CN117147812B - 鞘脂代谢标志物及其分析方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鞘脂代谢标志物及其分析方法和应用，能够有效用于哮喘的早期诊断、病程监测和预后评估，灵敏度高、快速便捷、结果准确可靠。这种鞘脂代谢标志物，至少包括以下物质的一种：半乳糖神经酰胺d18:1/16:0、半乳糖神经酰胺d18:1/14:0。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药检测的技术领域，尤其涉及一种鞘脂代谢标志物，这种鞘脂代谢标志物的分析方法，以及该鞘脂代谢标志物在哮喘病程动态监测中的应用。
背景技术
支气管哮喘（哮喘），是一种严重危害人类健康的以气道炎症和高反应性为特征的常见慢性呼吸道疾病。哮喘的早期诊断、病程监测和规范化治疗，对于提高哮喘的控制水平，改善患者生活质量具有重要作用。
目前，哮喘的主要诊断包括：血细胞分析、肺功能监测和过敏原检测等，并结合喘息、气促、胸闷或咳嗽等临床症状，而病理分期和分级的诊断更无生化指标，仅依靠临床表现。值得注意的是，这些手段仅是哮喘发生后的措施，无法对疾病风险进行预测，存在严重滞后性。因此，一种易于检测的新颖、无创贯穿诊断、分期、分级和预后的动态监测标志物对于哮喘的早期风险预警、病程管理和预后评估具有至关重要的意义。
代谢组学能够灵敏而全面地测定生物体自身生理病理状态时内源性代谢物的变化，可以系统地研究疾病与体内代谢物组成的关系，有利于全面认识和评价疾病状态并发现新的生物标志物。因此，代谢组学在疾病诊断、风险预测和预后评估等方面有着巨大的临床价值。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明要解决的技术问题是提供了一种鞘脂代谢标志物，其能够有效用于哮喘的早期诊断、病程监测和预后评估，灵敏度高、快速便捷、结果准确可靠。
本发明的技术方案是：这种鞘脂代谢标志物，至少包括以下物质的一种：半乳糖神经酰胺d18:1/16:0、半乳糖神经酰胺d18:1/14:0。
鞘脂代谢标志物的分析方法，经Logistic回归分析得到拟合的回归曲线：
Y =Logit(p)
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其中，Y为诊断概率，Logit(p)为逻辑回归函数，a-f分别为1-磷酸鞘氨醇，磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1，鞘脂d18:1/16:0，鞘脂d18:1/18:0，鞘脂d18:1/20:0，鞘脂d18:1/24:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值。
本发明的鞘脂代谢标志物以及分析方法能够有效用于哮喘的早期诊断、病程监测和预后评估，灵敏度高、快速便捷、结果准确可靠，可以在哮喘患者的临床控制期、慢性持续期和急性发作期多次监测，为临床决策提供依据，同时为后续基础研究和临床研究提供一定基础，具有较大的应用和研究价值。
还提供了鞘脂代谢标志物用于哮喘病程动态监测的应用。
还提供了鞘脂代谢标志物用于哮喘病程动态监测的芯片、试纸或试剂盒，获取检测对象生物样本中代谢物之间的比值水平并用来判断检测对象中哮喘的疾病状况。
附图说明
图1显示为本发明哮喘代谢组学研究的基本流程图。
图2显示为本发明一实施例中，样本高分辨质谱的检测结果。其中，图2A是样本高分辨质谱检测所得正离子全扫描总离子流；图2B是样本高分辨质谱检测所得负离子全扫描总离子流；图2C是样本高分辨质谱检测所得鞘脂 (d18:1/24:0)相应的精确质量数和分子式；图2D是样本高分辨质谱检测所得鞘脂 (d18:1/24:0)色谱图。
图3显示为本发明一实施例中，健康对照组和哮喘组的PCA和OPLS-DA模型得分图。其中，图3A为PCA模型得分图，圆圈代表健康对照组，菱形代表哮喘组。图3B为PCA的三维立体图，浅色球代表健康对照组，深色球代表哮喘组。从上述图中可以明显的看出，该模型可以将健康人群与哮喘患者明显区分。图3C为OPLS-DA模型得分图，圆圈代表健康对照组，菱形代表哮喘组，结果显示HC（健康对照）和哮喘患者之间可以显著区分。
图4显示为哮喘的差异代谢通路图。
图5显示为鞘脂代谢物结构图。
图6显示为混合人血浆样本中目标鞘脂代谢物及内标MRM提取图。
图7显示为基于标准加入法的目标鞘脂代谢物标准曲线。
图8显示为经Logistic回归分析得到基于鞘脂比值的多个代谢标志物拟合的回归曲线及ROC分析结果。
图9显示为稳定哮喘期（S）和重症哮喘期（A）自身对照患者目标鞘脂代谢物变化情况（鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/24:1等生物标志物急性期均上调）。
具体实施方式
这种鞘脂代谢标志物，至少包括以下物质的一种：半乳糖神经酰胺d18:1/16:0、半乳糖神经酰胺d18:1/14:0。
优选地，所述鞘脂代谢标志物还包括通过靶向代谢组学筛选得到的1-磷酸鞘氨醇、磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1、鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/24:1及分别与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值。具体地说，所述鞘脂代谢标志物还包括以下的至少一种：通过靶向代谢组学筛选得到的1-磷酸鞘氨醇、磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1、鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/24:1、1-磷酸鞘氨醇与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值、磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值、鞘脂d18:1/20:0与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值、鞘脂d18:1/18:0与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值、鞘脂d18:1/16:0与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值、鞘脂d18:1/24:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值。
鞘脂代谢标志物的分析方法，经Logistic回归分析得到拟合的回归曲线：
Y =Logit(p)
=37.604a-1116.674b+44.959c-2.948d+181.759e+0.439f-3.741
其中，Y为诊断概率，Logit(p)为逻辑回归函数，a-f分别为1-磷酸鞘氨醇，磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1，鞘脂d18:1/16:0，鞘脂d18:1/18:0，鞘脂d18:1/20:0，鞘脂d18:1/24:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值。
本发明的鞘脂代谢标志物以及分析方法能够有效用于哮喘的早期诊断、病程监测和预后评估，灵敏度高、快速便捷、结果准确可靠，可以在哮喘患者的临床控制期、慢性持续期和急性发作期多次监测，为临床决策提供依据，同时为后续基础研究和临床研究提供一定基础，具有较大的应用和研究价值。
还提供了鞘脂代谢标志物用于哮喘病程动态监测的应用。
还提供了鞘脂代谢标志物用于哮喘病程动态监测的芯片、试纸或试剂盒，获取检测对象生物样本中代谢物之间的比值水平并用来判断检测对象中哮喘的疾病状况。
优选地，所述生物样本为血浆、血清、全血、全血干血斑、或干血浆斑等的血液来源生物样本。
优选地，通过以下的一种或多种方法获取检测对象生物样本中代谢物水平：色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法、免疫法。
优选地，所述色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法；所述光谱法包括核磁共振光谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法；所述化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法；所述质谱法为三重四极杆质谱法，采用质谱法快速定量检测代谢标志物的方法是先采用色谱柱进行梯度洗脱，再于电喷雾离子源ESI正离子MRM模式下采集数据，所述质谱法中，是采用正离子扫描，一次进样分析所有代谢标志物和内标的方法进行检测。
优选地，所述生物样品在检测前的预处理方式为：精密吸取80 μL血浆或血清，加入10 μL内标工作溶液，加入480 μL异丙醇/甲醇溶液，9:1，v/v，沉淀蛋白，涡旋10 min，12000 rpm离心10 min，取上清，真空浓缩挥干，用80 μL甲醇复溶，涡旋10 min，12000 rpm离心15 min，得到供试品溶液用于定量分析。
优选地，吸取15-50 μL人全血滴至干血斑采集卡，室温下干燥1-4小时至颜色变为深红色，得到干血斑样品；用打孔器从干血斑上取下一至多个直径为3-8 mm的干血斑样片；将干血斑样片加至具有磷脂/蛋白去除功能的固相萃取小柱中，采用含有5%-50%比例水的有机试剂进行洗脱。
下面对本发明的实施方式做详细说明。
实施例1
利用非靶向代谢组学技术进行哮喘患者和健康人之间标志物的筛选和代谢通路富集。
1、样本来源：
经中日友好医院伦理委员会批准后，收集100例HC（健康对照）、154例稳定期哮喘患者、112例重症期哮喘患者的血浆样本。所有参与者均来自于中日友好医院，所有哮喘患者均依据《支气管哮喘防治指南（2020年版）》，经临床医生评估后诊断支气管哮喘，排除肺结核、肺间质纤维化、慢性阻塞性肺病等呼吸性疾病史。HC的年龄、性别与哮喘患者相匹配，以排除性别、年龄导致的代谢差异。采集血浆时间均为清晨空腹状态。所有样本均保存在-80℃待用。
2、主要试剂：
LC/MS级乙腈购自Merck公司，HPLC级甲醇购自Merck公司，甲酸购自CNW公司。其它试剂均为市售分析纯。去离子水由Millipore公司的Milli-Q超纯水系统制备。
3、研究方法：
3.1样品制备：
样品预处理：分别吸取血浆（健康对照组、稳定期哮喘组和重症哮喘组）20 μL加入含内标的(甲醇:乙腈=1:1)沉淀剂180 μL，涡旋混匀3 min，13000rpm离心10 min，吸取100μL用于非靶向代谢组学分析。
3.2 色谱/质谱条件：
采用高分辨质谱仪QE-Orbitrap检测。色谱流动相：A流动相为含0.1%甲酸及2.5mmoL/L甲酸铵的水溶液，D流动相为乙腈。样品测定的梯度洗脱程序：0-1.0min，95%A；1.0-5.0 min，95%-40% A；5.0-8.0min，40%-0%A；8.0-11.0 min，0% A；11.0-14.0 min，0%-40%A；14.0-15.0 min，40%-95% A；15.0-18.0 min，95% A，分析时间0~18min，每次进样5μL，流速为0.25mL/min，色谱柱：ACQUITY BEH C18 1.7µm，2.1×50 mm，色谱柱温度为30℃，自动进样器的温度保持在4℃。在电喷雾离子源(ESI)正负离子模式下采集数据，喷雾电压：3000V；蒸发温度：350℃；毛细管温度：350℃；S-lens RF：50；一级全扫描（Full scan）的分辨率：70000，扫描范围：70-1050m/z。二级数据依赖性扫描（Full MS/dd-MS2）：分辨率：17500；AGC target：1e5；Maximun TT：50ms；NCE：20，40，60。超高分辨质谱检测结果如图2所示。
3.3代谢通路分析：
利用 Metaboanalyst5.0分别分析血浆（健康对照组、稳定期哮喘组、重症哮喘组）中内源性代谢物的差异，找出VIP值>1、P值<0.05、Foldchange（FC）>1.5或<0.5的内源性代谢物，再利用MetaboAnalyst5.0网站中的Pathway Analysis分析骨髓组织和骨髓上清液的差异代谢通路，选择Impact值大于0.1的代谢通路作为哮喘的主要差异代谢通路。
4、数据处理和统计分析：
内源性代谢物的鉴定利用高分辨质谱mzCloud获取每一个内源性代谢物的小数点5位的精确质量数，并通过每个内源性代谢物的分子式来识别，再利用Tracefinder软件前期建立的1200余中内源性代谢物（包含糖类、脂质类、脂肪酸类、氨基酸类等）的数据库。通过Tracefinder数据库自动匹配相应内源性代谢物的峰面积，再利用MetaboAnalyst5.0网站分析，绘制OPLS-DA模型图，找出健康人与哮喘患者的代谢模式差异和明显的分类趋势，最后根据VIP>1、P<0.05、FC>1.5或<0.5的标准选出具有差异的代谢标志物。
5、结果：
利用MetaboAnalyst5.0网站计算PCA。PCA（图3A和3B）结果显示健康对照组与哮喘组的血浆之间的差异， OPLS-DA（图3C）结果分别显示健康对照组与哮喘组能彻底分开。同时选择VIP>1，P值小于0.05，FC>1.5或<0.5的内源性物质作为进一步分析哮喘患者的主要差异代谢通路。表1为利用OPLS-DA模型获得哮喘中差异代谢物的变化率，结果显示差异性代谢物总共有29种，与健康对照组相比，哮喘组中10种内源性物质的比例主要是上升的，另19种主要存在下降趋势。结果说明机体发生哮喘病变后影响了血浆内源性物质的代谢分泌，使它的含量起了明显变化，主要变化的成分是脂质类物质。其中，半乳糖神经酰胺d18:1/16:0和半乳糖神经酰胺d18:1/14:0的ROC曲线下面积高达0.97，具体结构见图5。
表1
内源性物质代谢通路的差异研究：
图4为利用MetaboAnalyst5.0分析哮喘的代谢通路。表3结果显示健康对照组与哮喘组存在Impact值大于0.1的具有显著差异的代谢通路，主要有5条，显示两者主要影响通路包括鞘脂代谢，分析结果显示哮喘发生后影响了鞘脂的代谢与合成，从而导致患者机体内源性物质含量的变化，所以最终选择鞘脂代谢通路上的代谢物作为区分健康人和哮喘患者的靶标进行靶向代谢组学分析。
表2
实施例2
利用靶向鞘脂代谢组学分析进行哮喘患者和健康人之间标志物的验证。
（一）样本收集：
收集100例HC（健康对照）、98例稳定期哮喘患者、94例重症期哮喘患者的血浆样本。所有参与者均来自于中日友好医院，哮喘患者均依据《支气管哮喘防治指南（2020年版）》，经临床医生评估后诊断支气管哮喘，排除肺结核、肺间质纤维化、慢性阻塞性肺病等呼吸性疾病史。HC的年龄、性别与哮喘患者相匹配，以排除性别、年龄导致的代谢差异。采血时间均为清晨空腹状态。收集被检者空腹血浆样本，-80℃冰箱贮藏，备用。
（二）样本检测：
1、仪器信息：
质谱名称：临床医学版IVD三重四极杆液质联用系统（K6460，Serial No.：SG1638K003，Agilent公司）配备有电喷雾离子源（ESI），液相名称：1200 RRLC system超高效液相色谱仪。ORTEX-2GENE 涡旋混合器（Scientific Industry 公司）；METLER TOLEDOAG135型电子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q 超纯水器（No.041572，默克公司）。
2、样本前处理：精密吸取80 μL血浆或血清，加入10 μL内标工作溶液，加入480 μL异丙醇/甲醇溶液（9:1，v/v）沉淀蛋白，涡旋10 min，12000 rpm离心10 min，取上清，真空浓缩挥干，用80 μL甲醇复溶，涡旋10 min，12000 rpm离心15 min，即得供试品溶液用于定量分析。干血片：吸取15-50 μL人全血滴至干血斑采集卡，室温下干燥1-4小时至颜色变为深红色，得到干血斑样品。用打孔器从干血斑上取下一至多个直径为3-8 mm的干血斑样片。将干血斑样片加至具有磷脂/蛋白去除功能的固相萃取小柱中，采用含有5%-50%比例水的有机试剂进行洗脱。
3、仪器参数：
色谱条件：色谱柱规格为：Agilent Poroshell 300 SB-C8（2.1×75 mm 5μm），色谱柱温度为40℃，自动进样器的温度保持在4℃，采用流动相A液为含0.1%甲酸及1.0 mM乙酸铵的水，流动相D液为甲醇，0-2.0 min，40% D梯度洗脱至70% D，2.0-8.0 min，70% D梯度洗脱至90% D，8.0-10.0 min，90% D梯度洗脱至96% D，每次进样10 μL，流速为0.4mL/min；
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子检测模式，MRM模式采集数据过程中，喷雾电压为2500-5000 V，干燥器温度为150-350 ºC，鞘气温度为250-400 ºC，喷雾气流速为10-50psi，鞘气流速为5-20 L/min，毛细管温度为150-320ºC，MRM离子对监测目标鞘脂代谢物。
（三）结果分析：
1. 各鞘酯代谢物标准曲线和线性范围
靶向代谢组学测定鞘脂代谢物结构图见图5，混合人血浆样本中目标鞘脂代谢物及内标MRM提取图见图6，取各鞘酯代谢物系列浓度的基质标准加入混合血浆样品，从低浓度到高浓度连续进样，以标准加入法各被测物加入浓度为横坐标（X），被测物峰面积扣除本底峰面积为纵坐标（Y）进行标准曲线的计算，得到基质标准曲线线性方程和线性相关系数值R2(图7)。结果表明，1-磷酸鞘氨醇（S1P），鞘脂d18:1/16:0（Ceramide16:0），鞘脂d18:1/18:0（Ceramide18:0），鞘脂d18:1/20:0（Ceramide20:0），鞘脂d18:1/22:0（Ceramide22:0），鞘脂d18:1/24:0（Ceramide24:0），二氢鞘脂d18:0/24:0（dhCeramide24:0），鞘脂d18:1/24:1（Ceramide24:1），鞘脂d18:1/26:0（Ceramide26:0）在各自浓度范围内，其峰面积与浓度线性良好，相关系数R2均大于0.98（表3）。
表3
2. 质控样本分析
采用混合血浆样品作为质控样品：各被测鞘脂批内精密度RSD＜12.45%；批间精密度RSD＜13.25%，符合内源性代谢物分析质量控制要求（表4）。
表4
3．哮喘相关人血清样品分析
分别对健康人（H）、稳定哮喘期患者（S）和重症哮喘期患者（A）血浆样品中的目标鞘脂代谢物进行定量分析，测定的各组样本中目标鞘脂代谢物血浆浓度见表5。进一步进行了各组间目标鞘脂代谢物的t检验，结果显示，在重症哮喘期（A）和稳定哮喘期（S）组间比较及重症哮喘期（A）和健康人（H）组间比较中，1-磷酸鞘氨醇（S1P），磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1（CeramideP14:1），鞘脂d18:1/16:0（Ceramide16:0），鞘脂d18:1/18:0（Ceramide18:0），鞘脂d18:1/20:0（Ceramide20:0），鞘脂d18:1/24:1（Ceramide24:1）组间t检验均具有显著性差异（p＜0.01）（表5）。其他鞘脂类代谢物t检验不具有显著性差异（p＞0.05）。
进一步基于ROC曲线来确定重症哮喘期诊断生物标志物，使用SPSS软件将组别设置为状态变量，目标鞘脂代谢物测定浓度为检验变量，以较大的检测结果表示更加肯定的检验进行分析。大规模数据分析中ROC分析曲线下面积大于0.7即可认为指标具有良好的诊断能力；在渐进显著性p＜0.05情况下。ROC曲线下面积大于0.65也可认为指标具有良好的诊断能力。计算了重症哮喘期（A）和稳定哮喘期（S）比较中1-磷酸鞘氨醇（S1P），磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1（CeramideP14:1），鞘脂d18:1/16:0（Ceramide16:0），鞘脂d18:1/18:0（Ceramide18:0），鞘脂d18:1/20:0（Ceramide20:0），鞘脂d18:1/24:1（Ceramide24:1）组间ROC分析曲线下面积（AUC）（表6）。
基于ROC分析曲线下面积评价重症哮喘期鞘脂生物标志物的诊断能力，进一步比较了：（1）直接带入样本测定的生物标志物浓度进行ROC分析；（2）带入样本测定的生物标志物浓度与鞘脂d18:1/24:0（Ceramide 24:0）浓度的比值进行ROC分析，总结的ROC分析数据见表6，结果表明生物标志物浓度与鞘脂24:0浓度的比值也可作为指征重症哮喘期的生物标志物。进一步经Logistic回归分析得到基于鞘脂标志物与鞘脂d18:1/24:0浓度比值的多个代谢标志物拟合的回归曲线：Y=Logit (p) = 37.604a - 1116.674b + 44.959c -2.948d + 181.759e + 0.439f - 3.741（Y为诊断概率，Logit(p)为逻辑回归函数，a-f分别为1-磷酸鞘氨醇，磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1，鞘脂d18:1/16:0，鞘脂d18:1/18:0，鞘脂d18:1/20:0，鞘脂d18:1/24:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值），经拟合后重症哮喘期（A）和稳定哮喘期（S）比较中ROC曲线下面积为0.811（图8），增加了哮喘疾病诊断的准确性。
表5
表6
实施例3
具体病例分析。
本试验包含4名自身对照患者，即同一患者分别处于稳定哮喘期（S）和重症哮喘期（A）的不同状态，结果表明诊断生物标志物鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/24:1在4名自身对照患者重症哮喘期（A）均上调（图9），综上结果表明鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/24:1可成为哮喘病程动态监测的生物标志物。
实施例4
为了验证代谢标志物的检测效果，设计了以下分组实验。
采用与实施例2相同的方法，对15例疑似哮喘患者的血浆中的代谢标志物进行了10次重复检测，代谢标志物分组如下：
1）鞘脂 d18:1/20:0单独检测组；
2）鞘脂 d18:1/18:0单独检测组；
3）鞘脂 d18:1/16:0单独检测组；
4）鞘脂 d18:1/ 24:1单独检测组；
5）联合检测组。
鉴于个体差异，以及检测过程中的仪器和试剂误差等原因，在实际操作的代谢标志物的检测过程中，通常会产生漏检，从而对患者的病情产生了延误等不利后果，基于此，本实施例对上述5组代谢物检测的漏检率进行了统计，具体结果如表7所示。
表7
从表7可以看出，同时检测代谢标志物（鞘脂组合物），能够有效降低针对哮喘的漏检率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.鞘脂代谢标志物在制备用于哮喘病程动态监测产品中的应用，其特征在于：所述鞘脂代谢标志物包括1-磷酸鞘氨醇、磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1、鞘脂d18:1/20:0、鞘脂d18:1/18:0、鞘脂d18:1/16:0、鞘脂d18:1/24:1及鞘脂d18:1/24:0；
经Logistic回归分析得到拟合的回归曲线：
Y =Logit(p)=37.604a-1116.674b+44.959c-2.948d+181.759e+0.439f-3.741
其中，Y为诊断概率，Logit(p)为逻辑回归函数，a-f分别为1-磷酸鞘氨醇，磷酸化神经酰胺鞘脂d18:1/14:1，鞘脂d18:1/16:0，鞘脂d18:1/18:0，鞘脂d18:1/20:0，鞘脂d18:1/24:1与鞘脂d18:1/24:0的浓度比值；
用于哮喘病程动态监测产品为芯片、试纸或试剂盒，获取检测对象生物样本中代谢物之间的比值水平并用来判断检测对象中哮喘的疾病状况；
所述生物样本为血浆、血清、全血、全血干血斑、或干血浆斑。
2.根据权利要求1所述的鞘脂代谢标志物在制备用于哮喘病程动态监测产品中的应用，其特征在于：通过以下的一种或多种方法获取检测对象生物样本中代谢物水平：色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法、免疫法。
3.根据权利要求2所述的鞘脂代谢标志物在制备用于哮喘病程动态监测产品中的应用，其特征在于：所述色谱法包括高效液色谱法、薄层色谱法、气相色谱法；所述光谱法包括核磁共振光谱法、折射率光谱法、紫外光谱法、近红外光谱法；所述化学分析法包括电化学分析法、放射化学分析法；所述质谱法为三重四极杆质谱法，采用质谱法快速定量检测代谢标志物的方法是先采用色谱柱进行梯度洗脱，再于电喷雾离子源ESI正离子MRM模式下采集数据，所述质谱法中，是采用正离子扫描，一次进样分析所有代谢标志物和内标的方法进行检测。
4.根据权利要求1所述的鞘脂代谢标志物在制备用于哮喘病程动态监测产品中的应用，其特征在于：所述生物样本在检测前的预处理方式为：精密吸取80 μL血浆或血清，加入10 μL内标工作溶液，加入480 μL异丙醇/甲醇溶液，9:1，v/v，沉淀蛋白，涡旋10 min，12000rpm离心10 min，取上清，真空浓缩挥干，用80 μL甲醇复溶，涡旋10 min，12000 rpm离心15min，得到供试品溶液用于定量分析。
5.根据权利要求1所述的鞘脂代谢标志物在制备用于哮喘病程动态监测产品中的应用，其特征在于：吸取15-50 μL人全血滴至干血斑采集卡，室温下干燥1-4小时至颜色变为深红色，得到干血斑样品；用打孔器从干血斑上取下一至多个直径为3-8 mm的干血斑样片；将干血斑样片加至具有磷脂/蛋白去除功能的固相萃取小柱中，采用含有5%-50%比例水的有机试剂进行洗脱。
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