CN117164705B - 一种靶向h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体；所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；该纳米抗体具有良好的生物活性且具有良好的特异性；为建立H5亚型禽流感快速诊断方法奠定基础，解决了以往检测过程中灵敏度低，效率低的问题；而且将抗体基因通过连接肽与麦芽糖结合蛋白基因连接构建表达载体，诱导融合蛋白表达，抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白为可溶性蛋白，该融合蛋白可实现规模化生产，对H5禽流感的监测具有重大的意义。

Description

一种靶向H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体。

背景技术

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种禽类烈性综合征，属于正黏病毒科流感病毒属，分为A、B、C三型，存在感染人类的风险，对动物而言轻则使产蛋率下降造成巨大经济损失，重则使动物感染致死，严重影响养禽业发展。接种疫苗一直是控制禽流感病毒传播最有效的手段。禽流感病毒的基因组由8个负链单股RNA片段组成，血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是其最主要的外膜蛋白，依据二者的抗原性不同，可将AIV分成16种HA亚型及9种NA亚型。近几年，禽流感发生的特点为：病毒毒株相对单一；发病的严重程度与家禽种类有关；不同品种有差异，地方品种比白羽肉鸡等常见进口品种易感度低；不同日龄家禽有差异，青年禽抵抗力低于老龄禽；群体健康状况越差则发病损失越大，发病反应程度越重；受应激刺激影响的家禽反应强于未受应激的；继发感染的家禽损失大于单独感染禽流感的家禽，早发现并早控制继发感染可有效降低禽流感发病产生的损失：受新城疫抗体水平高低影响，新城疫抗体水平较低的鸡群，发生禽流感时造成的损失比新城疫抗体水平高的鸡群大。

纳米抗体(Nanobody，Nb)是一种新型基因工程抗体，因其分子量小、稳定性强、亲和力高、能识别隐蔽表位、组织穿透力强、易于制备、成本低廉且便于进行改造与修饰，是疾病诊断、治疗和研究的理想分子，在癌症、脑部神经性疾病、毒素中毒性疾病、艾滋病以及其它感染性疾病和蛋白质功能、晶体结构解析等领域已有大量的相关研究报道。骆驼科动物或鲨鱼科动物体内含有天然缺失轻链的重链抗体亚型，通过基因工程手段制备的可变区重链抗体(VHH)即为纳米抗体。在动物疫病上，各国学者以全病原、病毒结构蛋白、非结构蛋白和病毒相关复制酶等为靶标，通过噬菌体展示技术、酵母杂交和细菌展示技术筛选了多种病原的Nb，推动了动物疫病防控技术的发展。Nb由于分子量小、具有较长的CDR3区，可很好识别一些隐蔽表位，是开发广谱中和治疗制剂的理想分子。同时，Nb能耐受胃蛋白酶、糜蛋白酶和极端理化条件，使其可以通过雾化吸入或口服方式大剂量给药，适用于畜禽大规模给药，在治疗呼吸道和消化道疫病上潜力巨大。

噬菌体展示技术(phage display)是一种用于鉴定蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。它将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。通过噬菌体展示快速分离特定配体在许多应用中是有利的，包括选择酶的活性和变构位点的抑制剂、受体激动剂和拮抗剂等。噬菌体展示技术已被用于蛋白质-蛋白质相互作用的表位定位和分析。从噬菌体文库中分离出的特异性配体可用于治疗靶点验证、药物设计和疫苗开发。噬菌体展示也可以与其他方法结合使用。

本实验用H5 Re-8毒株对骆驼进行5次免疫后达到免疫高峰，随后进行VHH噬菌体展示文库的建立与筛选。通过四轮筛选后得到一种新的针对Re-8毒株的特异性纳米抗体，建立基于纳米抗体的ELISA检测方法。将筛选得到的VHH克隆到大肠杆菌中表达所得到的蛋白皆为可溶性蛋白。通过血凝抑制实验(HI)证明了筛选出来的Nb与AIV病毒粒子相互作用，使原有的血凝反应被抑制。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段。

本发明第二方面的目的，在于提供一种融合蛋白。

本发明第三方面的目的，在于提供一种核酸分子。

本发明第四方面的目的，在于提供一种表达载体。

本发明第五方面的目的，在于提供一种重组细胞。

本发明第六方面的目的，在于提供上述纳米抗体或其抗原结合片段或融合蛋白或核酸分子或表达载体或重组细胞的应用。

本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列为：

a)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或

b)将SEQ ID NO.4经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

c)与SEQ ID NO.4具有80％、85％或90％以上的同源性，且SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供一种融合蛋白，包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和信号肽、引导肽、靶向肽、标签肽、荧光蛋白中的至少一种。

优选地，所述标签肽包括麦芽糖结合蛋白。

本发明的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含以下成分：

a)用于编码本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段；或

b)用于编码本发明第二方面所述融合蛋白的核酸片段。

优选地，所述用于编码本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段的核苷酸序列为：

a)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

b)将SEQ ID NO.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

c)与SEQ ID NO.3具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述用于编码本发明第二方面所述融合蛋白的核酸片段的核苷酸序列为：

a)如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；或

b)将SEQ ID NO.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

c)与SEQ ID NO.9具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。

在本发明的第四个方面，提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体具体为将本发明第三方面所述核酸分子克隆进入载体得到。

优选地，所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体。

优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。

优选地，所述非病毒性载体包括：质粒载体、阳离子多聚物载体、壳聚糖、聚乙烯亚胺、纳米颗粒载体、脂质体中的至少一种。

优选地，所述质粒载体为PET系列载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为pET-9a、pET-28a(+)、pET-22b(+)、pET-26b(+)或pET-31b(+)。

本发明的第五个方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第四个方面所述的表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞具体为将本发明第四个方面所述表达载体转入细胞中得到。

优选地，所述细胞包括原核细胞或真核细胞；所述细胞非植物或动物新品种。

优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的原核细胞。

优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。

本发明的第六方面，提供本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段或本发明第二方面所述融合蛋白或本发明第三方面所述核酸分子或本发明第四方面所述表达载体或本发明第五方面所述重组细胞在以下任一项中的应用：

a)制备禽流感病毒诊断或检测试剂；

b)筛选禽流感病毒疾病的治疗药物；

c)筛选禽流感病毒血凝素蛋白模拟表位肽；

d)制备筛选禽流感病毒血凝素蛋白模拟表位肽的试剂；

e)制备与禽流感病毒血凝素蛋白结合的产品。

优选地，所述禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒。

本发明的第七方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段或本发明第二方面所述融合蛋白或本发明第三方面所述核酸分子或本发明第四方面所述表达载体或本发明第五方面所述重组细胞。

优选地，所述产品包括药物、试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。

优选地，所述药物包括药学上可接受的载体或辅料。

本发明的有益效果是：

本发明通过噬菌体展示技术筛选出了一种针对H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体，该纳米抗体具有良好的生物活性且具有良好的特异性；为建立H5亚型禽流感快速诊断方法奠定基础，解决了以往检测过程中灵敏度低，效率低的问题。而且将抗体基因通过连接肽与麦芽糖结合蛋白基因连接构建表达载体，诱导融合蛋白表达，抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白为可溶性蛋白，该融合蛋白可实现规模化生产，对H5禽流感的监测具有重大的意义。

附图说明

图1是抗H5禽流感纳米抗体4a2的重组表达载体的图。

图2是将实施例4中保存的抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒4A2 in pET-28a(+)转化至受体大肠杆菌BL21(DE3)感受态内的PCR验证结果图(图中，泳道M为Vazyme2000Marker；泳道1-8为目的基因扩增片段；泳道9为阴对照)。

图3是SDS-PAGE电泳检测蛋白结果分析结果图(图中，泳道1为蛋白表达结果；泳道2为Vazyme MP102 Maker)。

图4为针对不同抗原的血凝抑制(HI)图。第一行抗原为H5，第二行抗原为H7，第三行抗原为H9。第11列为阴对照，第12列为空白对照。HI结果显示，抗H5禽流感纳米抗体对H5抗原效价为8log2，对H7、H9无血凝抑制。

图5为表达的抗H5禽流感纳米抗体蛋白与不同的包被抗原的ELISA反应折线图。横坐标为表达的抗H5禽流感纳米抗体蛋白稀释倍数，纵坐标是加入ELISA终止液后在450nm的波长下的读数。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1纳米抗体噬菌体展示文库的构建

(1)免疫骆驼

将重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型，Re-8株)禽流感病毒免疫双峰驼，每三周免疫一次，一共免疫5次。最后一次免疫之后第7天采血，利用间接ELISA(以Re-8为包被抗原，100ng/孔)检测4次免疫之后羊驼血清中的抗体效价。当血清中抗H5N1 AIV的抗体效价不低于1:64000时，进行噬菌体展示抗体库的构建。

(2)骆驼淋巴细胞的分离及RNA提取

利用外周血淋巴细胞分离液(Solarbio)分离羊驼外周血淋巴细胞(PBMC)，具体操作按照试剂盒按说明书(天津灏洋公司，货号LTS1076)，分离获得的PBMC用于细胞总RNA的提取。利用RNA提取试剂盒(OMEGA公司，货号R6834-01)提取PBMC的总RNA。

(3)第一轮巢式PCR反应

使用反转录试剂盒(TaKaRa公司，货号R026A)，以提取的总RNA为模板，反转录获得cDNA，再通过巢式PCR扩增VHH基因。第一轮巢氏PCR反应的反应体系为：cDNA模板2μL，2×Taq Plus Master Mix10μL，引物CALL001和CALL002各1μL，用ddH₂O补足至20μL；扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；对第一轮巢氏PCR反应产物进行凝胶电泳验证分析，扩增产物为约700bp的片段，然后按照DNA胶回收试剂盒进行PCR产物回收；其中，引物CALL001和CALL002的核苷酸序列如下所示：

引物CALL001：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG-3’(SEQ ID NO.12)；

引物CALL002：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO.13)；

(4)第二轮巢式PCR反应

以获得的第一轮PCR反应产物为模板进行第二轮巢氏PCR反应，其中，反应体系为：第一轮PCR反应产物(约700bp)2μL，2×Taq Plus Master Mix 25μL，引物VHH-Forward和VHH-Reverse各1μL，用ddH₂O补足至50μL，第二轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s，5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃10min；对第二轮巢氏PCR反应产物进行凝胶电泳验证分析，扩增产物为约400bp的VHH片段，然后按照DNA胶回收试剂盒进行PCR产物回收，测定目的片段浓度并保存于-20℃；其中，引物VHH-Forward和VHH-Reverse的核苷酸序列如下所示：

引物VHH-Forward：

5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG-3’(SEQ ID NO.1)；

引物VHH-Reverse：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3’(SEQ ID NO.2)；

(5)VHH噬菌体展示载体的构建

将上述VHH产物和线性化的噬菌粒载体，通过同源重组的方法进行连接，具体操作按照同源重组试剂盒说明书进行(Vazyme，货号C113-01)。

实施例2噬菌体纳米文库的筛选

用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将灭活抗原H5亚型禽流感(Re-8株)包被在酶标板上，每孔100μL，灭活抗原占10％，放于37℃2h；弃去孔中液体，用100μLPBS洗一遍后加入300μL3％BSA置于室温封闭1h；弃去封闭液，加入100μL噬菌体抗体液，在室温孵育1h；弃去孔中液体及未结合噬菌体，再用0.05％PBST洗5次，5min/次，加入100μL的甘氨酸-盐酸pH＝2.2的洗脱液，将洗脱液收集起来，加入适量2MTris碱，使得含有噬菌体的液体呈中性，获得第一轮富集筛选的噬菌体；将该噬菌体进一步扩增，进入下一轮筛选；五轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，就可以最终获得特异性较强的噬菌体克隆(其中第一轮筛选采用非特异性条件，后几轮筛选通过改变抗原包被浓度提高特异性)。

实施例3ELISA法筛选阳性单克隆

(1)将实施例2第三轮筛选出来的噬菌体先与5mL的TG1菌(OD600＝0.5)，37℃温育30min后，从侵染菌液中取出100μL进行10的N次方梯度稀释，重新吸取菌液100μL分别划线于2×YT/Amp/Glu固体培养基，37℃过夜培养，再将单菌落接种在50mL的2×YT/Amp/Glu液体培养基中，220rpm 37℃过夜培养，第二天吸取1mL菌液至100mL 2×YT/Amp/Glu液体培养基中，220rpm37℃摇菌至OD600＝0.6左右，加入感染复数MOI＝20:1的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置20min，200rpm振荡培养30min，进行辅助噬菌体侵染，3000g离心弃去上清包括培养基的葡萄糖，用新鲜的2×YT/Amp/Kana培养基重悬，37℃、250rpm过夜震荡培养，离心弃去上清，得到噬菌体阳性克隆；

(2)按照实施例2包被方法包被将H5亚型Re-8株的血凝抑制实验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)4℃过夜包被至酶标板上后进行封闭处理，以空白酶标板(即不包被)为空白对照；加入100μL步骤(1)筛选扩增后的噬菌体阳性克隆并室温孵育2h，用含体积百分比0.05％吐温-20的PBS洗5次，5min/次，再加入100μL/孔HRP-M13，37℃孵育1h；弃去孔中液体及未结合噬菌体，用含体积百分比0.05％吐温-20的PBS洗5次，5min/次，加入100μL/孔TMB底物显色液，避光室温放置20min，酶标仪测波长620nm的OD数值，以P/N值(即阳性孔OD读数/对照孔OD读数的比值)大于等于3为阳性。将阳性克隆菌液送去上海生工生物股份有限公司测序，即可得到抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体的核苷酸序列。

挑选单菌落进行ELISA法筛选阳性克隆：将单菌落按照上述包被方法包被至酶标板上后进行封闭处理，以空白酶标板(即不包被)为空白对照，再加入100μL/孔HRP-M13，37℃孵育1h，用0.05％PBST洗5次，5min/次，加入100μL/孔TMB底物显色液，避光室温放置20min，酶标仪测波长620nm的OD数值，以P/N值(即阳性孔OD读数/对照孔OD读数的比值)大于等于3为阳性。将阳性克隆送去测序，即可得到抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体序列。

实施例4抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒4A2 in pET-28a(+)的构建

(1)抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白质粒4A2 in pET-28a(+)的构建

所筛选出的抗H5禽流感纳米抗体的基因序列为：

ATGGACAATCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCTTGTACAGCCTCTGAAAACACCTACAGTCGTACCTGCATGGGTTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACTATTTATACTCGTAGTGGTATGACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACAACAAGAACACGTTGTATTTAGAAATGAACACCCTGAAACCTGAAGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCTTCGCCCGTAGGGGACGTCGAATGCGCACTGAAGGAAGGAACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.3)；

所筛选出的抗H5禽流感纳米抗体的氨基酸序列为：

MDNQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASENTYSRTCMGWFRQAPGKEREGVAT IYTRSGMTYYADSVKGRFTISQDNNKNTLYLEMNTLKPEDTAMYYCAASPVGDVEC ALKEGTWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.4)；

其中，

CDR1序列为：ENTYSRTCMG(SEQ ID NO.5)；

CDR2序列为：IYTRSGMT(SEQ ID NO.6)；

CDR3序列为：LEMNTLKPEDTAMYYCAASPVGDV(SEQ ID NO.7)；

与美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行序列比对搜索后未发现与现有的针对H5禽流感抗体一致的序列，筛选的抗体序列为新发现序列。

通过基因合成，将其C末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)通过连接肽(GGCGGCGGGTC A(SEQ ID NO.8))进行连接(由上海通用公司合成)，连接所得到的融合基因的核苷酸序列如下：ATGGACAATCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGC AGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCTTGTACAGCCTCTGAAAACACCTACAGTCGTACCTGCATGGGTTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAACTATTTATACTCGTAGTGGTATGACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACAACAAGAACACGTTGTATTTAGAAATGAACACCCTGAAACCTGAAGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCTTCGCCCGTAGGGGACGTCGAATGCGCACTGAAGGAAGGAACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGGTCAAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGTGAAAGATCCGCGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCACCACCACCATCATCACTAA(SEQ IDNO.9)；

在该融合基因两端加上XhoI和NcoI酶切位点，然后将获得的目的基因片段和进行XhoI和NcoI双酶切的pET-28a(+)载体相连，得到重组表达载体，命名为4A2 in pET-28a(+)，得到的连接片段核苷酸序列由上海通用公司合成，经测序正确后，获得大小为6742bp的融合基因(图1)。

(2)质粒抽提，双酶切确认质粒并送测序

将步骤(1)得到的抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白质粒为4A2 in pET-28a(+)的合成质粒转化至受体菌DH5α，菌液涂含卡那霉素的LB(含50mg/L的卡那霉素(Kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提，并对质粒做XhoI和NcoI双酶切，跑核酸电泳确认酶切片段大小，结果见图2。并将大小为2000bp左右的目的条带的克隆质粒进一步测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有15％～20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。

实施例5抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白的诱导表达

(1)将实施例4中抽提的4A2 in pET-28a(+)质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)上，冰上放置30min，42℃水浴锅中热击90s后加入1mL LB肉汤，在37℃，220rpm的摇床上复苏活化之后，6000rpm离心1min，弃去90％的上清后将菌液涂含50mg/mL卡那霉素的LB板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落利用T7引物进行菌落PCR确认，将大小介于1500-2000bp的目的条带的克隆菌落重新转接，一部分用于菌种保存，另一部用于下述步骤(2)。PCR反应完成之后，使用质量体积比为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶电泳显示大小介于1500-2000bp的目的条带。

其中，T7引物序列如下所示：

正向引物T7-F：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO.10)；

反向引物T7-R：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO.11)；

PCR反应体系和条件如下所示：

扩增体系：PCR Master Mix酶25μL，正向引物(10pmol/μL)1μL，反向引物(10pmol/μL)1μL，基因模板2μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，35个循环；72℃5min。

(2)挑取含目的条带的单菌落，转接至含有100mL的液体LB培养基的100ml摇瓶中，用封口膜封口，放置于37℃，220rpm摇床中。待菌液培养至OD600＝0.6后用IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.1mmol/L。随后将菌液转移至16℃，220rpm摇床中进行诱导。诱导16h后将菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清。

(3)用约30mL无咪唑的蛋白裂解液Lysis buffer(NaH₂PO₄·H₂O(MW137.99g/mol)6.9g，即0.05M，NaCl(MW 58.44g/mol)17.54g即0.3M，加入约900mL去离子水，搅拌溶解后加入NaOH调节溶液pH值至8.0，加入去离子水定容至1000mL)重悬步骤2中的菌体，使用超声破碎仪进行破碎，超声程序为破碎3s，间隔5s，超声破碎30min。

(4)将超声破碎后的产物8000rpm离心10min，收集上清，取出适量上清样品加入2×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样于购自南京金斯瑞的SDS-PAGE胶孔，同时加入等量的蛋白VazymeMP102 Maker，以电泳电压调节至120V跑胶，跑胶30min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽中1h；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清洗条带。将脱色的凝胶放于成像系统中进行扫描，如图3所示，观察结果，目标条带大小在15KDa左右，与预估蛋白大小相符，且SDS-PAGE图条带清晰，证明成功表达该融合蛋白。

实施例6抗H5禽流感纳米抗体的蛋白功能验证

抗H5禽流感纳米抗有抑制血凝的功能，因此通过血凝抑制(HI)实验检验该抗体，过程如下：先通过血凝(HA)试验测得病毒效价，配置四单位，再进行HI实验。

(1)HA实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加重组AIV H5亚型Re-8株HI试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μL，第12孔不加；

③从1～11孔，每孔加稀释好的25μL PBS；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果；其中，1％鸡红细胞悬液的制备：抽取抗凝血鸡血，700rpm,5min离心；用PBS清洗。再离心，吸取沉淀红细胞表面的白细胞，不断清洗直至红细胞表面无白细胞，PBS洗液呈透亮无颜色。以PBS：红细胞＝99：1的比例轻轻混匀，制得1％鸡红细胞悬液。

四单位配置：测得HA效价后，按照原液稀释2n-2倍的方法配置四单位抗原(4HAU)，配好后，进行HA的步骤进行四单位验证，配好的四单位在验证时，前两孔出现血凝现象。

(1)HI实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，混匀后弃去25μL PBS，第11、12孔不加；

③从1～11孔，每空加稀释好的25μL AIV H5亚型Re-8株4单位抗原悬液，室温(24-25℃)静置至少30min，第12孔不加；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果。

H5、H9血凝抑制实验步骤与H7亚型Re-1株的血凝抑制实验相同。H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型，均为购自哈尔滨维科生物技术有限公司的禽流感血凝抑制试验抗原。

HI结果显示，抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白抗体对H5抗原效价为4log2，对H5、H9无血凝抑制，是特异性结合的抗H5禽流感纳米蛋白抗体(如图4)。

实施例7抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白对抗原的特异性检测应用

该抗体是针对H5禽流感的特异性抗体，为此通过包被不同的抗原，用筛选表达的纳米抗体对包被的抗原进行检测。

具体实验方案如下：

1.抗原包被：取H5禽流感血凝抑制试验抗原(分别为Re-8株)10μL，按照第一孔抗原(抗原：碳酸盐包被缓冲液＝1:9)按照10倍稀释，第二孔开始4倍稀释，将抗原吸附在固相载体聚苯乙烯。即第一孔将抗原和包被液稀释均匀后，吸取25μL至第二孔，一次稀释至第七孔，第八孔只加包被液做为空白对照，每孔最终75μL，37℃孵育2h或者4℃过夜孵育后，弃去板内液体；

2.封闭：加300μL 3％BSA封闭1h；

3.一抗：抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白即为一抗，按照1:100的比例用PBS稀释加75μL稀释后抗体至每孔；

4.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min洗5次；

5.二抗：以金斯瑞公司的鼠源抗his多抗按照1:3000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔孵育1h；

6.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

7.三抗：以上海生工公司的羊抗鼠-HRP抗体按照1:5000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔，孵育1h；

8.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

9.显色：加入HRP底物显色液进行显色20min后每孔加入100μL ELISA终止液，用酶标仪的波长450nm进行读数。

ELISA结果显示：随着H5抗原(Re-8)梯度递减的包被抗原(一定范围内)，P/N比值也梯度递减，其中空白对照数值为0.05，P/N最大比值大于3，证明真核表达的抗H5亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的生物活性且具有良好的特异性(如图5)。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (12)

1.一种H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述纳米抗体或其抗原结合片段为：

a）如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；或

b）将SEQ ID NO.4经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQIDNO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

c）与SEQ ID NO.4具有80%以上的同源性，且与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

d）与SEQ ID NO.4具有85%以上的同源性，且与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

e）与SEQ ID NO.4具有90%以上的同源性，且与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

3.一种融合蛋白，包含权利要求1或2所述的纳米抗体或其抗原结合片段和信号肽、引导肽、靶向肽、标签肽、荧光蛋白中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述标签肽为麦芽糖结合蛋白。

5.一种核酸分子，所述核酸分子包含以下成分：

a）用于编码权利要求1或2所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段；或

b）用于编码权利要求3或4所述融合蛋白的核酸片段。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述用于编码权利要求1或2所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸片段为：

a）如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

b）将SEQ ID NO.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

c)与SEQ ID NO.3具有80%以上的同源性，且与SEQ ID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

d）与SEQ ID NO.3具有85%以上的同源性，且与SEQ ID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

e）与SEQ ID NO.3具有90%以上的同源性，且与SEQ ID NO.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述用于编码权利要求3或4所述融合蛋白的核酸片段为：

a）如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；或

b）将SEQ ID NO.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO.9所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

c)与SEQ ID NO.9具有80%以上的同源性，且与SEQ ID NO.9所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

d）与SEQ ID NO.9具有85%以上的同源性，且与SEQ ID NO.9所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列；或

e）与SEQ ID NO.9具有90%以上的同源性，且与SEQ ID NO.9所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。

8.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求5～7任一项所述核酸分子。

9.一种重组细胞，所述重组细胞包含权利要求8所述的表达载体。

10.权利要求1～2任一项所述纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求3～4任一项所述融合蛋白或权利要求5～7任一项所述核酸分子或权利要求8所述表达载体或权利要求9所述重组细胞在以下任一项中的应用：

a）制备禽流感病毒诊断或检测试剂；

b）筛选禽流感病毒疾病的治疗药物；

c）筛选禽流感病毒血凝素蛋白模拟表位肽；

d）制备筛选禽流感病毒血凝素蛋白模拟表位肽的试剂；

e）制备与禽流感病毒血凝素蛋白结合的产品；

所述禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒。

11.一种产品，所述产品包含权利要求1～2任一项所述纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求3～4任一项所述融合蛋白或权利要求5～7任一项所述核酸分子或权利要求8所述表达载体或权利要求9所述重组细胞。

12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物、试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。