CN117136193A - 一种多肽探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种多肽探针，包括至少两个疏水性氨基酸残基；其中，所述疏水性氨基酸残基个数占所述多肽探针氨基酸残基个数的四分之一至三分之二。
Description
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种多肽探针及其制备方法与应用。
恶性淋巴瘤的恶性程度及致死率极高，近年来成为医学界研究的主要热点之一。其中，弥漫大B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，属于恶性淋巴瘤。目前，血液病理学专家需要根据病理分析的取样，来得出弥漫大B细胞淋巴瘤的正确诊断。然而，病理分析的取样困难，且往往存在于发病的中晚期，导致患者不能及时得到有效地治疗。
发明内容
一方面，提供一种多肽探针，包括至少两个疏水性氨基酸残基。其中，所述疏水性氨基酸残基个数占所述多肽探针氨基酸残基个数的四分之一至三分之二。
在一些实施例中，氨基酸包括His、Gly、Cys、Leu、Asn、Arg、Trp、Phe、Asp、Ser和Tyr中的至少一个。
在一些实施例中，所述氨基酸残基的个数为5个～15个。
在一些实施例中，氨基酸残基的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。
在一些实施例中，所述多肽探针的氨基酸残基的序列为SEQ ID NO.6。
另一方面，提供一种制备如上所述的多肽探针的制备方法，包括：
S1、将Tentagel-NH
2树脂分别与His、Gly以及Cys偶联。
S2、将S1反应产物分别与Cys、Leu以及Arg进行偶联。
S3、将S2反应产物分别与Trp、Leu以及Asn进行偶联。
S4、将S3反应产物分别与Arg、Trp以及Phe进行偶联。
S5、将S4反应产物分别与Gly、Phe、Leu、Asp以及Ser进行偶联。
S6、将S5反应产物分别与Phe、Ser、Leu、Asp以及Tyr进行偶联。
S7、对S6反应产物进行置换与干燥，得到负载有多肽的干燥树脂。
S8、将S7得到的干燥树脂裂解、初筛得到多肽探针，所述多肽探针的氨基酸残基的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。
在一些实施例中，多肽探针的制备方法，包括：
S1包括S11。
S11、将Tentagel-NH
2树脂脱除保护基团，再分别与His、Gly、Cys以及 HBTU进行偶联循环至少三次，然后脱除Fmoc保护基团。
S2包括S22。
S22、将S11反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Cys、Leu、Arg与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
S3包括S33。
S33、将S22反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Trp、Leu、Asn与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
S4包括S44。
S44、将S33反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Arg、Trp、Phe与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
S5包括S55。
S55、将S44反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成四份，向每份中加入Gly、Phe、Leu、Asp、Ser与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
S6包括S66。
S66、将S55反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成五份，向每份中加入Phe、Ser、Leu、Asp、Tyr与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
S7包括S77。
S77、对S66反应产物在溶剂中进行溶剂置换和树脂收缩，真空抽干，得到负载有多肽的干燥树脂。
S8包括S88。
S88、将S77干燥树脂在裂解剂中裂解后，再进行磁珠初筛得到多肽探针。
另一方面，提供一种试剂盒，包括如上所述的多肽探针。
在一些实施例中，试剂盒还包括表面活性剂、抗酶解剂和细胞荧光染色剂。
在一些实施例中，所述表面活性剂的体积百分比为0.5％～5％，所述抗酶解剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～10mmol/L，所述细胞荧光染色剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～50mmol/L。
在一些实施例中，所述表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、 十二烷基硫酸钠和脂肪酸山梨坦中的至少一种。和/或；所述抗酶解剂包括乙二胺四乙酸。和/或；所述细胞荧光染色剂包括罗丹明B。
另一方面，提供一种芯片，包括基体和如上所述的多肽探针，所述多肽探针设置于所述基体上。
另一方面，提供一种芯片的制备方法，包括：
形成基体。
在所述基体的一侧偶联多肽探针，所述多肽探针如上所述的多肽探针。
在一些实施例中，所述在所述基体的一侧偶联多肽探针包括：
将多肽探针分别溶解，得到溶解液。
将溶解液分别置于基体上，并孵育与封闭处理。
在一些实施例中，所述形成基体包括：
在基底一侧形成粘附层。
在所述粘附层远离所述基底的一侧形成钝化层，对所述钝化层进行图案化处理。
在所述钝化层远离所述基底的一侧镀金膜与刻蚀。
在所述金膜上偶联多肽探针。
在一些实施例中，所述在所述粘附层远离所述基底的一侧形成钝化层包括形成第一绝缘层和第二绝缘层。所述第一绝缘层形成在所述粘附层远离所述基底的一侧。所述第二绝缘层形成在所述第二绝缘层远离所述基底的一侧。
又一方面，提供一种如上所述的芯片在检测弥漫性大B细胞淋巴瘤中的应用。
为了更清楚地说明本公开中的技术方案，下面将对本公开一些实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。此外，以下描述中的附图可以视作示意图，并非对本公开实施例所涉及的产品的实际尺寸、方法的实际流程、信号的实际时序等的限制。
图1～图2根据一些实施例的多肽探针的制备方法的流程图；
图3为根据一些实施例的磁珠初筛原理结构图；
图4A～图4B为根据一些实施例的芯片的制备方法的流程图；
图5A～图5E为根据一些实施例的芯片的制备方法中各步骤对应的截面结构图；
图6A～图6O为根据一些实施例的多肽探针在不同CD138浓度条件下的时间与响应曲线图；
图7A～图7B为根据一些实施例的流式细胞术表征图；
图8为根据一些实施例的磁珠结合细胞的电镜图。
下面将结合附图，对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
除非上下文另有要求，否则，在整个说明书和权利要求书中，术语“包括(comprise)”及其其他形式例如第三人称单数形式“包括(comprises)”和现在分词形式“包括(comprising)”被解释为开放、包含的意思，即为“包含，但不限于”。在说明书的描述中，术语“一个实施例(one embodiment)”、“一些实施例(some embodiments)”、“示例性实施例(exemplary embodiments)”、“示例(example)”、“特定示例(specific example)”或“一些示例(some examples)”等旨在表明与该实施例或示例相关的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开的至少一个实施例或示例中。上述术语的示意性表示不一定是指同一实施例或示例。此外，所述的特定特征、结构、材料或特点可以以任何适当方式包括在任何一个或多个实施例或示例中。
以下，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本公开实施例的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在描述一些实施例时，可能使用了“耦接”和“连接”及其衍伸的表达。例如，描述一些实施例时可能使用了术语“连接”以表明两个或两个以上部件彼此间有直接物理接触或电接触。又如，描述一些实施例时可能使用了术语“耦接”以表明两个或两个以上部件有直接物理接触或电接触。然而，术语“耦接”或“通信耦合(communicatively coupled)”也可能指两个或两个以上部件彼此间并无直接接触，但仍彼此协作或相互作用。这里所公开的实施例并不必然限制于本文内容。
“A、B和C中的至少一个”与“A、B或C中的至少一个”具有相同含义，均包括以下A、B和C的组合：仅A，仅B，仅C，A和B的组合，A和C的组合，B和C的组合，及A、B和C的组合。
“A和/或B”，包括以下三种组合：仅A，仅B，及A和B的组合。
如本文中所使用，根据上下文，术语“如果”任选地被解释为意思是“当……时”或“在……时”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，根据上下文，短语“如果确定……”或“如果检测到[所陈述的条件或事件]”任选地被解释为是指“在确定……时”或“响应于确定……”或“在检测到[所陈述的条件或事件]时”或“响应于检测到[所陈述的条件或事件]”。
本文中“适用于”或“被配置为”的使用意味着开放和包容性的语言，其不排除适用于或被配置为执行额外任务或步骤的设备。
另外，“基于”的使用意味着开放和包容性，因为“基于”一个或多个所述条件或值的过程、步骤、计算或其他动作在实践中可以基于额外条件或超出所述的值。
在本申请中，DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即：腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)。
试剂盒，是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。当然，本领域技术人员能够理解的是，为了盛放化学试剂，该盒子也可以是管子等其他容器。
His，是Histidine(组氨酸)的缩写，分子量为155.141，属于碱性氨基酸类。
Gly，是Glycine(甘氨酸)的缩写。分子量为75.052，属于脂肪族类。
Cys，是Cysteine(半胱氨酸)的缩写，分子量为121.145，属于含硫类。
Leu，是Leucine(亮氨酸)的缩写，分子量为131.16，属于脂肪族类。
Arg，是Arginine(精氨酸)的缩写，分子量为174.188，属于碱性氨基酸类。
Trp，是Tryptophan(色氨酸)的缩写，分子量为204.213，属于芳香族类。
Asn，是Asparagine(天冬酰胺)的缩写，分子量为132.104，属于酰胺类。
Phe，是Phenylalanine(苯丙氨酸)的缩写，分子量为165.177，属于芳香族类。
Asp，是Aspartic acid(天冬氨酸)的缩写，分子量为133.089，属于碱性氨基酸类。
Ser，是Serine(丝氨酸)的缩写，分子量为105.078，属于羟基类。
Tyr，是Tyrosine(酪氨酸)的缩写，分子量为181.176，属于芳香族类。
HBTU，是O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，属于一种肽偶联试剂。
PyBop，是六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，分子式为C
18H
28F
6N
6OP
2。
CD138，被命名为syndecan-1，是四种跨膜蛋白syndecan家族的成员，能够结合硫酸肝素和硫酸软骨素分子。其主要功能是控制细胞的生长和分化，维持细胞的粘附和迁移。CD138抗体在人造血细胞中的表达仅限于正常骨髓中的浆细胞，人骨髓中早期B细胞前体CD138阴性。CD138可能有助于区分活的骨髓瘤细胞和凋亡细胞，也在内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和正常肝细胞中表达。CD138有助于浆细胞瘤的诊断，但部分非淋巴造血系统肿瘤(如鳞状细胞癌、肌上皮瘤、甲状腺髓样癌、黑色素瘤)可有浆细胞样形态，也可能出现CD138阳性。此外CD138随着淋巴细胞发育进程和呈现不同地表达程度，在弥漫性大B患者的肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞表面有较高的表达。
Hanks液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等，Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(Balanced Salt Solution,BSS)，简称H。Hanks液主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液。
PBS缓冲液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分包括Na
2HPO
4、KH
2PO
4、NaCl和KCl，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
PBST缓冲液，为PBS缓冲液中加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(吐温20)。
NHL，是non-Hodgkin’s lymphoma(非霍奇金淋巴瘤)的缩写。
Tentagel-NH
2树脂，是一种PEG、PS树脂，用于固相合成的载体。
常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤，其中恶性淋巴瘤的恶性程度及致死率极高，近年来成为医学界研究的主要热点之一。弥漫大B细胞淋巴瘤是NHL中最常见的类型，占临床上的“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤的大多数病例。目前，血液病理学专家需要根据合适的活检和B细胞免疫表型的证据，来得出弥漫大B细胞淋巴瘤的正确诊断。
最新研究表明，CD138随着淋巴细胞发育进程和呈现不同地表达程度，在弥漫性大B患者的肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞表面有较高的表达。也就是说，在弥漫性大B细胞淋巴瘤发病的早期，可以根据CD138的表达程度 来判定是否患有弥漫大B细胞淋巴瘤。然而，由于检测灵敏度的限制，在弥漫性大B细胞淋巴瘤发病的早期，没有有效的早筛方法，得出弥漫大B细胞淋巴瘤的正确诊断，病理分析的取样检测时，其发病已处于中晚期，导致患者不能及时得到有效地治疗。
针对上述问题，本公开的一些实施例提供一种多肽探针。该多肽探针包括至少两个疏水性氨基酸残基。其中，所述疏水性氨基酸残基个数占所述多肽探针氨基酸残基个数的四分之一至三分之二。
多肽探针在检测弥漫大B细胞淋巴瘤时，由于CD138随着淋巴细胞发育进程和呈现不同地表达程度，在弥漫性大B患者的肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞表面有较高的表达，CD138是一种蛋白聚糖，其核心蛋白是Ⅰ型跨膜蛋白，为单链结构。有一个N末端功能区，疏水的跨膜段及短的细胞内C末端构成，因此可分为3个区，即胞外区、跨膜区和胞浆区。胞外区含有5个丝氨酸-甘氨酸重复序列。跨膜区由大约25个氨基酸构成，胞浆区由大约30个氨基酸构成，由于多肽探针中存在疏水性与亲水性氨基酸残基，在检测时与CD138相结合，以表现出高亲和力。
在一些实施例中，氨基酸包括His、Gly、Cys、Leu、Asn、Arg、Trp、Phe、Asp、Ser和Tyr中的至少一个。
在一些实施例中，所述氨基酸残基的个数为5个～15个，例如5个、6个、8个、10个或15个，本公开以6个进行解释说明。
在一些实施例中，氨基酸残基的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15的氨基酸残基的序列如下表1所示：
表1
| 序列编号 | 氨基酸残基的序列 |
| SEQ ID NO.1 | His Cys Trp Arg Gly Phe |
| SEQ ID NO.2 | His Cys Trp Arg Gly Tyr |
| SEQ ID NO.3 | His Cys Trp Arg Arg Tyr |
| SEQ ID NO.4 | His Cys Trp Arg Leu Tyr |
| SEQ ID NO.5 | His Cys Trp Arg Phe Ser |
| SEQ ID NO.6 | His Cys Trp Arg Gly Phe |
| SEQ ID NO.7 | His Cys Trp Phe Gly Tyr |
| SEQ ID NO.8 | Cys Cys Trp Arg Asp Phe |
| SEQ ID NO.9 | Cys Cys Trp Arg Leu Leu |
| SEQ ID NO.10 | His Cys Trp Arg Phe Leu |
| SEQ ID NO.11 | Gly Cys Trp Arg Leu Asp |
| SEQ ID NO.12 | His Cys Trp Arg Asp Leu |
| SEQ ID NO.13 | Cys Cys Trp Phe Gly Phe |
| SEQ ID NO.14 | His Leu Trp Arg Phe Tyr |
| SEQ ID NO.15 | His Arg Trp Arg Phe Asp |
本公开一些实施例提供的多肽探针，其多肽生物相容性好，合成便捷快速，且亲合力性强、特异性强、穿透力强、清除速度快的特点。
示例地，多肽探针的氨基酸残基的序列为表1中SEQ ID NO.6所示的氨基酸残基的序列。
如图1与图2所示，本公开一些实施例还提供一种多肽探针的制备方法，包括S1～S8。
S1、将Tentagel-NH
2树脂分别与His、Gly以及Cys偶联。
其中，S1包括S11。
S11、将Tentagel-NH
2树脂脱除保护基团，再分别与His、Gly、Cys以及HBTU进行偶联循环至少三次，然后脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，在Tentagel-NH
2树脂上重复氨基酸偶联步骤，从而偶联三个残基。上述中Tentagel-NH
2树脂脱除保护基团与脱除Fmoc保护基团是在的脱除剂中进行脱除，该脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S2、将S1反应产物分别与Cys、Leu以及Arg进行偶联。
其中，S2包括S22。
S22、将S11反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Cys、Leu、Arg与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，Tentagel-NH
2树脂混合后脱除Fmoc保护基团是在脱除剂中脱除，该脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S3、将S2反应产物分别与Trp、Leu以及Asn进行偶联。
其中，S3包括S33。
S33、将S22反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Trp、Leu、Asn与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，Tentagel-NH
2树脂混合后脱除Fmoc保护基团是在脱除剂中脱除，该脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S4、将S3反应产物分别与Arg、Trp以及Phe进行偶联。
其中，S4包括S44。
S44、将S33反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成三份，向每份中加入Arg、Trp、Phe与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，Tentagel-NH
2树脂混合后脱除Fmoc保护基团是在脱除剂中脱除，该脱除剂脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括 氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S5、将S4反应产物分别与Gly、Phe、Leu、Asp以及Ser进行偶联。
其中，S5包括S55。
S55、将S44反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成四份，向每份中加入Gly、Phe、Leu、Asp、Ser与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，Tentagel-NH
2树脂混合后脱除Fmoc保护基团是在脱除剂中脱除，该脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S6、将S5反应产物分别与Phe、Ser、Leu、Asp以及Tyr进行偶联。
其中，S6包括S66。
S66、将S55反应后的Tentagel-NH
2树脂均分成五份，向每份中加入Phe、Ser、Leu、Asp、Tyr与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH
2树脂混合，脱除Fmoc保护基团。
需要说明的是，Tentagel-NH
2树脂混合后脱除Fmoc保护基团是在脱除剂中脱除，该脱除剂可以为六氢吡啶和碱液中至少一种，例如碱液包括氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，对此本公开不作具体限定。此外HBTU作为肽偶联试剂，根据实际需求该肽偶联试剂还可以为PyBop，对此本公开不作具体限定。
S7、对S6反应产物进行置换与干燥，得到负载有多肽的干燥树脂。
其中，S7包括S77。
S77、对S66反应产物在溶剂中进行溶剂置换和树脂收缩，真空抽干，得到负载有多肽的干燥树脂。
需要说明的是，上述溶剂可以为水和/或甲醇。
S8、将S7得到的干燥树脂裂解、初筛得到多肽探针，多肽探针的氨基酸残基的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。
其中，S8包括S88。
S88、将S77干燥树脂在裂解剂中裂解后，再进行磁珠初筛得到多肽探针(即探针文库)。
需要说明的是，上述裂解剂可以为酸性溶液，例如，酸性溶液可以为氟化氢溶液，氟化氢溶液的质量分数为95％。在S88中的磁珠初筛其原理过程如图3所示，在图3中磁珠30表面附有CD138，游离的为多肽探针20，通过CD138与磁珠30相结合可以筛选出高亲和的多肽探针20，结合弱或者没结合的则不结合，后续通过磁铁40产生的磁场将有结合的富集下来，最终得到氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示的多肽探针20。
本公开的一些实施例中，提供一种试剂盒，包括如上的多肽探针20。
通过该试剂盒以非疾病诊断和/或非治疗为目的的对弥漫大B细胞淋巴瘤检测，操作便捷。
在一些实施例中，试剂盒还包括表面活性剂、抗酶解剂、细胞荧光染色剂和PBS缓冲液。
其中，表面活性剂用于磁珠结合捕获时，防止细胞团聚，同时提高多肽探针20与细胞表面抗原的结合效率。抗酶解剂有效实现抗酶解作用。细胞荧光染色剂用于对检测样本细胞进行荧光染色，以便于检测分析。PBS缓冲液为检测弥漫大B细胞提供检测环境，保证生物活性物质保持其最完整的特性，以便于对样本细胞进行检测。
需要说明的是，PBS缓冲液的pH值可以为7.1～7.6。示例性地，pH值为7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6，本公开实施例对此不做具体限定。
在一些实施例中，表面活性剂的体积百分比为0.5％～5％，示例性地，表面活性剂的体积百分比为0.5％、1％、2％、4％或5％，本公开对此不做具体限定。
在一些实施例中，抗酶解剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～10mmol/L，示例性地，抗酶解剂的摩尔浓度为0.5mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、8mmol/L或10mmol/L，本公开对此不做具体限定。
在一些实施例中，细胞荧光染色剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～50mmol/L，示例性地，0.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L或50mmol/L，本公开对此不做具体限定。
在一些实施例中，表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、十二烷基硫酸钠和脂肪酸山梨坦中的至少一种；示例性地，表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，本公开实施例不限于此。
在一些实施例中，抗酶解剂包括乙二胺四乙酸，本公开实施例不限于此。
在一些实施例中，细胞荧光染色剂包括罗丹明B，本公开实施例不限于此。
图4A～图4B为本公开一些实施例提供的芯片的制备方法的流程图；图5A～图5E为根据一些实施例的芯片的制备方法中各步骤对应的截面结构图。应当理解的是，图4A～图4B所示的步骤不是排它性的，还可以在所示步骤中的任何步骤之前、之后或之间执行其它步骤。此外，所述步骤中的一些步骤可以是同时地执行的、或者可以是按照不同于图4A～图4B所示的顺序执行的。下面结合图4A～图4B、以及图5A～图5E对一些实施例中的芯片的制备方法进行说明。
如图5E所示，本公开的一些实施例提供一种芯片100，包括基体10和如上的多肽探针20，多肽探针20设置于基体10上。
需要说明的是，该芯片100用于鉴别诊断弥漫大B细胞淋巴瘤，示例性地，该芯片可以为微流控芯片，微流控芯片具有高通量、分析速度快、污染小、所需样品量小、廉价、安全等优点
此外，将多肽探针与微流控芯片相结合可以有效提高检测的灵敏度和时效性，以及降低操作的复杂度和成本。
如图4A所示，本公开的一些实施例还提供一种芯片100的制备方法，包括S100～S200。
S100、如图5E所示，形成基体10。
其中，基体10作为多肽探针20的载体。针对该基体10的形成过程，可以参考下文，本公开实施例在此不做赘述，此外该基体10作为多肽探针20检测样本细胞的信息处理中心，使分析检测速度快。
S200、在基体10的一侧偶联多肽探针20。
在S200中，如图5E所示，多肽探针20偶联在基体10上。
在一些实施例中，在基体10的一侧偶联多肽探针20，包括将多肽探针20分别在溶剂中溶解，得到溶解液。
示例性地，该溶剂可以为ddH
2O，本公开不限于此。
将溶解液分别置于基体10上，并孵育与封闭处理，从而实现多肽探针20偶联在基体10上。
在一些实施例中，如图4B所示，在S100与S200中，包括：S110～S140。
S110、在基底11一侧形成粘附层12。
在S110中，如图5B所示，在基底11一侧形成粘附层12。示例性地，基底11可以为玻璃，粘附层12的形成可以采用溶胶凝胶法、纳米粒子旋涂法或溅射工艺形成粘附层12。例如，采用纳米粒子旋涂法形成粘附层12。其中，粘附层12为光学胶，厚度在100nm～800nm，示例性地，厚度为100nm、 200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm，根据实际需求与工艺选择，本公开实施例不限于此。
S120、在粘附层12远离基底11的一侧形成钝化层13，对钝化层13进行图案化处理。
在S120中，如图5C所示，所形成的钝化层13包括形成第一绝缘层131与第二绝缘层132。示例性地，第一绝缘层131可以为二氧化硅层，第二绝缘层132可以为氮化硅层，本公开实施例不限于此。
此外，第一绝缘层131可根据需要进行喷墨打印或磁控溅射方式沉积在粘附层12远离基底11的一侧。第二绝缘层132可根据需要进行喷墨打印或磁控溅射方式沉积在第一绝缘层131远离基底11的一侧。第一绝缘层131的厚度为1000埃。第二绝缘层132的厚度为2000埃。此外，第一绝缘层131与第二绝缘层132的厚度可根据实际需求与工艺选择，本公开对此不做具体限定。
其中，图案化处理包括涂胶光刻、图案化与刻蚀，其涂胶过程是在压强为30kPa，转速为300rpm旋涂10s、在90℃烘烤120s；两次重复后曝光，显影100s，在230℃硬烤30min，后进行电感耦合离子体刻蚀。如图5C与图5D所示，对钝化层13进行图案化处理后，在粘附层12上形成多个间隔设置的钝化部130，例如，多个间隔设置的钝化部130沿行列方向阵列排布。
S130、在钝化层13远离基底11的一侧镀金膜与刻蚀。
在S130中，如图5E所示，通过镀金膜与刻蚀，在钝化部130上形成金膜部14，金膜部14在垂直于粘附层12的方向上的正投影位于钝化部130区域内。
S140、在金膜上偶联多肽探针20。
在S140中，如图5E所示，金膜部14与多肽探针20之间通过金硫键连接在一起，从而形成高通量阵列芯片，示例性地，也可以形成高通量微阵列芯片，对于弥漫大B细胞的检测具有高通量、分析速度快、污染小的特点，提高检测的灵敏度与时效性。
为了对本公开的实施例的技术效果进行客观评价，本公开的实施例将通过如下试验例和实验例对本公开的一些实施例进行详细地示例性地描述。
1、多肽探针制备实施例
步骤(1)、称取150mg的Tentagel-NH
2浸入六氢吡啶中脱除FMOC保护基团，并充分溶胀，再将Tentagel-NH
2树脂用N，N-二甲基甲酰胺清洗三次后加入反应管，并分三次分别加入180mg的His、Gly、Cys与HBTU，反 应完成后加入六氢吡啶再次脱除FMOC保护基团。
步骤(2)、将步骤(1)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂均成三份，并分别加入三个反应管中，向每个反应管中分别加入60mg的Cys、Leu、Arg与HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把三个反应管中的Tentagel-NH
2树脂混合，浸入六氢吡啶中，脱除FMOC保护基团。
步骤(3)、将步骤(2)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂均分为三份，并分别加入三个反应管中，向每个反应管中分别加入60mg的Trp、Leu、Asn与HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把三个反应管中的Tentagel-NH
2树脂混合，浸入六氢吡啶中，脱除FMOC保护基团。
步骤(4)、将步骤(3)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂均分为三份，并分别加入三个反应管中，向每个反应管中分别加入45mg的Arg、Trp、Phe与HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把三个反应管中的Tentagel-NH
2树脂混合，浸入六氢吡啶中，脱除FMOC保护基团。
步骤(5)、将步骤(4)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂均分为四份，并分别加入四个反应管中，向每个反应管中分别加入36mg的Gly、Phe、Leu、Asp、Ser与HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把四个反应管中的Tentagel-NH
2树脂混合，浸入六氢吡啶中，脱除FMOC保护基团。
步骤(6)、将步骤(5)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂均分为五份，并分别加入五个反应管中，向每个反应管中分别加入36mg的Phe、Ser、Leu、Asp、Tyr与HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把五个反应管中的Tentagel-NH
2树脂混合，浸入六氢吡啶中，脱除FMOC保护基团。
步骤(7)、将步骤(6)反应完成后的Tentagel-NH
2树脂通过水和甲醇进行清洗，从而实现溶剂置换，同时收缩了树脂，并通过真空抽干掉水和甲醇，得到负载有多肽的干燥树脂。
步骤(8)、将步骤(7)得到负载有多肽的干燥树脂在体积分数为氟化氢中将多肽从树脂上裂解同时去除侧链保护基团，得到探针文库，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1的体系下，将CD138与末端修饰有羧基的磁珠相连，通过PBS充分清洗后，将修饰的磁珠与探针文库混匀相互作用30min，利用磁场将结合后的探针富集下来，得到氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示的多肽探针。
为进一步制备得到最佳的多肽探针，该多肽探针的制备方法还包括：步骤(9)～步骤(11)。
步骤(9)、将步骤(8)得到的多肽探针分别溶解到ddH
2O中，并配置 成浓度为100μg/mL的溶液。
步骤(10)、将步骤(9)得到的溶液点在一张裸金芯片表面上，每种溶液重复三个点，4℃孵育12小时后将裸金芯片侵入质量分数为5％脱脂奶中4℃封闭12小时，用10X PBS 1X PBS超纯水清洗干净，氮气吹干。
步骤(11)、将步骤(10)处理后的裸金芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；以PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L和800nmol/L的CD138进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。其检测结果如图6A与图6O所示的时间与响应曲线图，通过图6F可知，在不同浓度条件下的CD138进行检测时，该多肽探针响应强度最高，衰减最低，具有高亲和力，从而制备得到最佳氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.6所示的多肽探针。经拟合，平衡解离常数KD为1.29×10
-9mol/L。
2、特异性分析试验例
以氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.6所示的多肽探针进行特异性分析，具体包括如下步骤：
步骤(a)、梯度浓度细胞样本配置：以阳性细胞与阴性细胞为试验组，其中阳性细胞为弥漫性大B细胞，阴性细胞为海拉细胞，阳性细胞与阴性细胞以个数比例为1：10进行混合，重复吹打混匀。
步骤(b)、磁珠偶联：在PBS溶液中，1mg磁珠与10μg多肽探针，室温轻微振荡1小时。然后用体积分数为0.01％牛血清白蛋白的PBS缓冲液清洗磁珠5次，每次静置30s，最后重悬浮于PBS溶液中，得到浓度为15mg/mL磁珠悬浮液。
步骤(c)、阳性细胞富集：将阳性细胞与磁珠悬浮液充分混合，在4℃冰盒中手摇振荡30分钟，之后用PBS(含0.1％BSA和2mmol/LEDTA)缓冲液洗涤三次，重悬浮于PBS中。
步骤(d)、特异性分析：利用磁场将捕获到的细胞分离，通过流式细胞仪进行蛋白表达情况定量，计算阳性比例。
其特异性分析结果如图7A与图7B所示，该附图为流式细胞术表征结果图，通过该附图可知其氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.6所示的多肽探针的特异性大于90％。
3、芯片100制备实施例
步骤(1)、微阵列图案化：将玻璃进行清洗，接着旋涂一层光学胶形成 厚度为100nm～800nm的粘附层12，继而沉积厚度为1000埃的二氧化硅层与沉积厚度为2000埃的氮化硅层，通过涂胶光刻保护与图案化，其涂胶参数为30kPa\300rpm*10s、在90℃烘烤120s；两次重复后曝光，显影100s，在230℃硬烤30min，后进行电感耦合离子体刻蚀。
需要说明的是，粘附层12的厚度可以为100nm、200nm、400nm、600nm或800nm，根据实际需求选择不同的厚度，对此本公开不做具体限定。此外，二氧化硅层与氮化硅层的厚度也可根据实际需求选择不同的厚度，对此本公开不做具体限定。
步骤(2)、裸金阵列构建：在240℃条件下，将金镀在氮化硅层上蒸镀形成厚度为300nm金膜，再进行反应离子刻蚀。
步骤(3)、将多肽探针20偶联在金膜表面。
4、弥漫性大B细胞淋巴瘤检测试验例
本公开的一些实施例提供一种弥漫性大B细胞淋巴瘤的检测方法，其步骤如下所示：
样本提取：使用一次性的抗凝的真空抽血管采集人体静脉血2mL～5mL，室温保存，并采用乙二胺四乙酸或肝素抗凝。
样本处理：在无菌的塑料离心管中加入2mL淋巴细胞分离液，在装有2mL血样的真空管中加入2mL PBS缓冲液混匀。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，使血样尽量位于提取液上层，然后在20℃转速为1500rpm条件下离心15min。离心管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞，用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次11000r/min离心10min。
多肽探针固定：在镀膜有裸金的玻璃芯片表面进行氨基酸残基的序列如SEQ ID NO.6所示多肽探针偶联，用纯水将多肽探针溶解，配置1mmol/L浓度的多肽探针溶液，将多肽探针溶液涂敷在芯片表面，在温度为4℃，湿度为40％孵育24h，后采用10x PBS、1x PBS、纯水分别清洗3次，氮气吹干。
肿瘤细胞多肽探针捕获：将样本处理后得到的淋巴细胞加入1x PBST分散，保证无团聚现象发生，其后用1x PBST稀释细胞悬浮液至1×10
5/mL，以5μL/s流速通过偶联有多肽探针的芯片表面500s，继而以1x PBST以3μL/s的流速通过芯片表面500s，充分解离非特异性吸附。
如图8所示，磁珠结合细胞并通过细胞染色表征，利用荧光标记的抗体(与捕获用抗体不同位点)对捕获后的细胞进行结合，通过荧光显微镜表征， 验证捕获的阳性，从而进行弥漫性大B细胞淋巴瘤的诊断。
综上，本公开的多肽探针具有选择性好、免疫原性低、生物相容性好、穿透性强、易排泄清除等特点，在弥漫性大B细胞淋巴瘤检测具有特异性与高灵敏度。本公开的多肽探针的制备方法进行多肽探针的文库构建可以有效提高多肽探针的多样性。从而解决弥漫性大B细胞淋巴瘤早期诊断的检测灵敏度问题。本公开芯片具有高通量、分析速度快、污染小的特点，在临床诊断和疾病筛查领域具有广阔的发展前景。将高亲和多肽探针与芯片相结合可以有效提高检测的灵敏度和时效性。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (17)
- 一种多肽探针，包括：至少两个疏水性氨基酸残基；其中，所述疏水性氨基酸残基个数占所述多肽探针氨基酸残基个数的四分之一至三分之二。
- 根据权利要求1所述的多肽探针，其中，氨基酸包括His、Gly、Cys、Leu、Asn、Arg、Trp、Phe、Asp、Ser和Tyr中至少一个。
- 根据权利要求1所述的多肽探针，其中，所述氨基酸残基的个数为5个～15个。
- 根据权利要求1～3中任一项所述的多肽探针，其氨基酸残基的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。
- 根据权利要求4所述的多肽探针，其中，所述多肽探针的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
- 一种多肽探针的制备方法，包括：S1、将Tentagel-NH 2树脂分别与His、Gly以及Cys偶联；S2、将S1反应产物分别与Cys、Leu以及Arg进行偶联；S3、将S2反应产物分别与Trp、Leu以及Asn进行偶联；S4、将S3反应产物分别与Arg、Trp以及Phe进行偶联；S5、将S4反应产物分别与Gly、Phe、Leu、Asp以及Ser进行偶联；S6、将S5反应产物分别与Phe、Ser、Leu、Asp以及Tyr进行偶联；S7、对S6反应产物进行置换与干燥，得到负载有多肽的干燥树脂；S8、将S7得到的干燥树脂裂解、初筛得到多肽探针，所述多肽探针的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的至少一种。
- 根据权利要求6所述的制备方法，其中，S1包括S11：S11、将Tentagel-NH 2树脂脱除保护基团，再分别与His、Gly、Cys以及HBTU进行偶联循环至少三次，然后脱除Fmoc保护基团；S2包括S22：S22、将S11反应后的Tentagel-NH 2树脂均分成三份，向每份中加入Cys、Leu、Arg与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH 2树脂混合，脱除Fmoc保护基团；S3包括S33：S33、将S22反应后的Tentagel-NH 2树脂均分成三份，向每份中加入Trp、Leu、Asn与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH 2树脂混合，脱除Fmoc 保护基团；S4包括S44：S44、将S33反应后的Tentagel-NH 2树脂均分成三份，向每份中加入Arg、Trp、Phe与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH 2树脂混合，脱除Fmoc保护基团；S5包括S55：S55、将S44反应后的Tentagel-NH 2树脂均分成四份，向每份中加入Gly、Phe、Leu、Asp、Ser与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH 2树脂混合，脱除Fmoc保护基团；S6包括S66：S66、将S55反应后的Tentagel-NH 2树脂均分成五份，向每份中加入Phe、Ser、Leu、Asp、Tyr与HBTU进行偶联，反应后将Tentagel-NH 2树脂混合，脱除Fmoc保护基团；S7包括S77：S77、对S66反应产物在溶剂中进行溶剂置换和树脂收缩，真空抽干，得到负载有多肽的干燥树脂；S8包括S88：S88、将S77干燥树脂在裂解剂中裂解后，再进行磁珠初筛得到多肽探针。
- 一种试剂盒，包括如权利要求1～5中任一项所述的多肽探针。
- 根据权利要求8所述的试剂盒，其中，还包括表面活性剂、抗酶解剂和细胞荧光染色剂。
- 根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂的体积百分比为0.5％～5％，所述抗酶解剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～10mmol/L，所述细胞荧光染色剂的摩尔浓度为0.5mmol/L～50mmol/L。
- 根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、十二烷基硫酸钠和脂肪酸山梨坦中的至少一种；和/或；所述抗酶解剂包括乙二胺四乙酸；和/或；所述细胞荧光染色剂包括罗丹明B。
- 一种芯片，包括基体和权利要求1～5中任一项所述的多肽探针，所述多肽探针设置于所述基体上。
- 一种芯片的制备方法，包括：形成基体；在所述基体的一侧偶联多肽探针，所述多肽探针为如权利要求1或2所 述的多肽探针。
- 根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述在所述基体的一侧偶联多肽探针包括：将多肽探针分别溶解，得到溶解液；将溶解液分别置于基体上，并孵育与封闭处理。
- 根据权利要求13或14所述的制备方法，其中，所述形成基体包括：在基底一侧形成粘附层；在所述粘附层远离所述基底的一侧形成钝化层，对所述钝化层进行图案化处理；在所述钝化层远离所述基底的一侧镀金膜与刻蚀；在所述金膜上偶联多肽探针。
- 根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述在所述粘附层远离所述基底的一侧形成钝化层包括：形成第一绝缘层，所述第一绝缘层形成在所述粘附层远离所述基底的一侧；形成第二绝缘层，所述第二绝缘层形成在所述第二绝缘层远离所述基底的一侧。
- 一种如权利要求1～5中任一项所述的多肽探针在检测弥漫性大B细胞淋巴瘤中的应用。
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