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CN117137939A - 促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用 - Google Patents

促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用 Download PDF

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CN117137939A
CN117137939A CN202311095595.9A CN202311095595A CN117137939A CN 117137939 A CN117137939 A CN 117137939A CN 202311095595 A CN202311095595 A CN 202311095595A CN 117137939 A CN117137939 A CN 117137939A
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CN
China
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macrophage
wound
chitosan
polarization
chronic
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Application number
CN202311095595.9A
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朱萌
田野
廖碧雁
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Guocorona Zhongshan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guocorona Zhongshan Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请提供的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，将诱导巨噬细胞M1极化的材料与诱导巨噬细胞M2极化的材料先后分段用于慢性创面发生早期与皮肤组织开始重建的组织增殖期；诱导巨噬细胞M1极化的材料在创面愈合早期诱导急性免疫反应产生，吞噬病原微生物，缩短炎症期并推动其向增殖期顺利过度；诱导巨噬细胞M2极化的材料在增殖期清除坏死组织，溶解炎症并促进组织的修复与再生，如此为不同创面愈合时期提供最适的创面免疫微环境，恢复慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞表型平衡，从而加快体表慢性难愈合创面愈合。

Description

促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用
技术领域
本发明涉及创面愈合技术领域，尤其是涉及促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用。
背景技术
体表慢性难愈合创面，指经1个月以上治疗未能愈合、也无愈合倾向的创面，其中，糖尿病足、压力性损伤(如压疮、褥疮)是典型的慢性难愈合创面，如何促进体表慢性难愈合创面的愈合，是实施健康中国战略中亟待解决的人民重大健康问题。
根据《国际创伤修复与再生》统计，在糖尿病患者中，糖尿病足的发病率为19～34％，因糖尿病足造成的截肢率约20％；患有糖尿病足后5年内的死亡率的人数为单纯患有糖尿病人数的2.5倍。压力性损伤在人群中的发病率为0.75％，其中我国老年人患病率高达5～27％，患病者因褥疮及其并发症的死亡率高达40％以上。体表慢性难愈合创面患者由于长期慢性炎症、持续细菌感染、缺氧、胶原代谢异常、细胞迁移能力弱等特征，导致慢性难愈合创面的临床治疗伴随着高复发率、高截肢率和高死亡率，如何解决体表慢性难愈合创面问题，核心在于弄清创面愈合的机理以及选择合适的材料促进体表慢性难愈合创面。
经典的创面修复涉及一系列复杂而有序的生命活动，包括相互重叠而又各不相同的四个阶段：止血期、炎症期、增殖期、重塑期。巨噬细胞是创面愈合过程中的关键参与者，根据表型和分泌细胞因子的不同可以将其分为M1促炎表型(经典活化型)和M2抗炎表型(替代活化型)，二者的含量会随着愈合阶段的变化而发生改变。根据《科学转化医学》刊物记载，将伤口中巨噬细胞表型由M1为主逐渐转变为M2为主，对于溶解炎症、血管形成以及再上皮化有重要作用。
但在糖尿病足等慢性难愈合创面中，由于高血糖水平严重损害巨噬细胞功能，导致创面各个愈合阶段不同表型巨噬细胞之间的平衡被破坏。巨噬细胞表型失衡严重影响参与伤口愈合过程的细胞和信号分子，扰乱了正常的生理性愈合程序，从而阻碍了糖尿病创面愈合。如何弥补并恢复巨噬细胞功能、调控M1、M2抗炎表型巨噬细胞之间的平衡，推动炎症期向增殖期顺利过渡是促进糖尿病创面愈合的关键之一。
在先公开了专利CN202111425932.7一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料，公开日2023年4月11日；公开了技术方案使用PEG化壳聚糖诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2抗炎表型，以加快伤口愈合；而其并未对将巨噬细胞极化成为M1促炎表型的手段有所披露；基于此基础上，发明人经过研究在原有的专利基础上改进创新，提出了一种不同于现有技术的，研制出促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用。
发明内容
本发明为了解决如何缩短伤口愈合时间，加快伤口愈合速度、如何为糖尿病创面愈合时期提供最适的免疫微环境，恢复糖尿病慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞平衡的技术问题，提供一种促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用。
本发明采用的技术方案是：
促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，包括促巨噬细胞M1极化材料以及促巨噬细胞M2极化材料；
本发明将能够诱导巨噬细胞M1极化的材料与能够诱导巨噬细胞M2极化的材料先后分段用于慢性难愈合创面发生早期与皮肤组织开始重建的组织增殖期：在创面愈合前期诱导急性免疫反应产生，吞噬病原微生物，推动炎症期向增殖期顺利过度；而在创面愈合中晚期清除坏死组织，溶解炎症并促进组织的修复与再生，恢复慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞平衡，为不同创面愈合时期提供最适的创面免疫微环境，从而加快体表慢性难愈合创面愈合。
进一步地，所述促巨噬细胞M1极化材料为双胍壳聚糖(即DICY-CS)；
双胍壳聚糖采取以下方法制备：
S1、将分子量为10,000-1,000,000Da原料壳聚糖溶解在盐酸溶液中配置成浓度为0.1mol/L的壳聚糖盐酸盐溶液；
S2、搅拌条件下向S1中的壳聚糖盐酸盐溶液中加入物质的量为S1中原料壳聚糖的氨基2-4倍的双氰胺，得混合物B；
S3、将混合物B在90℃回流下反应6-48小时，得中间反应产物A
S4、将中间反应产物A转移至截留分子量为3,500-14,000Da的透析袋中，在去离子水中透析，每6-12小时换水一次，换水6-10次后，冷冻干燥得到双胍壳聚糖。
其中促巨噬细胞M1极化的双胍壳聚糖的溶解性以及抗菌性优于天然壳聚糖；在体表慢性难愈合性创面中，早期炎症反应不明显，M1型巨噬细胞不足，双胍壳聚糖生物相容性好，能够促进巨噬细胞M1极化，诱导急性炎症出现，加快炎症期到来，顺利启动经典的创面愈合程序；并且实验发现，由双胍壳聚糖引发的适度炎症并不会进一步积累发展成为过度炎症，能够合理地促进体表慢性难愈合创面愈合的进程。
优选的，所述S3中的反应时间为12-24小时，发明人实验发现，反应时间短会使反应不充分，反应时间过长会导致壳聚糖主链骨架发生断裂降解。
进一步地，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系RAW264.7、巨噬细胞系THP-1、巨噬细胞系U937、骨髓诱导的巨噬细胞BMDM、外周血来源的单核巨噬细胞PBMC、哺乳动物组织来源的原代巨噬细胞。
进一步地，所述双胍壳聚糖为双胍壳聚糖溶液、双胍壳聚糖喷雾、双胍壳聚糖凝胶。
进一步地，所述促巨噬细胞M2极化材料为聚乙二醇壳聚糖(即PEG-CS)。
进一步地，所述双胍壳聚糖的双胍取代度为5-20％；
优选的，所述双胍壳聚糖的双胍取代度为10-15％；
壳聚糖上双胍的取代度和其溶解性呈正比关系，如上述的双胍壳聚糖不仅溶解性及抗菌性优于天然壳聚糖，有利于制成各种溶液、凝胶、或喷雾等溶解于溶剂，便于在促进创口愈合的应用；而且本发明在促巨噬细胞M1极化材料中的壳聚糖需要有5-20％的双胍基团，才能实现刺激巨噬细胞，保证双胍壳聚糖促M1极化的作用，实现本发明的效果。
进一步地，所述促巨噬细胞M1极化材料应用于所述体表慢性难愈合创面最初发生直至肉芽组织形成阶段；所述促巨噬细胞M2极化材料应用于所述体表慢性难愈合创面皮肤组织开始重建的肉芽期组织增殖期。
进一步地，促巨噬细胞M1极化材料用于所述体表慢性难愈合创面后，所述巨噬细胞表现为A和/或B和/或C：
A、增强M1型巨噬细胞基因的转录；
B、增强炎性因子的分泌；
C、提高共刺激因子CD86的表达量。
进一步地，B中所述炎性因子包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6和白细胞介素-12中的一种或多种。
进一步地，所述体表慢性难愈合创面包括糖尿病足、压疮、下肢静脉溃疡、伴有严重感染的烧烫伤或大面积皮肤缺损等巨噬细胞功能受到破坏、巨噬细胞表型严重失衡，特别是创伤早期炎症反应明显不足的创面。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本申请提供的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，将诱导巨噬细胞M1极化的材料与诱导巨噬细胞M2极化的材料先后分段用于慢性创面愈合发生早期与皮肤组织开始重建的组织增殖期；诱导巨噬细胞M1极化的材料在创面愈合早期诱导急性免疫反应产生，吞噬病原微生物，缩短炎症期并推动其向增殖期顺利过度；诱导巨噬细胞M2极化的材料在增殖期清除坏死组织，溶解炎症并促进组织的修复与再生，如此为糖尿病的不同创面愈合时期提供最适的创面免疫微环境，恢复糖尿病慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞表型平衡，从而加快糖尿病体表慢性难愈合创面愈合。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中经样品刺激诱导后Raw264.7中CD86阳性细胞(M1型巨噬细胞)百分比分布图；
图2为实施例2中经样品刺激诱导后巨噬细胞中CD86阳性细胞(M1型巨噬细胞)百分比分布图；
图3a为实施例3中阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的CD86蛋白阳性细胞百分数柱状图；
图3b为实施例3中阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的CD206蛋白阳性细胞百分数柱状图；
图4a为实施例4中阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的培养上清液中的肿瘤坏死因子-α的含量柱状图；
图4b为实施例4中阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的培养上清液中的白细胞介素-6的含量柱状图；
图4c为实施例4中阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的培养上清液中的血管内皮生长因子的含量柱状图；
图4d为实施例4中阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的培养上清液中的白细胞介素-10的含量柱状图；
图5a为实施例5中阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的炎性基因中的TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的含量柱状图；
图5b为实施例5中阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组中的抗炎基因Stat6、Mcr1、IL-10、Arg1的含量柱状图；
图6是实施例6中第0、7、10、14天的大鼠创面对比图；
图7是实施例6中第0、7、10、14天的大鼠创面面积变化图；
图8a是实施例7中大鼠伤后第7天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中CD86荧光标记图；
图8b是实施例7中大鼠伤后第14天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中CD86荧光标记图；
图8c是实施例8中大鼠伤后第7天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中TNF-α浓度柱状图；
图8d是实施例8中大鼠伤后第14天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中TNF-α浓度柱状图；
图9a是实施例9中大鼠伤后第7天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中CD68以及CD206荧光标记图；
图9b是实施例9中大鼠伤后第14天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中CD68CD206荧光标记图；
图9c是实施例10中大鼠伤后第7天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中IL-10的浓度柱状图；
图9d是实施例8中大鼠伤后第14天的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组中IL-10的浓度柱状图；
图10a是实施例11中H&E染色图；
图10b是实施例12中Masson染色图；
图10c是实施例13中CD31荧光标记图；
图10d是根据图10a中的创面区域面积制成的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组的柱状图；
图10e是根据图10b中的胶原沉积区面积制成的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组的柱状图；
图10f是根据图10c中的荧光标记阳性面积百分比制成的空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组的柱状图；
图11是实施例14中糖尿病大鼠第1、5、7、14、21创面对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例1-14说明本发明的具体技术方案：
实施例1
双胍壳聚糖的制备：
S1、将2.5g分子量为200,000Da原料壳聚糖溶解在250mL物质的量浓度为0.1mol/L的盐酸溶液中制备壳聚糖盐酸盐溶液；
S2、搅拌条件下向S1中的壳聚糖盐酸盐溶液中加入4g双氰胺，得混合物B1；
S3、将混合物B1在90℃回流下反应24小时，得中间反应产物A1；
S4、将中间反应产物A1转移至截留分子量为7,000Da的透析袋中，在去离子水中透析，每6-8小时换水一次，换水6-8次后，冷冻干燥得到双胍壳聚糖。
S5、在12孔板中接种小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞悬液1mL/孔，使每孔内细胞数保持在10,000-20,000个；
S6.1、实验组处理：待细胞贴壁后，将部分孔中的条件培养基置换为S4中双胍壳聚糖含量为1mg/mL双胍壳聚糖溶液的条件培养基，并在37℃、5％CO2培养条件下孵育24h；
S6.2、阳性对照组处理：待细胞贴壁后，将部分孔中的条件培养基置换为10ng/mLLPS以及2ng/mL IFN-γ混合液培养，并在37℃、5％CO2培养条件下孵育24h；
S6.3、阴性对照组：细胞贴壁后不做任何处理，在37℃、5％CO2培养条件下孵育24h；
S7、待S6.1、S6.2以及S6.3孵育培养结束后，用细胞刮刀收集培养结束的巨噬细胞，用PBS清洗一次后用FITC-CD86荧光抗体对巨噬细胞进行染色，随后以中速通过流式细胞仪各收集10,000个细胞进行分别进行荧光强度分析，结果如图1所示，表明经双胍壳聚糖刺激的单核巨噬细胞大部分向M1促炎极化表型极化。
实施例2
S1、将2.5g分子量为500,000Da原料壳聚糖溶解在250mL物质的量浓度为0.1mol/L的盐酸溶液中制备壳聚糖盐酸盐溶液；
S2、搅拌条件下向S1中的壳聚糖盐酸盐溶液中加入2.35g双氰胺，得混合物B2；
S3、将混合物B2在90℃回流下反应24小时，得中间反应产物A2；
S4、将中间反应产物A2转移至截留分子量为8,000-14,000Da的透析袋中，在去离子水中透析，每8-12小时换水一次，换水8-10次后，冷冻干燥得到双胍壳聚糖。
S5、在6孔板中接种小鼠骨髓来源的巨噬细胞细胞悬液2mL/孔，使每孔内细胞数保持在50,000-100,000个；
S6.1、实验组处理：待细胞贴壁后，将部分孔中的条件培养基置换为S4中双胍壳聚糖含量为0.5mg/mL双胍壳聚糖溶液的条件培养基，并在37℃、5％CO2培养条件下孵育48h；
S6.2、阳性对照组处理：待细胞贴壁后，将部分孔中的条件培养基置换为10ng/mLLPS以及2ng/mL IFN-γ混合液培养，并在37℃、5％CO2培养条件下孵育48h；
S6.3、阴性对照组：细胞贴壁后不做任何处理，在37℃、5％CO2培养条件下孵育48h；
S7、待S6.1、S6.2以及S6.3孵育培养结束后，用细胞刮刀收集培养结束的巨噬细胞，用PBS清洗一次后用FITC-CD86对巨噬细胞进行染色，随后以中速通过流式细胞仪各收集10,000个细胞进行分别进行荧光强度分析，结果如图2所示，表明经双胍壳聚糖刺激的单核巨噬细胞大部分向M1促炎极化表型极化。
实施例3
S1、小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(即BMDM)处理：
M1型极化实验组处理：将双胍壳聚糖加入小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞中，使得原代巨噬细胞中双胍壳聚糖的浓度为1mg/mL；温度37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规细胞培养48小时；
M2型极化实验组处理：将聚乙二醇壳聚糖加入小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞中，使得原代巨噬细胞中聚乙二醇壳聚糖的浓度为1mg/mL；温度37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规细胞培养48小时；
阴性对照组处理：未经处理的入小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞，在温度37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规细胞培养48小时；
M1型极化阳性对照组处理：将细菌脂多糖(即LPS)以及IFN-γ混合物加入小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞中，使得原代巨噬细胞中细菌脂多糖(LPS)以及IFN-γ混合物的浓度为1mg/mL；温度37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规细胞培养48小时；
M2型极化阳性对照组处理：将白细胞介素-4(即IL-4)加入小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞中，使得原代巨噬细胞中IL-4的浓度为1mg/mL；温度37℃、5％CO2、饱和湿度条件下常规细胞培养48小时；S2、培养结束后，用细胞刮刀收集经M1型极化实验组处理、M2型极化实验组处理、阴性对照组处理、M1型极化阳性对照组处理、M2型极化阳性对照组处理的巨噬细胞；PBS清洗一次后用荧光标记的抗CD86与抗CD206对其进行染色；
S3、使用流式细胞术检测S2中处理后CD86阳性与CD206阳性的BMDM比例，制图成图3a以及图3b；
根据图3a所示，M1型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，使用DICY-CS刺激的BMDM多为CD86阳性即M1型巨噬细胞；
根据图3b所示，M2型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，而使用PEG-CS刺激的BMDM细胞多为CD206阳性即M2型巨噬细胞。
实施例4
收集实施例1中步骤S1培养48小时后的细胞培养上清液，通过酶联接免疫吸附剂测定(即ELISA)方法测定阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的培养上清液中的炎性细胞因子中的肿瘤坏死因子-α(即TNF-α)、白细胞介素-6(即IL-6)；制成图4a、4b；
同样ELISA方法测定组阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组中的抗炎细胞因子中的血管内皮生长因子(即VEGF)、白细胞介素-10(即IL-10)含量；制图成图4c以及4d。
根据图4a以及4b所示，M1型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，使用DICY-CS刺激的BMDM分泌更多的炎性细胞因子；
根据图4c以及图4d所示，M2型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，使用PEG-CS刺激的BMDM细胞分泌更多的抗炎细胞因子。
实施例5
收集实施例3中步骤S1培养48小时后的巨噬细胞，采用离心柱法提取各组的RNA，通过荧光定量PCR方法(即qRT-PCR方法)分别测定阴性对照组、M1型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组的炎性基因中的TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的表达情况；制成图5a；
同样的方法测定阴性对照组、M2型极化阳性对照组、M1型极化实验组、M2型极化实验组中的抗炎基因Stat6、Mcr1、IL-10、Arg1的表达情况；制成图5b；
根据图5a所示，M1型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，使用DICY-CS刺激的BMDM细胞其TNF-α、iNOS、IL-6和IL-1β基因的转录水平明显上调；
根据图5b所示，M2型极化实验组处理与阴性对照组处理相比，使用PEG-CS刺激的BMDM细胞其Stat6、Mcr1和IL-10基因的转录水平明显上调。
实施例6
S1、随机选取15只质量相近的大鼠，使用4％体积分数水合氯醛以0.1mL/10g对大鼠进行麻醉，使用电动剃毛刀对大鼠背部进行剃毛，使用镊子和剪刀在大鼠背部皮肤制造一个避免伤及肌肉组织的、直径约为25mm的圆形创口；
S2、在S1中制造的圆形创口上滴加100μL培养12小时的耐药性金黄色葡萄球菌(即MRSA菌液)后，放回笼中饲养72小时。
S3、对大鼠分为空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组，每三只大鼠为一组；
空白对照组创口上喷涂生理盐水，每隔一天换药一次；
商业对照组创口上涂覆磺胺嘧啶银乳膏，每隔一天换药一次；
DICY-CS组喷涂5mg/mL生理盐水配制的DICY-CS溶液，每隔一天换药一次；
PEG-CS组喷涂5mg/mL生理盐水配制的PEG-CS溶液，每隔一天换药一次；
联用组前7天创面最初发生直至肉芽组织形成阶段，隔天喷涂5mg/mL生理盐水配制的DICY-CS溶液，随后待创面皮肤肉芽组织开始重建的组织增殖期，隔天喷涂5mg/mL生理盐水配制的PEG-CS溶液；
S4、对S3中的大鼠创口共观察14天，在第0、7、10、14天拍照记录创口愈合情况，如图6所示；
S5、统计S3中不同时间的创面面积，通过图像处理软件计算不同时间点所占初始伤口面积的百分比，结果如图7所示。
根据图6以及图7所示，联用组与对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组相比，联用组采用的先后使用DICY-CS、PEG-CS促创面愈合速度的方法最快。
实施例7
伤后7天分别将实施例6中空白对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组的大鼠各1只制作创面组织切片；
伤后14天分别将实施例6中对照组、商业对照组、DICY-CS组、PEG-CS组以及联用组的大鼠各1只制作创面组织切片；
上述大鼠的创面组织切片制作方法：创面组织进行取材、固定；组织样本取材3mm厚，70％、80％、95％、100％乙醇梯度脱水各30分钟后，1L二甲苯处理各20分钟，石蜡浸蜡两缸各12分钟后包埋，切片4μm，烤片；随后1.5L二甲苯分三次脱蜡，每次8分钟；1L无水乙醇处理两次，每次500mL，8分钟；90％、80％、60％乙醇各处理8分钟。苏木精染色4分钟，流水清洗；盐酸乙醇分化2-3秒，流水清洗；0.5％氨水处理20秒，流水清洗；光学显微镜观察。0.5％伊红染色1分钟；80％、90％乙醇各分化3-5秒；95％乙醇处理5分钟；1.5L无水乙醇分三次处理，每次5分钟；1L二甲苯处理两次，每次5分钟，制成创面组织切片。
创面组织切片用PBS洗涤，室温下用山羊血清封闭，免疫荧光染色标记CD68、CD86蛋白，同时用含有DAPI的封片剂封片,使用激光共聚焦显微镜观察创面组织中CD68及CD86蛋白表达情况。
根据图8a所示(标尺为50μm)，伤后7天，联用组与其他各组相比，前7天中DICY-CS组与联用组中CD86荧光强度更高；
根据图8b所示(标尺为50μm)，伤后14天，仅在DICY-CS组观察到明显的荧光，联用组CD86荧光强度有所下降。说明联用组的CD86主要来源于DICY-CS对巨噬细胞的刺激作用。
实施例8
通过酶联免疫吸附试剂盒测定实施例7中伤后7天及14天中大鼠组织匀浆中单位蛋白质量中炎症因子TNF-α的浓度，结果如图8c、8d所示。M1型极化实验组的创面中TNF-α浓度较高，说明DICY-CS对促炎巨噬细胞的诱导作用大。
实施例9
实施例6中伤后7天、14天创面组织切片用PBS洗涤，室温下用山羊血清封闭，免疫荧光染色标记CD68、CD206蛋白，同时用含有DAPI的封片剂封片,使用激光共聚焦显微镜观察创面组织中CD68及CD206蛋白表达情况。
结果如图9a、9b所示(标尺为50μm)，伤后7天，PEG-CS组与其他各组相比，中CD206荧光强度更高；伤后14天，PEG-CS组与联用组CD206荧光强度较高。说明联用组的CD206主要来源于PEG-CS对巨噬细胞的刺激作用。
实施例10
通过酶联免疫吸附试剂盒测定实施例6中伤后7天大鼠组织组织匀浆中单位蛋白质量中抗炎因子IL-10的浓度，结果如图9c所示(图中ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)；
通过酶联免疫吸附试剂盒测定实施例4中伤后14天大鼠组织组织匀浆中单位蛋白质量中抗炎因子IL-10的浓度，结果如图9d所示(图中ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)；伤后14天的PEG-CS组的创面中IL-10浓度较高，说明PEG-CS对抗巨噬细胞的诱导作用。
实施例11
将实施例6中的大鼠创面组织切片使用中性树脂胶封固，光学显微镜下观察创面肉芽组织、成纤维细胞等结构的生长情况，结果如图10a所示(标尺为50μm)。统计各组创缘宽度，如图10d所示，联用组创缘宽度较小，已无明显炎性细胞浸润。
实施例12
伤后21天，实施例4中的剩余大鼠，与实施例7中同样方法制备组织切片，将石蜡切片脱蜡至水后，依次用自来水和蒸馏水洗涤。
用Regaud氏苏木精染色液或Weigert苏木精液染色液将细胞核染色5-10分钟；使用蒸馏水充分清洗洗涤。
使用Masson丽春红酸性复红液染色液溶解5-10分钟，用2％冰醋酸水溶液浸泡，1％磷钼酸水溶液分化3-5分钟，不需洗涤，直接用苯胺蓝或浅绿色溶液染色5分钟后，用0.2％冰醋酸水溶液浸泡，最后经95％酒精，无水酒精，透明二甲苯处理后，用中性胶密封。获得的Masson染色组织切片，结果如图10b所示(标尺为100μm)。统计各组创面中胶原沉积面积百分比。
如图10e所示，联用组胶原沉积丰富，创面愈合较好。
实施例13
实施例11中的切片，用PBS洗涤，室温下用山羊血清封闭，随后用兔CD31多克隆抗体孵育3小时后，用PBS洗涤切片，并用相应的荧光二抗对新生血管进行标记，同时用含有DAPI的封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜获取图像，其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光用来标记新生血管情况，结果如图10c所示(标尺为100μm)。统计CD31阳性面积百分比，如图10f所示。联用组与对照组相比，联用组的CD31表达丰富，说明本发明所采用的创面治疗方式对新生血管生成有促进作用。
实施例14
为验证本发明对促进糖尿病体表慢性难愈合创面愈合的作用，本发明采取以下方式：
对糖尿病大鼠进行称重，使用4％体积分数水合氯醛以0.1mL/10g对大鼠进行麻醉，使用电动剃毛刀对大鼠背部进行剃毛，使用镊子和剪刀在大鼠背部皮肤制造一个避免伤及肌肉组织、直径约为25mm的圆形伤口。对大鼠进行随机分组为空白对照组、促M2极化材料应用组、促M1极化材料+促M2极化材料应用组，每组为3只。对照组伤口喷涂1ml生理盐水，促M2巨噬细胞极化组喷涂5mg/mL生理盐水配制的1ml浓度为8mg/mL的PEG-CS溶液，以上各组每隔一天换药一次。联用组前7天隔天喷涂5mg/mL生理盐水配制的DICY-CS溶液1ml，随后隔天喷涂5mg/mL生理盐水配制的PEG-CS溶液1ml。观察大鼠伤口并拍照记录。伤后不同时间的创面照片如图11所示(图中ns p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)，与各对照组相比，经本发明中先后使用DICY-CS、PEG-CS的治疗方法的联用组创面愈合最快。
由实施例1-5可知，表明经双胍壳聚糖刺激的单核巨噬细胞大部分向M1促炎极化表型极化，并且按照本发明中提供的双胍壳聚糖溶液的制备方法中，按照实施例1中制备提供的方法制备出来的双胍壳聚糖应用到细胞贴壁检验效果时可以看出，与经典的LPS以及IFN-γ混合液培育相比，的LPS以及IFN-γ混合液培育仅有11.9％的巨噬细胞向M1促炎极化表型极化，而本发明中制备的双胍壳聚糖有82.1％的巨噬细胞向M1促炎极化表型极化，远比所述LPS以及IFN-γ混合液培育极化的巨噬细胞数量要大得多；并且通过双胍壳聚糖刺激的单核巨噬细胞，炎性细胞因子、TNF-α、iNOS、IL-6和IL-1β基因的转录水平明显上调，有助于加快体表慢性难愈合创面愈合。
由实施例6-13结合实验数据可知，本发明中将诱导巨噬细胞M1极化的材料与诱导巨噬细胞M2极化的材料先后分段用于慢性创面愈合最初发生直至肉芽组织形成阶段与皮肤肉芽组织开始重建的组织增殖期；促进创口愈合的效果要明显好于仅在创口上持续使用一种材料；证明本发明中促巨噬细胞极化材料可以恢复慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞平衡，体表慢性难愈合创面中的应用可以显著地提高体表创面的愈合速度。
从实施例14可以看出，本发明对促进糖尿病体表慢性难愈合创面愈合具有意料不到的技术效果，第21天的时候，联用组的创口以及完全闭合，原因在于促局势细胞M1极化的材料在炎症期诱导急性免疫反应产生，吞噬病原微生物，推动炎症期向增殖期顺利过度；诱导巨噬细胞M2极化的材料在增殖期清除坏死组织，溶解炎症并促进组织的修复与再生；如此为糖尿病不同创面愈合时期提供最适的创面免疫微环境，恢复慢性难愈合创面中的M1/M2型巨噬细胞平衡，从而加快体表慢性难愈合创面愈合。
所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述促巨噬细胞极化材料包括促巨噬细胞M1极化材料以及促巨噬细胞M2极化材料。
2.根据权利要求1所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述促巨噬细胞M1极化材料为双胍壳聚糖，所述双胍壳聚糖通过以下步骤制得：
S1、将分子量为10,000-1,000,000Da原料壳聚糖溶解在物质的量浓度为0.1mol/L的盐酸溶液中制备壳聚糖盐酸盐溶液；
S2、搅拌条件下向S1中的壳聚糖盐酸盐溶液中加入所述壳聚糖中氨基物质的量的2-4倍的双氰胺，得混合物B；
S3、将混合物B在90℃回流下反应6-48小时，得中间反应产物A；
S4、将中间反应产物A转移至截留分子量为3,500-14,000Da的透析袋中，在去离子水中透析，每6-12小时换水一次，换水6-10次后，冷冻干燥得到双胍壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系RAW264.7、巨噬细胞系THP-1、巨噬细胞系U937、骨髓诱导的巨噬细胞、外周血来源的单核巨噬细胞PBMC、哺乳动物组织来源的原代巨噬细胞。
4.根据权利要求2所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述双胍壳聚糖为双胍壳聚糖溶液、双胍壳聚糖喷雾、双胍壳聚糖凝胶。
5.根据权利要求2所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述双胍壳聚糖的双胍取代度为5-20％。
6.根据权利要求1或2所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于，所述促巨噬细胞M2极化材料为聚乙二醇壳聚糖。
7.根据权利要求1所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述促巨噬细胞M1极化材料应用于所述体表慢性难愈合创面最初发生直至肉芽组织形成阶段；所述促巨噬细胞M2极化材料应用于所述体表慢性难愈合创面皮肤肉芽组织开始重建的组织增殖期。
8.根据权利要求7所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述促巨噬细胞M1极化材料用于所述体表慢性难愈合创面后，所述巨噬细胞表现为A和/或B和/或C：
A、增强M1型巨噬细胞基因的转录；
B、增强炎性因子的分泌；
C、提高共刺激因子CD86的表达量。
9.根据权利要求8所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：B中所述炎性因子包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6和白细胞介素-12中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的促巨噬细胞极化材料在体表慢性难愈合创面中的应用，其特征在于：所述体表慢性难愈合创面为巨噬细胞功能受到破坏、巨噬细胞表型严重失衡以及创伤早期炎症反应明显不足的创面。
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