2.3针对内部构建的埃默森罗萨氏菌蛋白质数据库搜索所获得的数据。使用Percolator将结果过滤至<1％错误发现率。使用所谓的top3方法对所鉴定的蛋白质进行量化(参见Silva JC等人Mol.&Cell Proteomics 5.1:第144-156页,2006)并通过每个样品中的所有蛋白质的摩尔比和每种蛋白质的分子量转化为％(w/w)。
酶混合液含有37％(w/w)CBHI且不含GA。GA组合物含有45％(w/w)GA和1.1％(w/w)CBH1。BG组合物含有2.2％(w/w)CBH1且不含GA。
实验和所应用的酶剂量的概述在表1中示出。基于酶混合液、GA组合物和BG组合物的所应用的剂量以及在混合液和组合物中确定的GA和CBHI含量计算RCBHI和RGA。
以mg/g干物质(DM)计的所投配的CBHI蛋白质总量除以以mg/g干物质计的所投配的CBHI蛋白质总量与所投配的GA蛋白质总量之和反映在下式中：RCBHI＝CBHI/(CBHI+GA)。以mg/g干物质计的所投配的GA蛋白质总量除以以mg/g干物质计的所投配的GA蛋白质总量与所投配的CBHI蛋白质总量之和反映在下式中：RGA＝GA/(GA+CBHI)。
水解反应是用酸预处理的玉米纤维进行的。玉米纤维的预处理条件为：135-137℃，20-45min和pH＝1.8(通过添加H2SO4)并且所得的预处理的玉米纤维由～13％(w/w)总葡聚糖(其中±5-15％以葡萄糖的形式存在)、8.5％(w/w)总木聚糖(其中±20-40％以木糖的形式存在)和5％(w/w)总阿拉伯聚糖(其中±75-90％以阿拉伯糖的形式存在)构成。将材料的pH设置为4.8，并且每次水解反应均使用20g预处理的玉米纤维进行，最终干物质浓度为10％(w/w)，将其添加到50mL管中。
在每个实验开始时，每克干物质添加2.75mg总蛋白质，并将管置于55℃恒温的旋转培养箱中。在水解24小时后取样进行分析。立即将样品以4000xg离心8分钟。将上清液经0.20μm尼龙过滤器过滤，并将滤液储存在4℃下，直到如下文所述分析葡萄糖含量。
根据NREL技术报告NREL/TP-510-42623(2008年1月)，使用配备有Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories)的HPLC测量样品的葡萄糖浓度。
结果在表2中给出。结果清楚地显示出在其中RCBHI为0.97、0.94、0.88、0.77和0.66的实验中葡萄糖释放的增加。结果还清楚地显示出在其中RGA为0.03、0.06、0.12、0.23和0.34的实验中葡萄糖释放的增加。由结果可知，在其中RCBHI为0.98至0.60并且RGA为0.02至0.40的实验中发现葡萄糖释放的增加。
表1：所应用的酶共混物的概述。
实验 1 2 3 4 5 6 7 8
酶混合液(mg总蛋白质/g DM)1 2.50 2.44 2.38 2.25 2.00 1.75 1.50 1.25
GA组合物(mg总蛋白质/g DM)2 0.00 0.06 0.13 0.25 0.5 0.75 1.00 1.25
BG组合物(mg总蛋白质/g DM)3 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
总蛋白质(mg/g DM) 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75
GA(mg蛋白质/g DM) 0.00 0.03 0.06 0.11 0.23 0.34 0.45 0.56
CBHI(mg蛋白质/g DM) 0.93 0.91 0.89 0.84 0.75 0.66 0.57 0.48
RCBHI＝CBHI/(CBHI+GA) 1.00 0.97 0.94 0.88 0.77 0.66 0.56 0.46
RGA＝GA/(GA+CBHI) 0.00 0.03 0.06 0.12 0.23 0.34 0.44 0.56
1酶混合液含有37％ CBHI，不含GA
2GA组合物含有45％ GA和1.1％ CBHI
3BG组合物含有2.2％ CBHI，不含GA
表2：水解24小时后的葡萄糖释放。
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 (DSM IP Assets B.V.)
<120> 酶组合物
<130> 33961-WO-PCT
<150> EP21166960.1
<151> 2021-04-06
<160> 7
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1932
<212> DNA
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> 葡糖淀粉酶
<400> 1
atggctcctc ctctgtccta tgcgctgttc gcgctcgctc tcagcccggc ggtcatggca 60
gaccctctgc tgaaatcgcg cgcaacggcc agcctgagca gctggctggc cacggagacg 120
tcgtatgcgc tcgaggctat cctgaacaac atcggctcgt cgggtgcgtg ggcgcaatca 180
gccagcccag gcatcgtcgt ggccagtccc agcacgagcg atccagatta ctactacacc 240
tggacgcgag actcagcgct gaccttaaag gtgctgatcg acctcttcaa gaacggcaac 300
tccagcctcc agggcgtgat cgaggagtat atcgatgcgc aggcctatct ccagacggta 360
tccaatccgt ctggcaccct gtctacgggt ggcctggggg agcccaagtt caatgtcgac 420
aaaaccgcat ttaccggcag ctgggggcgt ccgcagcgag atggtccggc cctgcgagct 480
actgcgctga tttcttttgg cgaatggctg attgataatg gctattcgac gtatgcgtct 540
gatattgtgt ggcccattgt gcgcaatgat ctgtcatatg tcgcacagta ttggaacgag 600
accggttacg atctctggga ggaagtcgac gggtcttcgt tctttaccgt cgccgtccag 660
catcgcgcgc tggttgaggg agccaacttt gccagcgcac tgggaacgtc atgcgactac 720
tgtacctctc aggctcctga gatcctctgc tacctgcagt ccttctggac ggggtcctac 780
atcttggcca acttccagag cagccgctca ggaaaggacg tcaacaccat cctaggcagc 840
atccacacgt tcgaccctga agcggcctgc gatgacacca ccttccagcc ctgctcacca 900
agagcactcg cgaatcataa agtggtggtg gatgccttcc gagacctcta cactatcaac 960
aacaatgccg ctgaaggtgt agccgtggct gtgggtcggt atcctgaaga cacatactat 1020
aacggcaacc cgtggttctt gtgtacgctt gctgcagccg agcagctgta tgatgctctg 1080
tatcagtgga acaacattgg atccattacc atcaccgacg tctctttgga tttcttccag 1140
gacttgtata gcgatgccgc ggtgggcacg tactcttcct cgagctccga gtacagtgcg 1200
atcgtcgatg ccgtgaagac ctacgccgac ggattcgtga gcatcgtgga aaactatgca 1260
ctgacgaatg gatctctgtc cgagcaatac tccaagacgg acgggacaca ggagtccgct 1320
cgcgatctca cctggtcgta tgctgccctg ctaacggcca acatgcgtcg caactcgata 1380
gtgcccgcag cctggggtga gacggctgcc agcagtgtgc cggcgacctg tgtgtccacg 1440
tcggccacag gcatctacag cactgctacg gacacagcct ggccgagcac gttgactgca 1500
gccacaacga cagcaacagc gacgacaacg acaacgacaa ccacgagcaa gaccacaaca 1560
agcacaggaa catccaccat ctcaacaacc tcctcctcat catcatgtac gaccccaaca 1620
tccgtagccg taaccttcaa gctaaccgca acaacctact acggagaaaa catcaagatg 1680
tcaggctcaa tcccgcagct cggcgactgg gacacagacg acgcagtggc cctgagcgca 1740
gcaaactaca cgagcactga cccgctgtgg ttcgtcacca tcaacctgcc cgcaggcgag 1800
tcatttgagt acaagtacat ccgcatcgag agcgacggga cgatcgagtg ggagagtgat 1860
ccgaaccggt cgtacacggt tcctgcggct tgtggtgaga cggctgctgt tgagagcgat 1920
acgtggcggt aa 1932
<210> 2
<211> 643
<212> PRT
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> 葡糖淀粉酶
<400> 2
Met Ala Pro Pro Leu Ser Tyr Ala Leu Phe Ala Leu Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Val Met Ala Asp Pro Leu Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Ser Trp Leu Ala Thr Glu Thr Ser Tyr Ala Leu Glu Ala Ile Leu
35 40 45
Asn Asn Ile Gly Ser Ser Gly Ala Trp Ala Gln Ser Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Ile Asp Leu Phe
85 90 95
Lys Asn Gly Asn Ser Ser Leu Gln Gly Val Ile Glu Glu Tyr Ile Asp
100 105 110
Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Ser
115 120 125
Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Lys Thr Ala Phe
130 135 140
Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Ala Leu Ile Ser Phe Gly Glu Trp Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Ser
165 170 175
Thr Tyr Ala Ser Asp Ile Val Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu Ser
180 185 190
Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Glu Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu
195 200 205
Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Val Ala Val Gln His Arg Ala Leu
210 215 220
Val Glu Gly Ala Asn Phe Ala Ser Ala Leu Gly Thr Ser Cys Asp Tyr
225 230 235 240
Cys Thr Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp
245 250 255
Thr Gly Ser Tyr Ile Leu Ala Asn Phe Gln Ser Ser Arg Ser Gly Lys
260 265 270
Asp Val Asn Thr Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala
275 280 285
Ala Cys Asp Asp Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala
290 295 300
Asn His Lys Val Val Val Asp Ala Phe Arg Asp Leu Tyr Thr Ile Asn
305 310 315 320
Asn Asn Ala Ala Glu Gly Val Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu
325 330 335
Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala
340 345 350
Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asn Asn Ile Gly Ser
355 360 365
Ile Thr Ile Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Gln Asp Leu Tyr Ser
370 375 380
Asp Ala Ala Val Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Ser Ala
385 390 395 400
Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val
405 410 415
Glu Asn Tyr Ala Leu Thr Asn Gly Ser Leu Ser Glu Gln Tyr Ser Lys
420 425 430
Thr Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala
435 440 445
Ala Leu Leu Thr Ala Asn Met Arg Arg Asn Ser Ile Val Pro Ala Ala
450 455 460
Trp Gly Glu Thr Ala Ala Ser Ser Val Pro Ala Thr Cys Val Ser Thr
465 470 475 480
Ser Ala Thr Gly Ile Tyr Ser Thr Ala Thr Asp Thr Ala Trp Pro Ser
485 490 495
Thr Leu Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr
500 505 510
Thr Thr Thr Ser Lys Thr Thr Thr Ser Thr Gly Thr Ser Thr Ile Ser
515 520 525
Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val
530 535 540
Thr Phe Lys Leu Thr Ala Thr Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Ile Lys Met
545 550 555 560
Ser Gly Ser Ile Pro Gln Leu Gly Asp Trp Asp Thr Asp Asp Ala Val
565 570 575
Ala Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Thr Ser Thr Asp Pro Leu Trp Phe Val
580 585 590
Thr Ile Asn Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg
595 600 605
Ile Glu Ser Asp Gly Thr Ile Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser
610 615 620
Tyr Thr Val Pro Ala Ala Cys Gly Glu Thr Ala Ala Val Glu Ser Asp
625 630 635 640
Thr Trp Arg
<210> 3
<211> 1368
<212> DNA
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> 纤维二糖水解酶I
<400> 3
atgcttcgac gggctcttct tctatcctct tctgccatcc ttgctgtcaa agcacagcag 60
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aatgtcgggg gctacaccaa ctgctacacg ggcaacacct ggaacccaac gtactgcccg 240
gacgacgtca cctgcgccga gaattgtgcg ctggacggcg cggattacga gggcacctac 300
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tctcgtctct acctgttgca ggacgacgag acctatcaga tcttcaagct cctgaaccgg 420
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aagtacggaa ccgggtattg cgattcccaa tgcccacggg acctcaagtt tatcgacggc 600
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acatactcta ccaaccgcta tgcgggagag tgtgatcctg acggctgtga cttcaaccct 840
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tcgaacatca agtttggtcc gatcaactcg acctttaccg cttcataa 1368
<210> 4
<211> 455
<212> PRT
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> 纤维二糖水解酶I
<400> 4
Met Leu Arg Arg Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ser Ala Ile Leu Ala Val
1 5 10 15
Lys Ala Gln Gln Ala Gly Thr Ala Thr Ala Glu Asn His Pro Pro Leu
20 25 30
Thr Trp Gln Glu Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly
35 40 45
Ala Val Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Asn Val Gly Gly
50 55 60
Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asn Pro Thr Tyr Cys Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Thr Cys Ala Glu Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Glu Gly Thr Tyr Gly Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Leu Arg Leu Asn
100 105 110
Phe Val Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gln Asp
115 120 125
Asp Glu Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Asn Arg Glu Phe Thr Phe
130 135 140
Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Asn Asn
165 170 175
Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro
180 185 190
Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asp Gly Glu Gly Asn Val Glu Gly Trp Gln
195 200 205
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Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn Ala Val
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Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Asp Gly Asp
245 250 255
Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asn Arg Tyr Ala Gly Glu Cys Asp
260 265 270
Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Thr Ser Phe
275 280 285
Tyr Gly Pro Gly Lys Ile Ile Asp Thr Thr Gln Pro Phe Thr Val Val
290 295 300
Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Asp Thr Gly Thr Leu Ser Glu
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Ile Lys Arg Phe Tyr Ile Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Gln Pro Asn
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Ser Asp Ile Ala Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Phe Cys
340 345 350
Thr Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Thr Asp Asp Phe Ser Lys His
355 360 365
Gly Gly Leu Ala Ser Met Gly Ala Ala Met Gln Gln Gly Met Val Leu
370 375 380
Val Met Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Tyr Pro Thr Asn Ala Ser Ala Thr Thr Pro Gly Val Ala Arg
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Gly Thr Cys Pro Thr Asp Ser Gly Val Pro Ser Gln Val Glu Ser Gln
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Ser Pro Asn Ser Tyr Val Thr Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile
435 440 445
Asn Ser Thr Phe Thr Ala Ser
450 455
<210> 5
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 纤维二糖水解酶I
<400> 5
atgctccgcc gtgctctcct gctgagcagc tctgccatcc tggccgtcaa ggcccagcag 60
gctggtactg ccactgctga gaaccaccct cccttgacct ggcaggagtg cactgctcct 120
ggttcctgca ccactcagaa cggtgctgtt gtccttgaca gcaactggag atgggttcac 180
aacgtcggtg gttacaccaa ctgctacact ggcaacacct ggaaccccac ctactgcccc 240
gatgatgtca cctgcgctga gaactgcgct cttgacggtg ccgactacga gggtacctac 300
ggtgtcactt cttctggctc tgagctccgt ctgaacttcg tcaccggcag caacgtcggc 360
tctcgcctct acctcctcca ggatgacgag acttaccaga tcttcaagct cctcaaccgt 420
gagttcacct tcgatgttga tgtctccaac cttccttgcg gtctgaacgg tgctctgtac 480
ttcgtcgcca tggatgccga cggtggtgtc tccaagtacc ccaacaacaa ggccggtgcc 540
aagtacggta ccggttactg cgacagccag tgcccccgtg acctcaagtt cattgacggc 600
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accccccacc cttgcgacac ccccggccag accatgtgcg atggtgatga ctgcggtggt 780
acctactcca ccaaccgcta cgccggtgag tgcgaccccg atggctgcga cttcaacccc 840
taccgcatgg gcaacacctc cttctacggc cctggcaaga tcattgacac cacccagccc 900
ttcaccgttg tcacccagtt cctgaccgat gacggcaccg acactggtac cctctccgag 960
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<210> 6
<211> 2577
<212> DNA
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> β-葡糖苷酶
<400> 6
atgaggaacg ggttgctcaa ggtcgccgcc cttgcggccg cttcggtcgt caatggcgag 60
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actatgcacg agttgtactt gtggcctttt gccgatgctg ttcgcgctgg cgttggttca 720
atcatgtgct cctacaacca ggtgaacaac agctacgcct gctccaacag ctacaccatg 780
aacaagctgc tcaagagcga attgggcttc caaggcttcg tcatgaccga ctggggtggc 840
caccacagtg gtgtgggttc cgctctcgct ggtttggaca tgtcgatgcc cggagacatt 900
gccttcgaca gtggcacctc cttctggggc actaacctca cggttgccgt gctcaatgga 960
agtgttcctg agtggcgtgt tgatgacatg gctgtccgta tcatgtccgc ttattacaag 1020
gtcggccgcg accgctacag cgtccccatc aactttgact cgtggaccct ggatacctat 1080
ggtcccgagc actatgcggt gggccagggc aacaccaaga tcaacgagca cgttgatgtt 1140
cgcggcaacc atgcagaaat catccatgaa atcggtgctg ccagcgccgt ccttctcaag 1200
aacaagggtg ggcttccttt gactggcacc gaacggtttg tcggtgtttt cggagaggat 1260
gccggatcca acccttgggg tgtgaacggc tgcagtgacc gaggctgcga caatggtaca 1320
ttggccatgg gctggggcag tggtactgct aacttcccct acttggtgac gccggagcag 1380
gcgatcgaga gagaagtcgt gtcccgaaat ggaaccttca ccgccatcac ggacaatggc 1440
gctcttgagc agatggcggc tgtcgcctct caggctgatg tttgcctggt cttcgccaac 1500
gccgactccg gagaaggcta catcaacgtc gacggcaatg agggtgaccg gaagaatctg 1560
accctgtggc aaggggcgga tcaagtcatc cacaacgtca ctgccaactg caacaacacc 1620
gtcgtggtgt tgcacactgt cggccccgtt ttgatcgatg attggtatga ccaccccaac 1680
gtcactgcca ttctctgggc tggtcttccg ggccaggaga gcggtaactc gctcgtcgat 1740
gtcctctacg gccgtgtcaa ccctggcgga aagactccgt tcacctgggg acggacccgg 1800
gaggattacg gtgctcctct ggtcctgaag ccgaacaatg gcaagggcgc cccgcagcag 1860
gacttcactg agggtatctt catcgactac cgtcggtttg acaagtacaa catcaccccc 1920
atctacgaat tcggattcgg tctgagctac actacctttg agttttctga gctcaatgtg 1980
cagcctatca atacgccgcc gtacactccc gcttctggct tcaccaaggc ggcgcagtca 2040
ttcggcccgt cgtccaatgc ttctgacaac ctgtacccca gcgacattga gcgggtcccg 2100
ttgtacatct acccatggct caactccacc gatttgaagg cgtccgccaa tgaccctgac 2160
tatgggttgc ctaacgacaa atacgttcct cccaacgcca cgaacggtaa cccgcagccc 2220
attaacccgg ctggcggtgc tcctggtggc aaccctagtc tctatgagcc tgttgctcgg 2280
gtctcagcca tcatcaccaa caccggtaag gttacgggtg acgaggttcc tcaactgtat 2340
gtctctcttg gcggtcccga tgatgccccc aaggttcttc gtggcttcga ccgtatcaca 2400
cttgcgcctg gtcagcagac cttgtggacg accaccctga cgaggcgaga catctcgaac 2460
tgggaccctg tcacccagaa ctgggttgtg accaactaca ccaagacggt gtatgttggc 2520
aactcctccc gcaacctgcc tttgcaggca ccccttaagc catatcctgg aatctaa 2577
<210> 7
<211> 858
<212> PRT
<213> 埃默森罗萨氏菌 (Rasamsonia emersonii)
<220>
<223> β-葡糖苷酶
<400> 7
Met Arg Asn Gly Leu Leu Lys Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Val Asn Gly Glu Asn Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro
20 25 30
Trp Ala Asn Gly Gln Gly Asp Trp Ala Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val
35 40 45
Lys Phe Val Ser Gln Leu Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Trp Glu Gln Asp Arg Cys Val Gly Gln Val Gly Ser Ile
65 70 75 80
Pro Arg Leu Gly Phe Pro Gly Leu Cys Met Gln Asp Ser Pro Leu Gly
85 90 95
Val Arg Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val
100 105 110
Ala Ala Thr Trp Asn Arg Asp Leu Ala Tyr Arg Arg Gly Gln Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu His Arg Gly Lys Gly Val Asp Val Gln Leu Gly Pro Val
130 135 140
Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Ala Gly Arg Asn Trp Glu Gly
145 150 155 160
Phe Ala Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Asn Met Met Ala Ser Thr Ile
165 170 175
Gln Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Cys Ala Lys His Phe Ile
180 185 190
Leu Tyr Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gly Ala Gln Asp Gly Tyr Asp
195 200 205
Ile Ser Asp Ser Ile Ser Ala Asn Ala Asp Asp Lys Thr Met His Glu
210 215 220
Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly Ser
225 230 235 240
Ile Met Cys Ser Tyr Asn Gln Val Asn Asn Ser Tyr Ala Cys Ser Asn
245 250 255
Ser Tyr Thr Met Asn Lys Leu Leu Lys Ser Glu Leu Gly Phe Gln Gly
260 265 270
Phe Val Met Thr Asp Trp Gly Gly His His Ser Gly Val Gly Ser Ala
275 280 285
Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Ala Phe Asp Ser
290 295 300
Gly Thr Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ala Val Leu Asn Gly
305 310 315 320
Ser Val Pro Glu Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met Ser
325 330 335
Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Tyr Ser Val Pro Ile Asn Phe
340 345 350
Asp Ser Trp Thr Leu Asp Thr Tyr Gly Pro Glu His Tyr Ala Val Gly
355 360 365
Gln Gly Asn Thr Lys Ile Asn Glu His Val Asp Val Arg Gly Asn His
370 375 380
Ala Glu Ile Ile His Glu Ile Gly Ala Ala Ser Ala Val Leu Leu Lys
385 390 395 400
Asn Lys Gly Gly Leu Pro Leu Thr Gly Thr Glu Arg Phe Val Gly Val
405 410 415
Phe Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly Val Asn Gly Cys Ser
420 425 430
Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser Gly
435 440 445
Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Glu Arg
450 455 460
Glu Val Val Ser Arg Asn Gly Thr Phe Thr Ala Ile Thr Asp Asn Gly
465 470 475 480
Ala Leu Glu Gln Met Ala Ala Val Ala Ser Gln Ala Asp Val Cys Leu
485 490 495
Val Phe Ala Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val Asp Gly
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Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Gln Gly Ala Asp Gln
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Val Ile His Asn Val Thr Ala Asn Cys Asn Asn Thr Val Val Val Leu
530 535 540
His Thr Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Asp Trp Tyr Asp His Pro Asn
545 550 555 560
Val Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly Asn
565 570 575
Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Gly Lys Thr
580 585 590
Pro Phe Thr Trp Gly Arg Thr Arg Glu Asp Tyr Gly Ala Pro Leu Val
595 600 605
Leu Lys Pro Asn Asn Gly Lys Gly Ala Pro Gln Gln Asp Phe Thr Glu
610 615 620
Gly Ile Phe Ile Asp Tyr Arg Arg Phe Asp Lys Tyr Asn Ile Thr Pro
625 630 635 640
Ile Tyr Glu Phe Gly Phe Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Phe Ser
645 650 655
Glu Leu Asn Val Gln Pro Ile Asn Thr Pro Pro Tyr Thr Pro Ala Ser
660 665 670
Gly Phe Thr Lys Ala Ala Gln Ser Phe Gly Pro Ser Ser Asn Ala Ser
675 680 685
Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Asp Ile Glu Arg Val Pro Leu Tyr Ile Tyr
690 695 700
Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ala Asn Asp Pro Asp
705 710 715 720
Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Lys Tyr Val Pro Pro Asn Ala Thr Asn Gly
725 730 735
Asn Pro Gln Pro Ile Asn Pro Ala Gly Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro
740 745 750
Ser Leu Tyr Glu Pro Val Ala Arg Val Ser Ala Ile Ile Thr Asn Thr
755 760 765
Gly Lys Val Thr Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly
770 775 780
Gly Pro Asp Asp Ala Pro Lys Val Leu Arg Gly Phe Asp Arg Ile Thr
785 790 795 800
Leu Ala Pro Gly Gln Gln Thr Leu Trp Thr Thr Thr Leu Thr Arg Arg
805 810 815
Asp Ile Ser Asn Trp Asp Pro Val Thr Gln Asn Trp Val Val Thr Asn
820 825 830
Tyr Thr Lys Thr Val Tyr Val Gly Asn Ser Ser Arg Asn Leu Pro Leu
835 840 845
Gln Ala Pro Leu Lys Pro Tyr Pro Gly Ile
850 855

Claims (15)

1.一种包含葡糖淀粉酶(GA)和纤维二糖水解酶I(CBHI)的酶组合物，其中所述葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于所述葡糖淀粉酶和所述纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中所述纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于所述纤维二糖水解酶I和所述葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。
2.根据权利要求1所述的酶组合物，其中所述葡糖淀粉酶包括GH15葡糖淀粉酶、GH31葡糖淀粉酶、GH97葡糖淀粉酶或它们的任何组合。
3.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其中所述纤维二糖水解酶I包括GH7纤维二糖水解酶I。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含量为所述酶组合物中蛋白质总量的15％(w/w)至45％(w/w)的纤维二糖水解酶I。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含量为所述酶组合物中蛋白质总量的0.1％(w/w)至20％(w/w)的葡糖淀粉酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的酶组合物，其进一步包含β-葡糖苷酶(BG)。
7.根据权利要求6所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含量为所述酶组合物中蛋白质总量的1％(w/w)至20％(w/w)的β-葡糖苷酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶组合物，其为全发酵液。
9.一种用于由纤维素材料制备糖的方法，其包括以下步骤：
a)用酶组合物水解所述纤维素材料以获得所述糖，以及
b)任选地，回收所述糖，
其中所述酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I，并且所述葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于所述葡糖淀粉酶和所述纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中所述纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于所述纤维二糖水解酶I和所述葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。
10.一种用于由纤维素材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用酶组合物水解所述纤维素材料以获得糖，
b)通过使所获得的糖与发酵微生物接触来发酵所获得的糖以产生所述发酵产物，以及
c)任选地，回收所述发酵产物，
其中所述酶组合物包含葡糖淀粉酶和纤维二糖水解酶I，并且所述葡糖淀粉酶以由RGA所定义的相对于所述葡糖淀粉酶和所述纤维二糖水解酶I的分数存在，并且其中所述纤维二糖水解酶I以由RCBHI所定义的相对于所述纤维二糖水解酶I和所述葡糖淀粉酶的分数存在，其中RGA为0.02至0.40并且RCBHI为0.60至0.98。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中使用根据权利要求1至8中任一项所述的酶组合物。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述酶组合物以2mg蛋白质/克干物质重量至20mg蛋白质/克干物质重量的所述纤维素材料中的葡聚糖的量使用。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中在酶促水解之前对所述纤维素材料进行预处理步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述预处理是蒸汽处理、稀酸处理、有机溶剂处理、石灰处理、ARP处理或AFEX处理。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇并且所述发酵微生物是能够发酵至少一种C5糖的产醇微生物。
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